KR101567670B1 - 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법 및 미생물 살균효과 예측 방법 - Google Patents

카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법 및 미생물 살균효과 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법에 있어서, (i) 시료로부터 목표 미생물의 초기 농도(N0)를 측정하는 단계; (ii) 상기 목표 미생물의 초기 농도(N0) 및 사멸시키고자 하는 특정 미생물 농도(Ns)를 하기 식 1에 적용하여, x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)을 결정하는 단계; 및
식 1)
Figure 112014009810300-pat00012

(상기 식 1에서, Y = 미생물의 상용로그 감소 비율(Ns/N0)을 나타낸다.)
(iii) 상기 (ii) 단계에서 결정된 x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)에 따라, 시료에 카프릴산 및 구연산을 조합처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법에 관한 것이다.

Description

카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법 및 미생물 살균효과 예측 방법{a method for the bacterial inactivation By combined treatment of caprylic acid and citric acid, and predictive model method}
본 발명은 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법 및 미생물 살균효과 예측 방법에 관한 것이다.
대장균은 온혈동물의 장내에 널리분포하는 장내세균과에 속하는 균종으로 대부분의 대장균(E. coli)는 해가 없으나, 그 중 일부 균주는 가축 및 인간에게 치명적인 질병을 일으킬 수 있다. 병원성을 유발하는 인자를 내포하는 대장균을 병원성대장균이라고 부른다. 대장균의 지속적인 연구로 인체 감염 및 장관계 질병을 유발하는 다양한 종류의 병원성 대장균이 보고되었으며, 일반적으로 장병원성, 장출혈성, 장독소형, 장관흡착성, 장침입성, 분산부착성의 6가지로 분류하고 있는데, 그 중 장출혈성대장균(E. coli O157:H7)은 시가독소, 베로독소를 생성하며 복통, 수양성 또는 심한 혈액성 설사, 용혈성 요독 증후군을 일으키는 대표적인 고위해 식중독세균이다. 특히 매우 미량의 균수(10-100 cells)로도 질병을 일으킬 수 있어 식품산업에서는 더욱 주의가 필요하다. 장출혈성대장균은 전세계적으로 집단 식중독 발병을 일으켰으며, 그 예로 1996년 일본에서는 장출혈성대장균이 오염된 무순새싹을 섭취하고 9,451명이 질병을 일으켜 1,808명이 입원하고 12명이 사망에 이른 사건이 있다.
식품의 안전 및 품질관리는 기업 이미지 및 매출과 밀접한 관련이 있기 때문에 다양한 식품 기업에서는 관련 기술 개발에 많은 투자가 이루어지고 있으나, 신기술 개발 및 적용에 따른 경제적 부담이 커 식품기업에서 쉽게 적용할 수 있는 저비용 고효율 공정 개발이 필요하다. 식품 산업에서는 미생물학적 안전성 확보를 위해 다양한 물리·화학적 처리를 수행하며, 이러한 처리에 의해 식품의 영양소 및 이화학적 특성이 변화될 수 있는 한편 소비자들은 식품의 본래 형태를 유지하고 있는 신선한 제품을 선호하고 있다. 따라서 식품의 변화를 최소화 할 수 있는 기술의 개발이나 종전에 사용되고 있는 처리의 강도를 낮추면서 미생물을 효율적으로 사멸할 수 있는 신기술이 요구되고 있다. 따라서 식품에 처리 가능한 물질을 조합처리하여 단독처리보다 우수한 시너지 효과를 획득한다면 경제적 절감을 기대할 수 있다.
한편, 대한민국 공개출원 제 2012-0106135호 (천연 항미생물제를 이용한 조제분유 제조방법)에 분유 내 존재하는 위해미생물을 사멸시키기 위해 카프릴산과 바닐린이나 구연산 등을 조합처리 했을 시 단독처리에 비해 큰 시너지효과가 나타났다. 특히, 카프릴산은 식품 첨가물 공전에 등록되어 있는 천연 첨가물 제제이며, 구연산은 산업에서 널리 사용되는 제제로 식품 첨가물에 등록되어 있다(표 1). 따라서 식품에 첨가할 시에는 최근 소비자의 화학적 제제 첨가물에 대한 우려를 감소시킬 수 있다. 또한 보건, 의료 분야에서 다양한 제제로 사용될 수 있다는 장점이 있다.
식품첨가물명 첨가물공전 등재번호 식품첨가물공전 정의 및 화학 구조식
카프릴산 첨가물공전
192번		 이 품목은 지방에서 얻어지는 포화지방산으로서 그 주성분은 카프릴산(C8H16O2)이다.
Figure 112014009810300-pat00001
구연산 첨가물공전
16번
Figure 112014009810300-pat00002
하지만 기존의 특허에서의 실험은, 변수를 고정하여 몇 가지 수준에 따라 수행되는 전통적인 방식의 실험으로 주요요인 및 수준에 대한 정량적 해석이 불가능하다는 단점이 있다. 또한 조합처리시에는 카프릴산의 농도, 구연산의 농도, 처리온도, 처리시간 등 다양한 요인이 위해미생물 살균효과에 영향을 미치기 때문에 실험을 수행하지 않고서는 각 요인에 따른 살균효과를 예측할 수 없으며, 요인간 영향을 알 수 없기 때문에 최적 조건을 도출할 수 없다. 예를 들어, 조제 분유 살균을 위한 40-45℃의 살균 조건에서의 크로노박터 사카자키와 살모넬라 타이피무리움 사멸을 위한 기존 특허의 방법을, 다양한 식품에서의 대장균 사멸을 위해 바로 적용할 수 없는 문제가 있다.
따라서, 다양한 살균 대상 식품에 대한 산업현장에서의 신속한 도입을 위해서는 정량적 살균효과를 예상할 수 있는 예측모델식의 개발 및 효율성 극대화를 위한 최적 조건 도출이 필요하다. 본 특허에서는 천연유래 항균물질인 카프릴산과 구연산 조합처리 방법의 예측모델식을 개발하고 미생물 저감화를 위한 최적조건을 제시함으로써 효율적인 살균방법을 제시하고자 하였다.
대한민국 공개출원 제 2012-0106135호
상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 카프릴산과 구연산을 조합하여 처리했을 때 위해미생물 살균효과를 예측할 수 있는 수학적 모델식을 개발하여 간편하고 신속하게 살균효과를 예측할 수 있는 기술을 제공하고, 최소비용으로 최대의 효과를 도출할 수 있는 최적조건을 제시함으로써 기존 사용되던 조건보다 낮은 범위에서 우수한 살균력을 나타내는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법에 있어서, (i) 시료로부터 목표 미생물의 초기 농도(N0)를 측정하는 단계; (ii) 상기 목표 미생물의 초기 농도(N0)를 및 사멸시키고자 하는 특정 미생물 농도(Ns)를 하기 식 1에 적용하여, x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)을 결정하는 단계; 및
식 1)
Figure 112014009810300-pat00003
(상기 식 1에서, Y = 미생물의 상용로그 감소 비율(Ns/N0)을 나타낸다.)
(iii) 상기 (ii) 단계에서 결정된 x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)에 따라, 시료에 카프릴산 및 구연산을 조합처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예에 의하면, 상기 목표 미생물은 식중독 미생물일 수 있다.
본 발명의 다른 예에 의하면, 상기 목표 미생물은 장출혈성대장균(E. coli O157:H7)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에 의하면, x1(카프릴산 농도)는 0.1 내지 5.0 mM, x2(구연산 농도)는 0.1 내지 3.0 mM, x3(처리온도)는 35 내지 40℃ 및 x4(처리시간)는 1 내지 7분일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 식 1에 x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)을 적용하여 미생물의 상용로그 감소 비율(Y)를 예측하는 단계를 포함하는, 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의한 미생물을 사멸효과 예측 방법을 제공한다:
식 1)
Figure 112014009810300-pat00004
상기 식 1에서, Y = 미생물의 상용로그 감소 비율(Ns/N0)을 나타낸다.
본 발명의 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법을 사용하면, 수학적 모델식을 이용하여 간편하고 신속하게 위해미생물 살균효과를 예측할 수 있으며, 최소비용으로 최대의 효과를 도출할 수 있는 최적조건을 제시함으로써 기존 사용되던 조건보다 낮은 범위에서 우수한 살균력을 확보할 수 있는 장점이 있다.
도 1a 내지 도 1f는 각 요인의 E. coli O157:H7 살균효과에 미치는 영향을 보여주는 3차원 반응표면 그래프이다. 도 1a 내지 도 1f에서 x, y 및 z 축은 각각 다음을 나타낸다:
(도 1a) x축: 카프릴산 농도, y축: 구연산 농도, z축: 살균효과, (도 1b) x축: 카프릴산 농도, y축: 처리온도, z축: 살균효과, (도 1c) x축: 카프릴산 농도, y축: 처리시간, z축: 살균효과, (도 1d) x축: 구연산 농도, y축: 처리온도 z축: 살균효과, (도 1e) x축: 구연산 농도, y축: 처리시간, z축: 살균효과, (도 1f) x축: 처리온도, y축: 처리시간, z축: 살균효과
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법에 대한 것으로, 카프릴산 농도, 구연산 농도, 처리온도 및 처리시간에 따라 미생물 사멸 효과를 극대화 시키는 수학적 모델인 하기 식 1을 도출하여 본 발명을 완성하였다.
식 1)
Figure 112014009810300-pat00005
(상기 식 1에서, Y = 미생물의 상용로그 감소 비율(Ns/N0)을 나타낸다.)
본 발명의 식 1)에, 살균 대상 시료에 존재하는 살균 대상이 되는 목표 미생물의 초기 농도(N0), 사멸시키고자 하는 특정 미생물 농도(Ns), x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)에서 선택되는 변수를 입력하여, 시료를 살균하기 위한 최적의 조건을 도출할 수 있다.
예를 들어, 식 1)에 살균 대상 시료에 존재하는 살균 대상이 되는 목표 미생물의 초기 농도(N0), 사멸시키고자 하는 특정 미생물 농도(Ns), x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도) 및 x3(처리온도)를 대입하면, 시료를 살균하기 위한 최적의 x4(처리시간)을 도출할 수 있다. 또한, 식 1)에 살균 대상 시료에 존재하는 살균 대상이 되는 목표 미생물의 초기 농도(N0), 사멸시키고자 하는 특정 미생물 농도(Ns), x2(구연산 농도) 및 x3(처리온도)를 대입하면, 시료를 살균하기 위한 최적의 x1(카프릴산 농도) 및 x4(처리시간)의 관계를 도출할 수 있다.
특히, x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)의 요인 중 카프릴산의 농도와 온도가 미생물 살균효과에 가장 큰 영향을 미침을 실험적으로 확인하였으며, 실제 산업에서 조합처리 기술을 적용할 때에는 구연산 농도와 처리시간을 조절하는 것 보다 카프릴산 농도와 온도를 조절하는 것이 유효하다.
또한, 본 발명의 식 1)에, x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)에서 선택되는 변수를 입력하여, 간편하고 신속하게 살균효과를 예측할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법은, 다음 (i) 내지 (iii)의 단계를 포함할 수 있다:
(i) 시료로부터 목표 미생물의 초기 농도(N0)를 측정하는 단계;
(ii) 상기 목표 미생물의 초기 농도(N0) 및 사멸시키고자 하는 특정 미생물 농도(Ns)를 하기 식 1에 적용하여, x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)을 결정하는 단계; 및
식 1)
Figure 112014009810300-pat00006
(상기 식 1에서, Y = 미생물의 상용로그 감소 비율(Ns/N0)을 나타낸다.)
(iii) 상기 (ii) 단계에서 결정된 x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)에 따라, 시료에 카프릴산 및 구연산을 조합처리하는 단계.
본 발명에서 살균 대상이 되는 목표 미생물은 식중독 미생물일 수 있으며, 장출혈성대장균(E. coli O157:H7)인 것이 바람직하다.
본 발명을 이용하여, 장출혈성대장균(E. coli O157:H7)을 사멸하는 경우, x1(카프릴산 농도)는 0.1 내지 5.0 mM이고 x3(처리온도)는 35 내지 40℃인 것이 바람직하며, x1(카프릴산 농도)는 0.1 내지 5.0 mM, x2(구연산 농도)는 0.1 내지 3.0 mM, x3(처리온도)는 35 내지 40℃ 및 x4(처리시간)는 1 내지 7분인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 하기 식 1에 x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)을 적용하여 미생물의 상용로그 감소 비율(Y)를 예측하는 단계를 포함하는, 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의한 미생물을 사멸효과 예측 방법에 대한 것이다:
식 1)
Figure 112014009810300-pat00007
상기 식 1에서, Y = 미생물의 상용로그 감소 비율(Ns/N0)을 나타낸다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위하여 실시예를 첨부한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 보다 용이하게 하기 위하여 제공되는 것으로, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1. 장출혈성대장균 살균효과 관찰 방법
(1) 사용균주 및 배양
장출혈성대장균(E. coli O157:H7) ATCC 35150, 43889, 43890을 실험에 사용하였다. 각 균주의 활성을 최대로 하고자 최적 증균배지인 EC broth에 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 세 균주의 배양액을 동량으로 cocktail 한 후 원심분리기(Centri-CL2, IEC, Needham Heights, MA, USA)를 이용하여 3,000 g, 15분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후 0.85% 멸균 생리식염수로 2회 수세하였다.
(2) 카프릴산, 구연산 저장용액 준비
카프릴산(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 99% 에탄올에 용해하여 25, 50, 75, 100, 125 mM의 저장용액을 제조하였다. 구연산(Sigma Chemical Co.)은 멸균 증류수에 용해하여 25, 50, 75, 100, 125 mM의 저장용액을 제조하였다.
(3) 카프릴산 및 구연산 단독처리 방법
멸균튜브에 9.8 ml의 saline과 카프릴산 저장용액 0.1 ml 또는 구연산 저장용액 0.1 ml을 첨가한 후(총량 = 9.9 ml) 진탕항온수조(shaking water bath)에 넣어 처리 온도로 30분간 예열하였다. 예열이 완료된 후 균액 0.1 ml을 처리액 9.9 ml에 분주하여 100 rpm으로 설정한 시간동안 처리하였다(총량 10 ml로 저장용액의 농도가 100배 희석됨. 즉, working concentration은 저장용액의 농도의 1/100).
(4) 카프릴산 및 구연산 조합처리 방법
멸균튜브에 9.7 ml의 saline과 카프릴산 저장용액 0.1 ml과 구연산 저장용액 0.1 ml을 첨가한 후(총량 = 9.9 ml) 진탕항온수조(shaking water bath)에 넣어 처리 온도로 30분간 예열하였다. 예열이 완료된 후 균액 0.1 ml을 처리액 9.9 ml에 분주하여 설정한 시간 동안 처리하였다.
(5) 살균효과 확인
시료는 처리 직후 0.85% 멸균 생리식염수에 10진희석하여 각 단계 희석액을 tryptic soy agar(TSA)에 0.1 ml 분주하여 도말하였다. 이때 검출한계를 낮추기 위해 원액 0.2 ml을 5장의 TSA에 분주하였다(검출한계: 1 CFU/ml). 도말한 TSA는 37℃배양기에서 24시간 배양하였다. 균수는 TSA에 생성된 집락수를 계수하여 산출하였다. 배양 후 생성된 집락을 계수하고 희석배수와 단위환산 배수를 곱하여 균수를 측정하고 상용로그를 취하였다. 한천 평판 배양법을 통하여 도출된 값은 회기분석시 y값으로 사용하였다. 처리 전/후의 E. coli O157: H7의 균수 차이를 살균효과(log reduction)로 나타내었다.
실시예 2. 실험설계
본 발명에서는 예측모델식 개발 및 최적 처리 조건을 도출하기 위해 반응표면분석법을 이용하여 중심합성계획법으로 설계하였다. 중심합성계획법을 사용하면 2차 모델의 제곱 항들의 효율적인 추정이 가능하고, 직교 블록화(orthogonal blocking) 및 회전성(rotatiability) 구현이 용이하다. 중심합성계획은 중심점(central point), 요인배치 실험점(factorial points), 꼭지점(axial point)으로 이루어진다. 독립변수는 카프릴산의 농도(x1), 구연산의 농도(x2), 처리 온도(x3), 처리시간(x4)의 4개 요인으로 하였으며, 종속변수(Y)는 장출혈성대장균에 대한 살균효과로 하였다. 다수의 예비실험을 통해 각 요인에 대한 최소 및 최대의 범위를 각각 카프릴산의 농도는 0.25-1.25 mM, 구연산의 농도는 0.25-1.25 mM, 처리 온도 25-45℃, 처리시간 1-9분으로 결정하였으며, -2, -1, 0, 1, 2의 5단계로 부호화하여 표 2와 같이 구간을 설정하였다. 하기 표 2는 중심합성계획을 위한 조합처리의 독립변수와 구간을 나타낸다.
요인 부호 구간
-2 -1 0 +1 +2
카프릴산의 농도 (mM) x1 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25
구연산의 농도 (mM) x2 0.25 0.5 0.75 1.0 1.25
처리온도 (℃) x3 25 30 35 40 45
처리시간 (min) x4 1 3 5 7 9
6개의 중심점을 포함하여 중심합성설계에서 4개의 독립변수로 선택할 경우 실험해야하는 수인 30개의 조건(실험점 16개, 꼭지점 8개, 중심점 반복원리에 따른 6개)에 대해서 3반복 실험을 수행하여 평균값을 반응표면회귀분석에 사용하였다. 하기 표 3은 조합처리의 반응표면분석 조건을 나타낸다.
처리구 조건
카프릴산 농도 (mM) 구연산 농도
(mM)		 처리온도
(℃)		 처리시간
(min)
실험점 (Factorial points)
1 0.5 0.5 30 3
2 1.0 0.5 30 3
3 0.5 1.0 30 3
4 1.0 1.0 30 3
5 0.5 0.5 40 3
6 1.0 0.5 40 3
7 0.5 1.0 40 3
8 1.0 1.0 40 3
9 0.5 0.5 30 7
10 1.0 0.5 30 7
11 0.5 1.0 30 7
12 1.0 1.0 30 7
13 0.5 0.5 40 7
14 1.0 0.5 40 7
15 0.5 1.0 40 7
16 1.0 1.0 40 7
꼭지점 (Axial points)
17 0.25 0.75 35 5
18 1.25 0.75 35 5
19 0.75 0.25 35 5
20 0.75 1.25 35 5
21 0.75 0.75 25 5
22 0.75 0.75 45 5
23 0.75 0.75 35 1
24 0.75 0.75 35 9
중심점 (Central points)
25 0.75 0.75 35 5
26 0.75 0.75 35 5
27 0.75 0.75 35 5
28 0.75 0.75 35 5
29 0.75 0.75 35 5
30 0.75 0.75 35 5
실시예 3. 카프릴산 및 구연산의 단독처리의 장출혈성대장균 살균효과 관찰
조합처리의 살균효과를 도출하기에 앞서 살균효과의 면밀한 비교를 위해 각 요인의 +1 수준에서 카프릴산 단독, 구연산 단독, 열 단독처리의 살균효과를 관찰하였다(표 4). 각각의 단독처리에서는 처리 후 균수가 처리 전의 균수와 유의적인 차이가 나타나지 않아 살균효과가 전혀 없었다. 이는 본 실험의 조합처리에서 사용된 조건이 매우 미약한 조건임을 의미한다. 하기 표 4는 E. coli O157:H7에 대한 카프릴산, 구연산, 열처리의 살균효과(+1 range) (초기 E. coli O157:H7 균수: 7.45 ± 0.10 log CFU/ml)를 나타낸다.
단독처리 살균효과
(Log reduction, log CFU/ml)
카프릴산 1.0 mM (25℃, 9분) 0.14 ± 0.14
구연산 1.0 mM (25℃, 9분) 0.18 ± 0.12
40℃, 9분 열처리 0.11 ± 0.06
실시예 4. 조합처리의 반응표면분석 조건에서의 살균효과 및 예측모델식
단독처리와 달리 조합처리에서는 각 요인 수준에 따라 다양한 살균효과가 나타났다(표 5). 예를 들면, 단독처리에서는 살균효과가 전혀 나타나지 않았던 카프릴산 1.0 mM, 구연산 1.0 mM, 40℃, 3분 처리를 조합한 경우, 모든 미생물이 사멸하여 7.46 log reduction의 매우 큰 살균효과가 관찰되었다(8번 처리구). 이 외에도 다양한 처리구에서 유의적인 살균효과를 관찰할 수 있었다. 하기 표 5는 조합처리의 반응표면분석 조건에서의 미생물 살균효과 실측치 및 예측치를 나타낸다.
처리구 조건 미생물 살균효과
(log reduction, log CFU/ml)
카프릴산
농도(mM)		 구연산
농도(mM)		 처리온도
(℃)		 처리시간
(min)		 실측치 예측치
실험점 (Factorial points)
1 0.5 0.5 30 3 0.08 ± 0.05 -0.55
2 1.0 0.5 30 3 0.20 ± 0.03 0.10
3 0.5 1.0 30 3 0.18 ± 0.04 -0.18
4 1.0 1.0 30 3 0.42 ± 0.25 1.11
5 0.5 0.5 40 3 0.36 ± 0.06 1.13
6 1.0 0.5 40 3 6.96 ± 0.49 6.43
7 0.5 1.0 40 3 0.50 ± 0.10 1.09
8 1.0 1.0 40 3 7.46 ± 0.06 (ND) 7.02
9 0.5 0.5 30 7 0.27 ± 0.21 0.42
10 1.0 0.5 30 7 2.08 ± 0.50 2.16
11 0.5 1.0 30 7 0.24 ± 0.05 1.43
12 1.0 1.0 30 7 4.87 ± 0.08 3.80
13 0.5 0.5 40 7 1.15 ± 0.26 1.13
14 1.0 0.5 40 7 7.46 ± 0.06 (ND) 7.52
15 0.5 1.0 40 7 1.94 ± 0.17 1.73
16 1.0 1.0 40 7 7.46 ± 0.06 (ND) 8.75
꼭지점 (Axial points)
17 0.25 0.75 35 5 0.46 ± 0.06 -0.10
18 1.25 0.75 35 5 7.36 ± 0.17 7.57
19 0.75 0.25 35 5 0.53 ± 0.21 0.82
20 0.75 1.25 35 5 3.07 ± 0.81 2.42
21 0.75 0.75 25 5 0.10 ± 0.02 0.29
22 0.75 0.75 45 5 7.46 ± 0.06 (ND) 6.91
23 0.75 0.75 35 1 0.27 ± 0.05 0.46
24 0.75 0.75 35 9 3.70 ± 0.52 3.16
중심점 (Central points)
25 0.75 0.75 35 5 1.37 ± 0.71 1.15
26 0.75 0.75 35 5 1.38 ± 0.30 1.15
27 0.75 0.75 35 5 1.08 ± 0.49 1.15
28 0.75 0.75 35 5 1.20 ± 0.21 1.15
29 0.75 0.75 35 5 0.93 ± 0.03 1.15
30 0.75 0.75 35 5 0.91 ± 0.12 1.15
표 5의 살균효과 결과를 기반으로 종속변수와 독립변수와의 관계를 반응표면회귀분석을 통해 다항 회귀식으로 도출하였으며, 1차 선형효과와 2차 곡선효과, 인자간의 교호작용등을 살펴보았다. 예측모델식 도출을 위한 회귀분석은 statistical analysis system program(SAS, Version 8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하였다 수행하였다. 회귀식은 아래와 같다.
Figure 112014009810300-pat00008

Y = 미생물 살균효과; x1, x2, x3, x4 = 요인; k0 = 상수; k1, k2, k3, k4 = linear coefficients; k5, k6, k7, k8 = quadratic coefficients; k9, k10, k11, k12, k13, k14 = cross-product coefficients을 의미한다. 회귀분석을 통해 아래와 같은 4요인에 대한 2차 다항식의 예측모델식을 도출하였다. 각 변수들을 코드화시켜 산출한 예측모델식은 다음과 같다.
Figure 112014009810300-pat00009
Y = 미생물 살균효과; x1, x2, x3, x4 는 각각 카프릴산 농도, 구연산 농도, 처리온도, 처리시간을 나타낸다. 요인모델에 대한 유의확률이 p < 0.001로서 1% 이하의 높은 유의성을 나타냈으며(표 6), 관측점들의 변동을 예측모델식이 얼마나 잘 설명해주는가를 나타내는 회귀식의 결정계수 R 2값은 0.954로 변이의 95%를 설명 가능한 매우 높은 신뢰도를 보였다(결정계수의 값이 1에 가까울수록 회기식의 적합도가 높은 것을 나타낸다). 특히 본 모델의 독립변수가 4개임을 감안했을 때 매우 높은 신뢰수준이었다. 본 특허와 같은 수의 독립변수(4요인), 같은 방법(중심합성계획법, 반응표면분석법)으로 예측모델식을 도출한 선행연구와 비교했을 때, Gao 등(Use of response surface methodology to investigate the effect of food constituents on Staphylococcus arueus inactivation by high pressure and mild heat, 2006, Process Biochemistry, 41: 362-369)의 연구에서는 예측모델식의 결정계수의 값이 0.720으로 나타났고, Tanyildizi 등(Optimization of a-amylase production by Bacillus sp. using response surface methodology, 2005, Process Biochemistry, 40: 2291~2296)의 연구에서는 0.63으로 낮게 나타났다. 또한 전체 모델의 적합성 외에 회귀분석(종속변수와 독립변수의 관계) 및 분산분석(각 처리 결과와 변동성 관계)을 통해 전체 모델에 어떻게 영향을 주는지를 파악하기 위하여 분산분석을 수행한 결과 선형항, 이차항, 교차항 모두 p < 0.001로 매우 높은 유의성을 나타냈다. 회귀분석 결과는 표 6에 나타내었다.
Regression 자유도 제곱합 R-Square F-value P-value
Linear 4 506.1240 0.7572 309.78 < 0.0001
Quadratic 4 57.5066 0.0860 35.20 < 0.0001
Cross-product 6 74.1366 0.1109 30.25 < 0.0001
Overall model 14 637.767 0.9542 111.53 < 0.0001
예측모델식의 각 항의 계수와 t-value, p-value를 기반으로 한 각 계수의 유의성은 표 7에 나타내었다. x1, x3, x1 2, x2 4, x1x3, x1x4, x2x4, x3x4 항이 p < 0.05 수준에서 유의한 것으로 나타났다. 하기 표 7은 E. coli O157:H7 살균효과에 대한 예측모델식 계수와 유의성 검정 결과를 나타낸다.
Model term Parameter estimate Standard error Computed
t-value		 P-value
Intercept (k 0 ) 41.6240 5.1226 8.13 <0.0001
x 1 (k 1 ) -45.0318 3.4202 -13.17 <0.0001
x 2 (k 2 ) -1.8626 3.4202 -0.54 0.5876
x 3 (k 3 ) -1.9034 0.2177 -8.74 <0.0001
x 4 (k 4 ) 0.1229 0.4183 0.29 0.7698
x 1 2 (k 5 ) 10.3606 1.1273 9.19 <0.0001
x 2 2 (k 6 ) 1.9006 1.1273 1.71 0.0906
x 3 2 (k 7 ) 0.0246 0.0028 1.69 0.0960
x 4 2 (k 8 ) 0.0414 0.0176 12.6 <0.0001
x 1 x 2 (k 9 ) 2.5300 1.4760 -1.12 0.2672
x 1 x 3 (k 10 ) 0.9298 0.0738 8.72 <0.0001
x 1 x 4 (k 11 ) 0.5438 0.1845 2.95 0.0043
x 2 x 3 (k 12 ) -0.0825 0.0738 1.73 0.0873
x 2 x 4 (k 13 ) 0.3196 0.1845 -2.62 0.0106
x 3 x 4 (k 14 ) -0.0242 0.0092 2.35 0.0215
독립변수에 대한 종속변수의 반응 표면상태를 도 1a 내지 도 1f에 3차원 그래프로 나타내었다. 각각의 그래프는 두 변수에 대한 반응을 나타낸 것으로, 나타낸 변수 외의 다른 두 변수는 0 구간으로 고정하였다(카프릴산 농도 0.75 mM, 구연산 농도 0.75 mM, 처리온도 35℃, 처리시간 5분). 4개의 요인 중 카프릴산의 농도와 온도가 미생물 살균효과에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 나타났다. 카프릴산 농도의 증가, 온도의 증가가 다른 변수의 증가보다 더 크게 살균효과를 증가시켰다. 따라서 실제 산업에서 조합처리 기술을 적용할 때에는 구연산 농도와 처리시간을 조절하는 것 보다 카프릴산 농도와 온도를 조절하는 것이 유효할 것으로 생각된다.
실시예 5. 최적조건 도출
회귀분석 결과 최대점이 안장점으로 나타나 ridge 분석을 통해 최적조건을 도출하였다. 장출혈성대장균 살균효과의 최적조건은 카프릴산 농도 1.0 mM, 구연산 농도 0.8 mM, 처리온도 39.6℃, 처리시간 5.4분으로 나타났으며, 이 조건을 예측모델식에 도입한 결과 예측 살균효과는 7.16 log로 나타났다. 도출된 최적조건은 향후 조합처리 기술을 적용 할 때 비용을 절감할 수 있는 유용한 정보를 제공할 것으로 생각된다.
실시예 6. 예측모델식의 검증( validation )
도출된 예측모델식을 검증하기 위해 무작위로 선정된 10개의 조건으로 3반복 실험을 수행하여 살균효과의 실측치와 모델식을 통해 도출된 예측치간의 상관관계를 분석하였다. 무작위로 선정된 조건 및 미생물 살균효과 실측치, 예측치는 표 8에 나타내었다. 표 8은 예측모델식 검증을 위한 무작위 조건에서의 E. coli O157:H7 살균효과의 실측치 및 예측치를 나타낸다.
처리구 조건 미생물 살균효과
(log reduction, log CFU/ml)
카프릴산 농도(mM) 구연산
농도(mM)		 처리온도
(℃)		 처리시간
(min)		 실측치 예측치
1 0.5 0.75 37 3 0.41 ± 0.31 0.03
2 1 0.75 33 2 0.43 ± 0.34 1.49
3 0.75 1 37 3 1.13 ± 0.17 1.81
4 1 0.8 34 3 2.21 ± 0.22 2.43
5 1 0.75 33 6 2.53 ± 0.54 3.25
6 0.75 1 35 7 2.99 ± 0.75 2.66
7 1 0.5 35 5 3.67 ± 0.51 3.27
8 1 0.5 39 3 5.82 ± 0.52 5.57
9 1 0.6 39 3 5.93 ± 0.33 5.62
10 1 1 39 6 7.39 ± 0.14 7.45
실측치와 예측치는 매우 높은 유의성을 보였으며, 상관계수 R 2값이 0.946으로 높게 나타났다. 따라서 본 특허에서 도출된 예측모델식을 이용한다면 굳이 실험을 통하지 않더라도 각 변수를 예측모델식에 대입하여 다양한 조건에서의 살균효과를 산출할 수 있다. 예측 방법이 간편하여 전문가가 필요하지 않고, 신속한 적용을 필요로 하는 산업현장에서 용이하게 사용될 수 있을 것이라고 판단된다. 또한 본 특허에서는 조합처리 공정의 핵심인자를 규명함으로써 에너지, 비용, 시간 등 손실을 줄이고 공정의 효율을 극대화 하는데 유용할 것으로 판단된다.

Claims (5)

  1. 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법에 있어서,
    (i) 시료로부터 목표 미생물의 초기 농도(N0)를 측정하는 단계;
    (ii) 상기 목표 미생물의 초기 농도(N0) 및 사멸시키고자 하는 특정 미생물 농도(Ns)를 하기 식 1에 적용하여, x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)을 결정하는 단계; 및
    식 1)
    Figure 112015078481109-pat00010

    (상기 식 1에서, Y = 미생물의 상용로그 감소 비율(Ns/N0)을 나타낸다.)
    (iii) 상기 (ii) 단계에서 결정된 x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)에 따라, 시료에 카프릴산 및 구연산을 조합처리하는 단계를 포함하며,
    상기 목표 미생물은 장출혈성대장균(E. coli O157:H7)인 것을 특징으로 하는, 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, x1(카프릴산 농도)는 0.1 내지 5.0 mM, x2(구연산 농도)는 0.1 내지 3.0 mM, x3(처리온도)는 35 내지 40℃ 및 x4(처리시간)는 1 내지 7분인 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의한 미생물 사멸 방법으로,
    미생물의 사멸 효과(Y)가, 하기 식 1에 x1(카프릴산 농도), x2(구연산 농도), x3(처리온도) 및 x4(처리시간)을 적용하여 산출되며,
    상기 목표 미생물은 장출혈성대장균(E. coli O157:H7)인 것을 특징으로 하는, 방법:
    식 1)
    Figure 112015078481109-pat00011

    상기 식 1에서, Y = 미생물의 상용로그 감소 비율(Ns/N0)을 나타낸다.
KR1020140011355A 2014-01-29 2014-01-29 카프릴산 및 구연산의 조합처리에 의해 미생물을 사멸시키는 방법 및 미생물 살균효과 예측 방법 KR101567670B1 (ko)

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