KR101605522B1 - 2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1Ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드[2-(3-hydroxy-4-(4-(3-methoxyphenoxy)-1H-pyrazol-3-yl)phenoxy)aceto-hydrazide] 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 상기 화합물이 프리온 단백질의 침반형성을 농도의존적으로 억제하고, 세포독성이 없으므로 프리온 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1Ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Compositions for prevention or treatment of Prion disease containing 2-(3-hydroxy-4-(4-(3-methoxyphenoxy)-1H-pyrazol-3-yl)phenoxy)aceto-hydrazide or pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient}
본 발명은 2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1Ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드[2-(3-hydroxy-4-(4-(3-methoxyphenoxy)-1H-pyrazol-3-yl)phenoxy)aceto-hydrazide] 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
변성 프리온(Abnormal Prion; PrPSc)이란 정상 프리온(normal Prion;PrPC)이 구조적으로 변형된 것으로 DNA나 RNA 등의 핵산이 관여하지 않고 단백질만으로도 증식될 수 있는 단백질성 감염 입자(Proteinaceous infectious particle)를 가리키는 것으로 1982년 Stanley B. Prusiner에 의해서 처음 제시되었다. 이들은 여러 가지 신경변성 질환의 원인이 되는데, 대표적인 질환으로 소의 광우병(mad cow disease), 소의 해면상 뇌병증(bovine spongiform encephalophathy, BSE), 사람에게서 발생하는 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD) 등이 있다.
약 250년 전 프리온 질환의 하나인 스크래피(scrapie)가 양에서 발병하고 보고된 이후 1930년경이 되어서야 이들의 전염성이 알려졌으며 1960년대가 되어서 J. S. Griffith에 의해 이들이 긴 잠복기를 갖고 있으며 일반적인 멸균법에 의해 분해되지 않는다는 것을 밝혀진 이후로 Prusiner가 변성 프리온이라 불리는 Prpsc 정제에 성공하고, 종래에 단백질 감염으로 알려진 것들이 프리온 감염으로 확장되었다.
프리온 단백질이 관심을 받는 것은 인간에서도 질환을 유발하기 때문이다. 1920년대에 광우병에 걸린 소를 섭취하여 광우병이 인간이 전염되어 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)이 발생된 것이 보고되었고, 그 당시에는 이들이 특정 유전요인에 의한 감염으로 생각되어 그 중요성이 대두되지 않았으나, 그 후 다양한 형태의 프리온 질환이 인간에게 나타나면서 최근에는 매우 중요한 질환으로 분류되고 있다. 1920년대 발견된 CJD 이외에도 파푸아뉴기니 원주민에게서 처음 발견된 Kuru의 경우 이 병에 걸린 사람 조직을 섭취함으로써 감염되었다는 것이 밝혀진 이후 프리온 질환의 전염성을 고려하게 되었다.
1980년대 프리온 유전자인 PRNP의 염기서열이 밝혀졌고 프리온 질환 중 유전적 성향을 가지는 가족성 CJD(familial CJD, fCJD), 저스만-스크라우슬러-쉥크병 (Gerstmann-Strussler-Scheinker syndrome, GSS), 치명적 가족성 불면증(Fatal familial insomnia, FFI) 환자들에게서 프리온 유전자 변이적 특성이 밝혀짐으로써 이들 질환에 대한 원인이 규명되었다. 21세기에 들어서면서는 프리온 질환에 감염된 환자에게 사용되었던 수술도구나 이들로부터 분리한 뇌경막 및 각막 등의 이식수술을 통해서도 프리온 질환이 전염된다는 사실이 알려지면서 의원성 CJD (iatrogenic CJD, iCJD)의 발생이 보고되었으며 프리온 유전자의 돌연변이나 의원성 요인이 없이도 전염이 일어나는 산발성 CJD(sporadic CJD, sCJD)도 보고되었다.
프리온 질환은 일종의 퇴행성뇌질환으로 일단 발병하면 치매와 매우 유사한 증상을 나타내며 발병 후 사망률이 100%이므로 그 심각성이 매우 증폭되었다. 그럼에도, 현재까지 적절한 예방이나 치료법이 발견되지 않았으며 조기 진단방법도 미흡한 현실에서 프리온 질환을 억제하는 저해제의 개발은 매우 시급한 상황이다.
프리온 질환은 정상 프리온 단백질(Prpc)의 단백질 접힘(protein folding)에 이상이 생겨 변성 프리온 단백질(Prpsc)을 형성을 통해 침반을 형성하면서 발생한다. 지금까지 많은 연구진들이 정상 프리온 단백질의 변성 기작에 대해 다양한 연구를 수행하여 왔지만 현재까지도 뚜렷한 원인을 규명하지는 못하고 있다. 질환의 발생 원인이 불명확한 이유로 이에 대한 치료제 개발 역시 미흡한 상태이다. 취리히 대학의 Aguzzi, A. 연구진은 프리온을 제거한 마우스에 항 프리온 유전자를 도입하여 체내에서 변성 프리온에 대한 항체의 생산에 의한 프리온 질병 예방이 가능하다는 것을 제시(Science. 2001. 294:178-182)한 바 있으나, 마우스가 태어날 때부터 항체를 지닌다는 점에서 치료제로의 활용은 어렵다는 결론을 내렸다. Stanley B. Prusiner 연구진은 말라리아 치료에 사용되는 퀴나크린(Quinacrine)이 프리온 단백질의 병원성 형태로의 변환 과정을 저해한다는 결과를 신경세포를 이용한 실험을 통해 보고(PNAS. 2001. 98:9836-9841)한 바 있으며 Cashman N. 연구팀은 프리온 단백질에서 특정 아미노산 서열에 대해 직접 작용하는 항체가 변성 프리온 단백질만을 선택적으로 인식하는 것을 2003년에 밝혔다(Nature Medicine. 2003. 9:819-820). 캘리포니아 Scripps 연구소의 Williamson R. A. 연구진은 건강한 생쥐의 두뇌에 항체를 주입 시 항체 그 자체가 신경을 죽일 수 있다는 새로운 사실을 보고하고 항체 치료법 연구시의 두뇌 손상의 위험성을 지적(Science. 2004. 303:1514-1516)하여 새로운 개념의 치료제 개발이 절실함을 역설하였다. 2007년 일본 기후 대학의 Kazuo Kuwata 연구팀은 159번째 아스파라긴산(Asp)과 196번째 글루타민산(Glu) 사이의 거리가 정상 프리온 보다 변성 프리온이 3개 긴 것에 주목하고, 이러한 형상 변화를 억제하여 프리온 병의 진행을 억제할 수 있는 GN-8이라는 화합물을 디자인 하였다(PNAS. 2007. 104:11921-11926). 이로부터 정상 프리온의 변성을 억제하여 침반형성을 저해할 수 있다면 다양한 프리온 질환의 치료제로 적용가능함이 확인되었다.
이에, 본 발명자들은 프리온 단백질의 침반형성을 저해하는 신규한 프리온 질환 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1Ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드[2-(3-hydroxy-4-(4-(3-methoxyphenoxy)-1H-pyrazol-3-yl)phenoxy)aceto-hydrazide]가 프리온 단백질의 침반형성을 농도의존적으로 억제하고, 세포독성이 없으므로 프리온 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1Ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드[2-(3-hydroxy-4-(4-(3-methoxyphenoxy)-1H-pyrazol-3-yl)phenoxy)aceto-hydrazide] 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112014076594437-pat00001
.
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1Ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드[2-(3-hydroxy-4-(4-(3-methoxyphenoxy)-1H-pyrazol-3-yl)phenoxy)aceto-hydrazide]는 프리온 단백질의 침반형성을 농도의존적으로 억제하고, 세포독성이 없으므로 프리온 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 프리온 단량체(monomer)를 안정화시키는 주요 결합 부위(Hot spot region)를 나타낸 도이다.
도 2는 프리온 단량체 안정화 부위에 결합하는 것으로 알려진 GN-8의 도킹 시뮬레이션된 결합 모드를 나타낸 도이다.
도 3은 프리온 단량체의 주요 활성 부위에 표현이 된 활성 골격을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 화합물 처리에 따른 프리온 단백질의 침반형성 억제 효과를 확인한 도이다:
error bar: 각 측정값에 대한 오차; 및
RLU: 상대적 발광 유닛(relative luminescence units).
도 5는 정상세포에서 본 발명의 화합물 처리에 의한 세포 독성 검사를 나타낸 도이다;
(A) 마우스 프리온 과발현 신경세포(L2-2B1)를 이용한 본 발명의 화합물 처리에 따라 세포 생존율은 5회 반복 실험한 결과의 평균값을 나타내며, error bar는 각 실험값의 오차범위를 나타낸다; 및
(B) N2a 신경세포를 이용한 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 생존율을 나타낸다.
이하, 본 발명의 용어를 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 조성물의 투여로 발병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, "개선" 또는 "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 있어서, "활성골격(Pharmacophore)"이라는 것은 약물(리간드)이 표적 질병 혹은 표적 단백질에 대해 효능을 나타내기 위해 필수적으로 가져야 할 화학적 그룹(혹은 특징)의 3차원 배열이다. 특히, 어떤 화합물이 단백질과 잘 결합하여 그 단백질의 활성을 증가 혹은 저해시키기 위해서는 활성골격의 정의가 매우 중요하다. 활성골격은 수소결합 주개(HBA), 수소결합 받개(HBD), 그리고 소수성 자리(Lipo)라는 일종의 요소(feature)로 구성되며 이들을 적절하게 조합하여 하나의 지도(map) 형태로 표현된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1Ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드[2-(3-hydroxy-4-(4-(3-methoxyphenoxy)-1H-pyrazol-3-yl)phenoxy)aceto-hydrazide] 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112014076594437-pat00002
.
상기 화합물은 프리온 단백질 침반을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 프리온 질환은 광우병(mad cow disease), 해면상 뇌병증(bovine spongiform encephalophathy; BSE) 또는 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 단백질 구조 기반의 가상 신약탐색을 통하여, 프리온 단량체(monomer)의 안정화에 활성이 있을 것으로 예상되는 상기 화학식 1로 기재되는 화합물을 선별한 후, 변성 프리온 형성 억제 효과를 검증하기 위하여 생물학적 실험을 실시하였다(도 1 내지 도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 화합물의 프리온 단백질의 침반형성 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명에서 선별한 화합물은 농도의존적으로 프리온 단백질의 침반형성을 억제하는 것을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 화합물의 세포독성을 확인한 결과, L2-2B1 세포 및 N2a 두 가지의 신경세포에 대해 본 발명의 화합물은 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 5 참조).
따라서, 본 발명의 2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1Ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드[2-(3-hydroxy-4-(4-(3-methoxyphenoxy)-1H-pyrazol-3-yl)phenoxy)aceto-hydrazide]는 프리온 단백질의 침반형성을 농도의존적으로 억제하고, 세포독성이 없으므로 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세미체, 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 화학식 1로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.
또한, 동량의 화학식 1로 표시되는 화합물, 및 산 수용액 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출 된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1Ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드[2-(3-hydroxy-4-(4-(3-methoxyphenoxy)-1H-pyrazol-3-yl)phenoxy)aceto-hydrazide] 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112014076594437-pat00003
.
상기 화합물은 프리온 단백질 침반을 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 프리온 질환은 광우병(mad cow disease), 해면상 뇌병증(bovine spongiform encephalophathy; BSE) 또는 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 2-(3-히드록시-4-(4-(3-메톡시페녹시)-1Ｈ-피라졸-3-일)페녹시)아세토-하이드라자이드[2-(3-hydroxy-4-(4-(3-methoxyphenoxy)-1H-pyrazol-3-yl)phenoxy)aceto-hydrazide]는 프리온 단백질의 침반형성을 농도의존적으로 억제하고, 세포독성이 없으므로 프리온 질환 예방 및 개선용 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 단백질 구조 기반의 가상 신약탐색을 통한 물질의 발굴
프리온에 의한 침반 형성은 정상적인 프리온 단량체(monomer)가 구조의 변화를 통해서 변성 프리온의 집합체가 신경세포의 사멸을 초래하는 기작으로 일어난다. 정상적인 프리온 단량체의 안정화를 통해서 변성 프리온으로의 전환 및 집합체 형성을 저해함으로써 광우병 유발을 억제하는 물질을 개발하고자 하였다.
구체적으로, 정상 프리온 단량체의 안정화를 유도하는 주요 결합 부위(Hot spot region)과 결합함으로써 변성 프리온의 축적을 저해하는 물질에 대하여 문헌 조사를 실시하였다. 알려진 주요 결합 부위에서 화합물과 상호작용하는 중용한 아미노산으로는 아스파라긴(Asn) 159번, 글루타민(Gln) 160번, 리신(Lys) 194번, 아스파라트산(Asp) 196번이다(도 1). 주요 결합 부위에 적합한 활성골격을 생성하기 위해서, 먼저 주요 활성 부위에 결합하는 것으로 알려진 대표적인 알려진 물질(GN-8)을 통해서 결합 모드를 도킹 시뮬레이션 하였다(도 2).
도킹 시뮬레이션에 의해서 추출한 결합 모드는 문헌 조사를 통하여서 양자 계산을 통해서 결합 모드를 결정한 자료의 결합 모드와 비교하여 적합성을 판별하였다. 도킹 시뮬레이션에 의한 결합모드를 분석한 결과, 주요 결합 부위의 핵심 아미노산들과 상호작용을 파악할 수 있었다. 글루타민 160번의 주골격(backbone) 카보닐(C=O, carbonyl) 그룹이 수소결합받개의 역할을 하고, 백본 아마이드 그룹의 질소가 수소결합 주개의 역할을 함으로써 GN-8과 수소결합을 이룬다. 리신 194번의 곁사슬(side chain)의 질소가 수소결합 주개의 역할을 함으로써 2개의 수소결합 상호작용이 있음을 확인하였고, 동시에 리신 194번의 곁사슬의 알킬(alkyl) 그룹과 소수성 상호작용을 이루는 것을 관찰하였다.
이상의 GN-8과 주요 결합 부위의 핵심 아미노산들과의 상호작용을 근거로 하여 활성골격을 생성하였다. 최종적으로 선정한 활성골격은 다음의 요소들로 구성이 되어 있다. 아스파라긴 159번의 주골격(backbone) 카보닐 그룹에 대한 수소결합 주개, 글루타민 160번의 곁사슬의 아마이드(amide) 그룹의 산소에 대해서 수소결합 받개, 리신 194번의 곁사슬의 질소에 대해서 수소결합 주개 그리고 주요 결합 부위를 가로 지르는 공간상에서 소수성 자리 요소 2개이다.
이상의 상호작용 요소들뿐만 아니라 프리온 monomer의 주요 결합 부위의 결합모양을 표현하기 위해서 핵심 아미노산들로부터 5~6을 선택하여 배타적 영역 (exclusive volume)으로 설정하였다(도 3).
가상 신약탐색을 위한 라이브러리는 Accelrys 사의 Discovery Studio/CatDB 의 형태로 구성하였으며 화합물은 3차원 구조의 다중 입체구조(multiple conformation)을 찾아내어 화학적으로 가능한 모든 형태 이성질체(conformer)를 포함할 수 있도록 파라미터(parameter)를 잘 조절하였다. 현재 약 700만 종을 포함한 화합물 라이브러리를 구축하였다. Discovery Studio의 'Search 3D Database' 프로토콜을 이용하여 구축한 가상탐색용 화합물 라이브러리에 포함되어 있는 모든 화합물에 대하여 탐색을 실시하였다. 각각의 화합물이 가지는 여러 가지 형태 이성질체를 활성 골격에 맵핑(mapping) 시키면서 활성골격에 설정한 상호작용 요소들과 화합물 분자의 원자 또는 하부구조가 적합하게 위치하는지를 평가하여 적합도(Fitness)를 측정하였다. 하나의 분자 내에서 적합도가 높은 형태 이성질체를 선별하고, 선별된 형태 이성질체가 유의한 적합도를 가지는지 평가를 한다. 이상의 과정을 통해서 최종적으로 400여만 개의 화합물 중에서 활성 골격과 같은 특징을 가지는 화합물들을 선택하였다. 가상 탐색을 통해서 1,110개의 화합물이 가상 선도물질로 선정하였다. 가상탐색의 기본적인 목적은 활성 골격을 통하여서 1차로 구조적인 다양성을 지니는 화합물들을 선별하는 것이다. 따라서 1,110개의 화합물 중에서 구조적인 다양성을 고려한 화합물을 선택하기 위해서 분자 지문 표현자의 하나인 FCFP(Functional Circular Fingerprint) 방법을 이용하여서 구조적으로 유사한 집단으로 분류하였다.
최종 유도물질을 선별하기 전, 프리온 monomer의 안정화에 활성이 있을 것으로 예상이 되는 중점 데이터베이스(Focused library)를 생성하였다. 프리온 단량체에 활성이 있을 것으로 예상이 되는 물질에 대한 중점 데이터베이스는 추후에 변성 프리온 저해제 발굴에 중요한 인프라가 될 것이다. 총 300종의 화합물로 중점 데이터베이스를 구성한 후 300종의 화합물 내에서 분자 간의 유사도를 측정하여 최종 31개의 화합물을 선택하였다. 이 중에서 현재 구매 가능한 화합물 20여 종 중 하기 [화학식 1]로 기재되는 화합물을 선별하여 변성 프리온 형성 억제 효과를 검증하기 위한 생물학적 실험을 실시하였다.
[화학식 1]
Figure 112014076594437-pat00004
.
< 실시예 2> 프리온 단백질의 침반형성 억제 효과 검증
정상 프리온 단백은 42%의 α-helix와 3%의 β-sheet 구조로 구성되어 있으나 변성 프리온 단백은 β-sheet 구조가 43%로 증가하는 2차 구조를 형성하면서 응집(aggregation)을 형성하는 특성을 나타낸다. 이러한 특성을 이용하여 개발된 Multimer Detection System(MDS)은 멀티머(multimer) 형태의 프리온 단백만을 측정하는 실험법으로, 상기 <실시예 1>에서 선별한 화합물을 프리온 단백에 처리하였을 때 침반의 형성을 저해하는 정도를 측정함으로써 저해제의 효과를 검증하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 선별한 화합물을 DMSO를 이용하여 50mM의 농도로 가용화 시켜 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다. 상기 화합물은 사용직전 0.5 μM, 10 μM, 100 μM의 세 가지 농도로 조정하여 처리하였으며, 80 ng의 재조합 인간 프리온 단백(ajROBOSCREEN)과 섞어 37℃ 인큐베이터에서 3시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 그런 다음, 상기 반응물에 포획 및 검출에 필요한 두 가지 종류의 항 프리온 항체(3E7-ajROBOSCREEN, T2-HRP-일본 NIAH 연구소)를 1시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 교반 반응시키고 ECL substrate를 이용하여 발광시킨 후 발광측정장치(luminometer)를 이용하여 그 발광 값을 측정하여 멀티머 생성 저해 정도를 평가하였다. 아울러, 양성 대조군(rHuPrP)은 재조합 인간 프리온 단백을 사용하였고, 음성대조군으로는 Tris buffered saline-Tween 20(TBS-T)을 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군에 비하여 상기 <실시예 1>에서 선별한 화합물 처리군에서는 0.5 μM의 경우 62%, 10 μM은 79%, 100 μM에서는 92%의 멀티머의 생성이 유의적으로 감소함을 확인하였다(도 4).
< 실시예 3> 세포 독성 확인
상기 <실시예 1>에서 선별한 화합물이 세포에 미치는 독성을 평가하기 위하여 MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, invitrogen) 방법을 적용하였다. 정상 세포의 경우, MTT는 미토콘드리아 내의 환원효소(reductase)에 의해 환원되어 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 형성하며 이렇게 형성된 크리스탈을 분광학적인 방법으로 측정함으로써 상기 화합물의 독성에 의해 사멸되는 정도를 평가하였다.
구체적으로, N2a 신경세포(ATCC) 및 마우스 프리온 과발현 세포(L2-2B1)(국립보건연구원 인수공통감염과에서 수득)를 이용하여 수행하였으며, 각 세포는 4x104/웰로 96 웰 플레이트(well plate)에 깔고 상기 <실시예 1>에서 선별한 화합물을 0.5 μM, 10 μM, 30 μM, 60 μM, 100 μM의 농도로 24시간 동안 37℃, CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 이때 음성대조군은 저해제 대신 PBS를 동일 용량으로 처리하였다. 이후 5mg/ml 농도로 PBS에 녹인 MTT를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 다시 37℃, CO2 인큐베이터 내에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 4시간 후 MTT 용액을 제거하고 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 30분간 반응시키고 분광광도계를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 음성 대조군에 대한 저해제의 OD 값을 비교하여 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 L2-2B1 세포 및 N2a 두 가지의 신경세포에 대해 본 발명의 화합물은 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(도 5).
< 제조예 1> 약제의 제조
1. 산제의 제조
본 발명의 화합물 500 ng
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
본 발명의 화합물 500 ng
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
본 발명의 화합물 500 ng
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 주사제의 제조
본 발명의 화합물 500 ng
만니톨 180 mg
Na2HPO42H2O 26 mg
증류수 2974 mg
통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온(prion) 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112014076594437-pat00005
    .
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 프리온 단백질 침반을 억제하는 것을 특징으로 하는 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 프리온 질환은 광우병(mad cow disease), 해면상 뇌병증(bovine spongiform encephalophathy; BSE) 또는 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)인 것을 특징으로 하는 프리온 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 프리온 질환 예방 및 개선용 건강기능식품:
    [화학식 1]
    Figure 112014076594437-pat00006
    .
  5. 제 4항에 있어서, 상기 화합물은 프리온 단백질 침반을 억제하는 것을 특징으로 하는 프리온 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 프리온 질환은 광우병(mad cow disease), 해면상 뇌병증(bovine spongiform encephalophathy; BSE) 또는 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)인 것을 특징으로 하는 프리온 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
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