KR101600167B1 - Ｓｏｘ２를 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Ｓｏｘ２를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대장암 세포에서 과발현된 Sox2는 자가소화를 유도하는 유전자인 ATG10의 프로모터와 결합함으로써, ATG10의 발현을 활성화시킬 수 있다. Sox2에 의해 활성화된 ATG10는 대장암 세포의 자가소화를 유도하고 ATG10에 의해 유도된 자가소화는 암세포 내에 액포 생성 및 리소좀 작용을 활성화시켜 세포 사멸을 효과적으로 증가시키며, 암세포 노화를 유도하여 암 세포의 분화 및 증식을 억제함으로써, 종양의 성장을 억제할 수 있다.
또한 본 발명의 Sox2를 포함하는 조성물은 정상세포에는 영향을 주지 않고 대장암 세포에 선택적으로 자가소화를 유도하여, 암치료에 있어 발생하는 부작용은 감소시키고 암세포 사멸을 증진시킴으로써, 효과적으로 대장암을 예방하거나 치료할 수 있다.

Description

Ｓｏｘ２를 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating colon cancer containing Ｓｏｘ２}
본 발명은 Sox2를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여 암세포에 자가소화를 유도함으로써, 대장암 세포의 노화 및 사멸을 통하여 대장암 예방 또는 치료에 제공되는 약학조성물에 관한 것이다.
대장암은 동물성 지방질과 고기를 많이 먹는 미국이나 유럽에 사는 민족에게서 주로 발생하며, 특히 미국에서는 발생률과 사망률이 모두 두 번째로 높은 암이다. 한국이나 일본을 비롯한 아시아 각국에서는 서구에 비하여 발생률이 낮으나 근래에는 식생활이 서구화 되어감에 따라 대장암의 발생률이 증가하고 있는 추세이다. 이러한 대장암의 발생원인은 아직까지 확실하게 밝혀지지 않았으나, 가족성 대장용종증, 특발성 비특이성 궤양성 대장염, 대장 및 직장의 용종, 특히 융모성 선종인 경우 암으로 변화할 수 있는 병으로 알려져 있다.
이러한 대장암의 치료는 내시경을 이용하여 용종을 암이 되기 전에 미리 제거하여 예방하거나, 용종 형태의 작은 크기의 대장암의 경우 내시경적 절제수술만으로도 치료가 가능하다. 또한 대장암의 주된 치료법으로 외과적 수술방법이 있으며, 수술 후 항암제와 더불어 방사선 요법을 시행하고 있다. 그러나 항암제와 방사선 요법은 암세포를 비롯하여 정상세포의 손상까지 유도하는 부작용이 있다.
자가소화는 진핵생물의 이화 과정으로 수명이 오래된 단백질, 세포 소기관 및 벌크 세포질을 리소좀 시스템을 통하여 분해시킴으로써, 영양결핍이 진행되는 동안 아미노산 풀을 유지하는 기능을 통하여 배아 착상전의 성장, 신경퇴행의 억제 및 정상 성장시 항상성 유지 역할을 하며, 손상된 기관의 세포, 독성 대사물질 및 세포내 병원균을 제거하고 생체 기능 유지를 위해 요구되는 세포 내 구성단위를 만들어 냄으로써, 세포 생존에 관련된 모든 과정에서 중요한 역할을 한다.
이러한 자가소화는 필수적인 세포 구성성분의 과도한 자기 소화 및 분해를 통하여 세포사멸을 촉진시킬 수 있어, 중요한 암 처리 치료 방법 중 하나로 알려져 있다. 그러나 최근에는 자가소화가 죽어가는 세포의 자가식포 및 자가라이소좀 부족 과정에 의한 사포사멸과 다르게 베클린이 넉아웃되면, 자가소화가 차단되고 이는 종양 발달을 유도한다는 연구가 보고되어진 반면, 라스베라트롤과 같은 천연 화합물을 암세포에 처리한 경우 자가소화가 유도되어 암세포의 세포증식 및 악성종양을 억제결과가 보고되어짐에 따라 자가소화를 이용한 암 치료에 대한 논쟁이 진행중이다.
또한 최근 보고된 바에 의하면, 유사 분열 사람 이배체 세포에서 억제된 자가소화작용이 세포노화를 지연시키는 연구 결과에 의해 자가소화작용과 세포노화가 관련있음이 확인되어 졌다. 이러한 관점에서 볼 때, 자가소화는 암세포의 노화 및 암세포 스스로 세포 사멸을 유도할 수 있으며, 이를 이용하여 새로운 암치료 방법을 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
Sox2는 높은 이동성 그룹(HMG) 전사인자로 세포 운명, 분화 및 증식을 결정하는 역할을 하며, 배아 줄기세포의 자기 재생 및 iPS 세포로 말기 분화된 세포의 재프로그래밍에 중요한 조절자이다.
지금까지 Sox2와 같은 줄기 세포 인자 연구 보고에 의하면, 줄기세포와 암세포가 유사한 줄기세포능을 나타내는 것이 밝혀졌고 그에 따라, Sox2와 같은 줄기 세포 인자의 발암가능성에 대해서 지금까지 많은 논란이 있지만, 암세포에서 Sox2의 기능에 대해서는 명확하게 밝혀진 바가 없다.
이에 본 발명자는 암세포에서 Sox2의 역할 및 매커니즘을 연구하는 중 대장암에서 과발현된 Sox2가 암세포의 자가소화작용을 유도할 수 있는 ATG10 유전자의 발현을 유도하는 것을 최초로 발견하였으며, 이를 대장암 세포에 적용하고 효과적인 암 세포 사멸 결과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
미국공개특허 US 2012-0214684 A1 (2012.08.23)
본 발명은 Sox2를 함유하는 조성물을 제공하여, 대장암 세포의 자가 소화 및 세포 노화를 유도함으로써, 대장암 세포 사멸 효과를 증진시켜 대장암을 예방 또는 치료에 사용할 수 있는 약학조성물을 제공한다.
본 발명은 Sox2를 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 Sox2는 대장암 세포에서 ATG10의 발현을 촉진시킴으로써, 대장암세포의 자가소화를 유도하여 대장암세포의 노화 및 사멸을 증진시킬 수 있다.
본 발명은 Sox2를 유효성분으로 함유하는 ATG10 활성화 또는 발현촉진용 조성물을 제공한다.
상기 Sox2는 ATG10 프로모터와 결합하여 ATG10의 발현을 촉진시킴으로써, 세포의 자가소화를 유도할 수 있다.
또한 본 발명은 Sox2를 유효성분으로 함유하는 자가소화작용 장애 관련 질환 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 질환은 척추과민증, 잠재이분척추증, 관절강직, 무균성 골괴사, 골수염, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중, 타우병증, 근위축성 측삭경화증, 헌팅턴 병, 전두측두엽 치매, 척수소뇌성 실조증, 암, 데스민 관련 심근증, 감염성 질환, 염증성 질환 및 다농병으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 대장암 세포에서 과발현된 Sox2는 자가소화를 유도하는 유전자인 ATG10의 프로모터와 결합함으로써, ATG10의 발현을 활성화시킬 수 있다.
이렇게 Sox2에 의해 활성화된 ATG10는 대장암 세포의 자가소화를 유도하고 ATG10에 의해 유도된 자가소화는 대장암세포 내에 액포 생성 및 리소좀 작용을 활성화시켜 세포 사멸을 효과적으로 증가시키며, 대장암세포 노화를 유도하여 암 세포의 분화 및 증식을 억제함으로써, 종양의 성장을 억제할 수 있다.
또한 본 발명의 Sox2를 포함하는 조성물은 정상세포에는 영향을 주지 않고 대장암 세포에 선택적으로 자가소화를 유도하여, 대장암치료에 있어 발생하는 부작용은 감소시키고 암세포 사멸을 증진시킴으로써, 효과적으로 대장암을 예방하거나 치료할 수 있다.
도 1은 Sox2의 이소성 발현에 의해 유도되는 자가소화를 확인한 결과로, 1A는 iPS 인자의 이소성 발현에 의한 형태학적 변화를 유도하여 비교한 결과로, HCT116 세포에 iPS인자인 Sox2, Nanog, Lin28 및 Oct4를 각각 형질주입한 후 5일간 배양하고 광학현미경으로 변화를 확인한 결과(X200)와 형질주입 5일후 세포를 수집하고 단백질을 추출하여 Sox2, Nanog, Lin28 및 Oct4의 단백질 수준을 확인한 웨스턴 블롯팅 결과로 베타-액틴을 내부 대조군으로 비교하였으며, 1(B)는 액포형성을 확인한 결과로, HCT116 세포의 형질주입 5일 후 액포가 형성된 것을 확인하였으며, 광학현미경을 이용하여 액포를 계수한 후 비교한 그래프와 대조군인 mock및 Sox2 과발현을 웨스턴 블로팅과 면역세포질형광분석(x200)을 수행하여 확인한 결과이며, 1(C)는 리소좀 활성을 분석한 결과로, mock및 Sox2로 각각 감염된 HCT116 세포에 라이소트랙커 50nM을 첨가한 후 37℃에서 5% CO₂조건으로 5분간 인큐베이션한 후 4% 포르말린으로 고정시키고 PBS로 세척하여 형광현미경(x200)으로 리소좀 활성을 확인한 결과이며, 1(D)는 LC3b(ATG8b)의 면역형광분석 결과로, mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116세포에서 LC3b를 형광현미경(x200)을 이용하여 확인한 결과이며, DAPI로 핵 염색 후 광학현미경(x200)으로 관찰한 결과이다.
도 2는 암세포 특이적 리소좀 활성을 확인한 결과들로, 2(A)는 CCD-18Co(CRL-1459) 정상 대장세포와 HCT116, HT29 및 WiDr 대장암세포을 배양한 후 Sox2 바이러스 형질주입한 후 성장배지에서 5일간 형질전환시킨 후 광학현미경을 이용하여 각각의 세포를 확인한 결과로, 화살표는 Sox2가 발현된 대장암세포내 생성된 세포액포를 나타내며, 2(B)는 CCD-18Co 정상 대장세포에 mock 또는 Sox2 바이러스를 형질주입한 후 5일간 배양배지에서 성장시킨 후 세포를 고정하고 Sox2 특이적 항체를 투과시켜 결합시킨 후 Alexa 568이 결합된 2차 항체와 결합시켰으며, 핵은 DAPI로 염색한 후 형광현미경으로 관찰한 결과로, 광학현미경 분석결과와 Sox2 및 DAPI 형광분석결과를 비교한 것이며, 2(C)는 CCD-18Co 정상 대장세포 및 HCT116 대장암세포에 mock 또는 Sox2를 감염시키고 5일 후 리소좀 활성을 비교하기 위해 리소트랙커-레드 50nM을 첨가하여 형광현미경(x200)분석을 수행한 후 동일한 부분을 광학현미경(x200)으로 분석하여 비교한 결과이다.
도 3은 Sox2의 자가소화를 유도 매커니즘을 확인한 결과로, 3(A)는 mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116 대장암세포의 마이크로어레이 분석결과로, 노란색은 mock와 Sox2 발현에 있어서 유의적 차이점이 발견되지 않은 유전자의 수를 나타내며, 적색과 녹색은 대조군인 mock가 발현된 세포와 비교하여 Sox2가 발현된 HCT116 세포의 상향 또는 하향 조절에 관여하는 유전자의 수를 나타낸 결과이며, 아래 테이블은 마이크로어레이 분석결과에서 자가소화와 관련된 유전자를 요약한 것이며, 3(B)는 Sox2에 의해 유도되는 ATG10발현을 확인한 결과로, mock 또는 Sox2를 감염시킨 HCT116 세포에서 추출한 전체 RNA 1을 역전사하고 ATG10을 싸이클 의존성 PCR로 증폭시킨 후 21번 싸이클 증폭물을 아가로스 젤 전기영동하여 ATG10 발현 수준을 확인한 결과로 베타-액틴을 내부 대조군으로 이용하여 PCR과정에서 동일한 양의 cDNA가 사용되었음을 확인하였으며, 3(C)는 Sox2 발현에 의해 ATG10 및 LC3b(ATG8b) 단백질 수준의 상향 조절이 유도되는 것을 확인한 결과로, mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116 대장암세포에서 단백질을 추출하고 동일한 양으로 웨스턴 블롯팅하여 ATG10 및 LC3b(ATG8b) 단백질 수준을 확인한 결과로, 베타-액틴을 내부 대조군으로 이용하였으며, 3(D)는 ATG10 단백질 발현이 Sox2에 의해 유도되는 것을 확인한 결과로, HCT116 대장암세포에 mock 또는 Sox2를 감염시켜 5일간 배양시킨 후 세포를 고정하고 ATG10 특이적 일차항체와 Alexa 488이 결합된 이차항체를 세포에 결합시킨 후 ATG10 단백질 수준을 형광현미경(x200)으로 관찰하였으며, 동일한 부분을 광학현미경(x200)으로 관찰한 결과이며, 3(E)는 ATG10 프로모터 루시퍼라아제 리포터 플라스미드 설계도로 사람 ATG10 프로모터 부분의 뉴클레오티드 서열은 Ensemble(http://uswest.ensemble.org)로부터 얻었으며, 추정되는 프로모터 분석은 TFSEARCH(v1.3)(http://cbrc.jp/htbin/nph-tfsearch)를 이용하여 추정되는 SRY 및 Sox 가 결합하여 일치하는 서열을 적색으로 나타내었으며, 중합효소 Ⅲ가 결합하는 부분은 박스 표시하였으며, 3(F)는 BAC 클론(RP11-111B20)을Empire Genomics (Buffalo, NY)에서 구입하여 ATG10 프로모터의 1528 및 711bp 부분을 PCR 증폭하였으며, PCR 증폭물들과 pGL3 베이직 벡터를 재조합하여 pGL3-AT10-1582와 pGL3-ATG10-711 루시퍼라아제 리포터 플라스미드를 제작하였으며, DNA 시퀀싱을 통하여 pGL3-ATG10-luc 리포터 플라스미드를 확인하고, 확인된 ATG10 플라스미드인 pGL3-ATG10-1582와 pGL3-ATG10-711-luc을 HCT116 세포에 일시적으로 형질주입시켜 24시간 동안 루시퍼라아제 활성을 분석한 결과로, phRL-SV40 레닐라(renilla) 루시퍼라아제 리포터 플라스미드를 함께 형질주입하여 내부 대조군으로 사용하여 루시퍼라아제 활성을 규격화하였으며(*p<0.001), 3(G) pGL3-ATG10-1582 루시퍼라아제 리포터 플라스미드를 mock 또는 Sox2 바이러스 발현 벡터와 함께 HCT116 세포에 일시적으로 형질주입한 후 24시간 동안 루시퍼라아제 활성을 분석한 결과로, phRL-SV40 레닐라(renilla) 루시퍼라아제 리포터 플라스미드를 함께 형질주입하여 내부 대조군으로 사용하여 루시퍼라아제 활성을 규격화하였다(*p<0.001).
도 4는 Akt 신호전달 과정의 하향 조절을 통한 Sox2 자가소화 유도를 확인한 결과로, 4(A-C)는 mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116에서 Akt, mTOR 및 p70S6K와 같은 클래스 Ⅰ신호 분자; Vps34p와 같은 클래스 Ⅲ PI3-K 신호 분자 및 베클린의 단백질 수준을 각각의 특이적 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여 분석하였으며 베타-액틴을 내부 대조군으로 이용하였으며, 4(D)는 Sox2에 의해 유도되는 자가소화와 관련된 클래스 Ⅰ PI3-K 신호를 확인한 결과로, 왼쪽 현미경 사진 결과는 mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116에 5/ml 인슐린 또는 5LY294002를 10% 태아소혈청이 포함되는 조건에서 2일 동안 감염시킨 후 광학현미경(x200)으로 액포 형성을 확인한 결과이며, 오른쪽 현미경 사진 결과는 HCT116세포에 Sox2 바이러스 입자를 형질주입 후 2일간 배양하여 태아소혈청이 첨가되지 않은 McOoy's 5a 배양 배지로 교체한 후 5/ml 인슐린 또는 5LY294002를 첨가하여 5일 동안 배양한 세포를 광학현미경(x200)으로 관찰한 결과이며, 4(E) 클래스 Ⅰ PI3-K 신호로 유도된 자가소화 생성 정도를 비교한 결과로, 액포 생성된 세포를 D의 현미경 결과로 계수한 후 그 결과를 나타낸 그래프이다(*p<0.001).
도 5는 HCT116 세포에서 Sox2에 의해 유도되는 자가소화에 의한 세포 노화, 세포 증식 및 부착-독립성 콜로니 성장 감소를 확인한 결과로, 5(A)는 Sox2 발현에 의한 세포 증식 효과를 확인한 결과로, 왼쪽의 그래프는 mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116세포 2×103 개를 96웰-플레이트에 접종하고 24시간 내지 96시간 MTS 분석을 수행하여 세포 증식을 확인(*p<0.001)한 결과이며, 가운데와 왼쪽의 그래프는 Sox2 발현에 의한 세포 주기 분포를 나타낸 결과로, mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116세포 4×105개를 접종하여 배양하고 세포 주기를 분석하였으며, FACS를 수행하여 sub-G1 축적을 분석한 결과이며(*p<0.001), 5(B)는 Sox2 발현에 의한 부착-독립성 콜로니 성장 효과를 확인한 결과로, mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116세포 8×103개를 소프트 아가에서 5 내지 7일간 콜로니 성장시켜 현미경과 이미지-프로 PLUS (v6) 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용하여 세포 콜로니를 점수화한 결과이며(*p<0.001), 5(C)는 mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116에 단백질을 추출하여 세포 주기 조절과 관련된 단백질의 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯팅 결과이며, 5(D)의 왼쪽 사진은 mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116에 노화 β-갈락토시다아제 염색 키트를 이용하여 수행한 세포 노화 분석 결과와 β-갈락토시다아제 또는 Ki-67의 단백질 수준을 확인하기 위해 특이적 일차 항체와 HRP가 결합된 이차항체를 mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116에 결합시키고 시그마 FASTTM 3,3'-디아미노벤지딘 테라하이프로클로라이드와 메탈 향상 타블렛 세트를 이용하여 수행한 면역세포화학 분석결과를 확인한 광학현미경 사진이며, β-갈락토시다아제 양성 세포 밀도를 나타낸 그래프이다(*p<0.001).
도 6은 ATG10 넉아웃에 따른 Sox2에 의한 자가소화, 세포노화 및 세포증식 회복을 확인한 결과로, 6(A) ATG10의 넉아웃 효과를 확인하기 위해 pLKO-shATG10을 이용하여 ATG10을 넉아웃시켰다. pLKO-shATG10 넉아웃 렌티-바이러스 입자를 mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116에 감염시킨 후 36시간 동안 배양한 후 단백질을 추출하고 특이적 ATG10 항체와 베타-액틴으로 웨스턴 블롯팅하여 넉아웃 효과를 확인한 결과이며, 6(B) 형태학적 변화를 확인한 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116에서 ATG10 넉아웃이 유도한 세포의 형태학적 변화를 확인한 결과로, 특이적 항체를 이용하여 HCT116-mock; HCT116-Sox2 및 HCT116-Sox2/shATG10 세포의 형태학적 변화와 Sox2의 단백질 수준을 적색으로 ATG10의 단백질 수준을 녹색으로 나타낸 면역형광분석 결과(x200) 및 광학현미경(x200)을 이용한 세포 관찰 결과이며, 6(C) 는 Sox2/shATG10 세포를 4-챔버 슬라이드에 접종시키고 고정시킨 후 세포 식, 세포 노화 및 세포 주기 조절 마커인 Ki-67, β-갈락토시다아제, p16INK4a 및 p21을 투과시킨 후 시그마 FASTTM 3,3'-디아미노벤지딘 테라하이프로클로라이드와 메탈 향상 타블렛 세트를 이용한 면역세포화학을 수행하여 투과된 마커를 형광 또는 광학현미경(x200)으로 분석한 결과이며, 6(D)는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116에서 넉다운된 ATG10에 의해 회복된 세포 증식결과로, HCT116-mock; HCT116-Sox2 및 HCT116-Sox2/shATG10 세포를 2×103으로 96 웰-플레이트에 접종한 후 MTS 분석을 24 내지 96시간 간격으로 수행한 결과이다(*p< 0.05, *p<0.001).
도 7은 이종이식 마우스 동물 모델에서 Sox2에 의해 유도된 자가소화의 암 성장 억제 효과를 확인한 결과로, 7(A)는 mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116 세포 3×106개를 무흉선 누드마우스의 오른쪽 측면 피하에 주사하여 생체 내에 이종이식된 종양의 성장을 확인한 결과로, 세포 주사 30일 후 종양의 크기를 확인하였으며, 7(B)는 Sox2 발현에 따른 무흉선 누드 마우스 내 종양의 성장이 지연된 것을 확인한 결과로, mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116 세포 주사 후 종양이 처음 관찰된 시점을 비교한 결과이며(*p< 0.05, *p<0.01), 7(C)는 mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116 세포의 평균 종양 성장을 계산하여 비교한 그래프이며(*p< 0.05, *p<0.01), 7(D)는 종양 조직의 면역화학형광 분석 결과로, 각각의 종양 조직을 해부하고 Zamboni's fixative로 고정하여 조직 슬라이드를 제작하였으며, 그 조직에 Sox2 관찰 및 시각화를 위해 적색의 특이적 항체인 Cy3와 ATG10 및 ATG8b 관찰을 위한 녹색의 특이적 항체 Cy2를 결합시키고 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용하여 관찰한 결과(X200; NIKON C1si Confocal Spectral Imaging System, NIKON Instruments Co.)이다.
본 발명은 Sox2를 유효성분으로 함유하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예를 참고하면, 대조군인 mock가 발현된 HCT116 또는 Sox2가 발현된 HCT116 대장암 세포를 무흉선 누드 마우스에 주사한 이종이식 동물 모델의 종양 성장을 측정한 결과, 도 7(B)와 같이 Sox2가 발현된 HCT116 대장암 세포를 주사한 마우스군은 대장암 세포 주사 21 후 종양이 최초로 발견된 반면, 대조군인 mock가 발현된 HCT116를 주사한 마우스 군은 주사 9일 후부터 종양이 발견되었으며, 일주일에 두 번 종양의 크기를 측정한 결과 도 7(C)와 같이 Sox2가 발현된 HCT116를 주사한 마우스의 종양 성장 속도가 대조군의 종양 성장 속도보다 상당히 지연된 것을 확인할 수 있었다.
Sox2는 대장암 세포에서 ATG10의 발현을 촉진시킴으로써, 대장암세포의 자가소화를 유도하여 대장암세포의 노화 및 사멸을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예인 도3(B)의 PCR결과 및 도 3(C)의 웨스턴 블로팅 결과를 참고하면, Sox2가 자가소화를 유도하는 ATG10 유전자의 발현을 증가시키는 것이 확인되었으며, 도 3(D)의 면역화학형광 분석 결과에서도 역시 Sox2에 의한 ATG10 유전자 발현 증가가 확인되었다. 또한 pGL3-ATG10 루시퍼라아제 리포터 프로모터를 이용한 루시퍼라아제 분석결과 도 3(F) 및 3(G)와 같이, 대조군인 mock이 발현된 HCT116 보다 Sox2가 발현된 HCT116에서 Sox2에 의해 억제된 루시퍼라아제 프로모터의 루시퍼라아제 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한 Sox2에 의해 유도된 자가소화가 대장암세포에 미치는 영향을 확인한 결과, 도 5(A)와 같이 자가소화가 유도된 HCT116의 세포 주기단계가 G1기 상태로 세포 증식이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 또한 도(C)의 웨스턴 블롯팅 결과 Sox2가 발현된 HCT117 세포에서 세포노화와 관련된 p16INK4a , p21 및 인산화된 p53의 발현이 증가된 것이 확인되었으며, 세포 노화 분석 결과인 도 5(D)에서도 β-갈락토시다아제 및 Ki-67의 활성이 억제된 것이 확인되었다.
상기 결과들로부터 Sox2에 의해 유도된 자가소화는 대장암세포인 HCT116의 세포 주기 진행을 억제하고, 세포노화를 증가시킴으로써 Sox2에 의한 대장암세포의 증식 억제 및 사멸 효과를 확인하였다.
본 발명은 Sox2를 유효성분으로 함유하는 ATG10 활성화 또는 발현촉진용 조성물을 제공한다.
상기 Sox2는 ATG10 프로모터와 결합하여 ATG10의 발현을 촉진시킴으로써, 세포의 자가소화를 유도할 수 있다.
또한 본 발명은 Sox2를 유효성분으로 함유하는 자가소화작용 장애 관련 질환 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 질환은 척추과민증, 잠재이분척추증, 관절강직, 무균성 골괴사, 골수염, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중, 타우병증, 근위축성 측삭경화증, 헌팅턴 병, 전두측두엽 치매, 척수소뇌성 실조증, 암, 데스민 관련 심근증, 감염성 질환, 염증성 질환 및 다농병으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, Sox2를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, Sox2를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.
상기 Sox2를 유효성분으로 함유하는 약학조성물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 1> 물질 및 시약
화학 시약으로 분자 생물학 및 버퍼 준비를 위한 Tris, NaCl 및 SDS는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였으며, 제한효소 및 변형된 효소는 New England BioLabs,Inc.(Beverly, MA)에서 구입하였으며, Taq DNA 중합효소는 Qiagen, Inc. (Valencia, CA)에 얻었으며, DNA 결합(ligation) 키트(v.2.0)는 TAKATA Bio, Inc. (Otsu, Shiga, Japan)에서 구입하였다.
pSin-EF2-Sox2, -Nanog, -Oct4 및 -Lin28가 포함된 렌티바이러스 발현 벡터는 Addgene Inc. (Cambridge, MA)에서 구입하였다. 베클린과 ATG8b (LC3-b)에 대한 항체는 ABGENT (San Diego, CA)에서 p16INK4a 및 p21는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA)에서 각각 구입하였다.
Nanog, Oct4, Lin28 및 ATG10 항체는 Abcam (Cambridge,MA)에서 구입하였으며, 라이소트랙커(Lysotracker)는 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하였고, Sox2, Class III PI3-K, 인산화된 p53(Ser15), 전체 및 인산화된 Akt, mTOR, p70 S6 키나아제와 β-갈락토시다아제는 Cell Signaling Technology,Inc. (Danvers, MA)에서 구입하였다.
세포 노화 분석을 위한 SA-β-갈락토시다아제 분석 키트는 Cell Signaling Technology,Inc. (Danvers, MA)에서 구입하였으며, 세포 증식 분석을 위한 CellTiter 96® Aqueous One Solution은 Promega (Madison, WI)에서 구입하였다.
또한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 및 McCoy's 5a 배지는 Cellgro (Manassas, VA)에서 구입하였다.
< 실험예 2> 세포배양 및 형질주입( Transfection )
HEK293T, HCT116, CCD-18Co, HT29 및 WiDr 세포를 ATCC에서 구입하였으며, ATCC에서 제안한 조건에 따라 배양 및 유지시켰다.
HEK293T 세포는 10% 태아소혈청(FBS)와 항생제가 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Cellgro , Manassas, VA) 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, HCT116 대장암 세포는 10% 태아소혈청(FBS)과 항생제가 포함된 McCoy's 5a 배지( Cellgro , Manassas, VA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
Sox2, Oct4, Nanog 및 Lin28 바이러스 입자를 각각의 바이러스 벡터와 pMD2.0G 및 psPAX 패킹 벡터를 JetPEI (QBiogene, West Chester, PA)를 이용하여, Addgene의 설명서에 따라 HEK293T 세포 내로 형질주입시켰다. 형질주입 4시간 후 배양 배지로 교체하고 36시간 동안 배양하고 0.45μM 소디움 아세테이트 주사기 필터로 여과하여 바이러스 입자를 수집하였다. 수집된 바이러스 입자를 60% 합류된 HCT116 세포에 8 μg/ml 폴리 브렌(polybrane; Millipore, Billerica, MA)을 이용하여 하룻밤 동안 감염시켰다.
그 후 신선한 세포 배양 배지로 교체하여 24시간 동안 인큐베이션하고 1.5 μg/ml 퓨로마이신을 선택적으로 36시간 동안 처리하였다.
< 실험예 3> MTS 분석
세포 증식 평가를 위해, mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116 세포에 트립신 처리한 후 계수하여 96-웰(well)플레이트에 한 웰당 2×103 세포로 접종한 후 2시간 동안 배양하고 각각의 웰에 CellTiter 96® Aqueous One 용액을 20μl씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 배양하였다.
그 후 반응 종료를 위해, 10% SDS 용액을 25μl씩 첨가하고 492 및 690 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식은 24시간 간격으로 측정되었다.
< 실험예 4> 세포 주기 분석
mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 4×105 개의 HCT116 세포를 60 mm 디쉬에 접종하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 16시간 동안 배양하였다.
배양 배지를 교체하여 24시간 동안 배양한 후 트립신처리하고 메탄올로 고정한 후 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide; PI)로 염색하였다.
그 후 FACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 이용하여 세포 주기 단계를 분석하였다.
< 실험예 5> 웨스턴 블롯팅
RIPA 세포 융해 버퍼로 세포를 동결 및 융해시켜 단백질을 추출하고 단백질 농도를 측정하였다. 동량의 단백질을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 하여 분해 시킨 후 PVDF 막 위에 옮기고 5% 탈지유로 1시간 동안 실온에서 블로킹하였다.
블로킹된 PVDF 막에 4℃에서 하룻밤 동안 항체 결합을 수행한 후, HRP가 결합된 이차항체를 1시간 동안 실온에서 결합시켰다. 그 후 PVDF 막을 세척하고 ECL detection kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)를 이용하여 단백질을 시각화하였다.
< 실험예 6> cDNA 마이크로어레이( Microarray )
mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116 세포에서 RNA 추출 키트 (Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 전체 RNA를 추출하였으며, 추출된 RNA의 순도는 OD260/OD280 비율에서 2.0 이상이었다.
마이크로어레이는 Phalanx Biotech Group (Palo Alto, CA)에서 반복수행하였으며, 스탠포드 마이크로어레이 데이터베이스(http://smd.stanford.edu)로부터 Significance Analysis of Microarrays(SAM)프로그램을 이용하여 마이크로어레이 분석 결과를 얻었다.
SAM으로 유전자 특이적 t-테스트 세트를 수행하여 통계학적으로 유의한 유전자 발현 변화를 확인하고 발현이 증가된 유전자는 적색으로 감소된 유전자는 녹색으로 나타내었다.
< 실험예 7> 면역 형광 분석( Immunofluorescence Assay )
mock, Sox2 또는 shATG10이 안정적으로 발현된 HCT116 세포를 각각 2- 또는 4-챔버 슬라이드에 접종하고 4% 포르말린으로 고정한 후 0.5% 트리톤 X-100/1×PBS로 10분간 삼투화 시키고 항-Sox2, ATG10 및 ATG8b 일차 항체 결합시킨 후 IgG 고트가 결합된 Alexa 568 또는 Alexa 488(Invitrogen) 이차 항체를 결합시켰다.
항체가 결합된 세포를 DAPI (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)가 포함된 플루오로-겔 Ⅱ 탑재하여 형광 현미경으로 ×200로 확인하였다.
종양을 절개하고 0.03% 피크르산(w/v)과 2% 파라포름알데하이드(w/v)가 포함된 Zamboni's 고정액을 한 방울씩 떨어트려 4℃에서 48시간 동안 고정하고, 20% 수크로즈 용액과 0.05% 소디움 아지드이 첨가된 인산완충용액(PBS)에 옮겨 저장하였다. 종양의 처리 및 염색은 Wacnik PW, Baker CM, Herron MJ, Kren BT, Blazar BR, et al. (2005)에 따라 수행하였다.
형광이 나타나는 부분을 레이저 스캐닝 공초점 현미경(NIKON C1si Confocal Spectral Imaging System, NIKON Instruments Co., elville, NY)을 사용하여 캡쳐하였다.
< 실험예 8> 부착-독립성 콜로니 분석
mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116 세포를 이용하여 부착-독립성 콜로니 성장을 분석하였다.
10% 태아소혈청이 포함된 0.3% McCoy's 5a 아가 1 ml에 8×103/ml HCT116 세포를 혼합하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 5 내지 7일간 배양하였다.
배양 후 현미경과 Image-Pro PLUS (v.6) 컴퓨터 소프트웨어 프로그램(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)을 이용하여 세포 콜로니를 점수화하였다.
< 실험예 9> 생체 내 종양 성장 분석
mock 또는 Sox2가 안정적으로 발현된 HCT116 세포가 90% 합류될 때 수집하고 태아소혈청 또는 항생제가 포함되지 않은 McCoy's 5a 배지 200μl에 3×106 세포를 부유시켰다.
생쥐를 두 그룹으로 분리하고 생쥐 9 마리는 mock 벡터 대조군으로, 생쥐 10마리는 Sox2 실험군으로 나누어 각각의 세포를 3×106 씩 각 생쥐의 오른쪽 옆구리 피하에 주사하였다.
종양이 성장하는 동안 일주일에 두 번씩 생쥐의 무게를 측정하고 매일 모니터링하였으며, 종양이 나타났을 때부터, 컴퓨터화된 캘리퍼스를 이용하여 일주일에 두 번씩 측정하였다.
종양 부피는 각각의 종양의 두 지름을 측정하여 다음 식에 따라 계산하였다.종양 부피(mm3) = [긴 지름(longer diameter)×짧은 지름2(shorter diameter2)]/2
상기 방법으로 생쥐 종양의 전체 부피가 1,000mm3 에 도달할 때까지 모니터링하여 생쥐를 안락사시키고, 종양을 추출하여 조직 화학적 분석을 수행하였다.
모든 실험은 미네소타 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인받은 지침서에 따라 수행되었다.
< 실험예 10> Ex vivo 및 이종이식 동물 연구
사람 세포인 HEK293T, HCT116, CCD-18Co, HT-29 및 WiDr 세포를 Ex vivo 연구에 사용하기 위해 ATCC에서 구입하였으며, 연구는 미네소타 대학의 기관 바이오안전성 위원회(IBC)의 승인을 받아 수행되었다.
이종이식 동물 연구는 무흉선 누드 생쥐를 이용하여 미네소타 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아 수행하였다.
< 실시예 1> Sox2 의 이소성 발현에 의한 자가소화작용 확인
암에서 Sox2와 다른 iPS 인자의 역할을 조사하기 위해, HCT116 사람 대장암 세포에 상기 인자들을 이소성 발현시킨 결과, 도 1A와 같이 Sox2는 세포질에 액포를 형성한 반면, Oct4, Nanog 및 Lin28에서는 액포 형성이 나타나지 않았다.
또한 도 1B와 같이 감염된 세포의 90% 이상이 다른 크기의 액포를 세포질에 형성하였고 액포를 형성한 세포의 웨스턴 블롯 및 면역세포 형광 분석결과 모든 세포에서 이소성 Sox2 단백질의 발현이 확인되었다. 또한 도 1C와 같이, 도 1B에 형성된 액포는 HCT116 대장암 세포의 산성 리소좀 활성과 일치하였다.
특히 도 1D와 같이, Sox2 과발현은 LC3(ATG8b) 포커스 형성을 유도하였으며, 이러한 결과는 LC3은 자가소화의 바이오 마커로 사용될 수 있다.
상기 결과들로부터, Sox2 과발현은 자가소화 작용을 유도할 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 2> 암세포 및 정상세포에서 Sox2 의 자가소화작용 확인
Sox2 과발현에 의한 액포 형성이 다른 암세포 주에서도 나타나는지 확인하기 위해, 렌티(lenti)-Sox2 바이러스 입자를 정상 대장 세포인 CCD-18Co 세포와 사람 대장암 세포인 HCT116, HT29 및 WiDr 세포에 형질 주입시켰다.
그 결과 도 2A를 참고하면, 모든 대장암 세포주의 세포질에서 액포가 형성된 반면, 도 2A 내지 B와 같이 정상 세포인 CCD-18Co세포에서는 렌티(lenti)-Sox2의 형질 도입 후 Sox2가 발현되었으나, 액포 형성 또는 형태학상의 변화는 나타나지 않았다.
또한 도 2C와 같이 HCT116 대장암 세포에서는 액포 형성 및 산성 리소좀 활성이 확인된 반면, 정상 세포인 CCD-18Co세포에서는 나타나지 않았으며, 추가적인 실험에서 정상 마우스 배아 섬유아세포(MEFs) 또는 사람 초대 섬유아세포(NFDH 및 BJ)에서 Sox2의 이소성 발현은 액포 형성과 관련이 없음을 확인하였다.
상기 결과들로부터 HCT116 세포에서 Sox2 과발현에 의해 유도되는 액포 형성은 암세포 특이적 자가소화 작용을 유도하는 것을 확인하였다.
< 실시예 3> 자가 소화작용을 유도하기 위한 Sox2 타겟 확인
Sox2에 의해 유도되는 자가소화 작용의 매커니즘을 확인하였다.
먼저 자가소화를 유도하는 Sox2의 표적유전자를 확인하기 위하여, mock 또는 Sox2를 감염시킨 HCT116 세포로부터 분리된 cDNA의 전체 30,968 개의 유전자를 이용하여 마이크로 어레이 분석한 후 Significant Analysis of Microarray (SAM) program (http://www-stat.stanford.edu/tibs/SAM)을 이용한 데이터 분석 결과 11,245개의 유전자가 밝혀졌다.
그 중 도 3A와 같이 2,153개가 Sox2에 의해 발현증가가 유도되는 유전자로 분류되었으며, 1,575개의 유전자가 발현감소되는 되는 것으로 나타났다.
또한 Visualization and Integrated Discovery (DAVIDv6.7; http://niaid.abcc.ncifcrf.gove)를 이용하여 유전자의 생물학적 또는 분자적 기능에 따른 분류 및 Sox2의 이소성 발현에 의한 자가소화, 세포증식 및 세포주기 조절과 관련된 유전자 발현 수준의 변화를 확인하였다.
그 결과 도 3A와 같이 33개의 DNA 회복(repair)유전자, 25개의 DNA 복제 유전자, 20개의 세포 성장 관련 유전자, 26개의 세포 크기 관련 유전자, 191개의 전사관련 유전자 및 17개의 인슐린 신호 과정과 관련된 유전자들도 포함되어 있는 변화된 유전자 발현을 확인할 수 있었다.
특히, 도 3A를 참고하면, Sox2 발현은 ATG10, ATG3, ATG4a, ATG4D 및 ATG8b 유전자의 2 내지 4 배의 증가를 유도한 반면, ATG12, ATG16L2 및 ATG9B 유전자발현은 감소시켰다.
게놈의 프로모터 영역에서 Sox2와 결합하는 DNA 결합영역을 포함하는 데이터 베이스 검색 결과, ATG10 및 ATG12 프로모터의 잠복한 63%가 Sox2와 결합하는 뉴클레오티드 영역으로 추정되었다.
상기 데이터 베이스 분석결과 및 마이크로어레이 분석결과를 비교한 결과, Sox2에 의해 유도되는 자가소화는 ATG10 유전자를 타겟으로 하는 것이 확인되었다.
또한 주기 의존성 역전사 PCR결과 도 3B와 같이, Sox2가 형질 주입된 세포로부터 ATG10 mRNA 수준이 대조군인 mock 보다 2.5배 증가한 것을 확인할 수 있었으며, 웨스턴 블롯팅 결과인 도 3C 및 면역화학형광 분석 결과인 도 3D에서도 Sox2의 과발현에 의해 ATG10 및 LC3 단백질 수준이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과와 같이, Sox2에 의한 ATG10 프로모터의 활성화를 확인하기 위해, 도 3E와 같은 -1522에서 -1 (pGL3-ATG10-1522) 및 -711에서 -1 (pGL3-ATG10-711)이 포함된 2개의 루시퍼레이즈 리포터 플라스미드를 제작하여, Sox2 및 SRY 결합 모티브로 추정되는 전사시작 부분으로부터 -1327 및 -1473 부분을 포함한 ATG10 프로모터 영역을 탐색하고 분석하였다.
그 결과 도 3F와 같이, 추정되는 Sox2 결합 부분에서 유의하게 억제된 루시퍼라아제 활성이 확인되었다. 또한 도 3G를 참고하면, 과발현된 Sox2에 의해 ATG10 프로모터 활성이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터, Sox2는 ATG10 유전자의 발현을 증가시키고 이를 통하여 자가소화가 유도되는 것을 확인하였다.
< 실시예 4> Sox2 에 의해 유도된 자가소화는 AKT 신호 과정의 하향 조절을 통하여 매개된다
인슐린과 같은 성장 인자들의 분해 또는 고갈은 자가소화를 유도한다고 보고되어짐(Altman BJ, et al.(2009))에 따라, 본 발명의 일 실험예의 마이크로어레이 결과를 통하여, 인슐린 신호 과정과 연관된 유전자 발현이 억제된 것을 확인하였으며, 자가소화 및 인슐린 신호과정과 관련된 단백질 수준의 변화를 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅하였다.
그 결과, 도 4A를 참고하면, Class III PI3-K (Vps34p) 및 베클린(beclin)의 단백질 수준 변화는 나타나지 않았다.
상기 결과로부터, Class III PI3-K (Vps34p) 및 베클린(beclin) 신호 과정은 Sox2에 의해 유도된 자가소화에 관여하지 않음을 확인하였다.
반면, PI3-K-Akt 신호 과정을 확인한 결과인 도 4B를 참고하면, mock를 감염시킨 세포보다 Sox2를 감염시킨 세포에서 Akt의 인산화가(p-Akt) 유의하게 억제되었고, 또한 Akt, mTOR 및 p70S6K의 전체 단백질 수준의 감소를 확인할 수 있었다.
상기 결과인 PI3-K-Akt 신호 과정 억제를 확인하기 위해, GSK3α/β 및 PTEN 단백질 수준 분석을 위한 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
그 결과, 도 4C와 같이 mock를 감염시킨 세포와 비교하여 Sox2를 감염시킨 세포에서 Ser9/Ser21인 GSK3α/β의 인산화가 억제되었고, 전체 GSK3α/β 단백질 수준은 약간 증가하였다. 특히, PTEN의 뚜렷한 인산화의 증가가 확인되었는데, 이를 통하여 탈인산화에 의한 PI3-K 신호 억제를 확인할 수 있었다.
상기 결과들로부터 Sox2가 GSK3α/β 및 PTEN 신호를 통하여 PI3-K-Akt 신호 과정을 변화시키는 것을 확인하였다.
또한 Sox2 또는 mock를 발현시킨 HCT116 세포에 인슐린 또는 PI3-K 억제자인 LY294002를 처리하였다.
그 결과, 도 4D 및 4E와 같이, 인슐린을 처리한 HCT116 세포에서는 Sox2에 의한 액포 형성이 억제된 것을 확인하였다. 반면, 도 4D, 4E 및 4F와 같이 mock를 감염시킨 HCT116 세포에서는 10% 태아소혈청이 첨가된 정상 세포 배양 조건에서 인슐린 처리 여부와 관계없이 액포 형성이 나타나지 않았으며, 또한 태아소혈청이 0% 인 결핍 조건에서도 액포 형성이 나타나지 않았다.
또한 mock 감염 HCT116 세포에 LY294002 처리 후 액포 형성이 증가되었으나, Sox2이 과발현 HCT116 세포에서 LY294002 처리 후 더 많은 액포 형성이 유도되어졌으며 결핍 조건에서도 이와 유사한 결과가 확인되었다.
상기 결과들로부터, PTEN에 의한 PI3-K-Akt 과정의 하향 조절이 Sox2 발현에 의해 유도되는 자가소화와 관련있는 것이 확인되었다.
< 실시예 5> Sox2 에 의해 유도된 자가소화는 대장암 세포의 세포노화를 유도하여 세포증식 및 부착 의존성 콜로니 성장 억제한다
PTEN에 의해 활성 억제된 PI3-K는 결장에서 세포 증식 및 암 성장에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 졌으며, PTEN 또는 보르트만닌에 의한 PI3-K 억제는 핵인자 κB의 p50 및 p65 소단위를 조절하는 종양 괴사인자 -α(TNF-α)와 비교하여 다양한 효과를 나타내는 것으로 보고되어졌다. 또한 강글리오시드(ganglioside)GM3는 HCT116 대장암 세포에서 PTEN에 의해 유도되는 PI3-K-Akt-MDM2 생존 신호 억제에 의한 p53 단백질 축적을 통하여 사이클린 의존성 키나아제(CDK)억제자 (CKI)p21WAF1 발현을 급격히 증가시킨다.
상기 결과들로부터 사람 대장암에서 PTEN 단백질 수준과 Akt 인산화는 음의 상관관계인 것이 확인되어 졌으며, 본 발명의 도 4에서 PTEN을 통한 PI3-K-Akt 신호의 하향 조절은 Sox2에 의해 유도된 자가소화와 관련 있는 것이 확인되었다.
또한 본 발명자는 세포 증식 및 세포 주기 분석을 수행한 결과, 도 5A와 같이 Sox2 감염 HCR116 세포는 mock 감염 HCT116 세포와 비교하여 G0/G1 및 sub-G1의 축적과 S 세포 주기 단계의 감소로 인한 세포 증식 억제가 확인되었으며, 이러한 세포 증식 감소는 도 5B와 같이, 소트프 아가에 부착 의존성 암 성장이 90% 억제된 결과와 관련 있음을 확인하였다.
상기 결과와 같이 세포 증식 및 소프트 아가 성장과 같은 암세포의 특성의 상실을 유도하는 신호를 확인하기 위해, 세포주기 조절 역할을 하는 여러 종양 억제자들을 관찰하였다.
그 결과 도 5C와 같이, p53 인산화(Ser15)가 증가하였으며, p16INK4a 및 p21의 전체 단백질 수준의 증가가 확인되었으며, 이러한 단백질은 세포 노화를 유도하는 물질로 알려져있다.
상기 결과를 확인하기 위해, SA-β-갈라토시다아제 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 5D 사진과 같이 Sox2의 이소성 발현은 β-갈라토시다아제 활성 및 단백질 수준을 증가시키고, 세포 증식 마커인 Ki-67 단백질 수준을 감소시켰다.
특히, 도 5D의 그래프와 같이, β-갈(gal) 양성으로 염색된 액포를 90% 이상의 세포가 포함하고 있었다.
상기 결과들로부터, Sox2에 의해 유도되는 자가소화가 HCT116 대장암 세포의 종양 특성 상실의 원인으로 확인되었다.
< 실시예 6> ATG10 넉다운은 Sox2 에 의한 자가소화, 세포 노화 및 세포 증식을 회복
실시예 3에서 언급한 바와 같이, Sox2에 의해 유도되는 자가소화는 ATG10 발현을 통하여 매개된다. 그래서, ATG10이 넉다운 되면 Sox2 과발현에 의한 자가소화가 유도되는지를 확인하였다.
먼저 도 6A와 같은 psh-ATG10-1755 넉다운 벡터를 이용하여, Sox2로 이미 감염되어 있는 세포와 ATG10가 넉다운된 세포에 각각 sh-ATG10 바이러스 입자를 감염시키고 면역 형광 분석을 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 6B와 같이 sh-ATG10 바이러스 입자가 감염된 Sox2 감염 HCT116 세포(Sox2/sh-ATG10)의 세포 평탄화, 핵 크기 및 액포 형성과 같은 Sox2에 의해 자가소화가 유도된 세포의 형태가 mock 감염 HCT116 세포의 특징들과 유사하게 나타났다.
또한 도 6C와 같이, Sox2/sh-ATG10 세포의 Ki-67, β-갈라토시다아제, p16INK4a 및 p21 단백질 수준이 mock 감염 HCT116 세포의 Ki-67, β-갈라토시다아제, p16INK4a 및 p21 단백질 수준과 유사하게 회복된 것을 확인하였다.
상기 결과들로부터 HCT116 대장암 세포에서 Sox2가 안정적으로 발현되어 있어도 ATG10이 넉다운 되면 세포 증식억제가 회복되며 그에 따라 도 6D와 같이 대조군인 mock 감염 HCT116 세포보다 더 빠르게 HCT116 대장암 세포가 성장하는 것을 확인하였다.
< 실시예 7> 이종이식 마우스 동물모델에서 Sox2 에 의해 유도되는 자가소화에 의한 암 성장 억제 효과 확인
생체 내에서 Sox2 과발현에 의한 종양 성장 억제 효과를 확인하기 위해, 무흉선 누드 마우스에서 이종이식한 종양의 성장을 확인하였다.
먼저 3×106 개의 HCT116 세포와 mock 또는 Sox2를 함께 무흉선 누드 마우스의 오른쪽 옆구리 피하에 주사하였다. 종양 성장은 일주일에 두 번씩 30일간 측정하였다.
그 결과 도 7A와 같이, HCT116 세포와 mock 벡터를 함께 주사한 마우스 군이 HCT116 세포와 Sox2 벡터를 함께 주사한 마우스 군 보다 상당히 큰 종양으로 성장한 것을 확인할 수 있었다.
또한 도 7B와 같이 HCT116 세포와 Sox2 벡터를 함께 주사한 마우스 군은 주사 21일 후 최초로 종양이 발견된 반면, HCT116 세포와 mock 벡터를 함께 주사한 마우스 군은 주사 9일 후부터 종양이 발견되었다. 또한 도 7C을 참고하면, HCT116 세포와 Sox2 벡터를 함께 주사한 마우스 종양 성장이 HCT116 세포와 mock 벡터를 함께 주사한 마우스보다 매우 약화된 것을 확인하였다.
또한 각각의 마우스 군의 종양 조직에서 Sox2, ATG10 및 ATG8b 단백질 수준을 확인하기 위해, Sox2, ATG10 및 ATG8b 항체와 공초점 현미경을 이용한 면역 형광 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 7D와 같이 HCT116 세포와 Sox2 벡터를 함께 주사한 마우스의 종양 조직에서는 HCT116 세포와 mock 벡터를 함께 주사한 마우스의 종양 조직보다 높은 Sox2 단백질 수준이 나타났을 뿐만 아니라, ATG10 및 ATG8b 단백질 역시 높은 수준으로 발현된 것을 확인하였다.
상기 결과로부터 Sox2에 의해 유도되는 자가소화는 이종이식된 마우스 모델의 생체 내에서 암 성장 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명의 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
< 제제예 1> 주사제의 제조
Sox2 10 mg, 소디움 메타비설파이트 3.0 mg, 메틸파라벤 0.8 mg, 프로필파라벤 0.1 mg 및 주사용 멸균증류수 적량을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
< 제제예 2> 정제의 제조
Sox2 10 mg, 유당 100 mg, 전분 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.
< 제제예 3> 캡슐제의 제조
Sox2 10 mg, 유당 50 ㎎, 전분 50 ㎎, 탈크 2 ㎎ 및 스테아린산 마그네슘 적량을 혼합하고 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. Sox2를 유효성분으로 함유하며, 상기 Sox2는 대장암 세포에서 ATG10의 발현을 촉진시킴으로써, 대장암세포의 자가소화를 유도하여 대장암세포의 노화 및 사멸을 증진시키는 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 약학조성물.
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