KR101598054B1

KR101598054B1 - BoCYP38 gene conferring resistance to fusarium wilt of cabbage and uses thereof

Info

Publication number: KR101598054B1
Application number: KR1020130048140A
Authority: KR
Inventors: 박정미; 이연
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2013-04-30
Filing date: 2013-04-30
Publication date: 2016-02-26
Also published as: KR20140129620A

Abstract

본 발명은 양배추 시들음병 저항성 유전자 BoCYP38 및 이의 용도에 관한 것으로, 시들음병 저항성 양배추 유래의 BoCYP38 유전자는 식물체의 시들음병 저항성을 증진시키므로, 시들음병 피해가 심한 양배추, 배추 및 브로콜리 등의 작물에 BoCYP38 유전자를 도입하면 시들음병에 대한 저항성이 증진되어 생산성이 향상된 형질전환 식물체를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.The present invention relates to a cabbage wilt resistance gene, BoCYP38, and its use. BoCYP38 gene derived from wilt-resistant cabbage promotes resistance to wilt of a plant. Therefore , when BoCYP38 gene is introduced into a crop such as cabbage, cabbage and broccoli, And the productivity of the transgenic plant is improved.

Description

Cabbage wilt resistance gene BoCYP38 and its use {BoCYP38 gene conferring resistance to fusarium wilt of cabbage and uses thereof}

본 발명은 양배추 시들음병 저항성 유전자 BoCYP38 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 양배추 (Brassica oleracea) 유래의 시들음병 (fusarium wilt) 저항성 관련 BoCYP38 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 BoCYP38 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 시들음병 저항성을 증진시키는 방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 시들음병 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 시들음병 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 양배추 유래의 시들음병 저항성 관련 BoCYP38 단백질에 대한 항체 및 양배추 유래의 BoCYP38 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 시들음병 저항성 증진용 조성물에 관한 것이다.The invention is cabbage (Brassica it relates to a cabbage wilt BoCYP38 resistance genes and the use thereof, and more particularly a recombinant vector containing the gene, a host cell transformed with the recombinant vector, and the recombinant vector are transformed into plant cells to obtain BoCYP38 protein, which expresses the fusarium wilt resistance-related BoCYP38 protein derived from oleracea , A method for promoting resistance to wilt of a plant in comparison with a wild type comprising overexpressing a gene, a method for producing a transgenic plant having improved resistance to wilt disease using the recombinant vector, a method for producing a transgenic plant having improved resistance to wilt disease The present invention relates to a composition for promoting resistance to wilt disease in a plant containing a recombinant vector comprising a plant and its seed, an antibody against BoCYP38 protein related to wilt disease derived from cabbage, and a BoCYP38 gene derived from cabbage.

고착생활을 하는 농작물은 끊임없이 수많은 병원균 (곰팡이, 세균, 바이러스 등)에 노출되며, 그로 인해 발생하는 질병은 농작물의 생산량을 감소시킨다. 이러한 병원균에 의한 농작물의 피해를 줄이고 생산성을 향상시키기 위해 일반적으로 농약이 사용되고 있으나, 농약의 사용은 환경오염이라는 새로운 문제를 야기한다. 뿐만아니라, 토양이나 농산물에 존재하는 잔류 농약으로 인해 인간의 건강도 위협받고 있다. 따라서 식물의 병을 방제하고, 농약 사용으로 인한 환경 오염 및 인체 축적에 의한 질병 발생을 방지할 수 있는 새로운 방법이 요구되고 있다.Constantly growing crops are constantly exposed to a number of pathogens (fungi, bacteria, viruses, etc.), and diseases resulting from them reduce the yield of crops. Although pesticides are generally used to reduce the damage of crops caused by these pathogens and improve productivity, the use of pesticides causes a new problem of environmental pollution. In addition, human health is also threatened by residual pesticides present in soils and agricultural products. Therefore, there is a demand for a new method for preventing diseases of plants and preventing diseases caused by environmental pollution and human accumulation due to the use of pesticides.

현재 식물의 병을 방제하기 위해 병 저항성 작물 육성이 시도되고 있다. 그 예로서 생물체 내에 존재하는 병원균 살균 단백질의 탐색과 분리 및 이들을 코딩하는 유전자의 클로닝, 내병성 형질전환 식물체 개발이 이루어지고 있다. 집중적으로 연구되고 있는 작물로는 담배, 토마토 및 벼가 대표적이며, 애기장대가 식물 병 저항성 연구를 위한 모델 식물로서 세계적으로 이용되고 있다. 식물의 병 발생에 대한 방어반응으로 건전한 식물에서는 미량으로 존재하거나 발견되지 않는 유전자 또는 단백질들이 병 감염시 특이적으로 증가하거나 나타난다. 이를 병 저항성 유전자 또는 병 생성 관련 단백질 (pathogenesis-related protein)이라 한다. 식물은 특이한 병 방어유전자를 다양하게 발현하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 특이한 병 방어 유전자를 식물체로부터 분리하여, 유전공학적으로 적용하고자 하는 연구가 진행되고 있다.Currently, disease resistance crops are being cultivated to control plant disease. For example, the discovery and isolation of pathogenic bactericidal proteins present in living organisms, the cloning of genes encoding them, and the development of disease-resistant transgenic plants have been conducted. Cigarettes, tomatoes and rice are representative examples of intensive research, and Arabidopsis has been used worldwide as a model plant for studying plant disease resistance. The defensive response to the disease of plants causes the genes or proteins that are present or not found in trace amounts in healthy plants to specifically increase or appear when infected with the disease. This is called a disease-resistance gene or pathogenesis-related protein. Plants are known to express a variety of unusual disease-defending genes, and studies are under way to separate them from plants and apply them genetically.

엽록체 단백질인 시클로필린 38 (cyclophilin 38; CYP38)은 애기장대의 다양한 시클로필린 중 하나로 시클로필린 도메인과 E-루프 (E-loop)를 가지고 있고, 엽록소 단백질 47 (chlorophyll protein 47)과 결합하여 엽록체 내의 틸라코이드에서 광계 Ⅱ (photosystem Ⅱ) 복합체의 안정성을 조절하는 조절자로서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 또한, 애기장대 시클로필린 38은 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스이소머라아제 (peptidyl-prolyl cis-trans isomerase) 유전자 서열이 보존되어 있음에도 불구하고, 다른 시클로필린 단백질과는 달리 펩티딜-프롤릴 시스-트랜스이소머라아제 효소 기능이 없는 것으로 보고되었다 (Dileep Vasudevan, Plant Cell . 24(6):2666-2674 (2012)). CYP38은 여러 비생물학적 스트레스 반응에 있어 중요 기능을 수행하는 것으로 알려져 있으나, 아직까지 본 발명에 제시된 생물학적 병 저항성에 대한 기능은 보고된 바가 없다.Cyclophilin 38 (CYP38), a chloroplast protein, is one of the various cyclophilins in Arabidopsis thaliana and has a cyclophilin domain and an E-loop. It binds to chlorophyll protein 47 (chlorophyll protein 47) Is known to play an important role as a regulator of the stability of the photosystem II complex in thylakoids. In addition, the Arabidopsis cyclophilin 38, despite the conservation of the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase gene sequence, has been shown to contain peptidyl-prolyl cis-trans isomerase -Trans isomerase enzyme function (Dileep Vasudevan, Plant Cell . 24 (6): 2666-2674 (2012)). CYP38 has been known to play an important role in a variety of abiotic stress responses, but the function of the biological disease resistance presented in the present invention has not yet been reported.

양배추 (Brassica oleracea)의 BoCYP38 유전자는 애기장대 AtCYP38 (At3g01480) 유전자와 염기서열이 84% 일치하는 유전자이다. 본 발명에서는 시들음병 저항성 양배추 품종에서 특이적으로 발현되는 CYP38 cDNA 염기서열을 확보하였고, Q-RT-PCR을 통해 저항성 품종의 CYP38 mRNA가 감수성 품종에는 존재하지 않는다는 것을 확인하였다. 또한 이러한 시들음병 저항성 특이적 CYP38 mRNA가 저항성 양배추 품종과 감수성 양배추 품종 CYP38 게놈 DNA에 존재하는 엑손과 인트론의 선택적 스플라이싱에 의해서 나타남을 확인하였다.Cabbage ( Brassica BoCYP38 genes oleracea) is a gene which is AtCYP38 Arabidopsis thaliana (At3g01480) gene and the nucleotide sequence matches 84%. In the present invention, the nucleotide sequence of CYP38 cDNA specifically expressed in the wilt-resistant cabbage cultivar was obtained, and it was confirmed by Q-RT-PCR that CYP38 mRNA of the resistant strain was not present in the susceptible variety. It was also confirmed that such wilting resistance - specific CYP38 mRNA was caused by selective splicing of exons and introns present in resistant cabbage cultivars and susceptible cabbage cultivar CYP38 genomic DNA.

한편, 한국등록특허 제0809671호에는 'OsWRKY6 유전자를 과량 발현시켜 식물 병 저항성을 증진시키는 방법, 이러한 활성을 가진 OsWRKY6 유전자, 이 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 형질전환체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1183204호에는 '생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 증가된 저항성을 나타내는 유전자 도입 식물 및 이를 생산하는 방법'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 양배추 시들음병 저항성 유전자 BoCYP38 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.Korean Patent No. 0809671 discloses a method of overexpressing the OsWRKY6 gene to promote resistance to plant diseases, an OsWRKY6 gene having such an activity, an expression vector containing the gene and a transformant, Patent 1183204 discloses " transgenic plants exhibiting increased resistance to biological and abiotic stresses and methods for producing them. &Quot; However, as in the present invention, the cabbage wilt resistance gene, BoCYP38, and its uses have not been disclosed at all.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 양배추 (Brassica oleracea)의 BoCYP38 게놈 DNA 내의 엑손과 인트론의 선택적 스플라이싱에 의해 시들음병 저항성 및 감수성이 나타난다는 것을 확인하였고, 양배추 시들음병 저항성 품종에서 특이적으로 발현되는 BoCYP38 mRNA 염기서열을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have found that the selective splicing of exons and introns in BoCYP38 genomic DNA of cabbage ( Brassica oleracea ) results in wilting resistance and susceptibility, and the resistance to cabbage wilt disease The present invention has been accomplished by confirming the sequence of BoCYP38 mRNA specifically expressed in cultivars .

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 양배추 (Brassica oleracea) 유래의 시들음병 (fusarium wilt) 저항성 관련 BoCYP38 단백질을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention cabbage (Brassica Provides fusarium wilt resistance-related BoCYP38 protein derived from oleracea .

또한, 본 발명은 상기 BoCYP38 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.In addition, the present invention provides a gene encoding the BoCYP38 protein.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.The present invention also provides a host cell transformed with the recombinant vector.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 BoCYP38 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 시들음병 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for enhancing the resistance to wilt of a plant in comparison with a wild type strain comprising the step of over-expressing the BoCYP38 gene by transforming the recombinant vector into a plant cell.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 시들음병 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.Further, the present invention provides a method for producing a transgenic plant having improved wilt resistance as compared with the wild type using the recombinant vector.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 시들음병 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.In addition, the present invention provides transgenic plants and seeds thereof, which have been improved by the above-mentioned method, with improved wilt resistance.

또한, 본 발명은 양배추 유래의 시들음병 저항성 관련 BoCYP38 단백질에 대한 항체를 제공한다.The present invention also provides an antibody against the wilt resistance-related BoCYP38 protein from cabbage.

또한, 본 발명은 양배추 유래의 BoCYP38 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 시들음병 저항성 증진용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for promoting resistance to wilt disease in a plant containing a recombinant vector comprising a BoCYP38 gene derived from cabbage.

본 발명의 시들음병 저항성 양배추 유래의 BoCYP38 유전자는 식물체의 시들음병 저항성을 증진시키므로, 시들음병 피해가 심한 양배추, 배추 및 브로콜리 등의 작물에 BoCYP38 유전자를 도입하면 시들음병에 대한 저항성이 증진되어 생산성이 향상된 형질전환 식물체를 제공할 수 있다.Since the BoCYP38 gene derived from the wilt-resistant cabbage of the present invention promotes resistance to wilt of a plant, introduction of the BoCYP38 gene into crops such as cabbage, cabbage, and broccoli, which are severely damaged by wilt disease, increases the resistance to wilt disease, Can be provided.

도 1은 양배추 시들음병 저항성 품종 (KR)과 감수성 품종 (HY)의 총 단백질을 2D 전기영동한 결과를 나타낸다. 시들음병 저항성 및 감수성 양배추 품종을 토양에서 발아시키고 14일 동안 생장시킨 후 양배추 시들음병 병원균 (F. oxysporum f. sp . conglutinans)을 2×10⁷ spore/ml 농도로 처리하고 3일 후에 지상부 조직 샘플을 채취하여 총 단백질을 분리하였다. 분리한 총 단백질은 2D 전기영동을 수행한 한 후 CBB (colloidal coomassie brillant blue)로 염색하고 스캐닝하여 겔 이미지를 얻었다.
도 2는 2D 겔을 효소 절단한 후 MALDI-TOF/TOF MS 분석한 결과를 나타낸다. 겔 상에 나타난 80개의 단백질 스팟 (spot) 중 20, 21, 22, 37, 38 및 39번 단백질이 BoCYP38 단백질로 동정 되었다.
도 3은 80여 개의 단백질을 분석한 결과 확인된 저항성 품종의 BoCYP38 단백질 (spot. 20, 21, 22) 및 감수성 품종의 BoCYP38 단백질 (spot. 37, 38, 39)을 나타낸다. Image Master Program ver. 6. 데이터 분석으로 겔 스팟의 크기 (volume)를 비교하여 두 품종간 발현 양상 차이를 확인하였다.
도 4는 양배추 시들음병 저항성 품종에서 확인한 BoCYP38R gDNA를 나타낸다. BoCYP38R gDNA는 6개의 엑손과 5개의 인트론으로 구성되며, 인트론 영역은 회색으로 표시하였다.
도 5는 양배추 시들음병 저항성 품종 (BoCYP38R), 감수성 품종 (BoCYP38S) 및 애기장대 (AtCYP38; 서열번호 7)의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 양배추 시들음병 저항성 품종에서 확인한 BoCYP38R cDNA 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 7은 BoCYP38 gDNA, BoCYP38R cDNA 및 BoCYP38S cDNA 구조의 모식도 및 선택적 스플라이싱이 일어나는 BoCYP38 gDNA의 4번째 인트론 영역의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.Fig. 1 shows the result of 2D electrophoresis of total proteins of cabbage wilt-resistant rice varieties (KR) and susceptible varieties (HY). The wilt-resistant and susceptible cabbage cultivars were germinated in soil, grown for 14 days, treated with 2 × 10 ⁷ spores / ml of cabbage wilt pathogen ( F. oxysporum f. Sp . Conglutinans ) Total protein was isolated. The separated total protein was stained with CBB (colloidal coomassie brillant blue) and scanned to obtain a gel image after 2D electrophoresis.
Fig. 2 shows the result of MALDI-TOF / TOF MS analysis after enzyme digestion of 2D gel. Proteins 20, 21, 22, 37, 38 and 39 of the 80 protein spots on the gel were identified as BoCYP38 proteins.
Figure 3 shows the BoCYP38 protein (spot 20, 21, 22) and the susceptible variant BoCYP38 protein (spot 37, 38, 39), which were confirmed as a result of analysis of 80 proteins. Image Master Program ver. 6. Comparison of gel spots by data analysis. The difference in expression patterns between two cultivars was confirmed.
Fig. 4 shows BoCYP38R gDNA confirmed in cabbage wilt resistant varieties. The BoCYP38R gDNA consists of 6 exons and 5 introns, and the intron regions are shown in gray.
5 shows the results of comparing the amino acid sequences of cabbage wilt resistant varieties (BoCYP38R), susceptible varieties (BoCYP38S) and Arabidopsis thaliana (AtCYP38; SEQ ID NO: 7).
Figure 6 shows the BoCYP38R cDNA sequence and amino acid sequence identified in cabbage wilt resistant varieties.
Fig. 7 shows a schematic diagram of BoCYP38 gDNA, BoCYP38R cDNA and BoCYP38S cDNA structure, and the results of confirming the expression of the fourth intron region of BoCYP38 gDNA where selective splicing takes place.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 양배추 (Brassica oleracea) 유래의 시들음병 (fusarium wilt) 저항성 관련 BoCYP38 단백질을 제공한다.In order to accomplish the object of the present invention, the present invention provides a method for producing a mutant strain of cabbage ( Brassica Provides fusarium wilt resistance-related BoCYP38 protein derived from oleracea .

본 발명에 따른 BoCYP38 단백질의 범위는 양배추로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 시들음병 저항성을 의미한다.The scope of the BoCYP38 protein according to the present invention includes proteins having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 isolated from cabbage and functional equivalents of the proteins. Refers to an amino acid sequence having at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more amino acid sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of addition, substitution or deletion of an amino acid, Refers to a protein having substantially the same physiological activity as the protein represented by SEQ ID NO: 2 and having a sequence homology of 95% or more. "Substantially homogenous bioactivity" means resistance to wilt disease.

본 발명은 또한 BoCYP38 단백질의 단편, 유도체 및 유사체 (analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 BoCYP38 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적 (conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기 (바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드 (상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (iii) 또 다른 화합물 (폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열 (예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠 (proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.The present invention also includes fragments, derivatives and analogues of the BoCYP38 protein. As used herein, the terms "fragments", "derivatives" and "analogs" refer to polypeptides having substantially the same biological function or activity as the BoCYP38 polypeptides of the invention. The fragments, derivatives, and analogs of the present invention may be used in conjunction with (i) polypeptides in which one or more conservative or non-conservative amino acid residues (preferably conservative amino acid residues) are substituted (the substituted amino acid residues are encoded Or (ii) a polypeptide having substituent (s) at one or more amino acid residues, or (iii) another compound (a compound capable of extending the half-life of the polypeptide, such as polyethylene glycol) (Iv) an additional amino acid sequence (e. G., A leader sequence, a secretory sequence, a sequence used to purify the polypeptide, a proteinogen sequence or a fusion protein) and a polypeptide derived from the mature polypeptide Or a polypeptide derived from said polypeptide. Such fragments, derivatives and analogs as defined herein are well known to those skilled in the art.

서열번호 2로 표시되는 성숙 (mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드 (및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.A polynucleotide encoding the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2 encodes only a mature polypeptide; Sequences encoding mature polypeptides and various additional coding sequences; Mature polypeptides (and any additional coding sequences) and sequences coding for noncoding sequences.

용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.The term "polynucleotide encoding a polypeptide" refers to a polynucleotide encoding a polypeptide, or a polynucleotide further comprising additional coding and / or noncoding sequences.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 것과 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안 (alternative)이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.The invention also relates to variants of said polynucleotides encoding polypeptides comprising the same amino acid sequences as described herein, or fragments, analogs, and derivatives thereof. Polynucleotide variants can be naturally occurring allelic variants or non-naturally occurring variants. The nucleotide mutant includes a substitution mutant, a deletion mutant, and an insertion mutant. As is known in the art, an allelic variant is an alternative to a polynucleotide, which may comprise one or more substituted, deleted or inserted nucleotides and which does not result in a substantial functional change in the polypeptide encoded by the variant Do not.

본 발명의 시들음병은 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 생물학적 스트레스 (biotic stress)이며, 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)과 같은 푸사리움 속 (Fusarium sp.) 병원균에 의해 발생한다. 시들음병 저항성이란 상기와 같은 병원균의 감염에 의한 식물체의 성장 저하, 생산성 저하, 병반 형성 또는 고사가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.The wilt of the present invention is a biotic stress that lowers the growth or productivity of the plant, and the Fusarium sp. ( Fusarium sp.) pathogens, such as oxysporum . The wilting resistance refers to a trait that inhibits or slows the growth of plants, the loss of productivity, or the formation of lesions or death due to the infection of pathogens as described above.

또한, 본 발명은 상기 양배추 시들음병 저항성 관련 BoCYP38 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 BoCYP38 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA (서열번호 1), 게놈 DNA (서열번호 3) 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩 (coding) 가닥 또는 넌코딩 (non-coding) 가닥일 수 있다.The present invention also provides a gene encoding the cabbage wilt resistance-related BoCYP38 protein. The gene of the present invention may be DNA or RNA encoding a BoCYP38 protein. The DNA comprises a cDNA (SEQ ID NO: 1), a genomic DNA (SEQ ID NO: 3) or an artificial synthetic DNA. The DNA may be single stranded or double stranded. The DNA may be a coding strand or a non-coding strand.

바람직하게는, 본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.Preferably, the gene of the present invention may comprise the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, homologues of the nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene has a nucleotide sequence having a sequence homology of 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 . "% Of sequence homology to polynucleotides" is ascertained by comparing the comparison region with two optimally aligned sequences, and a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence for the optimal alignment of the two sequences (I. E., A gap) relative to the < / RTI >

또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.The present invention also relates to a polynucleotide which hybridizes with a sequence having at least 50%, preferably at least 70%, more preferably at least 80% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 described above. The present invention particularly relates to polynucleotides that hybridize to the polynucleotides described herein under stringent conditions. In the present invention, "stringent conditions" are (1) hybridization and washing under lower ionic strength and higher temperature such as 0.2 x SSC, 0.1% SDS, 60 ° C; Or (2) in the presence of a denaturant such as 50% (v / v) formamide, 0.1% bovine serum / 0.1% Ficoll and 42 ° C; Or (3) at least 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95%. In addition, the biological function and activity of the polypeptide encoded by the hybridizable polynucleotide is the same as the biological function and activity of the mature polypeptide represented by SEQ ID NO: 2.

본 발명의 구현예에 따라, BoCYP38 유전자는 바람직하게는 양배추 유래라는 것을 이해해야 한다. 그러나, 본 발명의 구현예는 양배추 BoCYP38 유전자와 높은 상동성 (예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단 (예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.According to an embodiment of the present invention, BoCYP38 It is to be understood that the gene is preferably derived from cabbage. However, an embodiment of the present invention relates to the use of cabbage BoCYP38 But also other genes from other plants with high homology to the gene (e. G., 60% or more, i.e., 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, or even 98% . Methods for sequencing, and means for determining sequence identity or homology (e.g., BLAST) are well known in the art.

또한, 본 발명은 상기 BoCYP38 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.The present invention also relates to the above- A recombinant vector containing the gene is provided.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.The term "recombinant" refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, heterologous peptide or heterologous nucleic acid. The recombinant cell can express a gene or a gene fragment that is not found in the natural form of the cell in one of the sense or antisense form. In addition, the recombinant cell can express a gene found in a cell in its natural state, but the gene has been re-introduced into the cell by an artificial means as modified.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.The term "vector" is used to refer to a DNA fragment (s), nucleic acid molecule, which is transferred into a cell. The vector replicates the DNA and can be independently regenerated in the host cell. The term "carrier" is often used interchangeably with "vector ". The term "expression vector" means a recombinant DNA molecule comprising a desired coding sequence and a suitable nucleic acid sequence necessary for expressing a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.

본 발명의 재조합 식물 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.The recombinant plant expression vector of the present invention can be used as a transient expression vector capable of transient expression in a plant into which the foreign gene is introduced and a plant expression vector capable of permanently expressing the foreign gene in the introduced plant.

본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (A. tumefaciens)의 Ti 플라스미드와 함께 존재 시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101 (Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19 (Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.Binary vectors which can be used in the present invention Agrobacterium tyumeo Pacific Enschede RB (right border) of the T-DNA that can transform the plant in the presence with a Ti plasmid (A. tumefaciens) and LB (left border) (Cat #: 6018-1, Clontech, USA), pBIN19 (Genbank Accession No. U09365), pBI121, pCAMBIA vector, etc., which are frequently used in the art It is good.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.A preferred example of a plant expression vector is a Ti-plasmid vector that is capable of transferring a so-called T-region into a plant cell when it is present in a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens. Other types of Ti-plasmid vectors (see EP 0 116 718 B1) are currently used to transfer hybrid DNA sequences to plant cells or protoplasts in which new plants capable of properly inserting hybrid DNA into the plant's genome can be produced have. A particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is a so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and U.S. Patent No. 4,940,838. Other suitable vectors that can be used to introduce a gene according to the invention into a plant host include viral vectors such as those that can be derived from double-stranded plant viruses (e. G., CaMV) and single- For example, from non -complete plant virus vectors. The use of such vectors may be particularly advantageous when it is difficult to transform the plant host properly.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.In a plant expression vector according to an embodiment of the present invention, the promoter may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, MAS, or histone promoter, but is not limited thereto. The term "promoter " refers to a region of DNA upstream from a structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription. A "plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation. Since the selection of the transformant can be carried out by various tissues at various stages, a constant promoter may be preferable in the present invention. Therefore, the constant promoter does not limit the selectivity.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In a plant expression vector according to an embodiment of the present invention, the terminator can be a conventional terminator, such as nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, Agro Bacterium Tumerpathians ( Agrobacterium and the terminator of the Octopine gene of Tumefaciens, but the present invention is not limited thereto.

본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.The expression vector of the present invention preferably comprises one or more selectable markers. The marker is typically a nucleic acid sequence having a property that can be selected by a chemical method, and includes all genes capable of distinguishing a transformed cell from a non-transformed cell. Examples include antibiotic resistance genes such as herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinotricin, kanamycin, G418, Bleomycin, hygromycin, chloramphenicol, It is not.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 인간 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물 세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물 세포가 이용될 수 있다.Any host cell known in the art may be used as a host cell capable of cloning and expressing the vector of the present invention in a stable manner continuously, for example, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli . such as E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus strains, and Salmonella typhimurium, Serratia marcesensus and various Pseudomonas spp. Enterobacteriaceae and strains. When the vector of the present invention is transformed into eukaryotic cells, yeast (Saccharomyce cerevisiae), insect cells, human cells (e.g., Chinese hamster ovary, W138, BHK, COS-7, 293 , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and plant cells, and preferably plant cells can be used.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580. 1983) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.The method of delivering the vector of the present invention into a host cell can be carried out by the CaCl ₂ method, one method (Hanahan, D., J. Mol . Biol . , 166: 557-580, 1983) An electric drilling method or the like. When the host cell is a eukaryotic cell, the vector may be injected into the host cell by microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, and gene bombardment have.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 BoCYP38 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 시들음병 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for promoting wilt resistance of a plant in comparison with a wild-type plant comprising the step of over-expressing a BoCYP38 gene by transforming a plant cell with the recombinant vector.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시들음병의 병원균은 푸사리움 속 (Fusarium sp.), 바람직하게는 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment of the invention the pathogen of the wilt is selected from the group consisting of Fusarium sp., Preferably Fusarium sp. oxysporum ), but are not limited thereto.

본 발명에 따른 유전자의 식물로의 도입은 본 발명의 유전자를 포함하는 적합한 벡터를 사용하여 이루어질 수 있으며, 본 발명의 벡터를 식물 숙주세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.Introduction of a gene into a plant according to the present invention can be achieved by using a suitable vector comprising the gene of the present invention, and a method of transporting the vector of the present invention into a plant host cell is known in the art. For example, gene-mediated transformation (bombardment), Agrobacterium-mediated transformation, microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, and DEAE-dextran treatment But is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및Also, the present invention provides a method for producing a plant cell, comprising the steps of: transforming a plant cell with the recombinant vector; And

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 시들음병 저항성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.And a step of regenerating the plant from the transformed plant cell, wherein the method further comprises the step of regenerating the plant from the transformed plant cell.

본 발명의 형질전환 식물체의 제조 방법에 있어서, 상기 시들음병의 병원균은 푸사리움 속 (Fusarium sp.), 바람직하게는 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method for producing the transgenic plant of the present invention, the pathogen is Fusarium wilt in (Fusarium sp.), Preferably from Fusarium oxy sports rooms (Fusarium oxysporum ), but are not limited thereto.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.The method of transforming the plant cell is as described above.

본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함할 수 있으며, 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.The method of the present invention may include the step of regenerating a transformed plant from the transformed plant cell, and any method known in the art may be used as a method of regenerating the transgenic plant.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 시들음병 저항성이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.Further, the present invention provides a transgenic plant and a seed thereof having improved wilt resistance as compared to the wild type produced by the above method.

본 발명에 있어서, 상기 식물체는 고구마, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두, 애기장대 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 쌍자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 애기장대, 양배추, 배추 또는 브로콜리일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the plant may be selected from the group consisting of sweet potato, potato, eggplant, cigarette, pepper, tomato, burdock, ciliaceae, lettuce, bellflower, spinach, modern celery, carrot, parsley, parsley, cabbage, For example, dicotyledonous plants such as cucumber, amber, poultry, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean, pea and Arabidopsis or rice plants such as rice, barley, wheat, rye, corn, sorghum, oats, It is a dicotyledonous plant, more preferably a Arabidopsis thaliana, cabbage, cabbage or broccoli, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 상기 양배추 유래의 시들음병 저항성 관련 BoCYP38 단백질에 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 양배추 BoCYP38 유전자의 4번째 인트론의 선택적 스플라이싱에 의해 생성된 양배추 시들음병 저항성 BoCYP38 단백질 (BoCYP38R)에 대한 항체이다. 시들음병 저항성 품종의 BoCYP38R 단백질은 선택적 스플라이싱에 의해 시들음병 감수성 품종의 BoCYP38 단백질 (BoCYP38S)보다 25개 더 많은 아미노산을 갖게 되므로, 본 발명의 항체는 바람직하게는 상기 25개 아미노산에 대한 항체일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 289번부터 313번까지의 25개 아미노산에 대한 항체일 수 있으나, 시들음병 저항성 BoCYP38R 단백질을 검출할 수 있는 항체라면 이에 제한되지 않는다.The present invention also provides an antibody against the wilt resistance-related BoCYP38 protein from the cabbage. The antibody of the present invention is an antibody against the cabbage wilt resistant BoCYP38 protein (BoCYP38R) produced by selective splicing of the fourth intron of cabbage BoCYP38 gene. Since the BoCYP38R protein of the wilt resistant strain has 25 more amino acids than the BoCYP38 protein (BoCYP38S) of the wilt-susceptible varieties by selective splicing, the antibody of the present invention is preferably an antibody to the above 25 amino acids , More preferably an antibody against 25 amino acids 289 to 313 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto, as long as it is an antibody capable of detecting the wilt-resistant BoCYP38R protein.

본 발명의 용어 "항체"는 모노클로날 항체, 다중특이적 (multispecific) 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 카멜화 항체 (camelised antibody), 키메라 항체, 단일 체인 Fvs (scFv), 단일 체인 항체, 단일 도메인 항체, Fab 프래그먼트, F(ab) 프래그먼트, 디설피드-결합 Fvs (sdFv), 및 항이디오타입 (항-Id) 항체 및 상기 임의의 에피토프 결합 단편을 말한다. 특히, 항체는 면역 글로불린 분자 및 면역학적으로 활성이 있는 면역글로불린 분자 단편, 즉 항원결합부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 종류 (예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.The term "antibody ", as used herein, refers to a monoclonal antibody, a multispecific antibody, a human antibody, a humanized antibody, a camelised antibody, a chimeric antibody, a single chain Fvs (scFv) Refers to antibody fragments, domain antibodies, Fab fragments, F (ab) fragments, disulfide-linked Fvs (sdFv), and antiidiotypic (anti-Id) antibodies and any of the epitope binding fragments. In particular, the antibody comprises an immunoglobulin molecule and an immunologically active immunoglobulin molecule fragment, i.e., a molecule containing an antigen binding site. The immunoglobulin molecule may be of any kind (e.g., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, and IgY), classes (e.g., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl and IgA2) or subclass.

본 발명의 항체는 본 발명의 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.The antibody of the present invention can be produced by cloning the gene of the present invention into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein, and obtaining the protein from the obtained protein by a conventional method. Also included are partial peptides that can be made from the protein, and the partial peptides of the invention include at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and a polyclonal antibody, a monoclonal antibody or a part thereof having antigen binding ability is included in the antibody of the present invention and includes all immunoglobulin antibodies. Furthermore, the antibodies of the present invention include special antibodies such as humanized antibodies.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 양배추 (Brassica oleracea) 유래의 BoCYP38 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 시들음병 저항성 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 양배추 (Brassica oleracea) 유래의 BoCYP38 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하며, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물체에 형질전환함으로써 식물체의 시들음병 저항성을 증가시킬 수 있는 것이다.
The present invention also provides a composition for promoting resistance to wilt disease in a plant comprising a recombinant vector comprising a gene encoding the BoCYP38 protein derived from cabbage ( Brassica oleracea ) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The composition contains, as an active ingredient, a recombinant vector comprising a gene encoding the BoCYP38 protein derived from cabbage ( Brassica oleracea ) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and transforming the recombinant vector comprising the gene into a plant It can increase the resistance of the plants to wilt disease.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

실시예Example 1. 양배추 1. Cabbage 시들음병Wilt 저항성 품종 및 감수성 품종의 Resistant varieties and susceptible varieties 단백질체Protein body 분석 analysis

양배추 저항성 품종과 감수성 품종의 단백질 프로파일 (profile)을 비교하기 위하여, 두 양배추 품종을 심은 토양에 양배추 시들음병 병원균 (Fusarium oxysporum f. sp . conglutinans) 및 증류수 (mock; 대조구)를 각각 처리하였고, 처리 3일 후에 지상부 조직을 채취하여 총 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질은 Kim 등이 보고한 2D 방법 (Journal of Plant Biotechnology, 39:81-92 (2012))을 수행하여 분석했으며, 양배추 시들음병 저항성 품종 및 감수성 품종에서 시들음병에 의해 유도되거나 발현 차이가 나타나는 단백질 스팟 (spot)을 찾았다 (도 1).To compare the protein profiles of the cabbage-resistant and susceptible varieties, the cabbage wilt pathogens ( Fusarium oxysporum f. Sp . Conglutinans ) and distilled water (mock; control) After the day, the upper part of the tissue was collected and the total protein was separated. The separated proteins were analyzed by the 2D method reported by Kim et al. ( Journal of Plant Biotechnology , 39: 81-92 (2012)), and protein spots induced by wilt disease or differences in expression were found in cabbage wilt-resistant and susceptible varieties (Fig. 1).

품종에 따라 또는 시들음병 병원균 처리 여부에 따라 발현 차이가 나는 80여 개의 단백질 스팟을 선발한 후, 겔 상에서 트립신을 처리하였다. 트립신 처리된 단백질 펩티드들은 MALDI-TOF/TOF MS 방법으로 질량을 분석하여 단백질을 동정하였다. 단백질 스팟 20, 21, 22, 37, 38 및 39번은 CYP38 (peptidyl-prolyl cis-transisomerase)로 동일한 단백질이라는 것이 확인되었으며, 시들음병 저항성 품종에서는 단백질 스팟 20, 21 및 22번이 발현되고, 감수성 품종에서는 37, 38 및 39번이 발현되는 것으로 나타났다 (도 2 및 3). 상기와 같은 결과에 따라, 본 발명자는 양배추 시들음병 저항성 및 감수성 품종을 구분하는 후보 단백질로 BoCYP38을 선택하여 연구를 진행하였다.
Eighty protein spots with different expression depending on the cultivar or wilt disease pathogen were selected and treated with trypsin on gel. The protein peptides treated with trypsin were analyzed for their mass by MALDI-TOF / TOF MS method to identify proteins. Protein spots 20, 21, 22, 37, 38 and 39 were found to be the same protein as CYP38 (peptidyl-prolyl cis-transisomerase) and protein spots 20, 21 and 22 were expressed in wilt resistant varieties. 37, 38 and 39 were expressed (Figs. 2 and 3). Based on the above results, the present inventors selected BoCYP38 as a candidate protein for classifying cabbage wilt resistance and susceptible varieties.

실시예Example 2. 양배추 2. Cabbage 시들음병Wilt 저항성 품종과 감수성 품종의 염기서열 확인 Identification of the nucleotide sequence of resistant and susceptible varieties

BoCYP38 유전자의 염기서열을 확인하기 위해, 양배추 시들음병 저항성과 감수성 품종의 잎 조직에서 게놈 DNA를 추출하였고, 추출한 게놈 DNA 250 ng을 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다. 애기장대 유래 AtCYP38 유전자의 염기서열을 바탕으로 프라이머 세트 (5'-ATG GCG GCG GCG TTT GCC TCT CTT C-3'; 서열번호 8 및 5'-GGC GAT TTT GTA ACT CGG GTT AGC GA-3'; 서열번호 9)를 합성하였고, 합성한 프라이머 세트로 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 10초의 32회 반복 및 72℃에서 5분의 조건으로 수행하였고, 그 결과 약 1.8 kb의 DNA 단편을 얻을 수 있었다. 증폭된 PCR 산물은 TA 클로닝 벡터에 클로닝하여 BoCYP38 염기서열을 확보했으며, 서열 분석 결과 AtCYP38 유전자와 유연관계가 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).Genomic DNA was extracted from leaves of susceptible varieties of cabbage wilt disease and PCR was performed using 250 ng of extracted genomic DNA as a template to confirm the base sequence of BoCYP38 gene. (5'-ATG GCG GCG GCG TTT GCC TCT CTT C-3 '; SEQ ID NO: 8 and 5'-GGC GAT TTT GTA ACT CGG GTT AGC GA-3' based on the nucleotide sequence of the Arabidopsis derived AtCYP38 gene; SEQ ID NO: 9) was synthesized and PCR was performed using the synthesized primer set. PCR was performed under conditions of 5 minutes at 94 ° C, 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 55 ° C, and 32 seconds at 72 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 5 minutes. As a result, a DNA fragment of about 1.8 kb was obtained I could. The amplified PCR product was cloned into a TA cloning vector to obtain a BoCYP38 base sequence. As a result of sequence analysis, it was confirmed that there is a positive relationship with the AtCYP38 gene (FIG. 4).

6개의 엑손 (exon)과 5개의 인트론 (intron)으로 구성된 양배추 BoCYP38 게놈 DNA를 시들음병 저항성 품종 (BoCYP38R gDNA; 서열번호 3) 및 감수성 품종 (BoCYP38S gDNA; 서열번호 6)에서 각각 확보하였다. BoCYP38은 애기장대 AtCYP38과 비교해서 84%의 염기서열이 일치하는 것으로 나타났다. 또한 양배추 시들음병 저항성 품종 및 감수성 품종의 잎 조직에서 RNA를 각각 추출한 후, 각각의 BoCYP38 cDNA 염기서열 (BoCYP38R cDNA (서열번호 1) 및 BoCYP38S cDNA (서열번호 4))을 확인하였다. 시들음병 감수성 품종의 아미노산 서열 (BoCYP38S; 서열번호 5)과 애기장대의 아미노산 서열 (AtCYP38; 서열번호 7)은 시들음병 저항성 품종의 아미노산 서열 (BoCYP38R; 서열번호 2)과 확연한 차이가 나타났으며 (도 5), 이는 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)에 의한 시들음병 표현형 차이가 나타나는 원인인 것으로 예측할 수 있다.
Cabbage BoCYP38 genomic DNA consisting of six exons and five introns was obtained from the wilt-resistant strain (BoCYP38R gDNA; SEQ ID NO: 3) and the susceptible varieties (BoCYP38S gDNA; SEQ ID NO: 6), respectively. BoCYP38 was found to be 84% identical to Arabidopsis AtCYP38. In addition, each of the BoCYP38 cDNA sequences (BoCYP38R cDNA (SEQ ID NO: 1) and BoCYP38S cDNA (SEQ ID NO: 4)) were identified after extracting RNA from the leaf tissues of the cabbage wilt-resistant and susceptible varieties. The amino acid sequence (BoCYP38S; SEQ ID NO: 5) of the wilt susceptible variety and the amino acid sequence (AtCYP38; SEQ ID NO: 7) of the Arabidopsis were significantly different from the amino acid sequence of the wilt resistant strain (BoCYP38R; SEQ ID NO: 2) ), which is Fusarium oxy sports rooms (Fusarium oxysporum ) caused by the widespread phenotype.

실시예Example 3. 3. BoCYP38BoCYP38 저항성 유전자의 선택적 Selective gene resistance 스플라이싱Splicing ( ( alternativealternative splicing) 확인 splicing

시들음병 저항성 품종과 감수성 품종에서 확보한 BoCYP38 cDNA를 비교한 결과 BoCYP38R 저항성 유전자 염기서열에서 선택적 스플라이싱이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 같은 유전자일지라도 선택적인 스플라이싱이 일어나 다른 mRNA들이 생성될 수 있으며, 따라서 다른 단백질이 만들어질 수 있다. BoCYP38 저항성 유전자는 감수성 유전자와 비교했을 때, 4번째 인트론에서 선택적 스플라이싱 일어나서 BoCYP38S와는 다른 mRNA가 생성되는 것으로 확인되었다. 선택적 스플라이싱 결과 감수성 BoCYP38 유전자에 비해 75 bp (25개 아미노산)가 더 긴 cDNA가 합성되었으며 (도 6), 이는 양배추에서 시들음병 저항성을 부여하는 단백질이 BoCYP38 유전자의 선택적 스플라이싱에 의해서 생성된다는 것을 나타낸다.
Comparison of BoCYP38 cDNA obtained from wilt - resistant and susceptible varieties showed selective splicing in the BoCYP38R resistance gene sequence. Even with the same gene, selective splicing can occur and other mRNAs can be generated, thus making other proteins. Compared to the susceptible gene, the BoCYP38 resistance gene was found to be selective splicing in the fourth intron, resulting in mRNA different from BoCYP38S. Selective splicing resulted in a longer 75 bp (25 amino acids) cDNA compared to the susceptible BoCYP38 gene (Fig. 6), suggesting that the protein that confers wilt resistance in cabbage is produced by selective splicing of the BoCYP38 gene .

실시예Example 4. 양배추 4. Cabbage 시들음병Wilt 저항성 품종 및 감수성 품종에서 Resistant and susceptible varieties BoCYP38BoCYP38 유전자의 발현 차이 확인 Identification of gene expression differences

BoCYP38R의 선택적 스플라이싱에 의해서 생성된 cDNA의 발현을 비교하기 위한 프라이머를 디자인하였다. BoCYP38R에서 선택적 스플라이싱이 일어나는 엑손 및 인트론 영역의 증폭을 위해 4번째 엑손 영역에 대한 BoCYP38R-F 프라이머 (5'-ATG TTT GTT GAT CAA TGG ATT GGC AG-3'; 서열번호 10) 및 4번째 인트론 영역에 대한 BoCYP38R-R 프라이머 (5'-CAT TGA TCA ACA AAC ATT GTC CC-3'; 서열번호 11)를 디자인하고, 선택적 스플라이싱이 일어나지 않는 5번째 엑손 영역에 대해 BoCYP38F 프라이머 (5'-AGG TGA TGC TTC CAT TCA ACG CR-3'; 서열번호 12) 및 BoCYP38R 프라이머 (5'-GAT GTT GGA ATT GCT TGG CGT C-3'; 서열번호 13)를 디자인하여 PCR을 수행하였다 (도 7).A primer was designed to compare the expression of cDNA generated by selective splicing of BoCYP38R. (5'-ATG TTT GTT GAT CAA TGG ATT GGC AG-3 '; SEQ ID NO: 10) for the 4th exon region and the 4th exon region for amplification of the exons and intron regions in which selective splicing occurs in BoCYP38R The BoCIP38R-R primer (5'-CAT TGA TCA ACA AAC ATT GTC CC-3 '; SEQ ID NO: 11) was designed for the intron region and the BoCYP38F primer (5' (SEQ ID NO: 12) and BoCYP38R primer (5'-GAT GTT GGA ATT GCT TGG CGT C-3 '; SEQ ID NO: 13) ).

양배추 시들음병 저항성 품종 (KR)과 감수성 품종 (HY)에서 상기 프라이머를 이용하여 증폭 여부를 확인한 결과, 저항성 품종에서는 선택적 스플라이싱 영역 (BoCYP38R)에 대한 발현이 확인되었으나, 감수성 품종에서는 선택적 스플라이싱 영역의 발현이 관찰되지 않았다. 반면에, 선택적 스플라이싱이 일어나지 않는 5번째 엑손 영역 (BoCYP38)에 대한 발현은 저항성 품종과 감수성 품종에서 큰 차이가 없는 것으로 나타났다 (도 7).In the case of resistant cultivars, expression in the selective splicing region (BoCYP38R) was confirmed in the KR and the susceptible varieties (HY) of the cabbage wilt disease, but in the susceptible varieties, the selective splicing No expression of the region was observed. On the other hand, the expression of the 5th exon region (BoCYP38) in which no selective splicing occurred was not significantly different between the resistant and susceptible varieties (Fig. 7).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> BoCYP38 gene conferring resistance to fusarium wilt of cabbage and uses thereof <130> PN13112 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1410 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 1 atggcggcgg cgtttgccac tctgcctaca ttgagtttgg tcaatacctc gagaaggaga 60 atcgattctt acagctccaa aaaacgcgtc ggagttgttc gttgttgctc cggcggcgac 120 attcccgaat ataagcaggt gcagagagga ggaggaggag ggacattgaa agaatgtgcg 180 attacattag ctttatcgtt gggtatgata gctggaggag gagcaccttc gattgcttac 240 gcggcgaacc cagcgattcc acaagtctca gtgttgatct ctggccctcc catcaaagac 300 ccaggagctt tgttgagata cgcattgccc atcgacaaca aagccatcag acaagtgcag 360 aagcctctcg aggacatcac tgacagcctc aagatcgctg gcgttaaggc tctcgattct 420 gttgaacgta atgtgaggca agcaagtaga tcactccagc aagggaaaag catgattgtt 480 gccggttttg ctgagtcgaa gaaggatcat ggtcacgaac tgattgggaa attggaagct 540 ggtatgcaag acatgctaca gattgtggaa gatcgcaaaa gagatgcggt tgctcctaaa 600 cagaaagaga ttctccaata tgttggcgga attgaagagg 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Leu Pro Thr Leu Ser Leu Val Asn Thr 1 5 10 15 Ser Arg Arg Arg Ile Asp Ser Tyr Ser Ser Lys Lys Arg Val Gly Val 20 25 30 Val Arg Cys Cys Ser Gly Gly Asp Ile Pro Glu Tyr Lys Gln Val Gln 35 40 45 Arg Gly Gly Gly Gly Gly Thr Leu Lys Glu Cys Ala Ile Thr Leu Ala 50 55 60 Leu Ser Leu Gly Met Ile Ala Gly Gly Gly Ala Pro Ser Ile Ala Tyr 65 70 75 80 Ala Ala Asn Pro Ala Ile Pro Gln Val Ser Val Leu Ile Ser Gly Pro 85 90 95 Pro Ile Lys Asp Pro Gly Ala Leu Leu Arg Tyr Ala Leu Pro Ile Asp 100 105 110 Asn Lys Ala Ile Arg Gln Val Gln Lys Pro Leu Glu Asp Ile Thr Asp 115 120 125 Ser Leu Lys Ile Ala Gly Val Lys Ala Leu Asp Ser Val Glu Arg Asn 130 135 140 Val Arg Gln Ala Ser Arg Ser Leu Gln Gln Gly Lys Ser Met Ile Val 145 150 155 160 Ala Gly Phe Ala Glu Ser Lys Lys Asp His Gly His Glu Leu Ile Gly 165 170 175 Lys Leu Glu Ala Gly Met Gln Asp Met Leu Gln Ile Val Glu Asp Arg 180 185 190 Lys Arg Asp Ala Val Ala Pro Lys Gln Lys Glu Ile Leu Gln Tyr Val 195 200 205 Gly Gly Ile Glu Glu Asp Met Val Asp Gly Phe Pro Tyr Asp Val Pro 210 215 220 Glu Glu Tyr Arg Asn Met Pro Leu Leu Lys Gly Arg Ala Thr Val Asp 225 230 235 240 Met Lys Val Lys Ile Lys Asp Asn Pro Asn Leu Glu Asp Cys Val Phe 245 250 255 Arg Leu Val Leu Asp Gly Tyr Asn Ala Pro Val Thr Ala Gly Asn Phe 260 265 270 Val Asp Leu Val Glu Arg His Phe Tyr Asp Gly Met Glu Ile Gln Arg 275 280 285 Cys Lys Thr Ser His Leu Pro Tyr His Leu Tyr Ile Ser Met Gly Gln 290 295 300 Cys Leu Leu Ile Asn Gly Leu Ala Ala Asp Gly Phe Val Val Gln Thr 305 310 315 320 Gly Asp Pro Glu Gly Pro Ala Glu Gly Phe Ile Asp Pro Ser Thr Glu 325 330 335 Lys Val Arg Thr Val Pro Leu Glu Ile Met Val Glu Gly Lys Lys Thr 340 345 350 Pro Phe Tyr Gly Ser Thr Leu Glu Glu Leu Gly Leu Tyr Lys Ala Gln 355 360 365 Val Met Leu Pro Phe Asn Ala Phe Gly Thr Met Ala Met Ala Arg Glu 370 375 380 Glu Phe Glu Asn Asp Ser Gly Ser Ser Gln Val Phe Trp Leu Leu Lys 385 390 395 400 Glu Ser Glu Leu Thr Pro Ser Asn Ser Asn Ile Leu Asp Gly Arg Tyr 405 410 415 Ala Val Phe Gly Tyr Val Thr Gln Asn Glu Asp Phe Leu Ala Asp Leu 420 425 430 Lys Val Gly Asp Val Ile Glu Ser Ile Gln Val Val Ser Gly Leu Asp 435 440 445 Asn Leu Ala Asn Pro Ser Tyr Lys Ile Ala Lys Gly Glu Phe Gln His 450 455 460 Thr Gly Gly Arg Tyr 465 <210> 3 <211> 1775 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 3 atggcggcgg cgtttgccac tctgcctaca ttgagtttgg tcaatacctc gagaaggaga 60 atcgattctt acagctccaa aaaacgcgtc ggagttgttc gttgttgctc cggcggcgac 120 attcccgaat ataagcaggt gcagagagga ggaggaggag ggacattgaa agaatgtgcg 180 attacattag ctttatcgtt gggtatgata gctggaggag gagcaccttc gattgcttac 240 gcggcgaacc cagcgattcc acaagtctca gtgttgatct ctggccctcc catcaaagac 300 ccaggagctt tgttgagata cgcattgccc atcgacaaca aagccatcag acaagtgcag 360 aagcctctcg aggacatcac tgacagcctc aagatcgctg gcgttaaggc tctcgattct 420 gttgaacgtg taagctgctt tatggtattg attgattgct ctgttttact tgattgttgt 480 tgcctatttg tagaatgtga ggcaagcaag tagatcactc cagcaaggga aaagcatgat 540 tgttgccggt tttgctgagt cgaagaagga tcatggtcac gaactgattg ggaaattgga 600 agctggtatg caagacatgc tacagattgt 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Lys Glu Ile Leu Gln Tyr Val 195 200 205 Gly Gly Ile Glu Glu Tyr Met Val Asp Gly Phe Pro Tyr Asp Val Pro 210 215 220 Glu Glu Tyr Arg Asn Met Pro Leu Leu Lys Gly Arg Ala Thr Val Asp 225 230 235 240 Met Lys Val Lys Ile Lys Asp Asn Pro Asn Leu Glu Asp Cys Val Phe 245 250 255 Arg Ile Val Leu Asp Gly Tyr Asn Ala Pro Val Thr Ala Gly Asn Phe 260 265 270 Val Asp Leu Val Glu Arg His Phe Tyr Asp Gly Met Glu Ile Gln Arg 275 280 285 Ser Asp Gly Phe Val Val Gln Thr Gly Asp Pro Glu Gly Pro Ala Glu 290 295 300 Gly Phe Ile Asp Pro Ser Thr Glu Lys Val Arg Thr Val Pro Leu Glu 305 310 315 320 Ile Met Val Glu Gly Lys Lys Thr Pro Phe Tyr Gly Ser Thr Leu Glu 325 330 335 Glu Leu Gly Leu Tyr Lys Ala Gln Val Met Leu Pro Phe Asn Ala Phe 340 345 350 Gly Thr Met Ala Met Ala Arg Glu Glu Phe Glu Asn Asp Ser Gly Ser 355 360 365 Ser Gln Val Phe Trp Leu Leu Lys Glu Ser Glu Leu Thr Pro Ser Asn 370 375 380 Ser Asn Ile Lys Gly Leu Asp Gly Arg Tyr Ala Val Phe Gly Tyr Val 385 390 395 400 Thr Gln Asn Glu Asp Phe Leu Ala Asp Leu Lys Val Gly Asp Val Ile 405 410 415 Glu Ser Ile Gln Val Val Ser Gly Leu Asp Asn Leu Ala Asn Pro Ser 420 425 430 Tyr Lys Ile Ala Lys Gly Glu Phe Gln His Thr Gly Gly Arg Tyr 435 440 445 <210> 6 <211> 1795 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 6 atggcggcgg cgtttgccac tctccctaca ttgagtttgg tcaattcctc gagaaggaga 60 atcgattctt acagctccaa aaagcgcgtc ggagttgttc gttgttgctc cggcggcgac 120 attcccgaat ataagcaggt gcagagagga ggaggaggag ggacattgaa agaatgtgcg 180 attacattag ctttatcgtt gggtttgata gctggaggag gagcaccttc gattgcttac 240 gcggcgaacc cagcgattcc acaagtctca gtgttgatct ctggtcctcc catcaaagac 300 ccaggagctt tgttgagata cgcattgccc atcgacaaca aagccatcag agaagtgcag 360 aagcctctcg aggacatcac tgacagcctc aagatcgctg gcgttaaggc tctcgattct 420 gttgaacgtg taagctgctt tatggtattg attgattgat tgctcttttt ttacttgatt 480 gttgttgcct atttgtagaa tgttaggcaa gcaagtagat cactccagca agggaaaagc 540 atgattgttg ccggttttgc tgagtcgaag aaggatcatg gtcacgaact gattgggaaa 600 ttggaagctg gtatgcaaga catgctacag attgtggaag 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atatatatat 1500 atgttgtaat tatatatgta atgcaaaaca ggagtttgag aatgactcgg gatcgagcca 1560 agtgttttgg ctgctgaaag agagtgagct gacgccaagc aattccaaca tcaagggctt 1620 ggacggtcgt tacgctgtct tcggttacgt tactcagaat gaagactttc ttgctgatct 1680 taaagtcggt gatgtcattg agtccatcca agttgtctcc ggtttagaca acctcgctaa 1740 cccgagttac aaaatcgcca agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt actag 1795 <210> 7 <211> 437 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 7 Met Ala Ala Ala Phe Ala Ser Leu Pro Thr Phe Ser Val Val Asn Ser 1 5 10 15 Ser Arg Phe Pro Arg Arg Arg Ile Gly Phe Ser Cys Ser Lys Lys Pro 20 25 30 Leu Glu Val Arg Cys Ser Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Thr Lys Gln Arg 35 40 45 Gly Ala Phe Thr Ser Leu Lys Glu Cys Ala Ile Ser Leu Ala Leu Ser 50 55 60 Val Gly Leu Met Val Ser Val Pro Ser Ile Ala Leu Pro Pro Asn Ala 65 70 75 80 His Ala Val Ala Asn Pro Val Ile Pro Asp Val Ser Val Leu Ile Ser 85 90 95 Gly Pro Pro Ile Lys Asp Pro Glu Ala Leu Leu Arg Tyr Ala Leu Pro 100 105 110 Ile Asp Asn Lys Ala Ile Arg Glu Val Gln Lys Pro Leu 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aattgattat cataatttaa catttgttca tttggttgga caggaattgg gtctgtacaa 1380 ggctcaggtg atgcttccat tcaacgcatt tgggactatg gcaatggcta gagaagtgag 1440 agttctttct cttctttcct ttcttcacaa ttgaatatat atatatatgt tgtaattata 1500 tatgtaatgc aaaacaggag tttgagaatg actcgggatc gagccaagtg ttttggctgc 1560 tgaaagagag tgagctgacg ccaagcaatt ccaacatctt ggacggtcgt tacgctgtct 1620 tcggttacgt tactcagaat gaagactttc ttgctgatct taaagtcggt gatgtcattg 1680 agtccatcca agttgtctcc ggtttagaca acctcgctaa cccgagttac aaaatcgcca 1740 agggcgaatt ccagcacact ggcggccgtt actag 1775 <210> 4 <211> 1344 <212> DNA <213> Brassica oleracea <400> 4 atggcggcgg cgtttgccac tctccctaca ttgagtttgg tcaattcctc gagaaggaga 60 atcgattctt acagctccaa aaagcgcgtc ggagttgttc gttgttgctc cggcggcgac 120 attcccgaat ataagcaggt gcagagagga ggaggaggag ggacattgaa agaatgtgcg 180 attacattag ctttatcgtt gggtttgata gctggaggag gagcaccttc gattgcttac 240 gcggcgaacc cagcgattcc acaagtctca gtgttgatct ctggtcctcc catcaaagac 300 ccaggagctt tgttgagata cgcattgccc atcgacaaca 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Claims

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The amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, cabbage ( Brassica A composition for promoting resistance to wilt disease in a plant containing a recombinant vector comprising a gene encoding a BoCYP38 protein derived from oleracea .