KR101570143B1

KR101570143B1 - 신장암 진단용 지질 마커 및 이를 이용한 신장암 진단방법

Info

Publication number: KR101570143B1
Application number: KR1020140061542A
Authority: KR
Inventors: 김학균; 김영환; 정진수
Original assignee: 국립암센터; 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2014-05-22
Filing date: 2014-05-22
Publication date: 2015-11-20

Abstract

본 발명은 지질발현분석을 이용한 신장암의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, C24-OH 설파티드(sulfatide), C22-OH 설파티드, PC(포스파티딜콜린){34:1} 및 PC{36:2} 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 신장암의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MALDI MS (MALDI 질량분석; matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry) 를 이용하여 신세포암 (또는 신장암) (renal cell carcinoma) 의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라, 적은 샘플의 양으로 간단하면서도 높은 정확도로 신장암을 진단할 수 있으며, 신장암의 하위유형으로서, 투명세포형, 유두형 및 난염형의 신장암을 간단하고 높은 정확도로 감별해낼 수 있고, 신장암의 하위유형으로서의 투명세포형 신장암과 비투명세포형 신장암을 간단하고 높은 정확도로 감별해낼 수 있다.

Description

신장암 진단용 지질 마커 및 이를 이용한 신장암 진단방법 {Lipid marker for diagnosing renal cell carcinoma and diagnostic method using the same}

본 발명은 지질발현분석을 이용하여 신장암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 C24-OH 설파티드(sulfatide), C22-OH 설파티드, PC(포스파티딜콜린){34:1} 및 PC{36:2} 등의 신장암 진단용 지질 마커 및 이를 이용한 신장암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

신세포암 (또는 신장암) (renal cell carcinoma; RCC) 은 성인 암의 3% 를 차지하는 비교적 흔한 질병이며, 그 발병율 및 치사율은 전 세계적으로 꾸준히 증가하고 있다. 중앙암등록본부(Korea Central Cancer Registry)의 보고에 따르면, 신세포암 환자가 2008년에 전체 암 환자의 1.8% 를 차지한 이래 꾸준히 증가하고 있다. 미국에서는 신세포암에 의해 1년에 57,000 명의 환자 중에 13,000 명의 환자가 사망하는 것으로 나타났다.

RCC의 조직 병리학적 진단은 종종 작은 조직 검사 샘플로는 어려울 수 있다. 따라서, RCC 진단의 정확성을 개선하기 위해 신규한 바이오마커 (biomarkers) 가 요구된다.

축적된 증거자료는 신장암이 발현되는 동안 지질 조성물이 변화된다는 것을 시사한다. Yoshimura 등은 탐침 전기분사 이온화 질량 분석기(probe electrospray ionization mass spectrometry; PESI-MS)를 이용하여, RCC 및 정상 조직 샘플 9쌍의 지질 프로파일을 분석하였다(K. Yoshimura, et al., Analysis of renal cell carcinoma as a first step for developing mass spectrometry-based diagnostics. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23:10, 1741-9). 상기 연구에 따르면, 트리아실글리세롤(triacylglycerol; TAG) 피크 (TAG 52:2, TAG 54:2, 및 TAG 54:3)는 오직 암 부위(cancerous region)에서만 높은 비율로 나타났다. 또한, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholne; PC)은 암 부위 및 그 이외의 영역 모두에 존재하였으며, 양 부위에서 이온양의 현저한 차이는 없었다. Tugnoli 등에 의해 수행된 NMR 분광학 연구에 따르면, 정상 신장 샘플에서는 유리 형태(free form)의 트리글리세리드 및 콜레스테롤이 많이 발견된 반면, RCC 샘플에서는 올레산으로 거의 완전히 에스테르화된 많은 양의 콜레스테롤이 나타났다(V. Tugnoli, et al., 1H-NMR and 13C-NMR lipid profiles of human renal tissues. Biopolymers 2003, 72:2, 86-95).

Szachowicz-Petelska 등은 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatohraphy)를 사용하여, 9 개의 RCC 샘플이 정상 조직에 비해 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)을 포함하여 상대적으로 많은 양의 총 지질을 함유한다는 사실을 발견하였다(B. Szachowicz-Petelska, et al., Lipid composition and electric charge in healthy and cancerous parts of human kidneys. J. Membr. Biol. 2013, 246:5, 421-5). 그러나, 위 연구들은 각각의 지질들의 상대적인 조성을 종합적으로 밝혀내지는 못하였다. 즉, 임상 RCC 샘플의 적은 양 때문에 이러한 연구들은 제한적일 수밖에 없으므로, 각각의 RCC 샘플의 지질 조성의 차이를 완벽히 설명하지는 못했다. 또한, 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol) 또는 설파티드(sulfatides)와 같은 음하전 지질(negatively charged lipids)은 아직까지 평가된 바 없다.

한편, 조직 MALDI 질량분석(tissue matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI MS)은 RCC를 포함하는 일반적인 고체 종양의 바이오마커 감별에 유용하게 사용되어 왔다. 위 연구들에서 MALDI MS는 정상 신장 조직으로부터 악성 조직을 정확하게 감별하는 펩티드를 동정하는데 유용하게 사용되었다. 효과적인 매트릭스(matrix)의 개발로, 조직-직접적 MALDI MS (histology-directed MALDI MS) 분석은 임상 조직 샘플의 지질 프로파일에 성공적으로 사용되어 왔다(S.R. Shanta, L.H. Zhou, Y.S. Park, Y.H. Kim, Y. Kim, K.P. Kim, Binary matrix for MALDI imaging mass spectrometry of lipids in both ion modes. Anal. Chem. 2011, 83:4, 1252-1259). 여기에서 나타나는 스펙트럼은 주로 샘플 조직에 존재하는 인지질(phospholipids) 및 황지질(sulfolipids)의 단일 하전 이온(singly charged ions)으로 구성된다.

이러한 접근법을 사용하여, 본 발명자들은 다수의 일반적인 고체 종양의 암-특이적 지질 표지들(cancer-specific lipid signatures)을 밝혀내었다(G.K. Lee, et al., Lipid MALDI profile classifies non-small cell lung cancers according to the histologic type. Lung Cancer 2012, 76:2, 197-203 등 참조). 그러나, 본 발명자들이 사용한 기술은, 음 및 양 하전 이온 모두가 공간 위치 정보와 함께 평가된다는 점에서, 기존의 RCC 지질 분석에 사용되었던 방법들과는 구별된다. 본 발명자들은 상기 기술을 RCC 조직 샘플에 적용하여 RCC 조직과 정상 조직 샘플의 지질 프로파일간의 차이를 평가함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 신장암 조직과 정상 조직 사이에서 상이하게 발현되는 신규한 신장암 진단용 지질 마커를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 특정 지질 마커를 이용하여 신장암을 정확하게 진단하기 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, C24-OH 설파티드(sulfatide), C22-OH 설파티드, PC(포스파티딜콜린){34:1} 및 PC{36:2} 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 신장암 진단용 지질 마커를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 C24-OH 설파티드(sulfatide), C22-OH 설파티드, PC{34:1} 는 정상 대조군에 비하여 신장암 환자 샘플에서 낮게 발현되며, PC{36:2}는 정상 대조군에 비하여 신장암 환자 샘플에서 높게 발현된다.

또한, 본 발명은 상기 지질 마커의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 신장암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 C24-OH 설파티드(sulfatide), C22-OH 설파티드 및 PC{34:1}로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 지질이 정상 대조군에 비하여 낮게 발현될 경우 신장암의 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 PC{36:2}가 정상 대조군에 비하여 높게 발현될 경우 신장암의 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 지질 마커의 발현을 분석하는 단계는 MALDI 질량분석을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 MALDI 질량분석을 이용하는 방법은 n906.7, n878.6, p760.6 및 p824.6 (여기서, n은 음이온 모드이며, p는 양이온 모드임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 m/z 값에 대한 지질 프로파일을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은, MALDI 질량분석을 수행하여 n588.2 (여기서, n은 음이온 모드임)가 정상 대조군에 비하여 높게 발현되는 경우 신장암의 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 신장암의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 화합물 공변 예측기 (compound covariate predictor), 사선 선형 판별 분석 (diagonal linear discriminant analysis), 1-니어리스트 네이버 (1-nearest neighbors), 3-니어리스트 네이버 (3-nearest neighbors), 니어리스트 센트로이드 (nearest centroid) 및 서포트 벡터 머신 (support vector machine) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 지질의 발현을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 지질 마커들은 정상 대조군에 비하여 신장암 환자 샘플에서 발현양상이 유의적으로 변화하는 것을 확인하였다. 따라서 이들 마커들을 이용할 경우 보다 정확하게 신장암 조직을 감별할 수 있다.

도 1은 RCC 샘플(적색으로 표시) 및 그에 인접한 정상 조직 샘플(녹색으로 표시)에 대해, 음(A)- 및 양(B)-이온 모드에서 수득된 모든 단일 질량 스펙트럼의 오버레이(overlay)를 나타낸 것이다(상단). 하단 패널은, RCC 및 인접 정상 조직 샘플에 대해 모든 단일 질량 스펙트럼들을 개별적으로 나타낸 것이다.
도 2(A)는 RCC 샘플(분홍색으로 표시) 및 인접 정상 조직 샘플(녹색으로 표시)에 대한 주성분분석(principal component analysis; PCA) 도표이다. '1-correlation distances among samples' 가 거리 측정에 사용되었다. 각가의 구(sphere)는 단일 샘플을 나타내고, 지질 MALDI 프로파일이 매우 유사한 샘플들은 서로 가까이에 있는 것으로 나타난다. 도 2(B)는 투명세포형(clear-cell type)(적색으로 표시), 유두형(papillary type)(녹색으로 표시) 및 난염형(chromophobe type)(청색으로 표시)에 대한 PCA 도표이다.
도 3은, 음이온 모드에서의 (A) m/z 906.7 및 (B) m/z 878.6 피크의 생성 이온 스펙트럼이다. 상기 피크들은 생성 이온 스펙트럼에서 HSO4- (m/z 97)에 기초하여 설파티드들로 동정되었다. 음이온 모드에서의 (A) m/z 906.7 피크는 C24-OH 설파티드 (ST-OH {18:1/24:0} [M-H]-)로 동정된다. (B) m/z 878.6 피크는 C22-OH 설파티드 (ST-OH {18:1/22:0}[M-H]-)로 동정된다.
도 4는, 인접 정상 조직 (n=24), RCC (n=59) 및 신장 호산성 과립세포종 (n=2) 에서의 C24-OH 설파티드 (ST-OH {18:1/24:0} [M-H]-) 의 정규화된 피크 세기에 대한 박스 플롯(plot)이다. Y 축은, 각 샘플의 음이온 모드에서의 m/z 906.7 피크의 정규화된 세기를 나타낸다. 박스는 중간값 (수평바) 의 사분위수 범위 (interquartile range) (IQR; Q1-Q3) 를 나타낸다. 각 점 (dot) 은, 피크 세기가 Q3+ (1.5xIQR) 초과이거나 Q1-(1.5xIQR) 미만인, 이상치 샘플을 나타낸다.
도 5는, P < 0.001 에서 조직학에 따라 다르게 나타나는 지질들에 대한 피크 세기 프로파일을 나타낸다.
도 6은, 일반적인 MALDI MS 방법을 나타낸다. 종양 샘플의 DHB/CHCA 매트릭스가 로딩된 크리오섹션(cryosection) ITO 슬라이드 및 H&E-염색된 연속적 크리오섹션 ITO 슬라이드의 대표적인 광학 이미지를 나타낸다. H&E-염색된 크리오섹션 슬라이드로 나타낸 바와 같이, 종양이 풍부함을 나타내는 ITO 크리오섹션 슬라이드 상의 매트릭스 위치들 (spots) 은, FlexImaging software 를 사용하여 선택된다. 그 후, 위치들로부터 선택된 질량 스펙트럼 데이터는 추가적인 데이터 처리를 위해 ClinProTools 로 추출되고, 처리된 데이터는 클래스 예측 분석을 위해 사용된다.
도 7은, 양이온 모드에서 (PC {34:1} [M+H]+) m/z 760.6 피크의 생성 이온 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은, 양이온 모드에서 (PC {36:2} [M+K]+) m/z 824.6 피크의 생성 이온 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명의 신장암의 진단을 위한 정보 제공 방법은, C24-OH 설파티드(sulfatide), C22-OH 설파티드, PC(포스파티딜콜린){34:1} 및 PC{36:2} 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질의 발현을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 상기 C24-OH 설파티드(sulfatide), C22-OH 설파티드, PC{34:1} 는 정상 대조군에 비하여 신장암 환자 샘플에서 낮게 발현되며, PC{36:2}는 정상 대조군에 비하여 신장암 환자 샘플에서 높게 발현되었다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 정보 제공 방법은 MALDI 질량분석을 이용하여 지질의 발현을 분석하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. MALDI 질량분석을 이용할 경우, 본 발명의 방법은 n906.7, n878.6, p760.6 및 p824.6 (여기서, n은 음이온 모드이며, p는 양이온 모드임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 m/z 값에 대한 지질의 프로파일 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 신장암의 진단을 위한 정보 제공 방법은, MALDI 질량분석을 수행하여 n588.2 (여기서, n은 음이온 모드임)가 정상 대조군에 비하여 높게 발현되는 경우 신장암의 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

조직 샘플의 준비

임상시험심사위원회(institutional review board; IRB)의 승인을 받은 후, 한국 국립암센터(National Cancer Center in Korea)에서 RCC 수술을 받은 환자들로부터 사전동의를 얻어 채집한 동결조직(frozen tissue) 샘플에 대해, 조직-직접적 MALDI MS 분석이 수행되었다. 부분 신적출된 경우 인접 정상 조직 샘플이 종양으로부터 5 mm 떨어진 곳에서 채취되고, 고도로 신적출된 경우 종양으로부터 4 cm 떨어진 곳에서 채취되었다. 조직 샘플은 분석 전에 액체질소에서 냉동되었다. 저온 유지 장치(cryostat) (Leica CM 3050S, Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL) 를 이용하여, 얇은 (10 ㎛) 크리오섹션(cryosection) 슬라이드가 동결조직으로부터 수득되었다. 하나의 절편이 indium tin oxide (ITO) 슬라이드 (HST Inc., Newark, NJ) 상에서 해동되고, 이후의 MALDI MS 분석을 위해 진공 건조되었다. 연속적인 크리오섹션 절편이 표준 글라스 스라이드에 부착되고, 후에 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) (H&E)로 염색되었다. 70% methanol, 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) 및 1% piperidine 1mL 중의 7 mg 씩의 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)/α-cyano-4- hydroxycinnamic acid (CHCA) 를 용해하여, 이중 (binary) 매트릭스 용액을 제조하였다. Chip-1000 instrument (Shimadzu, Kyoto, Japan) 을 이용하여, 400 마이크론의 인쇄 간격 (print pitch) 으로 DHB/CHCA 매트릭스 (15 nL, 34 회) 가 도포되었다.

< 실시예 2>

MALDI MS 와 MS / MS 데이터의 수득

질량 스펙트럼은 UltrafleXtreme MALDI time-of-light mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)를 이용하여, 음- 및 양이온 둘 모두의 반사 모드에서 수득되었다. 질량 분석 데이터는, 1 kHz 의 주파수로의 2000 의 연속적인 레이저 주사로부터의 신호를 평균을 내어, 500 내지 1100 Da의 범위의 m/z 로 수득되었다. 음이온 모드에서 m/z 564-906 및 양이온 모드에서 m/z 674-834 로 지질-혼합 교정 표준을 이용하여, 외부 교정이 수행되었다. 종양 샘플에 대해 FlexImaging software (version 2.1, Bruker Daltonics) 를 이용하여, H&E-염색된 연속적 크리오섹션에 따른 종양 부위(tumor-rich area)에 해당하는 매트리스 위치(spot)가 선택되었다 (도 6).

세뇨관 피질 상피(renal tubular epithelial)에 해당하는 매트릭스 위치가 인접 정상 조직 샘플에 대해 선택되었다. 위치들로부터 선택된 질량 스펙트럼은 추가 데이터 처리를 위해 ClinProTools (version 2.2, Bruker Daltonics) 로 추출되었다. MALDI MS 후 MALDI MS/MS 분석은 조직 절편에 직접적으로 수행되고, 그 결과는 공공의 지질 데이터베이스에 개시된다 (www.lipidmaps.org).

< 실시예 3>

데이터 처리

ClinProTools 가 baseline subtraction, spectral recalibration 및 spectral area calculation 에 사용된다. 300 의 resolution 이 상기 피크 감별법에 적용되었다. 10.0％의 minimal baseline width 의 Top Hat baseline subtraction 이 baseline subtraction 에 사용되었다. 스펙트럼은 참조와 피크 질량간 2000 ppm 의 maximal peak shift 로 재교정되었다. '％ Match to Calibrant Peaks' 변수의 값은 20％ 로 설정되었다. 신호 대 노이즈 비율 컷오프 (signal-to-noise ratio cut-off) 는 5 로 설정되었고, 피크 영역은 zero lovel integration 으로 피크 계산에 사용되었다. 그리고나서, 각각의 조직 샘플에 대해 계산된 총 평균 스펙트럼 상의 피크를 선택함으로써, 평균 피크 리스트가 각각의 조직 샘플에 대해 설정되어, 환자당 한 개의 평균 스펙트럼을 생성하였다. 음- 및 양이온 모드 데이터는 개별적으로 상기 평균에 대해 정규화되었고 (normalized), 후에 단일 데이터세트 (dataset) 로 결합되었으며, 이에 대해 BRB-ArrayTools (version 5.1; NCI, Bethesda, MD) 를 이용하여 통계 분석을 수행하였다.

통계 분석

본 발명자들은 BRB-ArrayTools 의 모든 분류 기능 (화합물 공변 예측기 (compound covariate predictor), 사선 선형 판별 분석 (diagonal linear discriminant analysis), 1- 및 3-니어리스트 네이버 (1- and 3-nearest neighbors), 니어리스트 센트로이드 (nearest centroid), 및 서포트 벡터 머신(support vector machine)) 을 이용하여 클래스 예측 분석 (class prediction analyses) 을 수행하였다. 클래스 예측 분석은 랜덤하게 트레이닝 세트 (training set) 를 2개의 서브세트 (training 및 test) 로 2 대 1의 비율로 나눔으로써 수행되었다. nQuery Advisor software (version 7.0, Statistical Solutions, Saugus, MA) 가 랜덤화에 사용되었다. 각 분류 기능은 100 개의 랜덤한 training-to-test 분할의 각각에 대해 샘플의 클래스 표지 (class labels) 를 예측했다.

조직학적 하위유형에 따라 지질 프로파일이 다른지의 여부를 평가하기 위해, 트레이닝 세트로서 모든 샘플을 사용하여 클래스 예측 분석을 수행하였다. 0.632+ bootstrap cross-validated misclassification 비율 (rates) 이 트레이닝 세트의 모든 분류 기능에 대해 계산되었다. 그 후, 클래스 표지들은 랜덤하게 섞이고 cross-validated misclassification 비율이 각각의 랜덤 데이터세트에 대해 계산되었다. 적은 misclassificatio 비율일수록 실제 클래스 지표로 수득되는, 랜덤 데이터세트의 비율로 정의되는 퍼뮤테이션 P 값 (permutation P value) 이 계산되었다. 상기 퍼뮤테이션 P 값이 <0.05 이면, 상기 클래스들의 MALDI MS 프로파일이 서로 다른 것으로 간주되었다.

< 실시예 4>

피크 분석 및 결과

본 연구에서는, 2011년부터 2014년까지의 한국 국립암센터에서 수술 받은 환자들로부터 채집된 59 개의 RCC 샘플 및 24 개의 인접 정상 조직 샘플을 평가하였다(표 1). 모든 환자들은 IRB-승인된 사전동의서에 사인하였다. 질량 스펙트럼들은 각 조직 절편에 대한 개별적인 위치에서 수득되었고, 전처리 (pre-processing) 후 상기 스펙트럼들은 함께 평균 내어짐으로써, 양- 및 음이온 모드 각각에서 환자당 한 개의 평균 스펙트럼이 생성되었다. 스펙트럼의 후처리 (post-spectral processing) 는 연구된 모든 샘플에 대한 전체 질량 범위에 걸쳐, 33 개의 특징들을 감별하였다 (음- 및 양이온 모드에 대해 각각 14 및 19 개) (도 1).

임상병리학적 특징들

	RCC (n=59)	정상 (n=24)
나이 (년)
범위	30-78	29-59
중간값 (median)	58	50
성별
남성	41 (69.5%)	15 (62.5%)
여성	18 (30.5%)	9 (37.5%)
수술
부분 신적출 (partial nephrectomy)	29 (49.2%)	13 (54.2%)
고도의 신적출 (radical nephrectomy)	30 (50.8%)	11 (45.8%)
조직학적 유형
투명세포형 (clear cell type)	51 (86.4%)
유두형 (Ⅱ) (papillary type (Ⅱ))	6 (10.2%)
난염형 (chromophobe)	2 (3.4%)
등급 ¹
1	2 (3.9%)
2	31 (60.8%)
3	17 (33.3%)
4	1 (2.0%)
병리학적 단계 (AJCC)
Ⅰ	41 (69.5%)
pT1aN0M0	32
pT1bN0M0	9
Ⅱ	7 (11.9%)
pT2N0M0	1
pT2aN0M0	3
pT2bN0M0	3
Ⅲ	6 (10.2%)
pT3aN0M0	6
Ⅳ	5 (8.5%)
pT1aN0M1	1
pT3aN1M1	1
pT3aN0M1	3
¹Furman grade RCC, renal cell carcinoma; AJCC, American Joint Committee on Cancer (7th Edition)

주성분분석 (principal component analysis) 에 따르면, RCC 샘플은 인접 정상 조직 샘플과 별도로 응집하였다 (clustered) (도 2A). RCC 샘플 및 인접 정상 조직 샘플 사이에, 5 개의 피크가 P < 10^-7 의 유의 수준으로 상이하게 나타났다 (이하, 'RCC-특이적 지질 프로파일' 로 칭함, 표 2). 특징 선별 (feature selection) P < 10^-7 에서 인접 정상 조직 샘플과 비교하여, 3 개의 피크 (음이온 모드에서 m/z 906.7 및 m/z 878.6, 및 양이온 모드에서 m/z 760.6) 가 RCC 샘플에서 낮게 나타났다.

RCC 및 정상 조직의 P < 10^-7 에서 상이하게 나타나는 지질 피크들 (RCC-특이적 지질 프로파일)

암에서 낮게 나타남
m/z	지정	P	정상	암	비율¹
n906.7	ST-OH {18:1/24:0} [M-H]-	<1 X 10^-7	28.3	3.2	0.1
n878.6	ST-OH {18:1/24:0} [M-H]-	<1 X 10^-7	11.0	2.0	0.2
p760.6	PC {34:1}[M+H]+	<1 X 10^-7	17.3	10.5	0.6

암에서 높게 나타남
m/z	지정	P	정상	암	비율
p824.6	PC {34:1}[M+H]+	<1 X 10^-7	4.1	6.2	1.5
n588.2		<1 X 10^-7	3.9	10.6	2.8
¹ 암 (RCC) 대 정상 조직의 피크 세기의 비율; n, 음이온 모드; p, 양이온 모드; ST, 설파티드; PC, 포스파티딜콜린

RCC 조직 절편에 대한 MS/MS 분석에 따르면, RCC 샘플에서, C24-OH 설파티드 (음이온 모드에서 ST-OH {18:1/24:0} [M-H]-; m/z 906.7) 및 C22-OH 설파티드 (음이온 모드에서 ST-OH {18:1/22:0}[M-H]-; m/z 878.6) 가 매우 상당히 낮게 나타났다 (도 3, 도 7 및 도 8). 주어진 P 컷오프 값 (10^-7) 의 엄격함으로 인해, 도 1에 개시된, 상이하게 나타나는 몇몇의 명백히 암-특이적인 피크는 통계적인 중요성이 인정되지 않는다 (따라서, RCC-특이적 지질 프로파일 에서 제외된다).

RCC-특이적 지질 프로파일 의 분류 기능을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 샘플들을 2 대 1의 비율로 2 개의 군으로 랜덤하게 나눈 후 클래스 예측 분석을 수행하였다. 상기 샘플들 중 100 개의 랜덤한 training-to-test 분할에 대한 중간 예측 정확도 (median prediction accuracy) (RCC vs. 정상) 가, 0.001 내지 10^-7 로부터의 특징 선별에 대한 다양한 P 에서 96.3% 내지 100% 의 범위였다 (표 3).

100 개의 랜덤 데이터세트의 특징 선별에 대한 다양한 P 컷오프에서의 RCC 및 정상 조직 샘플에서 상이하게 나타나는 지질의 중간 클래스 예측 정확도

P	CCP	LDA	1-NN	3-NN	NC	SVM
10^-3	96.4%	100.0%	100.0%	100.0%	96.3%	100.0%
10^-5	96.4%	100.0%	100.0%	100.0%	96.4%	100.0%
10^-7	96.4%	98.2%	96.4%	96.4%	96.4%	100.0%
CCP, compound covariate predictor; LDA, linear discriminant analysis; NN, nearest neighbor; NC, nearest centroid; SVM, support vector machine; RCC, 신세포암

C24-OH 설파티드 피크 (m/z 906.7) 은 RCC 에서 가장 낮게 나타난 피크였다. C24-OH 설파티드 피크 (m/z 906.7) 의 중간 피크 세기 (median peak intensity) 는 등급 2-4 투명세포형 (clear-cell) RCC 샘플에서보다 등급 1의 잘 분화된 투명세포형 RCC 샘플에서 2.9 배 높았다 (t-test 에 대한 P = 0.002). RCC 및 양성 종양을 세포학적으로 구별하는 것은 때때로 적은 생체 검사 샘플로는 어렵다. 예를 들어, 신장 호산성 과립세포종 (renal oncocytomas) 은 난염형 신장 세포 암종 (chromophobe) 과 유사한 조직 기원 및 조직학적 결론을 가진다. 지질 프로파일이 RCC 및 양성 신장 병변 (lesions) 을 구별할 수 있는지를 평가하기 위해, 2 명의 여성 환자 (48세 및 66세) 로부터의 호산성 과립세포종 샘플에 대해 동일한 지질 MALDI MS 분석을 수행하였고, RCC-특이적 지질 프로파일 을 사용하여 이들의 클래스 표지를 예측하였다. 클래스 예측 분석이 상기 두 개의 샘플에 대해 RCC-특이적 지질 프로파일 을 사용하여 수행되었을 때, 호산성 과립세포종 샘플 둘 모두가 모든 분류 기능에 의해 정상 조직 샘플로 예측되었다. C24-OH 설파티드 (m/z 906.7) 는, 2 개의 난염형 신장 세포 암종을 포함하는 59 개의 RCC 에서보다, 실험된 두 개의 신장 호산성 과립세포종에서 더욱 풍부했다. 도 4에 개시된 바와 같이, m/z 906.7 피크 (수평바 (horizontal bar) 로 개시됨) 의 중간 세기는 난염형 신장 세포 암종에서보다 호산성 과립세포종에서 6.2 배 높았다.

본 발명자들은 지질 프로파일이 조직학적 유형 (투명세포형, 유두형 및 난염형) 에 따라 다른지 및 어떻게 다른지에 대해 연구하였다. 주성분분석 도표는 샘플들이 조직학에 따라 응집하는 경향이 있음을 나타낸다 (도 2B). 조직학적 유형에 따라 지질 프로파일이 달라지는지의 여부를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 트레이닝 세트로서의 전체 샘플 세트에 대해 클래스 예측 분석을 수행하였다. 0.632+ bootstrap cross-validated misclassification 비율에 대한 퍼뮤테이션 P 값은, 1-니어리스트 네이버 분류 (1-nearest neighbor classifier), 3-니어리스트 네이버 분류 (3-nearest neighbor classifier) 및 니어리스트 센트로이드 분류 (nearest centroid classifier) 에 대해 각각 <0.001, 0.017 및 <0.001 이었다 (P < 0.01 에서). 12 개의 지질 종류가 특징 선별 P < 0.01 에서 조직학적 유형에 따라 서로 상이하게 나타났다 (표 4). 난염형 신장 세포 암종의 작은 샘플 크기에 의해 제한됨에도 불구하고 (n=2), 샘플들을 2 대 1의 비율로 2 개의 군으로 랜덤하게 나눈 후에 클래스 예측 분석 (투명세포형 vs. 비투명세포형) 이 수행되었다. 각각의 트레이닝 세트에서 서로 상이하게 나타나는 지질을 이용한, 투명세포형 및 비투명세포형 RCC 샘플의 분류에 대한 중간 예측 정확도는, 랜덤 테스트 세트에서 85 내지 90% 였다 (P < 0.05 에서) (표 5). 상기 결과들은, 지질 프로파일이 RCC 및 정상 조직을 정확하게 감별하고 조직학적으로 분류할 수 있다는 것을 입증한다.

P < 0.01 에서 조직학에 따라 다르게 나타나는 지질들

m/z	지정	P	투명세포형	유두형	난염형
p741.6	SM{d18:1/16:0}[M+K]+	< 0.001	7.0	5.7	2.5
n885.6	PI{38:4}[M-H]-	< 0.001	14.4	52.3	8.0
p524.4	LPS{18:1}[M+H]+	< 0.001	1.2	1.0	2.7
n834.9		< 0.001	4.0	3.9	22.1
p758.6	PC{34:2}[M+H}+	< 0.001	8.1	5.8	7.6
n1052.8		0.001	23.4	11.0	2.8
p786.6		0.001	8.8	7.7	5.2
p725.6	SM{34:1}[M+Na]+	0.003	9.0	7.8	3.2
n604.2		0.004	7.5	8.5	35.6
p750.5	PC{14:1(9Z)/20:5}[M+H]+	0.008	7.3	9.7	10.3
n862.6		0.009	8.9	6.3	26.1
p780.6		0.010	7.0	5.9	11.5
n, 음이온 모드; p, 양이온 모드; SM, (스핑고미엘린) Sphingomyelin, PI: 포스파티딜이노시톨; LPS, 리소포스파티딜세린(Lysophosphatidylserine); PC, 포스파티딜콜린; ST: 설파티드

100 개의 랜덤 데이터세트의 P <0.05 에서 투명세포형 RCC 및 비투명세포형 RCC 샘플에서 상이하게 나타나는 지질의 중간 클래스 예측 정확도

CCP	LDA	1-NN	3-NN	NC	SVM
85.0%	89.5%	90.0%	90.0%	85.0%	90.0%
CCP, compound covariate predictor; LDA, linear discriminant analysis; NN, nearest neighbor; NC, nearest centroid; SVM, support vector machine; RCC, 신세포암

RCC 의 가장 일반적인 하위유형인 투명세포형 RCC 는 글리코겐 (glycogen), 및 콜레스테롤 및 TAGs 와 같은 중성 지질의 존재로 특징지어진다. 본 발명은 TAGs 이외의 지질의 프로파일링이, 정상 조직 샘플로부터 RCC 조직을 감별하기에 유용하고, 조직학에 따라 RCC 를 분류하기에 유용하다는 것을 입증하였다. 기존에 RCC 의 지질 프로파일 평가에 대한 다수의 연구가 있었으나, 기존 연구들은 작은 샘플 크기에 의해 제한되었다. 게다가, 임상 RCC 샘플을 이용한 종합적인 음이온성 지질 평가에 대한 연구는 없었다.

MALDI 매트릭스는 어떠한 분자 그룹의 이온화에 선택적이다. 본 발명의 DHB/CHCA 이중 매트릭스계 조직 MALDI MS 분석은, TAGs 와 같은 중성 지질이 아닌, 하전된 지질에 최적화 되어있다. TAG 는 추출 및 용해한 후, MALDI MS 를 이용하여 매트릭스로서의 DHB 와 함께 분석되었다. RCC 환자의 임상 조직 샘플은 분산된 종양 세포의 오직 작은 부분만 함유할 수 있으며, 이는 분자 연구에 기술적인 제한을 야기한다. 이와 관련하여, 본 발명의 조직 MALDI MS 접근법은, 분석에 적은 양의 조직이 요구되므로, 잠재적 임상 적용을 위한 이점을 제공한다. 추출/용해계 방법 (extraction/solubilization-base) 과 비교하여, 비교적 단순한 실험 과정 및 짧은 회전 시간 또한 조직 MALDI MS 의 추가적인 장점이 될 수 있다. 본 발명의 DHB/CHCA 조직 MALDI MS 를 이용해서는 TAG 가 감별되지 않았으나, 포스포- 및 술포-지질 프로파일이 RCC 및 정상 조직을 정확하게 감별하였다.

최근 개발된 이온화 기술인 PESI-MS 는, 탐침자로 고체 바늘을 이용하며, 샘플 전처리 및 진공을 필요로 하지 않는다. 이러한 급격히 발달된 도구는, 임상 RCC 샘플에서 TAG 및 포스파티딜콜린을 감별할 수 있으며, 비신장암성 조직으로부터 RCC 를 감별한다. 그러나, PESI-MS 기술은, 높은 세포 불균일성을 가진 일반적인 고체 종양의 작은 생체 조직 샘플을 분석하는 데에 있어서는 불리하다. 이에 반해, 조직-직접적 조직 MALDI MS 는 동결조직의 얇은 절편에 사용하고, 조직에 대한 개별적 위치로부터 질량 스펙트럼을 수득한다. 이러한 특징으로부터, 본 발명의 DHB/CHCA 이중 매트릭스계 조직 MALDI MS 접근법은 정상 조직으로부터 RCC 를 감별하는 것 뿐만 아니라, 종양이 풍부한 구역으로부터 특별히 지질 프로파일을 수집함으로써 RCC 를 조직학적으로 분류한다. 하위유형에 따라 예후가 다르기 때문에, RCC 의 조직학적 하위유형을 분류하는 것은 중요하나, 이는 작은 생체 조직 샘플로 인해 때때로 어려울 수 있다. 이러한 특정 부분에서, 본 발명은 투명세포형, 유두형 및 난염형 RCCs 이 서로 다른 지질 프로파일을 나타낸다는 것을 입증하였다. 따라서, 장래에 조직학에 따라 다르게 나타나는 12 개의 지질들을 입증하는 추가적인 연구가 보장된다.

본 발명의 또다른 특징적인 결론은, RCC 샘플에서 C24-OH 설파티드 (m/z 906.7) 및 C22-OH 설파티드 (m/z 878.6) 가 낮게 나타난다는 것이다. 설파티드는 뇌, 신장, 비장 및 위장기관에서 발견되는 산성 당지질이다. RCC 가 유래된 신세뇨관 상피세포에서, 설파티드는 만성 대사성 산성 혈액증에 대해 신장 적응의 생리학적 역할을 한다. 전술한 연구에서, Pax8Cre 활성 내 술파티드 합성의 신장 근위 및 원위 세뇨관 상피-특이적 탈착 (knockout) 은, 이온 전달 과정의 기능 장애를 나타낸다. 신세뇨관 상피세포는, 발암 과정 중 탈분화하는 동안, 계속해서 C24-OH 및 C22-OH 를 잃게 되고, RCC 세포 및 원래 세포 간의 술파티드 양의 현저한 차이를 야기한다는 것이 상정된다. 상기 상정은 C24-OH 설파티드 (m/z 906.7) 가 잘 분화된 RCC 에서 비교적 풍부했던 본 연구에 의해 뒷받침 된다. 낮은 C24-OH 설파티드 (m/z 906.7) 에 의해 잘 나타나는 본 발명의 RCC-특이적 지질 프로파일 은 정상 조직으로부터 RCC 를 감별하기 위해 나타낸다. 이러한 흥미로운 가능성은 많은 양의 비암성 병변 (noncancerous lesions) 의 생체 검사 샘플에 대한 장래의 연구에 의해 입증될 필요가 있다.

결론적으로, C24-OH 및 C22-OH 설파티드는 정상 조직으로부터 RCC 를 감별해낼 수 있다. 또한, 본 연구는 투명세포형, 유두형 및 난염형 RCC 들이 서로 상이한 지질 프로파일을 나타낸다는 것을 가장 처음 밝혀낸 것이다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

C24-OH 설파티드(sulfatide), C22-OH 설파티드, PC(포스파티딜콜린){34:1} 및 PC{36:2} 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 신장암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제 1 항에 있어서,
C24-OH 설파티드(sulfatide), C22-OH 설파티드 및 PC{34:1} 는 정상 대조군에 비하여 신장암 환자 샘플에서 낮게 발현되며, PC{36:2}는 정상 대조군에 비하여 신장암 환자 샘플에서 높게 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
MALDI 질량분석(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry)을 이용하여 지질의 발현을 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 MALDI 질량분석은 n906.7, n878.6, p760.6 및 p824.6 (여기서, n은 음이온 모드이며, p는 양이온 모드임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 m/z 값에 대한 지질의 프로파일 분석을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
화합물 공변 예측기(compound covariate predictor), 사선 선형 판별 분석(diagonal linear discriminant analysis), 1-니어리스트 네이버(1-nearest neighbors), 3-니어리스트 네이버(3-nearest neighbors), 니어리스트 센트로이드(nearest centroid) 및 서포트 벡터 머신(support vector machine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용하여 분석을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.