KR101611950B1 - Pharmaceutical or food composition comprising Spergularia marina - Google Patents

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Abstract

본 발명은 부작용이 적어 안전하면서도 장 내분비세포 자극 활성이 뛰어난 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것으로서, 세발나물 추출물을 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 조성물은 식욕 억제, 항비만 효과, 심장질환 개선, 소화 장애 및 흡수 장애 개선 또는 치료, 동맥경화증 치료 또는 개선, 신경보호 작용, 또는 간질환 치료 또는 개선 등을 위한 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 GLP-1, CCK 또는 5-HT의 분비 자극 또는 hTGR5 활성화에 영향을 미치고, hGPR119, α-gustducin, TRP 활성화용 및 TRPA1 활성제로 작용할 수 있다.The present invention relates to a pharmaceutical composition or a food composition which is safe and has excellent long-term endocrine cell stimulating activity due to its low side effect, and contains a cedar herb extract as an active ingredient. The composition of the present invention is useful as a pharmaceutical composition or food composition for the treatment of an appetite suppression, anti-obesity effect, improvement of heart disease, improvement or treatment of digestive and absorption disorders, treatment or improvement of arteriosclerosis, neuroprotective action, . ≪ / RTI > The composition of the present invention also affects secretory stimulation or hTGR5 activation of GLP-1, CCK or 5-HT and may serve as hGPR119, a-gustducin, TRP activation and TRPA1 activator.

Description

세발나물 함유 약학적 조성물 또는 식품 조성물{Pharmaceutical or food composition comprising Spergularia marina}[0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition or a food composition comprising Sirgulia marina,

본 발명은 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이며, 더 구체적으로 본 발명은 장 내분비세포로부터 장 호르몬 또는 신경펩타이드의 분비를 활성화시키는 추출물을 유효성분으로 함유하는 특정 질병 또는 질환에 유용한 약학적 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition or a food composition. More particularly, the present invention relates to a pharmaceutical composition useful for a specific disease or disease containing, as an active ingredient, an extract that activates the secretion of endocrine hormones or neuropeptides from intestinal endocrine cells or ≪ / RTI >

장(gastrointestinal tract)에 존재하는 내분비세포인 장 내분비세포 (enteroendocrine cells)는 장(腸)의 내강(內腔)(intestinal lumen)에 유입된 성분에 의해 자극되어, 장 호르몬(gut hormones) 또는 신경펩타이드(neuropeptides)를 분비한다. 동일한 성분일지라도 혈액을 통하여 표적 장기로 이동하여 작용하면 호르몬이라 지칭하며 미주신경 활성화의 신호전달물질로 작용하면 신경펩타이드라 지칭한다. 예를 들어, 장 내분비세포에서 분비되는 특정 장 호르몬 또는 신경펩타이드는 국소 빈혈(ischemia)로부터 심장세포(cardiomyocytes)를 보호하고, 심장 질환을 겪는 환자들의 심장 기능 향상에 효과적임이 보고되고 있다. Enteroendocrine cells, which are endocrine cells present in the gastrointestinal tract, are stimulated by components that enter the intestinal lumen of the intestine, leading to the formation of gut hormones or nerves Secrete peptides (neuropeptides). Even if they are the same, they move to the target organs through the blood and are called hormones. When they act as vagal activation signaling substances, they are called neuropeptides. For example, specific endocrine hormones or neuropeptides secreted from intestinal endocrine cells have been reported to protect cardiomyocytes from ischemia and to be effective in improving cardiac function in patients suffering from heart disease.

장 내분비세포에서 분비되는 장 호르몬 또는 신경펩타이드로는 글루카곤-유사 펩타이드-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1), 콜레시스토키닌(Cholecystokinin, CCK), 세로토닌(Serotonin, 5-hydroxytryptamine, 5-HT) 등을 들 수 있다. Glucagon-like peptide-1 (GLP-1), cholecystokinin (CCK), serotonin (5-hydroxytryptamine, 5-HT ) And the like.

먼저, GLP-1은 회장(ileum) 및 결장(colon)에 존재하는 장 내분비세포의 일종인 L-cells에서 분비된다. First, GLP-1 is secreted in L-cells, a kind of intestinal endocrine cells present in the ileum and colon.

상기 GLP-1은 식욕 억제 효과, 포만감 증진, 음식 섭취 억제 등의 작용을 통해 비만 치료와 관련이 있고, 췌장 및 소장에서의 소화 효소 분비를 증진시켜 효율적인 소화 및 흡수 조절에 도움이 되는 것으로 알려져 있으며, 국소 빈혈 (ischemia)로부터 심장세포(cardiomyocytes) 보호 효과 및 심장마비 환자 (patients with heart failure)의 심장 기능 향상 효과를 통해 심장병 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Sokos, G.G. et al ., Glucagon-like peptide-1 infusion improves left ventricular ejection fraction and functional status in patients with chronic heart failure. J. Card. Fail. (2006) 12: 694-699; Ban, K., et al ., Cardioprotective and vasodilatory actions of glucagon-like peptide-1 receptor are mediated through both glucagon-like peptide-1 receptor-dependent and -independent pathways. Circulation (2008) 117: 2340-2350 참고).The GLP-1 is known to be associated with obesity treatment through actions such as an appetite suppressing effect, a feeling of fullness, and a suppression of food intake, and it is known to enhance the secretion of digestive enzymes in the pancreas and small intestine, , Cardiomyocyte protection from ischemia and cardiac function improvement of patients with heart failure (Sokos, GG et < RTI ID = 0.0 > al . , Glucagon-like peptide-1 infusion improves left ventricular ejection fraction and functional status in patients with chronic heart failure. J. Card. Fail. (2006) 12: 694-699; Ban, K., et al . , Cardioprotective and vasodilatory actions of glucagon-like peptide-1 receptors are mediated through both glucagon-like peptide-1 receptor-dependent and -independent pathways. Circulation (2008) 117: 2340-2350).

또한 GLP-1은 상기 GLP-1은 동맥경화증 치료 효과 [Burgmaier M et al., Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and its split products GLP-1(9-37) and GLP-1(28-37) stabilize atherosclerotic lesions in apoe-/- mice. Atherosclerosis (2013) 231, 427-435], 뇌혈관 질환 및 신경세포 염증 치료 효과(Salcedo I et al., Neuroprotective and neurotrophic actions of glucagon-like peptide-1 (GLP-1): an emerging opportunity to treat neurodegenerative and cerebrovascular disorders. British Journal of Pharmacology (2012) 166, 1586-1599)등이 있는 것으로 알려져 있다.Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) and its split products GLP-1 (9-37) and GLP-1 (28) -37) stabilize atherosclerotic lesions in apoe - / - mice. Atherosclerosis (2013) 231, 427-435], the therapeutic effect of cerebrovascular diseases and neuronal inflammation (Salcedo I et al., Neuroprotective and neurotrophic actions of glucagon-like peptide-1 (GLP-1): an emerging opportunity to treat neurodegenerative and cerebrovascular disorders. British Journal of Pharmacology (2012) 166, 1586-1599).

상기 GLP-1은 G protein-coupled receptors(GPCRs)의 일종인 TGR5 및 GPR119의 활성화(Reimann, F., et al ., Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. (2008) 8: 532-539; Lauffer, L.M., et al ., GPR119 is essential for oleoylethanolamide-induced glucagon-like peptide-1 secretion from the intestinal enteroendocrine L-cell. Diabetes (2009) 58:1058-1066. 참고) 또는 α-gustducin의 활성화(Jang, H.J., et al ., 2007. Gut expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceeding of the National Academy of Science 104, 1506915074. 참고)에 의해 분비가 촉진되며, 특히, 갈색 지방조직(brown adipose tissue) 및 근육(muscle)에 발현된 G protein-coupled receptor(GPCR) TGR5(GPR131)의 활성화는 에너지 소비를 증가시켜서 비만 치료 효과를 보이며, 간질환 개선에 관련이 있는 것으로 알려져 있으며(참고문헌 : Lieu T et al., GPBA: A G protein-coupled receptor for bile acids and an emerging therapeutic target for disorders of digestion and sensation. British Journal of Pharmacology (2013) in press), 동맥경화증을 억제하는 것으로 보고되었다(Pols TWH et al., TGR5 activation inhibits atherosclerosis by reducing macrophage inflammation. Cell Metabolism (2011) 14, 747).The GLP-1 activates TGR5 and GPR119, one of the G protein-coupled receptors (GPCRs) (Reimann, F., et al . , Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell Metab. (2008) 8: 532-539; Lauffer, LM, et al . , GPR119 is essential for oleoylethanolamide-induced glucagon-like peptide-1 secretion from the intestinal enteroendocrine L-cell. Diabetes (2009) 58: 1058-1066. ) Or activation of α-gustducin (Jang, HJ, et al . , 2007. Gut expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. (GPCR) TGR5 (GPR131) expressed in brown adipose tissue and muscle, in particular, by stimulating the secretion by TGF-β1 (see also Proceeding of the National Academy of Science 104, 1506915074) (Lieu T et al., GPBA: AG protein-coupled receptor for bile acids and an emerging therapeutic target for the treatment of obesity) (2011) 14, 747). In addition, TGR5 activation inhibits atherosclerosis by reducing macrophage inflammation (Cell Metabolism 2011, 14, 747) and has been reported to inhibit arteriosclerosis (Pols TWH et al. .

다음으로, CCK는 십이지장(duodenum) 및 공장(jejunum)에 존재하는 장 내분비세포의 일종인 I-cells에서 합성되어 분비되며, 소화 및 흡수 조절에 관여하고, 항비만 효과가 있는 것으로 알려져 있다.Next, it is known that CCK is synthesized and secreted in I-cells, a kind of intestinal endocrine cells present in duodenum and jejunum, and is involved in digestion and absorption regulation, and has an anti-obesity effect.

상기 CCK 분비에는 G단백 결합 수용체(G protein-coupled receptors (GPCRs)와 GPCRs 관련 신호전달 분자들(G proteins, PLCβ2), 또한 transient receptor potential(TRP) channels 등이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다. The CCK secretion is known to involve G protein-coupled receptors (GPCRs) and GPCRs-related signaling molecules (G proteins, PLCβ2) and transient receptor potential (TRP) channels.

그리고 5-HT는 위장관 전체에 존재하는 Enterochromaffin cells(EC cells)에서 분비되는 호르몬으로 소화 및 흡수 조절에 관여하며, 식욕 억제를 통해 항비만 효과를 가져오는 것으로 알려져 있다.And 5-HT is a hormone secreted from Enterochromaffin cells (EC cells) in the whole gastrointestinal tract. It is known that 5-HT is involved in digestion and absorption control, and has an anti-obesity effect through appetite suppression.

장 호르몬 또는 신경펩타이드 분비는 섭취한 음식을 소화의 단계에서 모니터링하여 음식 섭취와 소화 작용과 관련된 체내 항상성 (장 운동성, 장에서의 소화효소 분비 작용, 식욕 등)을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 체내 항상성은 흡수한 에너지와 소비된 에너지 사이의 균형을 나타내며, 과도한 에너지의 섭취로 인해 균형이 깨지게 되면 비만과 같은 대사질환 등을 유발하게 되고, 심혈관 질환 등을 유발할 수 있다. Gastrointestinal hormone or neuropeptide secretion is known to play a role in maintaining the homeostasis (intestinal motility, secretion of digestive enzymes in the intestines, appetite, etc.) related to food intake and digestion by monitoring ingested food at the stage of digestion , Body homeostasis represents a balance between the energy absorbed and the energy consumed. If the balance is broken due to excessive energy intake, metabolic diseases such as obesity may be induced, leading to cardiovascular diseases.

전 세계적으로 심혈관 질환 등과 같은 심각한 질병에 효과적인 약물을 개발하려는 노력이 꾸준히 이어져 오고 있다. 그러나, 효과가 매우 높으면서도 비만, 간독성, 부종과 같은 부작용이 적은 약물을 개발하는 것이 쉽지 않다. There have been steady efforts worldwide to develop drugs that are effective in serious diseases such as cardiovascular disease. However, it is not easy to develop drugs with very low effects, such as obesity, hepatotoxicity, and edema, which are very effective.

한편, 비만의 예방 또는 치료를 위해 항비만 효과를 갖는 약물이 사용되고 있으나, 이러한 약물은 기름변이나 복부 팽만감, 어지러움, 구갈, 변비, 혈압상승 등과 같은 부작용을 유발하는 것으로 알려지면서 보다 안전하고 효력이 강한 천연 기능성 물질의 개발이 절실히 요구되고 있다. On the other hand, medicines having anti-obesity effect are used for prevention or treatment of obesity, but these drugs are known to cause side effects such as oil stomach, abdominal bloating, dizziness, dryness, constipation, Development of strong natural functional materials is urgently required.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 부작용이 적어 안전하면서도 장 내분비세포 활성이 뛰어나 여러 가지 유용한 효능을 나타낼 수 있는 약학적 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다. Accordingly, the technical problem to be solved by the present invention is to provide a pharmaceutical or food composition which is safe and has excellent endocrine endothelial cell activity and can exhibit various useful effects because of its low side effect.

특히 본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 식욕 억제, 항비만 효과, 심장질환 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 및 간질환 치료 또는 개선 중 어느 하나 이상의 효과를 나타내는 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공하는 것이다.In particular, the present invention provides a pharmaceutical composition which exhibits an effect of at least one of an appetite suppression, an anti-obesity effect, an improvement of heart disease, an improvement of digestion and absorption disorder, an improvement of arteriosclerosis, a neuroprotective action, Or food composition.

본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 안전한 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 또는 식품 조성물의 유효한 양을 치료 또는 개선이 필요한 개체 또는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 개체 또는 환자에 있어 식욕 억제, 항비만, 심장질환 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 및 간질환 치료 또는 개선 중 어느 하나 이상의 효과를 달성하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating anorexia nervosa in an individual or a patient, which comprises administering an effective amount of a pharmaceutical or food composition containing a safe extract as an active ingredient to a patient or a patient in need thereof, The present invention provides a method for achieving at least one of the effects of obesity, improvement of heart disease, improvement of digestive and absorption disorder, improvement of arteriosclerosis, neuroprotective action and treatment or improvement of liver disease.

본 발명이 이루고자 하는 또 다른 기술적 과제는 GLP-1, CCK 또는 5-HT의 분비 자극 또는 hTGR5 활성화에 영향을 미치고, 결과적으로 TRP, TRPA1, 지 단백(G protein), 또는 PLCβ2 활성제로 작용하는 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition which acts on secretion stimulation of GLP-1, CCK or 5-HT or hTGR5 activation and consequently acts as TRP, TRPA1, G protein or PLCβ2 activator .

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 세발나물(Spergularia marina (L.) Griseb) 추출물을 유효성분으로 포함하고, 장 내분비세포 활성을 가져, 결과적으로는 식욕 억제 효과; 항비만 효과; 심장질환 개선 효과; 소화 및 흡수 장애 개선; 동맥경화증 개선; 신경보호 작용; 또는 간질환 치료 또는 개선 효과를 나타내는 조성물을 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides an extract of Spergularia marina (L.) Griseb as an active ingredient and having intestinal endocrine cell activity, resulting in an appetite suppressing effect; Anti-obesity effect; Improvement of heart disease; Improved digestion and absorption disorders; Improvement of arteriosclerosis; Neuroprotection; Or a liver disease treating or improving effect.

본 발명자들은 오랫동안 사용되어 안전성이 입증된 천연물 중에서 세발나물의 추출물이 장 내분비세포의 활성화로 인해 분비되는 장 호르몬 및/또는 신경펩타이드의 분비에 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors of the present invention have completed the present invention by confirming that the extract of Trichoderma herb extract is effective for the secretion of endocrine hormone and / or neuropeptide secreted by the activation of intestinal endocrine cells among natural products which have been used for a long time and proved to be safe.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 세발나물 추출물이 식욕 억제 효과를 가지고, 포만감을 증진시킨다는 것을 실험을 통해 밝혀내어 세발나물 추출물의 식욕 억제를 통한 항비만 효과에 대한 용도를 제공한다.In another embodiment of the present invention, it is demonstrated through experiments that the extract of T. hiragana has an appetite suppressing effect and promotes satiety, and provides an anti-obesity effect through the suppression of appetite suppression of T. hiragana extract.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 세발나물 추출물이 췌장 및 소장에서 소화효소 분비를 증진시키고, 장 수축작용 및 운동성을 조절한다는 것을 실험을 통해 밝혀내어 세발나물 추출물의 소화 및 흡수 장애 개선 효과에 대한 용도를 제공한다.In another embodiment of the present invention, it has been found through experimentation that the extract of Tricholoma herb extract improves the secretion of digestive enzymes in the pancreas and small intestine, and controls the intestinal motility and motility of the pancreas and small intestine. It provides usages.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 세발나물 추출물이 심장근육으로 전달되는 혈류를 조절하여 심장근육세포를 보호하는 효과가 뛰어나다는 사실을 밝혀내어 세발나물 추출물의 심장질환 개선 효과에 대한 용도를 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명의 세발나물 추출물은 국소빈혈로부터 심장세포를 보호하고, 심장마비 우려가 있는 환자의 심장 기능 향상 효과를 나타낼 수 있다.According to another embodiment of the present invention, it is revealed that the extract of Tricholoma herb extract has excellent effect of protecting cardiac muscle cells by regulating blood flow to the heart muscle, do. More specifically, the extract of Tricholoma herbaceousum of the present invention protects the heart cells from ischemia and can exhibit the cardiac function-improving effect of a patient who is at risk of heart attack.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 세발나물 추출물이 동맥경화증을 예방할 수 있다는 것을 확인하고, 상기 추출물의 동맥경화증 개선 효과에 대한 용도를 제공한다.In another embodiment of the present invention, it is confirmed that the extract of Tricholomae herb extract can prevent arteriosclerosis, and the use of the extract for improving arteriosclerosis is provided.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 세발나물 추출물에 의해 뇌의 Arcuate nucleus in hypothalamus(ARC)를 활성화시키고, 미주신경 (vagus nerves)을 활성화시킨다는 사실을 밝혀내어 세발나물 추출물의 신경보호 효과에 대한 용도를 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명의 세발나물 추출물은 신경변성(Neurodegenerative) 질환 및 뇌혈관(cerebrovascular) 질환을 치료하고, 신경세포 염증(Neuroinflammation)을 치료하고, 신경 조직 발생(Neurogenesis) 증진 효과를 기대할 수 있다. In another embodiment of the present invention, the present inventors found that the extracts of Trichoderma herb extract activates the arcuate nucleus in hypothalamus (ARC) of the brain and activates the vagus nerves, Lt; / RTI > More specifically, the extract of Tricholoma herb extract of the present invention can treat neurodegenerative diseases and cerebrovascular diseases, treat neuroinflammation, and enhance neurogenesis .

본 발명의 또 다른 실시예에서는 세발나물 추출물의 간질환 치료 또는 개선 효과에 대한 용도를 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명의 세발나물 추출물은 간 염증(Hepatic inflammation) 감소 효과, 장간 혈액순환(enterohepatic blood flow) 증진효과, 간 기능 개선 효과, cholestatic liver diseases 치료 효과, 소양병 (搔痒病; pruritus) 및 무통증 황달 (painless jaundice) 치료 효과, 장 기능 (intestinal functions) 개선 효과, 신경전달 반응 촉진 효과를 기대할 수 있다.In another embodiment of the present invention, there is provided a use for treating or improving the liver disease of the extract of Trichoderma herbacea. More specifically, the extract of Tricholoma herb extract of the present invention is effective for reducing hepatic inflammation, enhancing enterohepatic blood flow, improving liver function, treating cholestatic liver diseases, pruritus, And painless jaundice treatment, improvement of intestinal functions, and promotion of neurotransmission response can be expected.

또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 GLP-1, CCK 또는 5-HT의 분비 자극 또는 hTGR5 활성화에 영향을 미치거나 hGPR119, α-gustducin, TRP, TRPA1 활성제로 작용하는 조성물을 제공한다.In order to achieve still another technical object, the present invention provides a composition which acts on secretion stimulation or hTGR5 activation of GLP-1, CCK or 5-HT or acts as hGPR119, a-gustducin, TRP or TRPA1 activator.

구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 세발나물 추출물이 GLP-1 분비를 자극한다는 것을 실험을 통해 밝혀내어 세발나물 추출물의 GLP-1 분비 자극 효과에 대한 용도를 제공한다.Specifically, in one embodiment of the present invention, it is demonstrated through experiments that GLP-1 secretion stimulates GLP-1 secretion, and provides use of GLP-1 secretion stimulating effect of GLP-1 extract.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 세발나물 추출물이 CCK 분비를 자극하고, 세포내 칼슘 농도 및 cAMP 증가로 GPCRs이 활성화되는 것을 실험을 통해 밝혀내어 세발나물 추출물의 CCK 분비 자극 효과에 대한 용도를 제공한다.In another embodiment of the present invention, the extracts of Trichophyton oryzae stimulate CCK secretion, and activation of GPCRs by intracellular calcium concentration and cAMP increase is demonstrated through experiments to provide a CCK secretion stimulating effect of Trichoderma herb extract .

본 발명의 또 다른 실시예에서는 세발나물 추출물이 5-HT분비를 자극하고, 세포내 칼슘 농도 변화를 유발하는 것을 실험을 통해 밝혀내어 세발나물 추출물의 5-HT 분비 자극 효과에 대한 용도를 제공한다.In another embodiment of the present invention, it has been experimentally confirmed that the extract of Tricholoma herb extract stimulates 5-HT secretion and induces a change in intracellular calcium concentration, and provides a use for 5-HT secretion stimulating effect of Trichoderma herb extract .

또 다른 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 TGR5, hGPR119, α-gustducin, TRP 또는 TRPA1 활성제로 작용하는 조성물을 제공한다. In order to achieve still another technical object, the present invention provides a composition which acts as TGR5, hGPR119, a-gustducin, TRP or TRPA1 activator.

구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 세발나물 추출물이 TGR5를 활성화시키는 것을 실험을 통해 밝혀내어 TGR5 활성 효과에 대한 용도를 제공한다. More specifically, in one embodiment of the present invention, it is experimentally confirmed that the extract of Trifolium norbacillus activates TGR5, thereby providing a use for the effect of TGR5 activity.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 세발나물 추출물이 칼슘농도를 증가시키는 것을 발견하고, 세발나물 추출물이 TRP, TRPA1 채널을 활성화시키는 것을 실험을 통해 밝혀내어 TRP, TRPA1 채널 활성 효과에 대한 용도를 제공한다. 또한 본 발명의 세발나물 추출물에 의해 hGPR119가 활성화되어 세포내 칼슘이온 농도가 증가하는 것을 밝혀내어 hGPR119 활성 효과에 대한 용도를 제공한다. In another embodiment of the present invention, it has been found that the extract of Trichophyton sp. Increases the calcium concentration, and the extract of Trichoderma herb extract activates the TRP and TRPA1 channels through experiments and provides a use for TRP and TRPA1 channel activity . In addition, the present invention provides the use of hGPR119 activity for the effect of hGPR119 activity by confirming that the intracellular calcium ion concentration is increased by activating hGPR119.

또 다른 실시예에서 세발나물 추출물에 의해 GLP-1 분비의 매개 분자인 α-gustducin가 활성화되어 세포내 칼슘이온 농도와 cAMP 농도가 증가하는 것을 밝혀내어 α-gustducin 활성 효과에 대한 용도를 제공한다. In another embodiment, α-gustducin, which is a mediator of GLP-1 secretion, is activated by the extract of Tetranych philosopher, and intracellular calcium ion concentration and cAMP concentration are increased to provide an application for the effect of α-gustducin activity.

본 발명의 세발나물 추출물은 본 발명이 속한 분야에서 통상적인 방법으로 추출해낸 추출물을 의미하며, 추출 후 분획, 분리, 여과 등의 방법으로 추가적으로 정제될 수 있다. The extract of the present invention is extracted by a conventional method in the field of the present invention, and can be further purified by extraction, fractionation, separation, filtration and the like.

예를 들어, 본 발명에 따른 상기 세발나물 추출물은 세발나물의 용매 추출물 또는 이의 건조물일 수 있다. 세발나물 추출 시 추출 용매는 천연물 추출에 사용되는 용매이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 정제수; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글라이콜, 프로필렌글라이콜 등의 다가 알코올; 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들은 혼합 용매를 이용할 수 있으나, 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하고, 정제수, 에탄올 또는 이들의 혼합용매를 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 정제수와 에탄올의 혼합용매를 사용하는 것이 본 발명의 목적상 더욱 바람직하다. For example, the extract of Tricholoma extract according to the present invention may be a solvent extract of Trichoderma herbaceousum or a dried product thereof. The extraction solvent used in the extraction of Trifolium herbaceousum may be any solvent used for extracting natural products without limitation, for example, purified water; Lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol and butyl alcohol; Polyhydric alcohols such as glycerin, butylene glycol and propylene glycol; Hydrocarbon solvents such as methyl acetate, ethyl acetate, acetone, benzene, hexane, diethyl ether and dichloromethane; Or a mixed solvent thereof may be used, but it is preferable to use purified water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol, butyl alcohol, or a mixed solvent thereof, and it is preferable to use purified water, ethanol, , And it is more preferable for the purpose of the present invention to use a mixed solvent of purified water and ethanol.

상기 추출 용매의 양은 세발나물 중량대비 10 내지 100배가 이용될 수 있고, 바람직하게는 20 내지 80배가 이용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 30 내지 50배가 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The amount of the extraction solvent may be 10 to 100 times, preferably 20 to 80 times, and more preferably 30 to 50 times, based on the weight of the extract, but is not limited thereto.

상기 세발나물 추출물을 추출하는 방법은 교반 추출, 냉침 추출, 열수 추출, 침지 추출, 초임계 추출, 아임계 추출, 고온 추출, 고압 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 가온하여 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하다. 추출 시 온도는 10 내지 30℃인 것이 바람직하고, 상기 추출 시간은 1일 내지 20일인 것이 바람직하며, 1 내지 5일인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.Examples of the method for extracting the extract from the herbal extract include conventional extraction methods such as stirring, cold extraction, hot water extraction, immersion extraction, supercritical extraction, subcritical extraction, high temperature extraction, high pressure extraction, May be used, and it is preferable to heat and reflux or extract at room temperature. The extraction temperature is preferably 10 to 30 ° C, and the extraction time is preferably 1 to 20 days, more preferably 1 to 5 days, but is not limited thereto.

더욱 구체적으로, 세발나물을 음건하여 분쇄한 후, 추출용매를 세발나물 분쇄물의 1 내지 20배 부피량 만큼 가하여 추출하고 나서, 선택적으로 (감압)농축, 건조 또는 정제 과정을 거쳐 제조할 수 있다. 보다 구체적으로, 전술한 방법과 같이 추출용매를 가하여 유효성분물질을 추출하되 (a) 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50 내지 100℃의 온도 조건에서 1 내지 20시간 가열하여 추출하거나, (b) 5 내지 37℃의 온도 조건에서 1 내지 15일간 침적시켜 유효성분을 추출할 수 있다. More specifically, the extract can be prepared by shredding shredded herbs, extracting the extracting solvent by adding 1 to 20 times the volume of the shredded herbal extract, and then extracting (concentrating) the concentrate, drying or refining selectively. More specifically, an extraction solvent is added to extract an active ingredient substance as in the above-mentioned method, (a) heating at a temperature of 50 to 100 ° C for 1 to 20 hours in a state where a cooling condenser is installed to prevent evaporation of the solvent, (B) immersing the mixture at a temperature of 5 to 37 DEG C for 1 to 15 days to extract the active ingredient.

또한, 본 발명에 따른 상기 장 내분비세포 활성화를 위한 세발나물 추출물은, 바람직하게는, 세발나물 추출물의 분획물일 수 있다.In addition, the coryneb herb extract for the intestinal endocrine cell activation according to the present invention may be preferably a fraction of the corynebacterium extract.

본 발명의 세발나물 분획물은 상기 세발나물 추출물(바람직하게는 탄소수 1-4의 저급 알코올 추출물)을 헥산, 클로로포름, 부탄올 및 에틸 아세테이트와 같은 물보다 극성이 낮은 용매로 분획하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 헥산 또는 클로로포름을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.The cevanothial fractions of the present invention can be obtained by fractionating the cefnitol extract (preferably a lower alcohol extract having 1 to 4 carbon atoms) with a solvent having a polarity lower than that of water such as hexane, chloroform, butanol and ethyl acetate, But is not limited to, hexane or chloroform.

특히, 본 발명에 따른 효과를 달성한다는 목적에서 본 발명에 따른 세발나물 추출물은 탄소수 1-4의 저급 알코올 추출물의 헥산 또는 클로로포름 분획물인 것이 바람직하다.Particularly, for the purpose of achieving the effect of the present invention, the extract of T. donegulis according to the present invention is preferably a hexane or chloroform fraction of a lower alcohol extract having 1-4 carbon atoms.

상기 분획물은 건조시키기 전의 액상 상태의 세발나물 추출물을 이용하거나 건조된 세발나물 추출물을 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 등 적당한 용매에 현탁 또는 용해시킨 후, 헥산, 클로로포름, 부탄올 또는 에틸 아세테이트와 같은 물보다 극성이 낮은 용매를 순차적으로 첨가하여 각각의 층을 분리한 다음 각 층을 감압 농축 및/또는 건조시켜 수득할 수 있다.The fractions may be prepared by suspending or dissolving the extract of cedar-herb extract in a liquid state before drying or drying the extracted extract of cedar-herb extract in a suitable solvent such as water, ethanol or a mixed solvent thereof, and then dissolving the extract in water such as hexane, chloroform, butanol or ethyl acetate A solvent having a lower polarity may be sequentially added to separate each layer, and then each layer may be obtained by concentration under reduced pressure and / or drying.

이때, 상기 감압 농축은 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. At this time, the vacuum concentration is preferably performed using a vacuum rotary evaporator, but not limited thereto.

또한, 본 발명에 따른 “건조”는 감압 건조, 진공 건조, 비등 건조, 분무 건조, 상온 건조 또는 동결 건조일 수 있으나, 동결 건조를 하는 것이 더욱 바람직하다. 다만 본 발명은 이러한 건조 방법에 한정되지 않는다.In addition, " drying " according to the present invention may be vacuum drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying, room temperature drying or freeze-drying, However, the present invention is not limited to this drying method.

본 발명에 따른 세발나물의 추출물은 글루카곤 유사 펩타이드-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1, GLP-1-(7-36) amide), 콜레시스토키닌(Cholecystokinin (CCK)), 세레토닌(Serotonin, 5-hydroxytryptamine, 5-HT) 등과 같은 장 호르몬 및/또는 신경펩타이드를 분비하는 장 내분비세포를 활성화시켜 상기 장 호르몬 및/또는 신경펩타이드의 분비를 촉진시키는 것을 발견하게 되었다. The extracts of Tetranych japonica according to the present invention can be used in combination with glucagon-like peptide-1, GLP-1, GLP-1- (7-36) amide, cholecystokinin (CCK), seretonin Serotonin, 5-hydroxytryptamine, 5-HT), and the like, thereby stimulating the secretion of the endocrine hormone and / or neuropeptide.

따라서, 본 발명은 세발나물 추출물이 장 호르몬 및 신경펩타이드의 분비를 촉진시켜, 활성화된 장 호르몬 및/또는 신경 펩타이드에 의해 항비만 효과, 심장 기능 향상 효과, 소화 및 흡수 장애 개선 효과, 신경보호 작용 효과, 동맥경화증 개선 또는 간질환 치료 또는 개선 효과 등을 갖는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.Accordingly, the present invention relates to a method for preventing or treating neuroprotective effects, which comprises the step of stimulating the secretion of endocrine hormones and neuropeptides, Effect, improvement of arteriosclerosis or treatment or improvement of liver disease, etc., can be provided.

또한, 본 발명은 세발나물 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만 또는 식욕 억제용, 심장질환 예방 또는 개선용, 소화 및 흡수 장애 개선용, 동맥경화증 개선용 또는 신경보호용, 및/또는 간질환 치료 또는 개선용 식품 조성물을 제공할 수 있다.The present invention also relates to a method for preventing or ameliorating heart diseases or diseases, for improving digestive or absorption disorders, for improving arteriosclerosis or for nerve protection, and / or for treating liver diseases, A food composition for improvement can be provided.

즉, 본 발명에 따른 상기 조성물은 의약품, 건강 보조 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 등에 이용될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. That is, the composition according to the present invention can be used for medicines, health supplements, food additives, feed additives, and the like, but is not limited thereto.

본 발명의 약학적 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical compositions of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the manufacture of medicaments. The pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated in the form of oral, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol or the like oral preparation, external preparation, suppository and sterilized injection solution according to a conventional method Can be used. Examples of carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium Silicates, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, (sucrose), lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to water and liquid paraffin, simple diluents commonly used, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included . Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin and the like.

보다 구체적으로, 예를 들어, 산제는 본 발명의 추출물과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 추출물; 약제학적으로 허용되는 적당한 부형제; 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약제학적으로 허용되는 적당한 활택제화 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다.More specifically, for example, powders can be prepared by simple mixing of an extract of the present invention with an appropriate pharmaceutically acceptable excipient such as lactose, starch, microcrystalline cellulose and the like. The granule is an extract of the present invention; Suitable excipients which are pharmaceutically acceptable; And a suitable pharmaceutically acceptable binder such as polyvinylpyrrolidone and hydroxypropylcellulose, followed by wet granulation using a solvent such as water, ethanol or isopropanol or dry granulation using a compressive force . Further, the tablet may be prepared by mixing the above granule with a suitable pharmaceutically acceptable salt such as magnesium stearate and then tableting it using a tablet machine.

본 발명의 세발나물 조성물은 치료해야할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약제학적으로 허용되는 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다. 일정 시간 동안 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 데포(depot) 제형 또한 본 발명의 범위에 포함된다.The ceviri herb composition of the present invention can be administered orally or parenterally depending on the disease to be treated and the condition of the subject, an injection (for example, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, infusion, subcutaneous injection, implant) , Rectal, rectal, sublingual, transdermal, topical, and the like, but is not limited thereto. May be formulated into suitable dosage unit formulations, including those conventionally used and non-toxic, pharmaceutically acceptable carriers, additives, vehicles according to the route of administration. Depot formulations that are capable of sustained release of the drug over a period of time are also within the scope of the present invention.

항비만, 식욕 억제, 소화흡수장애 개선, 심장질환 개선, 신경보호 작용 또는 간질환 치료 효과라는 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 세발나물 추출물은 매일 약 0.001 mg/kg 내지 약 10 g/kg이 투여될 수 있으며, 약 0.01 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 1일 투여 용량이 바람직하다. 그러나 상기 투여량은 세발나물 추출물의 정제 정도, 환자의 상태(연령, 성별, 체중 등), 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량이 나누어지고 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다.In order to achieve the object of the present invention, which is an anti-obesity, an appetite suppression, improvement of digestive absorption disorder, improvement of heart disease, neuroprotective action or treatment of liver disease, the extract of Tricholoma extract according to the present invention is about 0.001 mg / kg to about 10 g / kg can be administered, and a daily dosage of about 0.01 mg / kg to about 1 g / kg is preferred. However, the above dosage may vary depending on the degree of purification of the extract of the herbal extract, the condition of the patient (age, sex, weight, etc.), severity of the condition being treated and the like. For convenience, the total daily dose may be divided as needed and divided into several doses throughout the day.

본 발명의 세발나물 추출물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 세발나물 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.When the extract of the present invention is used as a food composition, the kind of the food is not particularly limited. Examples of the food to which the extract can be added include a dairy product including a drink, a meat, a sausage, a bread, a biscuit, a rice cake, a chocolate, a candy, a snack, a confectionery, a pizza, a ramen, Soups, beverages, alcoholic beverages, and vitamin complexes, all of which include health foods in a conventional sense.

본 발명의 세발나물 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.The extract of Tricholoma herb extract of the present invention can be added directly to the food or can be used together with other food or food ingredients, and can be suitably used according to a conventional method. The amount of the active ingredient to be mixed can be suitably determined according to its use purpose (for prevention or improvement). Generally, the amount of the extract in the food may be added in an amount of 0.01 to 50% by weight of the whole food. However, in the case of long-term consumption intended for health or hygiene purposes or for health control purposes, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount exceeding the above range.

본 발명에 따른 식품 조성물 중 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 세발나물 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. The health functional beverage composition of the food composition according to the present invention has no particular limitation on the other components other than the above-mentioned extract of cedar herb extract as an essential ingredient in the indicated ratios, and various flavors or natural carbohydrates, . Examples of such natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. The flavoring agent may be a natural flavoring agent (tau martin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavorings (for example, saccharin and aspartame).

본 발명의 세발나물 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. The extract of Tricholoma herbaceousum of the present invention can be used as a flavoring agent such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavies (cheese, chocolate etc.), pectic acid and its salts, Salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated beverages and the like.

본 발명은 또한 상기 세발나물 추출물의 치료학적으로 유효한 양 또는 건강 개선을 위해 유효한 양을 치료 또는 상태 개선이 필요한 환자 또는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 항비만, 식욕 억제, 심장질환 예방 또는 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 신경보호 작용 및/또는 간질환 치료 또는 개선 방법을 제공한다. The present invention also relates to a method for preventing or ameliorating an anti-obesity, an appetite suppression, a cardiac disease, or an inflammation, comprising administering to a patient or an individual in need thereof a therapeutically effective amount or an amount effective for improving health, And improvement of absorption disorder, neuroprotective action, and / or treatment or improvement of liver disease.

즉, 본 발명은 세발나물 추출물의 항비만, 식욕 억제, 심장질환 예방 또는 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 및/또는 간질환 치료 또는 개선 효과를 갖는 의약 또는 건강기능식품 용도를 제공한다.That is, the present invention provides a medicinal or health functional food having anti-obesity, appetite suppression, prevention or improvement of heart disease, improvement of digestion and absorption disorder, improvement of arteriosclerosis, neuroprotection and / It provides usages.

본 발명은 세발나물 추출물의 항비만 또는 식욕 억제, 심장질환 예방 또는 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 및/또는 간질환 치료 또는 개선 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 식품 조성물은 천연 추출물을 이용하여 부작용이 적고 안전하며, 항비만 또는 식욕 억제, 심장질환 예방 또는 개선, 소화 및 흡수 장애 개선, 동맥경화증 개선, 신경보호 작용 및/또는 간질환 치료 또는 개선 효과가 탁월하다.The present invention provides anti-obesity or appetite suppression, prevention or improvement of heart disease, improvement of digestion and absorption disorder, improvement of arteriosclerosis, neuroprotection, and / or treatment or improvement of liver disease. The pharmaceutical composition or food composition according to the present invention can be used as a medicinal composition or a food composition which is safe and low in side effects using natural extracts, and can be used as an anti-obesity or appetite suppressant, prevention or improvement of heart disease, improvement of digestive and absorption disorders, improvement of arteriosclerosis, The effect of treating or improving liver disease is excellent.

도 1은 세발나물 추출물 투여에 의한 Caudal DVC(Dorsal vagal comlpex)에서의 c-Fos 활성화를 나타낸 사진이다.
도 2는 세발나물 추출물 투여에 의한 Arcuate nucleus in hypothalamus(ARC)에서의 c-Fos 활성화를 나타낸 사진이다.
FIG. 1 is a photograph showing c-Fos activation in Caudal DVC (Dorsal vagal comlpex) by the administration of the extract of Corydalis oryzae.
FIG. 2 is a photograph showing the activation of c-Fos in the arcuate nucleus in hypothalamus (ARC) by administration of the extract of cedarwood herb.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail to facilitate understanding of the present invention. However, the embodiments according to the present invention can be modified into various other forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following embodiments. Embodiments of the invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.

<실시예 1> 세발나물 추출물 및 이의 분획물의 제조&Lt; Example 1 > Preparation of extract of cedarciferol and its fractions

추출물 제조 방법Method of manufacturing extract

본 실험에 사용된 세발나물[Spergularia marina (L.) Griseb]의 뿌리를 제외한 전초는 전라남도 해남군에서 구입하였다. 먼저 시료를 동결 건조시킨 후 마쇄하여 시료 1g에 50 중량% 에탄올 40 mL을 가하고 상온에서 3일 간 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No. 1, England)를 사용하여 2회 여과하고 회전감압 농축기(B-480, Buchi, Switzerland)로 농축한 후 다시 동결건조를 한 후 분말화하여 본 실험의 시료로 사용하였다. Outposts except for the roots of Spergularia marina (L.) Griseb used in this experiment were purchased from Haenam county, Jeollanam - do. First, the sample was lyophilized and then ground. 40 ml of 50% by weight ethanol was added to 1 g of the sample, and the mixture was extracted at room temperature for 3 days. The extract was filtered twice using a filter paper (Whatman No. 1, England), concentrated using a rotary evaporator (B-480, Buchi, Switzerland), lyophilized again, and powdered to give a sample .

분획물 제조 방법Fraction production method

50% 에탄올 추출물을 물에 용해한 후 물보다 극성이 낮은 용매(헥산, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부탄올)를 이용하여 순차적으로 분획 후 각각 농축하고 동결건조 함으로써 각 용매를 이용한 분획물을 얻었다.
The 50% ethanol extracts were dissolved in water and then sequentially fractionated using a solvent (hexane, ethyl acetate, chloroform, butanol) having a polarity lower than that of water, concentrated and lyophilized to obtain fractions using each solvent.

이하에서는, 상기 방법으로 얻어진 세발나물 추출물 및 이의 분획물이 장 호르몬 또는 신경펩타이드 분비에 효과적임을 보여주는 실험 및 그 결과를 나타내었다.
Hereinafter, experiments showing the results of the experiments showing that the extracts of cyanogen bromide and its fractions obtained by the above method are effective for the secretion of endocrine hormones or neuropeptides, and the results are shown.

<실시예 2> NCI-H716 세포를 이용한 GLP-1 분비자극, GPR119 활성화 실험Example 2 GLP-1 secretion stimulation using NCI-H716 cells, GPR119 activation experiment

1) 세포배양1) Cell culture

인체 유래 세포주인 NCI-H716 cells는 ATCC (the American Type Culture Collection (Manassas, VA))으로부터 구입하였다. 세포는 10% 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100IU/ml 페니실린, 100/ml 스트렙토마이신이 함유된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.Human-derived cell lines, NCI-H716 cells, were obtained from the American Type Culture Collection (Manassas, Va.). Cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicillin, 100 / ml streptomycin.

2) 시료의 GLP-1 분비 작용 측정 방법2) Determination of GLP-1 secretion effect of sample

NCI-H716 세포를 2 x 105 cells/mL의 농도로 96-well plate에 3일간 배양하였다. 실험 당일, 세포는 phosphated buffered saline(PBS)로 수세과정을 거친 뒤, Krebs-Ringer bicarbonate buffer (KRB, 128.8mmol/l NaCl, 4.8mmol/l KCl, 1.2mmol/l KH2PO4, 1.2mmol/l MgSO4, 2.5 mmol/l CaCl2, 5mmol/l NaHCO3, 및 10mmol/l HEPES, 0.2% BSA, pH 7.4)에서 시료를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 1시간 배양 후 GLP-1 분석을 위하여 상층액을 취하고(100μL), GLP-1 활성 ELISA 키트(EGLP-35K, Millipore)에 의하여 분석하였다. GLP-1의 농도는 공급된 GLP-1 표준물질에 준하여 (pmole/mL) 계산되었으며, 결과는 시료의 자극에 의해 분비된 GLP-1의 농도를 대조군의 자극에 의해 분비된 농도와 비교하여 fold of control로 나타내었다.NCI-H716 cells were cultured in 96-wells at a concentration of 2 x 10 &lt; 5 &gt; cells / plate for 3 days. On the day of the experiment, the cells were rinsed with phosphate-buffered saline (PBS), washed with Krebs-Ringer bicarbonate buffer (KRB, 128.8 mmol / l NaCl, 4.8 mmol / l KCl, 1.2 mmol / l KH 2 PO 4 , 1.2 mmol / 1 mM MgSO 4 , 2.5 mmol / l CaCl 2 , 5 mmol / l NaHCO 3 , and 10 mmol / l HEPES, 0.2% BSA, pH 7.4) and incubated at 37 ° C for 1 hour. After 1 hour incubation, the supernatant was collected (100 μL) for GLP-1 analysis and analyzed by GLP-1 activity ELISA kit (EGLP-35K, Millipore). The concentration of GLP-1 was calculated according to the supplied GLP-1 standard (pmole / mL), and the result was compared with the concentration secreted by stimulation of GLP-1 secreted by the stimulus of the sample, of control.

3) 세포내 칼슘 농도 변화 측정 방법3) Measurement of changes in intracellular calcium concentration

세포내 칼슘의 변화를 살펴보기 위하여 형광-기반 에세이(Fluorescence-based assay) 방법을 이용하였다. 96-well plate에 4.0 x104 cells/well의 농도로 세포를 분취한 후 48 시간 후 Molecular device에서 구입한 칼슘-5 에세이 키트(Calcium-5 assay kit)를 사용하여 Fluorometric imaging plate reader (FLIPRTM)인 Flexstation III (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 세포내 Ca2+ 농도를 측정하였다. 즉 시료를 주입한 후 120초간 칼슘이 염색되어 나오는 형광을 파장 488nm (excitation)과 525 (emmision)에서 측정하였으며, 결과는 최대 형광치(maximum fluorescent value) - 최소 형광치(minimum fluorescent value) = 상대 형광 단위(delta relative fluorescent units (ΔRFU))로 자동으로 계산되었다. Fluorescence-based assay was used to examine changes in intracellular calcium. Cells were collected at a concentration of 4.0 × 10 4 cells / well in a 96-well plate. Fluorometric imaging plate reader (FLIPR ) was prepared using a calcium-5 assay kit purchased from Molecular Devices, Intracellular Ca 2+ concentration was measured using Flexstation III (Molecular Devices Co., Sunnyvale, Calif., USA). Fluorescence intensity of calcium stained for 120 seconds after injection of sample was measured at 488 nm excitation and 525 emmision. The results were as follows: maximum fluorescence value - minimum fluorescence value = relative fluorescence value And was automatically calculated as a fluorescence unit (delta relative fluorescent units (? RFU)).

특정 성분이 GPCRs를 활성화시키면 GPCRs과 연결된 G protein complex (Gα-gustducin, Gα-transtducin, Gα14, Gβ3, Gβ1, Gγ13)가 활성화되고, 이는 phospholipase 를 활성화시켜서 type Ⅲ IP3-receptor를 활성화시키게 되고, 세포질 (cytoplasm) 내에 Ca2 + 농도의 증가를 일으키므로 상기 세포내 Ca2 + ion 농도 변화를 측정하는 방법을 통하여 GPCRs의 활성화를 측정할 수 있을 것으로 판단하였다. Activation of the GPCRs activates the G protein complex (Gα-gustducin, Gα-transtducin, Gα14, Gβ3, Gβ1, Gγ13), which activates the phospholipase to activate the type Ⅲ IP3-receptor, it is possible to measure the activation of GPCRs by measuring the change of intracellular Ca 2 + ion concentration because it causes an increase of Ca 2 + concentration in cytoplasm.

또한, TRP channels이 활성화되면 세포막 바깥의 칼슘 이온이 세포내로 들어오게 되므로, 세포내 Ca2 + ion 의 농도를 측정함으로써 TRP channels의 활성화를 측정할 수 있을 것으로 생각된다.In addition, when TRP channels are activated, the calcium ions outside the cell membrane enter the cell, so that the measurement of the intracellular Ca 2 + ion concentration may be able to measure the activation of TRP channels.

4) cAMP 측정 방법4) cAMP measurement method

NCI-H716 세포주는 1 x 106 cells/mL의 농도로 24-well culture plate에 분취한 후 3일간 배양하였다. 실험 당일 시료와 함께 KRB 버퍼 안에서 37℃ in 5% CO2 배양기에서 배양되었으며, 반응된 배지는 제거하고 세포는 KRB 버퍼로 3회 수세과정을 거친 뒤 0.1N HCl 0.5mL을 넣고 150 rpm, 상온에서 20분간 반응시켰다. 반응된 세포는 1000g에서 10분 동안 원심분리 과정을 거쳐 상층액을 얻고 바로 효소 면역분석법(EIA, enzyme immunoassay)을 이용한 cyclic AMP kit를 이용하였다.NCI-H716 cell line in 24-well 1 x 10 6 cells / mL concentration of culture and then cultured for 3 days. In the KRB buffer at 37 ° C in 5% CO 2 The cells were washed three times with KRB buffer, and then 0.5 mL of 0.1 N HCl was added and the cells were reacted at 150 rpm for 20 minutes at room temperature. The reacted cells were centrifuged at 1000 g for 10 minutes, and the supernatant was obtained. The cyclic AMP kit using enzyme immunoassay (EIA) was used.

5) siRNA 트랜스펙션(transfection)에 의한 유전자 기능 억제(gene knock-down)5) gene knock-down by siRNA transfection

인간 α-gustducin 타겟 siRNA 시퀀스(siRNA sequence targeting human α-gustducin)(GNAT3, accession no. NM 001102386, Dharmacon on-target SMARTpool siRNA reagent), GPR119 (taste receptor, type 2, member 38/GeneBank accession no. NM_176817), non-target SMARTpool siRNA는 Dharmacon (Lafayette, CO)사로부터 구입하였다. NCI-H716의 siRNA 처리는 NeonTM transfection system (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 각 농도별로 48시간 트렌스펙션 한 후 GLP-1분비, Ca2 + 농도, cAMP를 측정하였다. Human α-gustducin target siRNA sequence (GNAT3, accession No. NM 001102386, Dharmacon on-target SMARTpool siRNA reagent), GPR119 (taste receptor, type 2, member 38 / GeneBank accession no. NM_176817 ) and non-target SMARTpool siRNA were purchased from Dharmacon (Lafayette, CO). SiRNA treatment of NCI-H716, after 48 hours trans peksyeon for each concentration using the Neon TM transfection system (Invitrogen, Carlsbad , CA) were determined for GLP-1 secretion, Ca 2 + concentrations, cAMP.

6) 결과6) Results

GLP-1과 cAMP의 농도는 EIA 방법에 따라 실시하였다. 세포내 칼슘 농도 변화는 상대 형광 단위(△RFU)로 표현하였다. 모든 값은 triplicate로 실험한 3회 반복 실험으로 mean ± S.E.M (n=9)으로 나타내었다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001 vs control (대조군)
The concentrations of GLP-1 and cAMP were determined according to the EIA method. Changes in intracellular calcium concentration were expressed in relative fluorescence units (ΔRFU). All values were expressed as mean ± SEM (n = 9) in triplicate experiments. * p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; *** p <0.001 vs control (control group)

2-1. 2-1. NCINCI -- H716H716 세포에서  In a cell 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물의  Of 50% ethanol extract GLPGLP -1 분비 효과-1 secretion effect

시료sample 농도density GLP-1 분비 효과
(fold of control)
GLP-1 secretion effect
(fold of control)
대조군Control group 1.000 ± 0.1621.000 ± 0.162 세발나물(50% 에탄올 추출물)Three-legged herbs (50% ethanol extract) 100 μg/mL100 μg / mL 1.616 ± 0.221*1.616 + 0.221 * 250 μg/mL250 μg / mL 5.480 ± 0.312***5.480 ± 0.312 *** 500 μg/mL500 μg / mL 7.337 ± 0.431***7.337 ± 0.431 ***

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 세발나물(50% 에탄올 추출물)은 NCI-H716 세포에서 농도 의존적으로 GLP-1 분비효과가 있음을 알 수 있었다.As shown in the above Table 1, it was found that the secretion of GLP-1 in the concentration-dependent manner in NCI-H716 cells was found to be effective in the secretion of 50% ethanol.

이로부터 상기 추출물은 신경변성(Neurodegenerative) 질환 및 뇌혈관(cerebrovascular) 질환을 치료하고, 신경세포 염증(Neuroinflammation)을 치료하고, 신경 조직 발생(Neurogenesis) 증진 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다. From this, it is thought that the above extract can be expected to treat neurodegenerative diseases and cerebrovascular diseases, treat neuroinflammation, and enhance neurogenesis.

그리고, 간 염증(Hepatic inflammation) 감소 효과, 장간 혈액순환(enterohepatic blood flow) 증진효과, 간 기능 개선 효과, cholestatic liver diseases 치료 효과, 소양병 (搔痒病; pruritus) 및 무통증 황달 (painless jaundice) 치료 효과, 장 기능 (intestinal functions) 개선 효과, 신경전달 반응 촉진 효과를 기대할 수 있어 간질환 개선에 유용할 것으로 생각된다. In addition, it has been shown that treatment of hepatic inflammation, enhancement of enterohepatic blood flow, improvement of liver function, treatment of cholestatic liver diseases, treatment of pruritus and painless jaundice , Intestinal functions, and neurotransmitter - stimulating effects, which may be useful for the improvement of liver disease.

뿐만 아니라, 상기 추출물은 동맥경화증 개선에도 효과적일 것으로 생각된다.
In addition, the extract is believed to be effective in improving arteriosclerosis.

2-2. 2-2. NCINCI -- H716H716 세포에서  In a cell 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물의  Of 50% ethanol extract 세포내Intracellular CaCa 22 ++ 농도 변화 Concentration change

시료sample 농도density Ca2 + 농도 변화(ΔRFU)Ca 2 + concentration change (ΔRFU) 대조군Control group 6.491 ± 0.1336.491 + 0.133 세발나물(50% 에탄올 추출물)Three-legged herbs (50% ethanol extract) 100 μg/mL100 μg / mL 14.453 ± 2.606*14.453 + - 2.606 * 250 μg/mL250 μg / mL 19.791 ± 2.148**19.791 ± 2.148 ** 500 μg/mL500 μg / mL 25.701 ± 2.233**25.701 ± 2.233 **

표 2에 나타난 결과에 따르면, 세포에서 세발나물 50% 에탄올 추출물 100, 250, 500μg/mL은 대조군에 비하여 유의적으로 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 것으로 나타났다. 세포 내 칼슘 농도가 증가했다는 것은 GPCRs의 활성화로 칼슘 이온이동이 활발해진 것으로 생각되며, 따라서, 세발나물 추출물은 GPCRs를 활성화시켜 GLP-1 분비를 증가시키고 비만에 효과적일 것으로 생각된다.
According to the results shown in Table 2, the extracts of 100%, 250 and 500 μg / ml of the extracts of the 50% ethanol extract of cells showed a significant increase in intracellular calcium concentration compared to the control. The increase of intracellular calcium concentration seems to be activated by the activation of GPCRs. Therefore, it seems that the extract of Trichophyton spp. Activates GPCRs and increases GLP-1 secretion and is effective for obesity.

2-3. 2-3. NCINCI -- H716H716 세포에서  In a cell 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물의  Of 50% ethanol extract 세포내Intracellular cAMPcAMP 증가 효과 Increase effect

시료sample 농도density cAMP(fold of control)cAMP (fold of control) 대조군Control group 1.000 ± 0.1921.000 ± 0.192 세발나물(50% 에탄올 추출물)Three-legged herbs (50% ethanol extract) 500μg/mL500 μg / mL 9.986 ± 2.224***9.986 ± 2.224 *** OEA (oleoylethanolamide)OEA (oleoylethanolamide) 20μM20 μM 6.813 ± 1.634*6.813 + - 1.634 *

상기 표 3에 나타난 바와 같이 대조군에 비해서 세발나물(50% 에탄올 추출물)은 세포내 cAMP 증가에 효과가 있는 것으로 나타났다. 즉, 칼슘농도와 관련이 높은 cAMP 농도를 측정하여 세발나물 추출물이 GLP-1 분비 증가에 영향을 미쳐 항비만 효과, 식욕억제 효과, 심장질환 개선 효과, 소화 장애 및 흡수 장애 개선 효과 등을 보일 것으로 생각되었다.
As shown in the above Table 3, the extracts of Tb (50% ethanol extract) showed an effect on the increase of intracellular cAMP compared to the control group. In other words, by measuring the cAMP concentration which is highly related to the calcium concentration, the extract of cedar herb extract affects the increase of GLP-1 secretion, and it will show the anti-obesity effect, the appetite suppression effect, the improvement of the heart disease, Thought.

2-4. 2-4. NCINCI -- H716H716 세포에서  In a cell 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물의 5가지  5 kinds of 50% ethanol extract 분획별By fraction GLPGLP -1 분비 효과-1 secretion effect

농도density 분획물Fraction GLP-1 분비 (fold of control)GLP-1 secretion (fold of control) 대조군Control group 1.000 ± 0.068 1.000 ± 0.068 500μg/mL500 μg / mL 세발나물(50% 에탄올 추출물)Three-legged herbs (50% ethanol extract) 7.337 ± 0.431***7.337 ± 0.431 *** 헥산층Hexane layer 8.712 ± 0.246 ***8.712 + - 0.246 *** 클로로포름층Chloroform layer 11.575± 0.222 ***11.575 ± 0.222 *** 에틸 아세테이트층Ethyl acetate layer 4.650 ± 0 .558 *4.650 ± 0.558 * 부탄올층Butanol layer 6.334 ± 0.875 **6.334 + 0.875 ** H2O 층H 2 O layer 4.395 ± 0.671 *4.395 + 0.671 *

상기 표 4에 나타난 결과에 따르면, 세발나물 헥산 분획층 및 클로로포름 분획층은 세발나물 추출물(50% 에탄올 추출물)에 비하여 더 우수한 GLP-1 분비 효과를 보임을 알 수 있었다. According to the results shown in Table 4, it was found that the hexane fraction and chloroform fraction of cevan herb extract showed better GLP-1 secretion effect than the extract of cervical herb extract (50% ethanol extract).

이로부터 상기 추출물은 신경변성(Neurodegenerative) 질환 및 뇌혈관(cerebrovascular) 질환을 치료하고, 신경세포 염증(Neuroinflammation)을 치료하고, 신경 조직 발생(Neurogenesis) 증진 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다. From this, it is thought that the above extract can be expected to treat neurodegenerative diseases and cerebrovascular diseases, treat neuroinflammation, and enhance neurogenesis.

그리고, 간 염증(Hepatic inflammation) 감소 효과, 장간 혈액순환(enterohepatic blood flow) 증진효과, 간 기능 개선 효과, cholestatic liver diseases 치료 효과, 소양병 (搔痒病; pruritus) 및 무통증 황달 (painless jaundice) 치료 효과, 장 기능 (intestinal functions) 개선 효과, 신경전달 반응 촉진 효과를 기대할 수 있어 간질환 개선에 유용할 것으로 생각된다. In addition, it has been shown that treatment of hepatic inflammation, enhancement of enterohepatic blood flow, improvement of liver function, treatment of cholestatic liver diseases, treatment of pruritus and painless jaundice , Intestinal functions, and neurotransmitter - stimulating effects, which may be useful for the improvement of liver disease.

뿐만 아니라, 상기 추출물은 동맥경화증 개선에도 효과적일 것으로 생각된다.
In addition, the extract is believed to be effective in improving arteriosclerosis.

2-5. α-2-5. α- gustducingustducin siRNAsiRNA in 처리 된Treated NCINCI -- H716H716 세포에서  In a cell 세발나물에On three-legged herbs 의한  by GLPGLP -- 1 의1 of 영향 effect

시료sample 농도density GLP-1 분비(fold of control)GLP-1 secretion (fold of control) 저해율(%)Inhibition rate (%) control-siRNAcontrol-siRNA α-gustducin siRNAα-gustducin siRNA 대조군Control group 1.000 ± 0.108 1.000 ± 0.108 1.000 ± 0.197 1.000 ± 0.197 00 세발나물
(50% 에탄올 추출)
Three-legged herbs
(50% ethanol extraction)
100μg/mL100 μg / mL 1.248 ± 0.304 1.248 + 0.304 0.301 ± 0.084 *0.301 0.084 * 75.85 75.85
250μg/mL250 μg / mL 3.739 ± 1.159 3.739 + 1.159 0.460 ± 0.110** 0.460 ± 0.110 ** 87.69 87.69 500μg/mL500 μg / mL 5.994 ± 0.323 5.994 + 0.323 3.338 ± 0.220 **3.338 + - 0.220 ** 44.31 44.31 포도당glucose 500mM500 mM 6.386 ± 0.327 6.386 0.327 1.363 ± 0.320 ***1.363 ± 0.320 *** 78.6578.65

± S.E.M (n=9) ; *p<0.05; **p<0.01; ***P<0.001 vs 대조군 siRNA
± SEM (n = 9); * p &lt;0.05; ** p < 0.01; *** P <0.001 vs control siRNA

상기 결과에 따르면, 세포를 α-gustducin-targeted siRNA로 트렌스펙션 시키면 α-gustducin 유전자가 기능상실(knock-down)된다. 이 조건에서는 세발나물 50% 에탄올 추출물의 GLP-1 분비 효과가 유의적으로 저해되는 결과로부터 세발나물 50% 에탄올 추출물은 α-gustducin 활성화 제제로 작용한다고 판단하였다.
According to the above results, when the cells are transfected with α-gustducin-targeted siRNA, the α-gustducin gene is knocked down. In this condition, GLP-1 secretion was significantly inhibited by the 50% ethanol extract of Trifolium extract. The 50% ethanol extract of Trifolium herb extract acted as α-gustducin activator.

2-6. 2-6. GPR119GPR119 siRNAsiRNA in 처리 된Treated NCINCI -- H716H716 세포에서  In a cell 세발나물에On three-legged herbs 의한  by GLPGLP -1 분비의 영향Influence of -1 secretion

시료sample 농도density GLP-1분비(fold of control)GLP-1 secretion (fold of control) 저해율(%)Inhibition rate (%) control-siRNAcontrol-siRNA GPR119 siRNAGPR119 siRNA 대조군Control group 1.000 ± 0.0621.000 + 0.062 1.033 ± 0.0541.033 + - 0.054 세발나물
(50% 에탄올 추출)
Three-legged herbs
(50% ethanol extraction)
10μg/mL10 μg / mL 2.840 ± 0.0822.840 + 0.082 1.354 ± 0.2351.354 + 0.235
50μg/mL50 μg / mL 3.098 ± 0.0223.098 + 0.022 1.681 ± 0.5671.681 + - 0.567 100μg/mL100 μg / mL 3.829 ± 0.2783.829 + 0.278 2.094 ± 0.1722.094 + 0.172 250μg/mL250 μg / mL 4.401 ± 0.1074.401 + - 0.107 2.559 ± 0.303**2.559 + - 0.303 ** 41.85341.853 500μg/mL500 μg / mL 4.767 ± 0.3074.767 + 0.307 2.948 ± 0.216**2.948 ± 0.216 ** 38.15238.152 OEA (oleoylethanolamide)OEA (oleoylethanolamide) 20μM20 μM 4.822 ± 0.3584.822 + 0.358 2.975 ± 0.241**2.975 + - 0.241 ** 38.30338.303

± S.E.M (n=9) ; *p<0.05; **p<0.01; ***P<0.001 vs 대조군 siRNA
± SEM (n = 9); * p &lt;0.05; ** p < 0.01; *** P <0.001 vs control siRNA

세포를 GPR119-타겟 siRNA로 트렌스펙션 시키면 GPR119 유전자가 기능상실(knock-down)된다. 이 조건에서는 세발나물 50% 에탄올 추출물의 GLP-1 분비 효과가 유의적으로 저해되는 결과로부터 세발나물 50% 에탄올 추출물은 GPR119 작용제 (agonists)로 작용한다고 판단하였다.
Transfection of the cells with GPR119-targeted siRNAs results in knock-down of the GPR119 gene. In this condition, GLP-1 secretion was significantly inhibited by the 50% ethanol extract of Trifolium extract. Therefore, it was concluded that 50% ethanol extract of Trifolium extract acted as GPR119 agonists.

GPR119는 신호전달 분자로서 cAMP 생성과 관련 있으므로 cAMP 생성에 미치는 효과도 실험하였다.
GPR119 is involved in the production of cAMP as a signaling molecule and thus its effect on cAMP production was also examined.

2-7. 2-7. GPR119GPR119 siRNAsiRNA in 처리 된Treated NCINCI -- H716H716 세포에서  In a cell 세발나물에On three-legged herbs 의한  by 세포내Intracellular cAMPcAMP 의 영향Influence of

SampleSample Conc.
(μg/mL)
Conc.
(μg / mL)
cAMP(fold of contrrol)cAMP (fold of contrrol) 저해율(%)Inhibition rate (%)
control-siRNAcontrol-siRNA GPR119 siRNAGPR119 siRNA 대조군Control group 1.000± 0.1921.000 ± 0.192 1.466± 0.1781.466 + 0.178 세발나물
(50% 에탄올 추출)
Three-legged herbs
(50% ethanol extraction)
250μg/mL250 μg / mL 3.046 ± 0.8653.046 0.865 2.331 ± 0.466*2.331 + 0.466 * 23.47323.473
500μg/mL500 μg / mL 9.986 ± 2.2249.986 ± 2.224 5.182 ± 0.641*5.182 + 0.641 * 48.10148.101

± S.E.M (n=9) ; *p<0.05; **p<0.01; ***P<0.001 vs control siRNA± SEM (n = 9); * p &lt;0.05; ** p < 0.01; *** P <0.001 vs control siRNA

상기 표 7에 나타난 바와 같이, 세포를 GPR119-타겟 siRNA로 트렌스펙션 시키면 GPR119 유전자가 기능상실(knock-down)되는 조건에서 세발나물 50% 에탄올 추출물의 cAMP 생성이 유의적으로 저해되는 결과로부터 세발나물 50% 에탄올 추출물은 GPR119로 작용한다고 판단하였다.
As shown in Table 7 above, when the cells were transfected with GPR119-target siRNA, the cAMP production of the 50% ethanol extract of cervical herb was significantly inhibited under the condition that the GPR119 gene was knocked down, The 50% ethanol extract was judged to act as GPR119.

<실시예 3> TGR5 활성 측정<Example 3> Measurement of TGR5 activity

1) 세포배양1) Cell culture

CHO-K1세포는 ATCC (Mnassas, VA)로부터 분양받았으며 10% (v/v) 소 태아 혈청(FBS), 100U/mL 페니실린, 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 함유한 Ham's F-12K 배지에 배양하였다.CHO-K1 cells were cultured in Ham's F-12K medium containing 10% (v / v) fetal bovine serum (FBS), 100 U / mL penicillin, and 100 μg / mL streptomycin, .

2) TGR5 활성 측정2) Measurement of TGR5 activity

hTGR5 plasmid DNA는 G-protein-coupled bile acid receptor 1[Homo sapiens](GPBAR1, TGR5), transfection-ready DNA로서 transcript variant 3는 Origene 사로부터 구입하였으며 vector는 4.5Kb의 pCMV6-XL5이며 insert인 GPBAR1(TGR5)은 1.4 Kb이었다. TGR5 플라스미드를 얻기 위해 일단 100μg/mL 앰피실린(ampicillin)이 포함된 형질전환 E. coli에 증식시킨 후 Invitrogen Purelink(High pure filter maxiprep kit)를 이용하여 플라스미드를 얻었다. TGR5 발현 플라스미드 (pCMV6-XL5/TGR5) 400ng/well을 CHO-K1에 100ng/well CRE-driven luciferase reporter plasmid와 함께 NeonTM (Invitrogen, Cergy Pontoise, France)을 이용하여 트렌스펙션한 후 48시간 후에 5시간 동안 시료를 처리하여 반응시킨 후 dual-gloTM luciferase assay system kit(promega)를 이용하여 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다. 루미네선스(luminescence)는 Victor3TM(PerkinElmer)를 이용하였다.The hTGR5 plasmid DNA was purchased from Origene, Inc. The transcript variant 3 was purchased from Origene Inc., and the vector was pCMV6-XL5 (4.5 kb), and the insert, GPBAR1 (SEQ ID NO: TGR5) was 1.4 Kb. In order to obtain the TGR5 plasmid, plasmids were obtained using Invitrogen Purelink (High pure filter maxiprep kit) after transfection into transformed E. coli containing 100 μg / ml ampicillin. 400 ng / well of TGR5 expression plasmid (pCMV6-XL5 / TGR5) was transfected with CHO-K1 in 100 ng / well CRE-driven luciferase reporter plasmid using Neon (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) after reaction by treating the sample for a time to measure the luciferase activity using a dual-glo TM luciferase assay system kit (promega). Luminescence was obtained using Victor 3 TM (PerkinElmer).

3) 결과3) Results

3-1. 3-1. CHOCHO -- K1K1 세포에  To the cell hTGR5hTGR5 To 트렌스펙션시킨Transfection 세포에서의  In the cell 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물의  Of 50% ethanol extract TGR5TGR5 활성 증진 효과 Activity enhancement effect

시료sample 농도density TGR5 활성 측정
(fold of control)
TGR5 activity measurement
(fold of control)
대조군Control group 1.000 ± 0.1201.000 ± 0.120 세발나물(50% 에탄올 추출)Three-legged herbs (50% ethanol extract) 10μg/mL10 μg / mL 2.034 ± 0.063***2.034 ± 0.063 *** 50μg/mL50 μg / mL 2.910 ± 0.503*2.910 ± 0.503 * 100μg/mL100 μg / mL 2.411 ± 0.112***2.411 + - 0.112 ***

TGR5 플라스미드로 트렌스펙션된 CHO-K1 세포가 이용되었으며 여기에 세발나물 50% 에탄올 추출물이 5시간 동안 처리되었다. TGR5 활성은 앞서 방법에서 언급했듯이 루시퍼레이즈 측정에 의해 평가되었으며 모든 값은 means± SEM으로 나타내었다. n=9. *p<0.05, ***p<0.001 vs control(대조군)CHO-K1 cells transfected with the TGR5 plasmid were used and treated with 50% ethanol extract of Tb for 5 hours. TGR5 activity was assessed by Luciferase assay as mentioned in the previous method and all values are expressed as means ± SEM. n = 9. * p <0.05, *** p <0.001 vs control (control group)

상기 표 8에 나타난 바와 같이, hTGR5를 트렌스펙션시킨 세포에서 세발나물 50% 에탄올 추출물에 의해 TGR5 활성이 증가하였다. 따라서, TGR5의 활성화는 에너지 소비를 증가시켜 비만 치료 효과를 보이므로, 세발나물 추출물에 의해 활성화된 TGR5가 에너지 소비를 증가시켜 항비만 효과, 식욕억제 효과, 심장질환 개선 효과, 소화 장애 및 흡수 장애 개선 효과 등을 보일 것으로 생각되었다.
As shown in Table 8 above, the TGR5 activity was increased by the 50% ethanol extract of Tbsp from the cells transfected with hTGR5. Therefore, activation of TGR5 increases energy expenditure, and thus shows an effect of treating obesity. Therefore, TGR5 activated by the extract of Trifolium extract increases energy consumption, and thus, has an anti-obesity effect, an appetite suppressing effect, And the effect of improvement.

3-2. 3-2. CHOCHO -- K1K1 세포에서  In a cell 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물의 5가지  5 kinds of 50% ethanol extract 분획별By fraction TGR5TGR5 활성 측정 Active measurement

TGR5 플라스미드로 트렌스펙션된 CHO-K1 세포가 대조군으로 이용되었으며 여기에 세발나물 50% 에탄올 추출물이 5시간 동안 처리되었다. TGR5 활성은 앞서 방법에서 언급했듯이 루시퍼레이즈 측정에 의해 평가되었으며 모든 값은 means± SEM으로 나타내었다. n=9. *p<0.05, ***p<0.001 vs control (대조군)CHO-K1 cells transfected with the TGR5 plasmid were used as a control, and 50% ethanol extract of Tbsp was treated for 5 hours. TGR5 activity was assessed by Luciferase assay as mentioned in the previous method and all values are expressed as means ± SEM. n = 9. * p <0.05, *** p <0.001 vs control (control group)

시료sample 농도density 분 획Minute TGR5 활성 측정
(fold of control)
TGR5 activity measurement
(fold of control)
대조군Control group 1.000 ± 0.024 1.000 + 0.024 세발나물(50% 에탄올 추출)Three-legged herbs (50% ethanol extract) 500μg/mL500 μg / mL 분획전Before fractionation 2.759± 0.303**2.759 ± 0.303 ** 헥산층Hexane layer 1.529± 0.012 1.529 + 0.012 클로로포름층Chloroform layer 1.689± 0.062 1.689 + 0.062 에틸 아세테이트층Ethyl acetate layer 3.279± 0.151***3.279 + - 0.151 *** 부탄올층Butanol layer 2.584± 0.448* 2.584 + - 0.448 * H2O층H 2 O layer 3.184± 0.512 *3.184 + - 0.512 *

상기 표 9에 나타난 결과에 따르면, 에틸 아세테이트 분획층은 세발나물 추출물(50% 에탄올 추출물)에 비하여 더욱 우수한 TGR5 활성화 효과를 보이는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 세발나물 추출물의 에틸 아세테이트 분획물은 항비만 효과, 식욕억제 효과, 심장질환 개선 효과, 소화 장애 및 흡수 장애 개선 효과 등을 보일 것으로 생각되었다.
According to the results shown in Table 9 above, the ethyl acetate fraction layer showed more excellent TGR5 activation effect than the extract of Trifoliate herb extract (50% ethanol extract). Therefore, it was thought that the ethyl acetate fraction of the extract of Cegetti had the anti-obesity effect, the appetite suppression effect, the heart disease improvement effect, the digestive disorder and the absorption disorder improvement effect.

<실시예 4> STC-1 세포 이용한 CCK 분비 실험Example 4 CCK secretion experiment using STC-1 cells

1) 세포 배양1) Cell culture

STC-1 cell은 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)을 사용하였으며, 온도 37℃와 5%의 CO2를 유지하면서 배양기에서 배양하였다.STC-1 cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin and maintained at 37 ° C and 5% CO 2 .

배양에 사용된 소 태아 혈청(FBS), 페니실린-스트렙토마이신, Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)은 Gibco에서 구입하였다.Fetal serum (FBS), penicillin-streptomycin, and Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) used for culture were purchased from Gibco.

2) CCK 분비 측정 방법2) CCK secretion measurement method

세포를 배양하여 24well plate에 각 well당 2×105cells/well의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 72시간 후 HEPES 버퍼(4.5mM KCl, 1.2mM CaCl2, 1.2mM MgCl2, 10mM glucose, 140mM NaCl, 및 20mM Hepes-Tris, pH7.4)로 2회 세척하고 HEPES 버퍼에 물질을 첨가한 후 37℃에서 60분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 배지를 모아 10000rpm에서 10분간 원심분리 하였으며 얻어진 상층액은 -70℃에 보관하여 분석에 사용하였다. 실험에 사용된 kit는 효소 면역분석법(enzyme immunoassay (EIA)) kit (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont CA)이다.Cells were cultured and inoculated at a concentration of 2 × 10 5 cells / well on a 24-well plate and cultured at 37 ° C and 5% CO 2 . After 72 hours, the cells were washed twice with HEPES buffer (4.5 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 10 mM glucose, 140 mM NaCl, and 20 mM Hepes-Tris, pH 7.4) The reaction was carried out for 60 minutes. After completion of the reaction, the culture medium was collected and centrifuged at 10000 rpm for 10 minutes. The obtained supernatant was stored at -70 ° C for analysis. The kit used in the experiment is the enzyme immunoassay (EIA) kit (Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont CA).

3) 세포내 칼슘 반응 측정 방법3) Measurement of intracellular calcium response

Poly-D-Lysine cotead black 96-well clear-bottom plates (Thermo)에 8.0 x 104 cells/well의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 72시간 후 Calcium-5 assay kit (Moelcular device)로 37°C에서 60분 배양하고 Flexstation III을 이용하여 Ca2 + 반응을 측정하였다. 형광 파장은 488nm(ex)과 525(em)으로 약 120초간 반응을 보았으며 화합물의 주입은 20초에 실시하여 2초간의 반응을 보았다.Poly-D-Lysine cotead black 96 -well clear-bottom plates (Thermo) to 8.0 x 10 4 cells / well, and inoculated at a concentration of 37 ℃, 5% CO 2 Lt; / RTI &gt; After 72 hours and incubated 60 min at 37 ° C with 5-Calcium assay kit (Moelcular device) to measure the Ca 2 + reaction using a Flexstation III. Fluorescence wavelengths were 488 nm (ex) and 525 (em) for about 120 seconds. Compound injection was performed for 20 seconds and reaction was observed for 2 seconds.

4) 결과4) Results

4-1. 4-1. STCSTC -1 세포에서 -1 cells 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물에 의한  By 50% ethanol extract CCKCCK 분비 효과Secretory effect

시료sample 농도density Fold of control
(mean ± SEM)
Fold of control
(mean ± SEM)
t-testt-test P-ValueP-Value
대조군Control group 1% DMSO1% DMSO 1.00 ± 0.011.00 + - 0.01 세발나물 50% 에탄올 추출물50% Ethanol Extract 500μg/ml500 μg / ml 12.72 ± 6.5612.72 + - 6.56 ****** <0.001<0.001

Fold of control = 샘플 value/미처리 대조군 valueFold of control = sample value / untreated control value

± S.E.M.(n=9) ***P<0.001 vs. 대조군(1% DMSO)+/- S.E.M. (n = 9) *** P < Control (1% DMSO)

상기 표 10에 나타난 바에 따르면, 세발나물 추출물은 효율적인 소화 흡수 조절 작용, 항비만 작용 등을 하는 것으로 알려진 CCK 분비 활성화에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
According to the results shown in Table 10, the extracts of Trichophyton sp. Had an effect on the activation of secretion of CCK, which is known to efficiently regulate digestion and absorption, and anti-obesity.

4-2. 4-2. STCSTC -1 세포에서 -1 cells 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물의 5종  5 kinds of 50% ethanol extract 분획물에In the fraction 의한  by CCKCCK 분비 효과Secretory effect

분획Fraction 농도
(μg/ml)
density
(μg / ml)
Fold of control
(mean ± S.E.M.)
Fold of control
(mean ± SEM)
t-testt-test P- ValueP-Value
대조군Control group 1.00 ± 0.071.00 + 0.07 세발나물
50% 에탄올
추출물
Three-legged herbs
50% ethanol
extract
분획전Before fractionation 100100 1.08 ± 0.121.08 + - 0.12
헥산층Hexane layer 100100 100.75 ± 5.54100.75 + - 5.54 ****** <0.001<0.001 클로로포름층Chloroform layer 100100 96.15 ± 4.5796.15 + - 4.57 ****** <0.001<0.001 에틸 아세테이트층Ethyl acetate layer 100100 2.25 ± 0.882.25 ± 0.88 0.2580.258 부탄올층Butanol layer 100100 1.27 ± 0.071.27 ± 0.07 0.2390.239 증류수층Distilled water layer 100100 1.18 ± 0.271.18 ± 0.27 0.7520.752

Fold of control = 샘플 value/미처리 대조군 valueFold of control = sample value / untreated control value

± S.E.M.(n=9) ***P<0.001 vs. 분획전+/- S.E.M. (n = 9) *** P < Before fractionation

상기 표 11에 나타난 바에 따르면, 세발나물 추출물의 분획물은 추출물 상태일 때보다 CCK 분비 효과가 더욱 우수한 것으로 나타났다.
According to the results shown in Table 11, the fractions of the extracts of Trichoderma sp. Exhibited better CCK secretion effects than those in the extract.

4-3. 4-3. STCSTC -1 세포에서 -1 cells 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물의 5종  5 kinds of 50% ethanol extract 분획물의Fraction 농도별  By concentration CCKCCK 분비 효과Secretory effect

시료sample 분획Fraction 농도
(μg/ml)
density
(μg / ml)
Fold of control
(mean ± S.E.M.)
Fold of control
(mean ± SEM)
t-testt-test P-ValueP-Value
대조군Control group 1.00 ± 0.181.00 + - 0.18 세발나물
50%에탄올
추출물
Three-legged herbs
50% ethanol
extract
분획전Before fractionation 100100 1.08 ± 0.311.08 0.31
헥산층Hexane layer 1010 2.55 ± 0.432.55 + - 0.43 ** 0.0290.029 5050 47.26 ± 0.7547.26 + 0.75 ****** <0.001<0.001 100100 73.47 ± 3.6373.47 ± 3.63 ****** <0.001<0.001 클로로포름층Chloroform layer 1010 1.00 ± 0.051.00 ± 0.05 0.5590.559 5050 31.85 ± 0.8931.85 ± 0.89 ****** <0.001<0.001 100100 61.92 ± 0.7261.92 + 0.72 ****** <0.001<0.001

Fold of control = 샘플 value/미처리 대조군 valueFold of control = sample value / untreated control value

± S.E.M.(n=9) *P<0.05, ***P<0.001 vs. 분획전+ - S.E.M. (n = 9) * P < 0.05, *** P < Before fractionation

상기 표 12는 세발나물 추출물의 분획물 중에서 가장 우수한 CCK 분비 효과를 보였던 헥산 분획물과 클로로포름 분획물의 농도별 CCK 분비 효과를 나타낸 자료이다. 상기 결과에 따르면, 헥산 분획물과 클로포름 분획물의 농도 의존적으로 CCK 분비 증가효과를 가져왔으며, 특히 그 중에서 헥산 분획물의 CCK 분비 효과가 더욱 우수한 것으로 나타났다.
Table 12 shows the CCK secretion effects of the hexane fraction and the chloroform fraction, which showed the best CCK secretion effect among the fractions of the extracts of cedarwood herb extract. According to the above results, the hexane fraction and the chloroform fraction had an effect of increasing the CCK secretion depending on the concentration. Especially, the hexane fraction had better CCK secretion effect.

4-4. 4-4. STCSTC -1 세포에서 -1 cells 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물의 5종  5 kinds of 50% ethanol extract 분획물에In the fraction 의한  by CCKCCK 분비에서 저해제가 미치는 영향Influence of inhibitors on secretion

STC-1 cells은 30분간 100μM 루테늄 레드(ruthenium red, RR) 또는 50μΜ HC-030031로 사전처리하였다. 50μg/ml 추출물을 추가한 후에, 37°C에서 60분간 배양하였다. STC-1 cells were pre-treated with 100 [mu] M ruthenium red (RR) or 50 [mu] M HC-030031 for 30 minutes. After addition of 50 μg / ml extract, the cells were incubated at 37 ° C for 60 minutes.

시료sample 분획Fraction 저해제Inhibitor Fold of control
(mean ± S.E.M.)
Fold of control
(mean ± SEM)
t-
test
t-
test
P-
Value
P-
Value
Inhibition
(%)
Inhibition
(%)
대조군Control group 1.00 ± 0.001.00 ± 0.00 세발나물
50%에탄올 추출물
Three-legged herbs
50% ethanol extract
분획전Before fractionation 무처리No treatment 1.08 ± 0.081.08 0.08
RRRR 0.38 ± 0.090.38 ± 0.09 0.1180.118 44.2644.26 HC-030031HC-030031 0.54 ± 0.060.54 + 0.06 0.2740.274 21.4721.47 헥산층Hexane layer 무처리No treatment 36.87 ± 2.0836.87 ± 2.08 RRRR 12.69 ± 0.6612.69 + - 0.66 **** 0.0080.008 65.5765.57 HC-030031HC-030031 12.88 ± 0.6212.88 + - 0.62 **** 0.0080.008 65.0665.06 클로로포름층Chloroform layer 무처리No treatment 13.41 ± 1.5113.41 ± 1.51 RRRR 3.24 ± 0.783.24 ± 0.78 ** 0.0270.027 75.8175.81 HC-030031HC-030031 1.04 ± 0.281.04 ± 0.28 ** 0.0150.015 92.2892.28

상기 표 13에 나타난 결과에 따르면, 칼슘 유입을 저해하는 루테늄 레드 또는 HC-030031 등을 처리한 경우 세발나물 50% 추출물에 의한 CCK 분비가 크게 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 세발나물 추출물의 분획물은 CCK 분비 활성화 제제로 작용한다고 판단하였다.According to the results shown in the above Table 13, when ruthenium red or HC-030031 inhibiting calcium influx was treated, the CCK secretion by the 50% extract of Tricholoma extract was greatly reduced. From these results, it was concluded that the fractions of the extract of Tricholoma extract act as a CCK secretion activation agent.

Fold of control =sample value/untreated control valueFold of control = sample value / untreated control value

± S.E.M.(n=9) *P<0.05, **P<0.01 vs. 무처리
± SEM (n = 9) * P <0.05, ** P <0.01 vs. No treatment

<실시예 5> RIN 세포 이용한 5-HT 측정 방법Example 5 Measurement of 5-HT using RIN cells

1) 세포배양1) Cell culture

RIN cell은 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 RPMI medium 1640을 사용하였으며, 온도 37℃와 5%의 CO2를 유지하면서 배양기에서 배양하였다. RIN cells were cultured in RPMI medium 1640 containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin-streptomycin and incubated at 37 ° C and 5% CO 2 .

배양에 사용된 소 태아 혈청(FBS), 페니실린-스트렙토마이신, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)은 Gibco에서 구입하였다.Fetal serum (FBS), penicillin-streptomycin, and Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) used for culture were purchased from Gibco.

2) 5-HT 분비 측정 방법 2) 5-HT secretion measurement method

세포를 배양하여 24well plate에 각 well당 2×105cells/well의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 72시간 후 5-HT 에세이 버퍼(HBSS, 0.1% BSA, 1.25mM CaCl2, 2μM 플록세틴, pH 7.4)로 2회 수세하고 5-HT 에세이 버퍼에 물질을 첨가한 후 37℃에서 60분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 배지를 모아 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 하였으며 얻어진 상층액은 -70℃에 보관하여 분석에 사용하였다. 실험에 사용된 kit는 Serotonin(EIA) kit (Enzo Life Sciences)이다Cells were cultured and inoculated at a concentration of 2 × 10 5 cells / well on a 24-well plate and cultured at 37 ° C and 5% CO 2 . After 72 hours, the cells were washed twice with 5-HT assay buffer (HBSS, 0.1% BSA, 1.25 mM CaCl 2, 2 μM flocetin, pH 7.4) and the material was added to 5-HT assay buffer and reacted at 37 ° C. for 60 minutes. After the reaction, the medium was collected and centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes. The obtained supernatant was stored at -70 ° C for analysis. The kit used for the experiment was the Serotonin (EIA) kit (Enzo Life Sciences)

3) 세포내 칼슘 반응 측정 방법 3) Measurement of intracellular calcium response

Black 96-well clear-bottom plates (Corning)에 5.0 x 104 cells/well의 농도로 접종하고 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 48시간 후 Calcium-5 assay kit (Moelcular device)로 37°C에서 60분 배양하고 Flexstation III을 이용하여 Ca2 + 반응을 측정하였다. 형광파장은 488nm(ex)과 525(em)으로 약 120초간 반응을 보았으며 화합물의 주입은 20초에 실시하여 2초간의 반응을 보았다.Cells were inoculated into Black 96-well clear-bottom plates (Corning) at a concentration of 5.0 x 10 4 cells / well, incubated at 37 ° C in 5% CO 2 Lt; / RTI &gt; After 48 hours and incubated 60 min at 37 ° C with 5-Calcium assay kit (Moelcular device) to measure the Ca 2 + reaction using a Flexstation III. Fluorescence wavelengths were 488 nm (ex) and 525 (em) for about 120 seconds. Compound injection was performed for 20 seconds and reaction was observed for 2 seconds.

4) 결과4) Results

5-5- HTHT 분비 효과 측정 Secretory effect measurement

5-1. 5-1. RIN14BRIN14B 세포에서  In a cell 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물에 의한 5- 50% ethanol extract of 5- HTHT 분비 효과 Secretory effect

시료sample 농도density Fold of control
(mean ± SEM)
Fold of control
(mean ± SEM)
t-testt-test P-
Value
P-
Value
대조군Control group 1% DMSO1% DMSO 1.00 ± 0.261.00 + - 0.26 세발나물 50% 에탄올 추출물50% Ethanol Extract 500μg/ml500 μg / ml 2.51 ± 0.352.51 + - 0.35 ** 0.050.05

Fold of control =sample value/untreated control valueFold of control = sample value / untreated control value

Values are presented as the mean ± S.E.M.(n=9)Values are presented as the mean ± SE (n = 9)

상기 표 14의 결과에 따르면, 세발나물 추출물은 효율적인 소화 흡수 조절 작용, 식욕 억제 작용 등을 하는 것으로 알려진 5-HT 분비에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
According to the results shown in the above Table 14, the extract of T. hiragana was found to affect the secretion of 5-HT, which is known to efficiently control digestion and absorption, and suppress the appetite.

5-2. 5-2. 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물의 5가지  5 kinds of 50% ethanol extract 분획물에In the fraction 의한 5- 5- HTHT 분비 효과 Secretory effect

시료sample 분획Fraction 농도
(μg/ml)
density
(μg / ml)
Fold of control
(mean ± S.E.M.)
Fold of control
(mean ± SEM)
t-testt-test P- ValueP-Value
대조군Control group 1% DMSO1% DMSO 1.00 ± 0.191.00 + - 0.19 세발나물
50% 에탄올
추출물
Three-legged herbs
50% ethanol
extract
분획전Before fractionation 100100 2.51 ± 0.042.51 + 0.04
헥산층Hexane layer 100100 59.50 ± 1.0759.50 ± 1.07 ****** <0.001<0.001 클로로포름층Chloroform layer 100100 41.68 ± 3.9641.68 ± 3.96 ****** <0.001<0.001 에틸 아세테이트층Ethyl acetate layer 100100 2.91 ± 0.022.91 + 0.02 ****** <0.001<0.001 부탄올층Butanol layer 100100 2.65 ± 0.222.65 ± 0.22 0.5490.549 증류수층Distilled water layer 100100 2.13 ± 0.232.13 + - 0.23 0.1720.172

Fold of control =sample value/untreated control valueFold of control = sample value / untreated control value

± S.E.M.(n=9)***P<0.001 vs. 분획전+/- S.E.M. (n = 9) *** P < Before fractionation

상기 표 15의 결과에 따르면, 세발나물 추출물의 헥산 분획물 및 클로로포름 분획물은 세발나물 추출물에 비해서 더 우수한 5-HT 분비 효과를 나타내는 것을 알 수 있다. 따라서 세발나물 추출물의 헥산 분획물 및 클로로포름 분획물은 5-HT 분비를 증가시켜 소화 흡수 조절 작용, 식욕 억제 작용, 항비만 효과 등을 나타낼 것으로 생각된다.
According to the results shown in Table 15 above, the hexane fraction and the chloroform fraction of the extract of T. foraminifera showed a better 5-HT secretion effect as compared with the extract of T. fragileum. Therefore, the hexane fraction and the chloroform fraction of the extracts of the extracts of Tetranych with the 5-HT increased the digestion absorption and absorption, the appetite suppression effect, and the anti-obesity effect.

5-3. 5-3. RIN14BRIN14B 세포에서  In a cell 세발나물Three-legged herbs 50% 에탄올 추출물이  50% Ethanol Extract CaCa 22 ++ 반응에 미치는 영향 Effect on reaction

시료sample 농도density ΔRFU
(mean ± S.E.M.)
ΔRFU
(mean ± SEM)
t-testt-test P- ValueP-Value
대조군Control group 0.5% DMSO0.5% DMSO 3.34 ± 0.443.34 ± 0.44 세발나물
50% 에탄올 추출물
Three-legged herbs
50% ethanol extract
500μg/ml500 μg / ml 32.45 ± 1.9032.45 ± 1.90 ****** <0.001<0.001
AITCAITC 50uM50 uM 13.44 ± 1.7813.44 ± 1.78 **** 0.0050.005 300uM300uM 19.78 ± 4.0819.78 ± 4.08 ** 0.0170.017 500uM500uM 22.17 ± 3.6522.17 ± 3.65 ****** 0.0070.007

각각의 well의 반응은 ΔRFU로 결정하였다.The reaction of each well was determined by ΔRFU.

± S.E.M.(n=3-4)*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. 대조군+ - S.E.M. (n = 3-4) * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 vs. Control group

상기 표 16에 나타난 바에 따르면, 세발나물 추출물을 처리한 RIN14B 세포의 ΔRFU 값은 5-HT 분비를 촉진하는 것으로 알려져 있는 AITC의 ΔRFU 값에 비해서 더 큰 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 세발나물 추출물은 CCK 분비에 관여하는 TRP에 channel 활성화에 영향을 미치는 것으로 생각된다.
As shown in Table 16 above, the RFU value of RIN14B cells treated with the extract of Trichoderma herb extract was higher than that of AITC, which is known to promote 5-HT secretion. From these results, it is suggested that the extract of Trichophyton spp. Affects channel activation in TRP involved in CCK secretion.

5-4. RIN14B 세포에서 세발나물 50% 에탄올 추출물의 5가지 분획물이 Ca 2 + 반응에 미치는 영향(대조군: 0.5% DMSO, 시료농도: 500μg/ml) 5-4. The five fractions of 50% ethanol extracts from herbs tricycle RIN14B cells Ca 2 + Effect of the reaction (control group: 0.5% DMSO, sample concentration: 500μg / ml)

시료sample 분획Fraction ΔRFU
(mean ± S.E.M.)
ΔRFU
(mean ± SEM)
t-testt-test P-ValueP-Value
대조군Control group 0.5% DMSO0.5% DMSO 4.19 ± 0.824.19 ± 0.82 세발나물
50% 에탄올 추출물
Three-legged herbs
50% ethanol extract
분획전Before fractionation 24.53 ± 1.3224.53 + - 1.32
헥산층Hexane layer 54.02 ± 2.0654.02 ± 2.06 ****** <0.001<0.001 클로로포름층Chloroform layer 70.24 ± 1.3870.24 + 1.38 ****** <0.001<0.001 에틸 아세테이트층Ethyl acetate layer 39.96 ± 0.6439.96 + 0.64 ****** <0.001<0.001 부탄올층Butanol layer 42.13 ± 2.3442.13 + - 2.34 ****** <0.001<0.001 증류수층Distilled water layer 34.39 ± 2.0034.39 ± 2.00 **** 0.0060.006

각각의 well의 반응은 ΔRFU로 결정하였다.The reaction of each well was determined by ΔRFU.

± S.E.M.(n=3-4) **P<0.01, ***P<0.001 vs. 분획전± S.E.M. (n = 3-4) ** P <0.01, *** P <0.001 vs. Before fractionation

상기 표 17의 결과에 따르면, 세발나물 추출물의 분획물들은 분획전 추출물 상태일 때 칼슘농도 변화에 더 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이러한 결과로부터 세발나물의 분획물이 Ca2+ 이온 농도 변화 유발에 더 우수한 효과를 가지는 것을 알 수 있고, Ca2 + 이온 농도 변화는 GPCRs의 활성화를 의미하므로 세발나물의 분획물이 GPCRs을 활성화시켜 GLP-1의 분비를 촉진해 비만을 예방할 수 있을 것으로 생각된다.
According to the results in Table 17 above, the fractions of the extracts of Trifolium northerni had a greater effect on the change of calcium concentration in the pre-fraction extract condition. From these results, it can be seen that the fractions of Trichophyton spp. Have a better effect on the induction of Ca 2+ ion concentration change, and since the change of Ca 2 + ion concentration means the activation of GPCRs, fractions of Trichophyton spp. Activates GPCRs, 1 secretion and promote obesity can be prevented.

<실시예 6> 세발나물 추출물을 이용한 동물실험 &Lt; Example 6 > Animal experiment using cedar herb extract

실시예 1에서 얻은 세발나물 추출물을 증류수에 용해하여 실험용 쥐에 경구투여하여 1) 뇌조직의 면역염색에 의한 중추 활성화 실험, 2) Glucose tolerance tests, 3) Gastric emptying rate, 4) Food intake 측정, 5) Chloride 분비 효과 실험을 실시하였다.
2) Glucose tolerance tests, 3) Gastric emptying rate, 4) Food intake measurement, 3) Gastric emptying rate, 4) Food intake measurement, 5) Chloride secretion effect experiment was performed.

(1) 실험방법(1) Experimental method

1) 뇌조직의 면역염색에 의한 중추 활성화 실험1) Activation of the central nervous system by immunological staining of brain tissue

세발나물 추출물을 위내로 투여하고 뇌부위의 활성화를 분석하기 위해 c-Fos 면역 염색을 하였다. 실험동물을 12시간 금식 시킨 후, 증류수에 녹인 세발나물 추출물(500 mg/kg BW)을 경구 투여한 후 2시간을 방치한다. 이후 urethan으로 깊은 마취 상태를 유도한다. 차가운 PBS 200 mL를 심장을 통해 관류 시키고, 이어서 4% paraformaldehyde을 300 mL 관류 시킨 후 뇌를 적출하여 4% paraformaldehyde에 4시간동안 4oC에서 보관한다. 그 후 30% sucrose 용액에 옮겨 4 oC에서 충분히 가라앉게 하였다. 고정 작업이 끝난 뇌 조직은 OCT 용액을 이용하여 얼린다. 얼린 조직은 -20oC에서 30um의 두께로 목표 영역을 중심으로 잘라준다. 목표 영역은 Arcuate nucleus in hypothalamus(ARC)와 Dorsal vagal complex (DVC)이다. 잘라진 조직은 PBS로 이동 시킨 후 PBS를 이용하여 세척한다. 이 조직은 0.3% H2O2에 15분간 담가 둔 후, 3회에 걸쳐 PBS로 세척한다. 이 조직은 3% normal goat serum을 포함한 PBS에 30분간 반응시킨다. 이 조직은 세척과정 없이 polyclonal rabbit c-Fos antibody (sc-25, Santa Cruz Biotech, USA)를 1:1000의 비율로 0.3%의 normal goat serum이 들어있는 PBST로 희석시켜 실온에서 24시간 반응시킨다. 반응이 끝난 조직은 PBST로 10분간 3회에 걸쳐 세척한다. 그 후 두 번째 anti-rabbit antibody (BA-1000, Vector, USA)를 30분간 실온에서 반응시킨 후 3회에 걸쳐 5분씩 세척한다. 이 조직은 avidin-giotinyated horseradish peroxidase complex(ABC) (PK-6100, Vector, USA)를 실온에서 30분간 반응 시킨 후 5분씩 3회에 걸쳐 PBST로 세척한 후 DAB kit (Zytomed Systems, Germany)을 이용하여 발색 시킨 후 PBS로 반응을 종결한다. 염색이 끝난 조직은 슬라이드로 옮겨 충분히 건조시킨 후, 탈수 반응을 수행한다. 탈수반응이 끝난 슬라이드는 커버슬라이드를 덮어 현미경으로 관찰 한다. C-Fos immunohistochemistry was performed to analyze the activation of the brain region. After the animals were fasted for 12 hours, they were orally administered the extract of herb extract (500 mg / kg BW) dissolved in distilled water and left for 2 hours. Then induce deep anesthesia with urethan. 200 mL of cold PBS is perfused through the heart, followed by 300 mL perfusion of 4% paraformaldehyde, then the brain is harvested and stored in 4% paraformaldehyde for 4 hours at 4 ° C. Then, it was transferred to a 30% sucrose solution and sufficiently submerged at 4 ° C. After the fixation, brain tissue is frozen using OCT solution. The frozen tissue is cut from the target area at a thickness of 30 μm at -20 ° C. The target areas are Arcuate nucleus in hypothalamus (ARC) and Dorsal vagal complex (DVC). The cut tissue is transferred to PBS and washed with PBS. The tissue is immersed in 0.3% H 2 O 2 for 15 minutes and then washed three times with PBS. The tissue is incubated in PBS containing 3% normal goat serum for 30 minutes. The tissue was diluted with PBST containing 0.3% normal goat serum at a ratio of 1: 1000 with polyclonal rabbit c-Fos antibody (sc-25, Santa Cruz Biotech, USA) without washing and reacted at room temperature for 24 hours. After the reaction, the tissue is washed with PBST three times for 10 minutes. Then, the second anti-rabbit antibody (BA-1000, Vector, USA) was reacted at room temperature for 30 minutes and washed three times for 5 minutes. This tissue was reacted with avidin-giotinyated horseradish peroxidase complex (ABC) (PK-6100, Vector, USA) for 30 minutes at room temperature, washed with PBST three times for 5 minutes each, and then with DAB kit (Zytomed Systems, Germany) After color development, the reaction is terminated with PBS. The dyed tissue is transferred to a slide, dried thoroughly, and dehydrated. After completion of the dehydration reaction, cover slides are covered with a microscope.

염색이 끝난 조직은 현미경(AXio. 4. 8. 1, Zeiss, Germany)을 이용하여 목표 영역을 Paxinos and Watson의 좌표에 따라 결정한 후, 슬라이드 3-6장의 c-Fos antibody로 염색된 핵의 수를 세어 그 평균값을 구한다.
After staining, the target area was determined according to the coordinates of Paxinos and Watson using a microscope (AXio 4.8.1, Zeiss, Germany), and the number of nuclei stained with c-Fos antibody on slides 3-6 And the average value is obtained.

2) 2) 흰쥐에서의In rats 경구당부하Oral glucose tolerance 검사에 미치는 영향 평가 ( Impact Assessment on Testing GlucoseGlucose tolerancetolerance teststests ) )

스프래그 돌리 흰쥐 (Sprague-Dawley rats; 체중 약 400g; 수컷)를 16시간 절식시킨 후 포도당 (2g/kg 체중)과 동시에 세발나물 추출물 (500 mg/kg BW)을 경구 투여한다. 투여 후 0, 30, 60, 90, 120분에 꼬리 끝 부분을 절개하여 혈액을 채취하여 아쿠첵 혈당측정기(로슈사 제품)를 이용하여 혈당치를 측정한다. 포도당 (2g/kg 체중)만 투여한 군을 대조군으로 실험하였다.
Sprague-Dawley rats (body weight: about 400 g; male) were fasted for 16 hours and then administered orally with a mixture of glucose (2 g / kg body weight) and cervical herb extract (500 mg / kg BW). The tail tip was cut at 0, 30, 60, 90, and 120 minutes after the administration, and the blood was collected and the blood glucose level was measured using an Aquacheck blood glucose meter (manufactured by Roche). Glucose (2 g / kg body weight) was administered as a control group.

3) 3) GastricGastric emptyingemptying raterate (위장이 비워지는 속도)를 늦추는 효과  (Slowing the rate at which the stomach is emptied)

Gastric emptying rate 측정은 Izbeki와 Doihara 등(*1,*2)의 방법을 이용하여 측정하였다. 본 실험에 사용한 흰쥐는 실험 시작 하루 전 절식 후 세발나물 추출물 (100, 250, 500 mg/kg BW)을 증류수에 녹여 경구 투여 후 30분 동안 방치한다. 흰쥐에 0.05% phenol red solution (1.5 mL)를 경구투여 후 20분이 지나고 경추탈골 후 위를 제거 한 후, 식염수에 세척하고 바로 0.1N NaOH (100 mL)에 잘게 균질화시킨다. 1시간 실온에서 안정화시킨 후 상층액(5 mL)을 20% trichloroacetic acid (0.5 mL)과 혼합 후 20분 간 4oC에서 3000 rpm으로 원심분리 시킨다. 상층액을 0.5 N NaOH (4 mL)과 혼합 후 UV-spectrophotometer로 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 증류수를 경구 투여하여 위와 같은 방법으로 실시하였다.Gastric emptying rate was measured using the method of Izbeki and Doihara (* 1, * 2). The rats used in this experiment were aspirated three times a day before the start of the experiment and dissolved in distilled water for 30 minutes after oral administration. Twenty minutes after oral administration of 0.05% phenol red solution (1.5 mL) to rats, the stomach is removed after cervical dislocation, washed in saline and homogenized in 0.1 N NaOH (100 mL). After stabilization at room temperature for 1 hour, the supernatant (5 mL) is mixed with 20% trichloroacetic acid (0.5 mL) and centrifuged at 3000 rpm at 4 ° C for 20 minutes. The supernatant was mixed with 0.5 N NaOH (4 mL) and absorbance was measured at 560 nm by UV-spectrophotometer. The control group was administered with distilled water orally.

참고문헌references

(1) F. Izbeki, T. Wittmann, S. Csati, J. Lonovics. 2004. The mechani는 of the inhibitory effect of ethanol on gastric emptying involve type A CCK receptors. Regulatory Peptides. 117: 101-105 (1) F. Izbeki, T. Wittmann, S. Csati, J. Lonovics. 2004. The mechani of the inhibitory effect of ethanol on gastric emptying involve type A CCK receptors. Regulatory Peptides. 117: 101-105

(2) H. Doihara, K. Nosawa, E. Kawabata-Shoda, R. Kojima, T. Yokoyama, H. Ito. 2009. TRPA1 agonists delay gastric emptying in rats through serotonergic pathways. Naunyn-Schmied Arch Pharmacol. 380: 353-357(2) H. Doihara, K. Nosawa, E. Kawabata-Shoda, R. Kojima, T. Yokoyama, H. Ito. 2009. TRPA1 agonists delay gastric emptying in rats through serotonergic pathways. Naunyn-Schmied Arch Pharmacol. 380: 353-357

Gastric emptying rate(위장이 비워지는 속도) 는 다음과 같이 계산하였다.Gastric emptying rate was calculated as follows.

Gastric emptying rate (%) = 100 (A/B) × 100,Gastric emptying rate (%) = 100 (A / B) x 100,

A : 실험군의 phenol red solution을 경구투여 20분 후 위장 간 내에 phenol red가 남아 있는 양   A: The amount of phenol red remained in the gastrointestinal tract 20 minutes after the oral administration of phenol red solution

B : 대조군의 phenol red solution을 경구투여 후 즉시 위장 간 내에 phenol red의 양
B: The amount of phenol red in the gastrointestinal tract immediately after oral administration of the phenol red solution of the control group

4) 4) FoodFood intakeintake 측정  Measure

세발나물 추출물을 위내로 투여하고 Food intake를 측정하기 위해, 흰쥐를 실험 시작 하루 전 절식하였다. 각 군당 5마리씩 세발나물 추출물 (500 mg/kg)을 증류수에 녹여 경구 투여 후 120분 경과 후의 food intake를 측정하였다(*3). 대조군은 증류수를 경구 투여하여 위와 같은 방법으로 실시하였다.In order to administer the herbal extracts to the stomach and to measure the food intake, the rats were sacrificed one day before the start of the experiment. The food intake was measured 120 minutes after oral administration of cedar herb extract (500 mg / kg) dissolved in distilled water (5) per group (* 3). The control group was administered with distilled water orally.

참고문헌:references:

(3) A. Serrano, FJ. Pav, S. Tovar, F. Casanueva, R. Se, C. Di, F.R. Fonseca. 2011. Oleoylethanolamide: Effects on hypothalamic transmitters and gut peptides regulating food intake. Neurohparmacology 60: 593-601
(3) A. Serrano, FJ. Pav, S. Tovar, F. Casanueva, R. Se, C. Di, FR Fonseca. 2011. Oleoylethanolamide: Effects on hypothalamic transmitters and gut peptides regulating food intake. Neurohparmacology 60: 593-601

5) Chloride 분비 효과 실험orsal vagal complex (DVC)를 활성화시키며 이는 다시 Arcuate nucleus in hypothalamus(ARC)를 활성화시킴으로써 식품섭취 정보를 중추에 전달하며 중추는 이 정보를 습득 후 말초 조직에 각종 체내 항상성과 관련된 명령을 내 보내어 신체 활동을 조절한다. 5) Chloride secretion effect The experiment activates the orsal vagal complex (DVC), which in turn activates the arcuate nucleus in hypothalamus (ARC) and delivers food intake information to the central region. Controls physical activity by sending out commands.

그 결과 세발나물 추출물은 DVC 및 ARC 활성화 효과가 있었다 (도 1 및 2 참조). 이는 GLP-1, CCK, 5-HT가 분비됨으로써 알려진 각종 체내 항상성과 관련된 작용이 일어남을 예상할 수 있다.
As a result, the extract of Tricholoma extract had effects of activating DVC and ARC (see FIGS. 1 and 2). This can be expected to result in various homeostatic functions known to be secreted by GLP-1, CCK, and 5-HT.

2) 2) 흰쥐에서의In rats 경구당부하Oral glucose tolerance 검사에 미치는 영향 평가 Assessing Impact on Testing (( 항당뇨Anti-diabetic 효과 확인) Effect check)

그 결과 본 발명의 세발나물 추출물은 포도당 부하에 의한 30분후의 혈당치 상승분이 대조군은 102.7mg/dl인데 비하여 63.2mg/dl로 38.5% 낮추었으며, 60분후의 혈당치 상승분이 대조군은 110.7mg/dl인데 비하여 76.2mg/dl로 31.2% 낮추었으며, 혈당증가곡선 아래 면적 (Area under the curve; AUC)은 대조군은 17465 mg/dlm As a result, the extract of Tricholoma herb extract of the present invention lowered the blood glucose level increase after 30 minutes by glucose load to 63.2 mg / dl by 38.5% compared with 102.7 mg / dl in the control group, and the increase of blood glucose level after 60 minutes was 110.7 mg / dl in the control group The area under the curve (AUC) in the control group was 17465 mg / dlm

흰쥐의 혈청 중 chloride 함량 측정을 위해서 실험 시작 하루 전 절식 후 각 군당 5마리씩 세발나물 추출물(500 mg/kg BW)을 경구 투여하여 30분 경과 후 안와 채혈하였다. 혈액을 실온에서 30분간 방치한 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하여 Chloride Assay Kit (BioAssay Systems, USA)를 사용하여 측정하였다.
To determine the chloride content in the serum of rats, Orb sputum was orally administered after oral administration of 5 mg / kg BW (500 mg / kg BW) per 5 rats per group. Blood was left at room temperature for 30 minutes, centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes, and the serum was separated and measured using a Chloride Assay Kit (BioAssay Systems, USA).

(2) 실험 결과(2) Experimental results

1) 뇌조직의 면역염색에 의한 중추 활성화 실험 결과1) Experimental results of central activation by immunostaining of brain tissue

세발나물 추출물을 위내로 투여하고 뇌부위의 활성화를 c-Fos 면역 염색으로 분석하였다. 세발나물 추출물의 자극에 의하여 장에서 GLP-1, CCK, 5-HT 등이 분비되면 이들은 혈액으로 분비되어 호르몬으로서 작용하며 또한 신경펩타이드로서도 작용한다. GLP-1, CCK, 5-HT 등은 호르몬으로 작용하여 뇌의 Arcuate nucleus in hypothalamus(ARC)를 직접 활성화시킨다. 또한 GLP-1, CCK, 5-HT 등은 미주신경 (vagus nerves)을 활성화시킨 후 이는 Din인데 비하여 14060 mg/dlmin로 19.5% 낮추었으며, 이를 하기 표 18에 나타내었다.
The extracts of the herbal extracts were injected into the stomach and the activation of the brain region was analyzed by c-Fos immunostaining. When GLP-1, CCK, and 5-HT are secreted from the intestine by stimulation of the extract, the blood is secreted into the blood and acts as a hormone and also acts as a neuropeptide. GLP-1, CCK, and 5-HT act as hormones directly activating the brain's Arcuate nucleus in hypothalamus (ARC). The vagus nerves were activated by GLP-1, CCK, 5-HT and the like, which was decreased by 19.5% to 14060 mg / dlmin, which is shown in Table 18 below.

세발나물 추출물이 흰쥐의 경구 당부하에 의한 혈당 상승에 미치는 영향Effect of Extract of Herbal Extracts on Blood Glucose by Oral Glucose Loading in Rats 실험군1 ) Experimental group 1 ) 당부하후 시간별 혈당치 (mg / dL)Blood glucose level per hour ( mg / dL ) AUC2 ) AUC 2 ) 0분0 minutes 30분30 minutes 60분60 minutes 90분90 minutes 120분120 minutes 대조군3 ) Control group 3 ) 65.3±
5.9
65.3 ±
5.9
168±
22.9
168 ±
22.9
176±
14.7
176 ±
14.7
130±
15.1
130 ±
15.1
121±
11.2
121 ±
11.2
17465±
1500
17465 ±
1500
세발나물추출물 Herbal Extract 68.8±
3.4
68.8 ±
3.4
132±
17.4
132 ±
17.4
145±
22.8
145 ±
22.8
128±
11.9
128 ±
11.9
111±
12.3
111 ±
12.3
14060±
1387
14060 ±
1387

1)Values are mean± SD(n=10). 1) Values are mean ± SD (n = 10).

2)AUC : Area under the curve (포도당 부하 후 120분 동안의 혈당치 상승 곡선 아래의 면적이며 단위는 minmg/dl) 2) AUC: Area under the curve (area under the blood glucose level rise curve for 120 minutes after glucose load, in units of minmg / dl)

3)포도당만 투여한 군
3) Glucose alone group

3) 3) GastricGastric emptyingemptying ratrat (위장이 비워지는 속도)를 늦추는 효과( (The rate at which the stomach is emptied) 항비만Anti-obesity 효과 확인) Effect check)

세발나물 추출물 100, 250, 500 mg/kg 투여에 의하여 위장이 비워지는 속도가 낮아졌다 (하기 표 19 참조). 이를 통해 음식물이 위에 머무는 시간을 연장시켜 식품 섭취량이 감소되어 항비만효과를 가질 수 있음을 알 수 있었다.
The rate at which the stomach was emptied was reduced by the administration of 100, 250, 500 mg / kg of the herbal extract (see Table 19 below). This suggests that food intake can be reduced by prolonging the time for food to stay on top, resulting in an anti - obesity effect.

세발나물 추출물 투여가 위가 비워지는 속도를 늦추는 효과Effect of herbal extracts on the rate of emptying the stomach 실험군Experimental group 경구 투여 용량(mg/kg BW)Oral dose (mg / kg BW) Gastric emptying rate (%)Gastric emptying rate (%) 대조군Control group -- 90 ± 7.490 ± 7.4 세발나물 추출물 투여군Herb extract 100100 80 ± 5.180 ± 5.1 250250 46 ± 3.346 ± 3.3 500500 38 ± 1.938 ± 1.9

페놀 레드(phenol red) 투여 후 20분후 위장에 남아 있는 페놀 레드의 양을 측정하여 위가 비워지는 속도를 측정하였다. 시료는 염색 30분 전 경구투여하였다.Twenty minutes after administration of phenol red, the amount of phenol red remaining in the stomach was measured to determine the rate at which the stomach was emptied. Samples were orally administered 30 min before dyeing.

대조군은 증류수 투여군임. Values are means SEM (N=6).Control group was treated with distilled water. Values are means SEM ( N = 6).

상기 표 19에 나타난 바에 따르면, 세발나물 추출물을 투여한 투여군은 추출물의 농도 의존적으로 위장이 비워지는 속도가 낮아지는 것을 알 수 있었다. 이는 음식물이 위에 머무는 시간을 연장시켜서 항비만 효과를 보일 수 있다.
As shown in Table 19, it was found that the rate at which the stomach was emptied was low in the dose-dependent group of the extract-administered group. This can prolong the time the food stays on and thus produce an anti-obesity effect.

4) 4) FoodFood intakeintake 측정 ( Measure ( 항비만Anti-obesity 효과 확인) Effect check)

세발나물 추출물을 위내로 투여하고 120분 경과 후 섭취한 식이량에 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과 세발나물 추출물은 식이섭취량을 72% 감소시켰다 (하기 표 20 참조).The effects of the extracts of three - herbal extracts on the amount of dietary intake after 120 minutes were measured. As a result, the extract of Tricholoma extract reduced the dietary intake by 72% (see Table 20 below).

세발나물 추출물 투여가 흰쥐 식이 섭취량에 미치는 영향Effect of Herbal Extracts on Dietary Intake in Rats 실험군Experimental group 경구 투여 용량(mg/kg BW)Oral dose (mg / kg BW) 2시간 동안의 식이섭취량(g)Dietary intake (g) for 2 hours 대조군Control group -- 1.9 ± 0.181.9 ± 0.18 세발나물 추출물 투여군Herb extract 500500 0.54 ± 0.210.54 0.21

상기 표 20에 나타난 결과에 따르면, 2시간 동안의 식이섭취량은 세발나물 추출물 투여군이 대조군에 비해 훨씬 더 적은 것으로 나타났다. 이러한 결과를 볼 때, 세발나물 추출물을 투여한 군에서 항비만 효과가 우수할 것으로 생각되었다.
According to the results shown in the above Table 20, the dietary intake for 2 hours was much lower in the group administered with the extract of the herb extract than the control group. These results suggest that the anti - obesity effect in the group treated with the extract of T. japonica is excellent.

5) 5) ChlorideChloride 분비에 미치는 효과 (소화작용 촉진 효과 확인) Effect on secretion (confirmation of digestion promoting effect)

세발나물 추출물 투여가 위산 분비에 미치는 영향을 간접적으로 평가하기 위하여, 흰쥐의 혈청 중 chloride 농도를 측정하였다. 세발나물 추출물(500 mg/kg BW)을 경구 투여하여 30분 경과 후 혈액 중 chloride 농도를 측정한 결과, 세발나물 추출물 투여는 혈청 중 chloride 농도를 대조군에 비해 21% 증가시키는 효과가 있었다 (하기 표 21 참조). 이는 위산 분비 자극으로 인한 염산이 혈액으로 분비된 것으로 사료되어 소화작용 촉진 효과를 기대할 수 있다.In order to indirectly evaluate the effect of the extract on the gastric acid secretion, the concentration of chloride in the serum of rats was measured. As a result of measuring the chloride concentration in the blood after 30 minutes of orally administering the extract of the herb extract (500 mg / kg BW), the administration of the extract of the herbal extract had an effect of increasing the chloride concentration in the serum by 21% 21). This suggests that hydrochloric acid due to gastric acid stimulation is secreted into the blood, which can be expected to promote digestion.

세발나물 추출물 투여가 흰쥐 혈청 chloride 농도에 미치는 영향Effect of Herbal Extracts on the Serum Chloride Concentration in Rats 실험군Experimental group 경구 투여 용량(mg/kg BW)Oral dose (mg / kg BW) 혈청 chloride 농도(mg/dL)Serum chloride concentration (mg / dL) 대조군Control group -- 265 ± 19.1265 ± 19.1 세발나물 추출물 투여군Herb extract 500500 321 ± 21.4321 ± 21.4

상기 표 21에 나타난 결과에 따르면, 세발나물 추출물을 투여한 흰쥐의 혈청 클로라이드 농도가 더 높은 것을 알 수 있었다. 따라서, 상기 결과로 부터 세발나물 추출물이 위산 분비를 촉진시켜 소화작용을 촉진할 것으로 생각되었다.According to the results shown in Table 21, it was found that the serum chloride concentration in the rats administered with the extract of the herbal extract was higher. Therefore, it was thought that the extract of cedar herb extract promotes gastric acid secretion and promotes digestion by the above results.

Claims (18)

세발나물(Spergularia marina) 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 세발나물 추출물은 GLP-1, CCK 또는 5-HT의 분비를 자극하는, 항비만 또는 식욕 억제용 약학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising an extract of Spergularia marina as an active ingredient, wherein the extract of Cervarius herb extract stimulates the secretion of GLP-1, CCK or 5-HT. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 세발나물의 탄소수 1-4의 저급알코올 추출물을 헥산 또는 클로로포름으로 분획한 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.The pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the pharmaceutical composition is obtained by fractionating a lower alcohol extract having a carbon number of 1 to 4 of cedar herb extract by hexane or chloroform. 삭제delete 세발나물(Spergularia marina) 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 세발나물 추출물은 GLP-1, CCK 또는 5-HT의 분비를 자극하는, 항비만 또는 식욕 억제용 식품 조성물. Wherein the extract contains Spergularia marina extract as an active ingredient and the extract of Cervarius herb extract stimulates the secretion of GLP-1, CCK or 5-HT. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제9항에 있어서, 상기 식품 조성물은 세발나물의 탄소수 1-4의 저급알코올 추출물을 헥산 또는 클로로포름으로 분획한 것임을 특징으로 하는 식품 조성물.[10] The food composition according to claim 9, wherein the food composition is obtained by fractionating a lower alcohol extract having 1-4 carbon atoms of cetyl alcohol with hexane or chloroform. 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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