KR101566107B1 - Three-dimensional structure of TLR6 TIR domain and method of screening drug using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TLR6 TIR 도메인의 3차원 결정 구조 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것으로, 상기 TLR6 TIR 도메인의 3차원 결정 구조를 이용하여 상기 TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 기반으로 하는 약물을 스크리닝 하는 데에 정보를 제공할 수 있으며, 또한 TLR6 TIR 도메인 단백질 조절제를 스크리닝 할 수 있다.The present invention relates to a three-dimensional crystal structure of a TLR6 TIR domain and a drug screening method using the TLR6 TIR domain. In order to screen drugs based on the tertiary structure of the TLR6 TIR domain using the three-dimensional crystal structure of the TLR6 TIR domain And can also screen for TLR6 TIR domain protein modulators.

Description

TLR6 TIR 도메인의 ３차 구조 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법{Three-dimensional structure of TLR6 TIR domain and method of screening drug using the same}[0001] The present invention relates to a tertiary structure of a TLR6 TIR domain and a drug screening method using the tertiary structure of the TLR6 TIR domain,

본 발명은 TLR6 TIR 도메인의 3차 구조 및 이를 이용한 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a tertiary structure of a TLR6 TIR domain and a drug screening method using the same.

선천성 면역은 병원균 침입에 대한 숙주의 최초 방어로서, 병원균-연관 분자 패턴(PAMP)으로 알려진 병원균의 특이한 패턴을 인식하여 개시된다. PAMP는 세포막과 사이토졸에 위치한 병원균 인식 수용체(PRR)로 불리는 숙주세포의 특이한 수용체에 의해 검출될 수 있다. 톨유사수용체(TLR)는 주요한 PRRs 중 하나로서, 노랑초파리에 존재하는 톨수용체는 곰팡이 감염에 대해 작용하는 선천성 면역 관련 수용체로서 가장 먼저 알려졌으며, 그후 여러 포유동물의 톨 동족체가 확인되어 톨유사수용체(TLR)로 명명하였다. TLR은 세포외 루신 풍부 반복영역(LRR)을 함유한 단일경로 막전위 단백질로서, LLR은 다운스트림 신호전달에 관여하는 시토졸 톨/인터류킨-1 수용체(TIR) 도메인과 특정 병원균을 인지한다. Congenital immunity is the host's first defense against pathogen infestation and is initiated by recognizing a unique pattern of pathogens known as pathogen-associated molecular patterns (PAMP). PAMP can be detected by a specific receptor in the host cell called the pathogen-recognition receptor (PRR) located in the cell membrane and cytosol. Toll-like receptors (TLRs) are one of the major PRRs. Toll receptors present in yellow flies are the first known congenital immune-related receptors to act against fungal infections, and then tocoproteins of several mammals have been identified, (TLR). TLR is a single-pathway transmembrane protein containing an extracellular leucine rich repeat region (LRR), which recognizes cytosolic / interleukin-1 receptor (TIR) domains and specific pathogens involved in downstream signal transduction.

지금까지 총 10개의 TLR 즉, TLR1 내지 TLR10이 인간에서 확인되었고, 모두 TIR 도메인을 함유하였다. 다양한 TLR이 선천성 면역 초기에 명확한 PAMP를 인식하면, MyD88, MyD88-어댑터 유사(MAL)를 포함한 TIR 도메인 함유 어댑터 단백질, IFNβ (TRIF)를 포함한 TIR 도메인 함유 어댑터 단백질, TRIF 관련 어댑터 분자(TRAM) 및 멸균 α- 및 아르마딜로-모티브-함유 단백질(SARM)을 수용체로 모아 숙주세포 내에서 신호전달이 개시된다. TIR 도메인 함유 어댑터 단백질은 TIR-TIR 상호작용을 통해 TLR과 상호작용한다. TIR-TIR 상호작용을 포함한 상동기관 도메인 간 상호작용은 세포성 신호전달 경로에 중요한 역할을 수행한다. MyD88은 흔한 TIR 어댑터인 반면, 다른 어댑터들은 보다 선택적이다. 일단 신호전달이 일어나면, 각 어댑터는 NF-kB를 활성화하여 선천성 면역과 관련된 다양한 유전자의 발현을 조절한다.To date, a total of 10 TLRs, TLR1 to TLR10, have been identified in humans and all contain the TIR domain. When various TLRs recognize a clear PAMP at the beginning of congenital immunity, the TIR domain containing adapter protein including MyD88, MyD88-adapter-like (MAL), the TIR domain containing adapter protein including IFN beta (TRIF) Sterile a- and armadillo-motif-containing proteins (SARMs) are assembled into receptors to initiate signal transduction in host cells. The TIR domain containing adapter protein interacts with the TLR through a TIR-TIR interaction. Interactions between homologous domains, including TIR-TIR interactions, play an important role in the cellular signaling pathway. MyD88 is a common TIR adapter, while other adapters are more selective. Once signaling occurs, each adapter activates NF-kB to regulate the expression of various genes associated with innate immunity.

TLR1, TLR2, TLR5, TLR10, MyD88 및 MAL의 결정 구조를 포함한 TIR 도메인의 몇 가지 구조적 연구들로부터 TIR 도메인은 4개 또는 5개의 α-헬릭스로 둘러싸인 5가닥 동일방향 β 시트를 포함하는 것으로 알려져 있다. TIR 도메인의 헤테로 이합체 구조는 유용하지 않기 때문에 TIR 도메인 매개 상호작용에 관한 추측들이 논란중에 있다. TLR10 및 TLR4의 결정 구조에 근거하여, TIR은 BB 루프, DD 루프 및 헬릭스 αC를 이용하여 이합체를 형성할 수 있다. 그러나, 데코이 펩타이드 실험과 모델링 연구를 통해 BB 루프와 헬릭스 αE가 신호전달을 위한 복합체 조립을 매개하는 데에 중요하다고 알려져 있다.From several structural studies of the TIR domain including the crystal structure of TLR1, TLR2, TLR5, TLR10, MyD88 and MAL, it is known that the TIR domain contains five stranded β-helix-surrounded five-stranded β- . Since the heterodimer structure of the TIR domain is not useful, conjectures about TIR domain mediated interactions are controversial. Based on the crystal structure of TLR10 and TLR4, TIR can form dimers using BB loops, DD loops and helix aC. However, decoy peptide experiments and modeling studies have shown that the BB loop and helix αE are important for mediating complex assembly for signaling.

그러나, TLR6 TIR 도메인의 3차 구조에 대한 정보가 아직까지 없어 TLR6 TIR 도메인의 구조적 연구는 TLR6 TIR 도메인과 관련된 다양한 신호전달계 등의 기전을 연구하는 데에 필수적인 실정이다.However, since there is no information on the tertiary structure of the TLR6 TIR domain, a structural study of the TLR6 TIR domain is essential for studying various signal transduction systems related to the TLR6 TIR domain.

한국공개특허 제2006-0016817호Korean Patent Publication No. 2006-0016817

본 발명의 목적은 TLR6 TIR 도메인의 3차원적 결정 구조 및 이러한 결정화 방법을 제공함으로써 TLR6 TIR 도메인의 특이적인 3차원 활성 구조를 규명하고, 이를 이용하여 TLR6 TIR 도메인 조절제를 개발하는 방법을 제공하는 데에 있다. It is an object of the present invention to provide a three-dimensional crystal structure of the TLR6 TIR domain and to provide a method for crystallizing the TLR6 TIR domain by identifying the specific three-dimensional active structure of the TLR6 TIR domain and using the three- .

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 단사정계의 공간 그룹(monoclinic space group)이 C2이고, 유니트 셀 차원(unit-cell dimension)이 a=127.60 Å, b=44.20 Å, c=75.72 Å이고, 4개 또는 5개의 α-헬릭스에 둘러싸인 5개 또는 4개 가닥의 동일방향 β-시트로 이루어지며, 비대칭 유니트 내에서 2개의 단량체가 이합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, TLR6 TIR 도메인의 3차구조를 제공한다.In order to accomplish the above object, the present invention provides a DNA polymerase having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the monoclinic space group is C2, the unit cell dimension is a = 127.60 A, b = 44.20 Å, c = 75.72 Å, consisting of five or four stranded β-sheets in the same direction surrounded by four or five α-helixes, in which two monomers in the asymmetric unit form a dimer Lt; RTI ID = 0.0 > TLR6 < / RTI > TIR domain.

또한, 본 발명은 상기 TLR6 TIR 도메인의 결정 구조를 이용하여 TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 기반으로 하는 약물 스크리닝에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for providing information to drug screening based on the tertiary structure of the TLR6 TIR domain using the crystal structure of the TLR6 TIR domain.

또한, 본 발명은 상기 TLR6 TIR 도메인의 결정 구조를 이용하여 TLR6 TIR 도메인 조절제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for screening a TLR6 TIR domain modulator using the crystal structure of the TLR6 TIR domain.

앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 최초 규명한 것으로, 이렇게 규명된 TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 이용하여 상기 TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 기반으로 하는 약물을 스크리닝 하는 데에 정보를 제공할 수 있으며, 또한 TLR6 TIR 도메인 조절제를 스크리닝 할 수 있다.As described above, the present invention firstly identifies the tertiary structure of the TLR6 TIR domain. Using the thus-identified tertiary structure of the TLR6 TIR domain, screening for drugs based on the tertiary structure of the TLR6 TIR domain And can also screen for TLR6 TIR domain modulators.

도 1은 TLR6 TIR 도메인의 결정 구조를 나타낸 것으로, A는 TLR6의 주요 경계면을 나타낸 것이고, B는 단량체성 TLR6 TIR 도메인의 모식도이고, C는 다른 TLR들로부터 유래한 대표적인 TIR 도메인 서열의 정렬을 나타낸 것이다.
도 2는 B인자 분포를 나타낸 것이다.
도 3은 TLR6 TIR 도메인의 화학량론 분석결과를 나타낸 것으로, A는 겔-여과 크로마토그리피 프로파일, B는 MALS 결과, C는 비대칭 유닛에서 검출된 TLR6 TIR 도메인의 이합체 구조, D는 사슬 A 및 사슬 B의 중첩을 나타낸 것이다.
도 4는 TLR6 TIR 도메인의 구조에서 이합체 계면을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 TLR6 TIR 도메인과 다른 TIR 도메인들 간의 중첩을 나타낸 것이다.
도 6은 TLR6에서 TIR-TIR 상호작용을 위해 보존적이며 생리학적으로 중요한 잔기를 맵핑한 것을 나타낸 것이다.Figure 1 shows the crystal structure of the TLR6 TIR domain, where A is the major interface of TLR6, B is the schematic of the monomeric TLR6 TIR domain and C is the alignment of representative TIR domain sequences from other TLRs will be.
Fig. 2 shows the distribution of the B factor.
Figure 3 shows the stoichiometric analysis of the TLR6 TIR domain, where A is the gel-filtration chromatographic profile, B is the MALS result, C is the dimer structure of the TLR6 TIR domain detected in the asymmetric unit, D is the chain A and chain B . ≪ / RTI >
Figure 4 shows the dimer interface in the structure of the TLR6 TIR domain.
Figure 5 shows the overlap between the TLR6 TIR domain and other TIR domains according to the present invention.
Figure 6 shows conservative and physiologically important residues mapping for TIR-TIR interaction in TLR6.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에서는 2.2Å 해상도에서 아미노산 640 내지 796을 함유한 TLR6의 TIR 도메인의 결정구조를 최초로 밝혀내었다. 이로부터 선천성 면역계에서 TLR 매개 신호전달을 보다 잘 이해할 수 있으며, 특히 시토졸 영역에서 TLR6의 신호전달 단백질의 TIR 도메인 매개 조합을 잘 이해할 수 있다. The present invention firstly revealed the crystal structure of the TIR domain of TLR6 containing amino acids 640 to 796 at a resolution of 2.2 Å. From this it is possible to better understand the TLR-mediated signaling in the innate immune system, particularly the TIR domain-mediated combination of TLR6 signaling proteins in the cytosolic domain.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 단사정계의 공간 그룹(monoclinic space group)이 C2이고, 유니트 셀 차원(unit-cell dimension)이 a=127.60 Å, b=44.20 Å, c=75.72 Å이고, 4개 또는 5개의 α-헬릭스에 둘러싸인 5개 또는 4개 가닥의 동일방향 β-시트로 이루어지며, 비대칭 유니트 내에서 2개의 단량체가 이합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, TLR6 TIR 도메인의 3차구조를 제공한다.The present invention is directed to a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the monoclinic space group is C2 and the unit cell dimension is a = 127.60 A, b = 44.20 A, c = Lt; RTI ID = 0.0 > 1, < / RTI > 75.72 A, consisting of 5 or 4 stranded in-b-sheets surrounded by 4 or 5 a-helixes and 2 monomers in the asymmetric unit forming a dimer. Lt; / RTI >

상기 비대칭 유니트 중 사슬 A 상의 Ile684, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu 716 및 Tyr717과, 사슬 B 상의 Ile684, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu 716 및 Tyr717 간에 형성된 하나 이상의 수소결합을 포함할 수 있다.One or more hydrogen bonds formed between Ile684, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu716 and Tyr717 on the chain A in the asymmetric unit and Ile684, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu716 and Tyr717 on the chain B have.

상기 비대칭 유니트 중 사슬 A 상의 Cys712와 사슬 B 상의 Cys712 간 형성된 이황화결합을 포함할 수 있다.A disulfide bond formed between Cys712 on chain A and Cys712 on chain B in the asymmetric unit.

TLR6 TIR 도메인의 이합체 계면은 한 단량체의 CD 루프, DD 루프 및 αC의 말단을 다른 이웃 단량체의 동일 영역에 패킹하여 형성될 수 있다.The dimer interface of the TLR6 TIR domain can be formed by packing the CD loop of one monomer, the DD loop and the end of a C into the same region of the other monomer.

TLR6 TIR 도메인의 표면 상의 보존 잔기로서, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu 716, Tyr717 및 Cys712를 포함할 수 있다.Conserved residues on the surface of the TLR6 TIR domain may include His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu716, Tyr717 and Cys712.

또한, 본 발명은 상기 TLR6 TIR 도메인의 결정 구조를 이용하여 TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 기반으로 하는 약물 스크리닝에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for providing information to drug screening based on the tertiary structure of the TLR6 TIR domain using the crystal structure of the TLR6 TIR domain.

또한, 본 발명은 상기 TLR6 TIR 도메인의 결정 구조를 이용하여 TLR6 TIR 도메인 조절제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for screening a TLR6 TIR domain modulator using the crystal structure of the TLR6 TIR domain.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이러한 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이러한 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by these examples.

<< 실시예Example 1> 단백질 발현 및 정제 1> Protein expression and purification

인간 TLR6 TIR 도메인(NCBI accession no. BAA78631 중 아미노산 640 내지 796: 서열번호 1)을 본 발명자가 직접 만든 pOKD 벡터 내에서 클로닝 시키고, 20℃의 온도에서 밤새 단백질을 유도하여 E. coli BL21(DE3)에서 발현시켰다(Dzivenu, O. K., Hyun Ho Park and Hao Wu. (2004). General co-expression vectors for the overexpression of heterodimeric protein complexes in Escherichia coli. Protein Exp. & Purif. 38: 1-8). Cloning of the human TLR6 TIR domain (amino acids 640 to 796 in SEQ ID NO: 1 of NCBI accession no. BAA78631) in the pOKD vector prepared by the present inventor and induction of the protein overnight at a temperature of 20 DEG C yielded E. coli BL21 (DE3) (Dzivenu, OK, Hyun Ho Park and Hao Wu (2004).) General co-expression vectors for the overexpression of heterodimeric protein complexes in Escherichia coli Protein Exp.

이렇게 발현된 단백질은 카르복실기 말단 His-태그를 함유하였으며, 니켈 친화성 겔여과 크로마토그래피(nickel affinity and gel filtration chromatography)를 통해 정제하였다. 수퍼덱스 200 겔 여과 컬럼 10/30(Superdex 200 gel filtration column 10/30, GE healthcare)은 20 mM Tris-HCl(pH 8.0)과 150 mM NaCl로 미리 평형을 맞추어 사용하였다. 상기 겔 여과 크로마토그래피 상에서 약 18 mL로 용출된 단백질을 모으고, 결정화를 위하여 단백질을 4-5 mg/ml로 농축시켰다.
The protein thus expressed contained carboxyl-terminal His-tag and purified through nickel affinity and gel filtration chromatography. Superdex 200 gel filtration column 10/30 (Superdex 200 gel filtration column 10/30, GE healthcare) was pre-equilibrated with 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 150 mM NaCl. The protein eluted at about 18 mL on the gel filtration chromatography was collected and the protein was concentrated to 4-5 mg / ml for crystallization.

<< 실시예Example 2>  2> 다각도Angle 광산란Light scattering (( multimulti angleangle lightlight scatteringscattering ; ; MALSMALS ) 분석) analysis

인간 TLR6 TIR 도메인의 절대 몰농도는 다각도 광산란(multi angle light scattering; MALS)을 통해 분석하였다. 표적 단백질을 수퍼덱스 200 HR 10/30 겔-여과 컬럼 내에 로딩시켰다. 이때, 수퍼덱스 200 HR 10/30 겔-여과 컬럼은 20 mM Tris-HCl(pH 8.0)과 150 mM NaCl를 함유한 완충액으로 미리 평형을 맞추어 사용하였다. acta 크로마토그래피 시스템(Wyatt Technology)이 MALS 검출기(mini-DAWM treos) 및 굴절률 검출기(Optilab DSP)와 결합되어 사용되었다.
The absolute molar concentration of the human TLR6 TIR domain was analyzed by multi angle light scattering (MALS). The target protein was loaded into a Superdex 200 HR 10/30 gel-filtration column. At this time, the Superdex 200 HR 10/30 gel-filtration column was used in advance with equilibration with a buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) and 150 mM NaCl. acta chromatography system (Wyatt Technology) was used in combination with a MALS detector (mini-DAWM treos) and a refractive index detector (Optilab DSP).

<< 실시예Example 3> 단백질 결정화 및 데이터 수집 3> Protein crystallization and data collection

단백질 결정화 단계는 다양한 스크리닝 키트를 이용하여 일반적인 결정화 방법인 행잉 드랍 증기 확산 (hanging drop vapor diffusion) 방법을 통해 20℃에서 수행하였다. x-선 회절 연구를 위해 사용된 최종 결정은 1㎕의 단백질 용액[20 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl 중 4-5 mg/ml 단백질]과 1㎕의 보존용액을 함유한 혼합물로 평형을 맞추어 플레이트 상에서 성장시켰다. 이때, 상기 보존용액은 보존용액 0.4 mL에 대해 0.2M 리튬 설페이트 1수화물, 0.1M Tris(pH 8.6), 25%(w/v) 폴리에틸렌글리콜 3350 및 4%(v/v) 포름아마이드를 포함하였다. 포항가속기 연구소에서 BL-4A 빔라인에서 2.2 Å의 원데이터를 수집하였고, 데이터 가공 및 스케일링은 HKL3000 패키지를 이용하여 수행되었다.
The protein crystallization step was carried out at 20 캜 using a hanging drop vapor diffusion method which is a general crystallization method using various screening kits. The final crystals used for x-ray diffraction studies were a mixture containing 1 μl of protein solution [20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 4-5 mg / ml protein in 150 mM NaCl] and 1 μl of preservation solution &Lt; / RTI &gt; and grown on the plate. At this time, the preservation solution contained 0.2 M lithium sulfate monohydrate, 0.1 M Tris (pH 8.6), 25% (w / v) polyethylene glycol 3350 and 4% (v / v) formamide for 0.4 mL of preservation solution . At the Pohang Accelerator Laboratory, 2.2 Å of raw data was collected on the BL-4A beamline, and data processing and scaling were performed using the HKL3000 package.

<< 실시예Example 4> 입체 구조 결정 및 분석 4> Determination of stereostructure and analysis

1. 입체 구조 결정 방법1. Determination of steric structure

입체 구조는 종래 알려진 방법(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 63, 32-41, 2007)에 따른 분자 치환 방법(molecular replacement phasing method)에 의해 결정하였다. TLR6 TIR 도메인과 84% 서열 동일성을 공유하는 종래 알려진 TLR1 구조(PDB code: 1FYV)를 조사 모델로서 이용하였다. 모델화 및 정밀화는 각각 COOT 및 Refmac5를 이용하여 수행하였다. The stereostructure can be obtained by a known method ( Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 63, 32-41, 2007). &Lt; / RTI &gt; A previously known TLR1 structure (PDB code: 1FYV) sharing 84% sequence identity with the TLR6 TIR domain was used as an investigation model. Modeling and refinement were performed using COOT and Refmac5, respectively.

Refmac5에서 ARP/wARP 기능을 이용하여 물 분자를 자동적으로 첨가한 후, 합리적인 수소결합 가능성에 대하여 조사하였다. 모델의 질은 PROCHECK를 이용하여 확인하였으며 좋은 것으로 확인되었다. 전체 중 85.5%의 잔기는 가장 선호되는 영역(most favorable regions)에, 14.5%의 잔기는 라마찬드란조사구(Ramachandran plot)의 허용되는(allowed) 영역에 분포하였다. 데이터 수집 및 정밀화 통계는 표 1과 같다.
In Refmac5, water molecules were automatically added using the ARP / wARP function and then the possibility of hydrogen bonding was investigated. The quality of the model was verified by using PROCHECK. 85.5% of the total were distributed in the most favorable regions, and 14.5% were distributed in the allowed areas of the Ramachandran plot. Data collection and refinement statistics are shown in Table 1.

데이터 수집Data collection 공간군Space group C2C2 셀 차원
a, b, c Cell dimension
a, b, c 127.60Å,44.20Å, 75.72Å127.60 A, 44.20 A, 75.72 A 해상도resolution 50-2.2Å50-2.2 RR symsym 9.1% (66.0%)9.1% (66.0%) I/σII / I 43.6 (4.0)43.6 (4.0) 보상도 데이터완성도Compensation data completeness 96.4% (97.2%)96.4% (97.2%) 중복성(Redundancy)Redundancy 6.2 (6.2)6.2 (6.2) 구조 정밀화Structure refinement 해상도resolution 31.8-2.2Å31.8-2.2 A 리플렉션 수Reflection Number 18,212 (96.1%)18,212 (96.1%) Rwork/Rfree R work / R free 23.4%/27.4%23.4% / 27.4% 원자 수Atomic number 단백질protein 2,4312,431 물 및 다른 소분자Water and other small molecules 2727 평균 B-인자Average B-factor 단백질protein 52.2Å2 52.2 Å 2 물 및 다른 소분자Water and other small molecules 30.4Å2 30.4 Å 2 R.m.s 편차R.m.s deviation 결합길이Coupling length 0.009Å0.009Å 결합각Coupling angle 1.390°1.390 [deg.] 라마찬드란조사구 Ramachandran plotRamachandran plot Ramachandran plot 가장 선호되는 영역Most preferred area 97.9%97.9% 추가적으로 허용되는 영역Additional allowed areas 2.1%2.1%

리본 다이어그램(Ribbon diagrams)과 분자 표면 표현(molecular surface representations)은 프로그램 Pymol(The pymol Molecular Graphics System (2002), DeLano Scientific, San Carlos, USA)을 이용하여 얻었다.Ribbon diagrams and molecular surface representations were obtained using the program Pymol (The pymol Molecular Graphics System (2002), DeLano Scientific, San Carlos, USA).

또한, TIR 도메인의 아미노산 서열을 Clustal W(http://www.ebi.ac.kr/Tools/clustalw2/index.html)를 이용하여 분석하였다. 그리고, RCSB 단백질 데이터 은행에 3차원적 좌표와 구조 인자들이 등록되어 있으며, PDB ID 코드는 4OM7이었다.
In addition, the amino acid sequence of the TIR domain was analyzed using Clustal W ( http://www.ebi.ac.kr/Tools/clustalw2/index.html) . Three dimensional coordinates and structural factors were registered in the RCSB protein data bank, and the PDB ID code was 4OM7.

2. 2. TLR6TLR6 TIRTIR 도메인의 입체 구조 결정 분석 Analysis of domain structure determination

TLR의 C말단에 있는 TIR 도메인은 NF-kB 매개 선천성 면역 기능에 중요하며, 도 1A와 같이 TLR6은 N말단에 류신 풍부 도메인과 C말단에 TIR 도메인을 포함한 몇가지 구별되는 도메인을 포함한다. The TIR domain at the C-terminus of the TLR is important for NF-kB mediated congenital immune function, and TLR6 contains several distinct domains including the leucine rich domain at the N terminus and the TIR domain at the C terminus, as in Figure 1A.

분자 치환법을 이용하여 TLR6 TIR 도메인의 2.2 Å 결정 구조를 규명하였고, R work = 23.4% 및 R free = 27.4%로 정의되었다. TLR6 TIR 도메인의 고해상 구조는 도 1B와 같이 4개 또는 5개의 α-헬릭스에 둘러싸인 5개 또는 4개 가닥의 동일방향 β-시트로 이루어진 전형적인 TIR 도메인 폴드인 것으로 확인되었다. 전체 폴드는 다른 TIR 도메인과 유사하며, TLR10 및 MAL의 구조에서 나타나는 βB는 TRL6에서는 관찰되지 않는 반면, αB 앞에 위치한 αA'는 TLR6에서만 관찰되었다. 또한, TRL6 TIR 도메인은 BB 루프와 DD 루프를 포함한 몇 개의 잘 보존된 루프를 포함하며, 이러한 루프들은 TIR 도메인의 기능에 중요한 것으로 예상된다(도 1B, 도 1C 참조).The 2.2 Å crystal structure of the TLR6 TIR domain was identified using molecular substitution method and defined as R work = 23.4% and R free = 27.4%. The high-resolution structure of the TLR6 TIR domain was confirmed to be a typical TIR domain fold consisting of five or four stranded in-b-sheets surrounded by four or five a-helixes as in Fig. 1B. The entire fold is similar to other TIR domains, and βB in the structure of TLR10 and MAL is not observed in TRL6, whereas αA 'located before αB was observed only in TLR6. In addition, the TRL6 TIR domain includes several well-preserved loops including the BB loop and the DD loop, which are expected to be important for the function of the TIR domain (see FIG. 1B, FIG. 1C).

도 1C와 같이, TLR2에서 기능적으로 중요한 잔기로 알려진 P681, F679 및 C713은 TLR6에서도 잘 보존되었다(P680, F678, C712). TLR6 TIR 도메인의 구조는 컴팩트하며 말초에서 몇 개의 루프를 가지며 중심영역으로 잘 정렬되어 있다. As in Figure 1C, P681, F679 and C713, which are known to functionally important residues in TLR2, were well conserved in TLR6 (P680, F678, C712). The structure of the TLR6 TIR domain is compact, has several loops at the periphery and is well aligned with the central region.

평균 B 인자는 52.2Å이며, 각 잔기의 플로팅 개별 B-인자로부터 쌓아올린 β-시트들과 이를 둘러싼 α-헬릭스가 가장 낮은 B 인자를 가지며, BB, DD 및 EE 루프를 포함한 길게 연신된 루프들이 가장 높은 B 인자를 가짐을 나타내었다(도 2A 및 도 2B 참조). 아댑터 분자의 몇 개 TIR 도메인과의 상호작용에 직접적 관련이 있는 것으로 알려진 BB 루프는 가장 높은 B 인자를 가지므로, BB 루프는 TLR6 TIR 도메인의 구조에서 가장 유연한 루프임을 의미한다.
The average B factor is 52.2 ANGSTROM, and the β-sheets stacked from the floating individual B-factor of each residue and the surrounding α-helix have the lowest B factor and the elongated loops containing the BB, DD and EE loops And had the highest B factor (see Figures 2A and 2B). The BB loop, which is known to be directly related to its interaction with several TIR domains of the adapter molecule, has the highest B factor, meaning that the BB loop is the most flexible loop in the structure of the TLR6 TIR domain.

3. 3. TLR6TLR6 TIRTIR 도메인의  Of the domain 이합체Dimer 계면 Interface

TLR6 TIR 도메인은 박테리아에서 과발현되며, 친화성 크로마토그래피 후 겔-여과 크로마토그래피를 통해 정제되었다. 표적 단백질은 겔-여과 크로마토그래피 상 약 17-18 mL로 용출되어 용액 상에서 단량체 또는 이합체로 형성될 것으로 추정되었다(도 3A). The TLR6 TIR domain is overexpressed in bacteria and purified via affinity chromatography followed by gel-filtration chromatography. The target protein was estimated to elute at about 17-18 mL on gel-filtration chromatography to form monomers or dimers in solution (Figure 3A).

TLR6 TIR 도메인의 화학량론 분석은 MALS에 의해 정확하게 컨펌되었다. C-말단 His-태그를 포함한 단량체성 TLR6 TIR 도메인의 산출된 분자량은 19.7 kDa이었고, MALS로부터 얻어진 실험적 분자량은 33.2-27.8 kDa(0.8% 잔차), 다분산도 1.000이었다(도 3B 참조). 겔-여과 크로마토그래피와 MALS의 분석에 따라 본 발명자들은 TLR6 TIR 도메인이 용액 상에서는 단량체 및 이합체 TLR6 TIR 도메인이 공존하며, 도 3C와 같이 비대칭 유닛에서 2개의 단량체 즉, 사슬 A 및 사슬 B가 존재하며, 각 단량체는 거의 동일하며, 도 3D와 같이 0.7Å의 평균제곱근편차(RMSD)로 겹쳐져 있었다. 이러한 유사성에도 불구하고, BB 루프는 구조적으로 잘 보존되지 않아 BB 루프는 동일 조건 하에서조차 매우 가변적임을 알 수 있다.The stoichiometric analysis of the TLR6 TIR domain was correctly confirmed by MALS. The calculated molecular weight of the monomeric TLR6 TIR domain containing the C-terminal His- tag was 19.7 kDa, the experimental molecular weight from MALS was 33.2-27.8 kDa (0.8% residual) and the polydispersity was 1.000 (see Fig. According to gel-filtration chromatography and analysis of MALS, the present inventors have found that the monomer and dimeric TLR6 TIR domains coexist in the solution phase in the TLR6 TIR domain, and two monomers, i.e., chain A and chain B, are present in the asymmetric unit , Each monomer being approximately the same and overlapping with a mean square root deviation (RMSD) of 0.7 A as in Figure 3D. Despite this similarity, it can be seen that the BB loop is not well structurally well preserved, so the BB loop is highly variable even under the same conditions.

도 4와 같이, TLR6 TIR 도메인의 이합체성 계면은 한개 단량체의 CD 루프, DD 루프 및 αC의 말단을 다른 단량체의 동일 영역에 패킹하여 형성된다. 몇 개의 수소결합이 한 분자(사슬 A) 내의 Ile684, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu 716 및 Tyr717와 다른 분자(사슬 B) 내의 동일 잔기 간에 형성되었고, 주요한 이황화결합은 각 단량체(사슬 A)의 Cys712와 이웃한 단량체(사슬 B)의 Cys712 간에 형성되어 이합체 형성에 중요한 역할을 수행하였다. 주요 이황화결합은 αC의 중심부에 위치하여 αC이 이합체성 계면 형성에 중요함을 시사한다.As shown in Figure 4, the dimeric interface of the TLR6 TIR domain is formed by packing the CD loops, the DD loops, and the ends of a C into the same region of another monomer. Several hydrogen bonds were formed between identical residues in Ile684, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu 716 and Tyr717 and other molecules (chain B) in one molecule (chain A), and the major disulfide bonds were found in each monomer (chain A) Cys712 of the monomer (chain B) and Cys712 of the neighboring monomer (chain B). The major disulfide bonds are located at the center of αC suggesting that αC is important for the formation of dimeric interfaces.

2개 분자에 의해 형성된 총 표면적은 약 16,417Å2 및 1,342Å2이었고, 복합체 형성 하에서 묻혀져 있고, 분자당 평균 671Å2와 일치하였다. 표면적의 평균 8.2%가 이합체성 계면 형성 하에 묻혀져 있다.
The total surface area formed by the two molecules was about 16,417 Å 2 and 1,342 Å 2 , buried under complex formation, and consistent with an average of 671 Å 2 per molecule. An average of 8.2% of the surface area is buried under dimeric interfacial formation.

4. 다른 4. Other TLRTLR 도메인 구조와의 비교 Comparison with domain structure

DALI를 이용한 구조적 상동성 조사로부터 TLR6 TIR 도메인과 유사한 단백질을 확인하였다(표 2).
Proteins similar to the TLR6 TIR domain were identified from structural homology studies using DALI (Table 2).

단백질 수납번호Protein storage number Z-스코어Z-score RMSD(Å)RMSD (A) 동일성(%)sameness(%) 문헌literature TLR1 (1FYV)TLR1 (1FYV) 22.722.7 1.11.1 8484 (Xu et al ., 2000)(Xu meat al . , 2000) TLR10 (2J67)TLR10 (2J67) 21.721.7 1.31.3 7373 (Nyman et al ., 2008)(Nyman meat al . , 2008) TLR5 (3J0A)TLR5 (3J0A) 20.620.6 1.31.3 2424 (Zhou et al ., 2012)(Zhou meat al . , 2012) TLR2 (1FYW)TLR2 (1FYW) 19.419.4 2.22.2 4848 (Xu et al ., 2000)(Xu meat al . , 2000) IL-1RAPL (1T3G)IL-1RAPL (1T3G) 13.813.8 2.52.5 2424 (Khan et al ., 2004)(Khan meat al . , 2004) MyD88 (4DOM) MyD88 (4DOM) 12.012.0 2.62.6 2323 (Snyder et al ., 2013)(Snyder meat al . , 2013) MAL (3UB2)MAL (3UB2) 9.79.7 2.82.8 1818 (Lin et al ., 2012)(Lin meat al . , 2012)

22.7부터 9.7까지의 Z-스코어를 이용하여 탑 7 매치는 TLR1(1FYV), TLR10(2J67), TLR5(3JOA), TLR2(1FYW), IL-1RAPL(1T3G), MyD88(4DOM) 및 MAL(3UB2)로 나타났다(도 5A 참조).Using the Z-score from 22.7 to 9.7, the top 7 matches were TLR1 (1FYV), TLR10 (2J67), TLR5 (3JOA), TLR2 (1FYW), IL-1RAPL (1T3G), MyD88 ) (See Fig. 5A).

TLR6 TIR 도메인과 다른 TIR 도메인 간의 쌍 구조 정렬(Pair-wise structural alignment)을 통해 TLR6 TIR 도메인 내 몇가지 루프를 포함한 멀티플 2차 구조의 위치 및 길이가 다른 TIR 도메인과 상이한 것으로 나타났다(도 5B 내지 도 5G 참조). 특히, BB 루프는 잘 중첩되지 않고 TLR6 TIR 도메인의 αA는 다른 TIR 도메인의 그것보다 더 길었다(도 5B 내지 도 5G 참조). 이렇게 긴 BB 루프의 존재는 TLR 패밀리로부터 TIR 도메인의 특징이다. 그러나, MyD88 및 MAL을 포함한 아댑터 단백질로부터 유래한 TIR 도메인은 긴 BB 루프를 포함하지 않는다(도 5F 및 도 5G 참조). 이러한 구조적 차이는 TIR 도메인 함유 단백질 간의 기능적 차이에 중요한 역할을 수행할 것이다.
The position and length of multiple secondary structures including several loops in the TLR6 TIR domain differed from other TIR domains through a pair-wise structural alignment between the TLR6 TIR domain and the other TIR domains (Figures 5B-5G Reference). In particular, the BB loop did not overlap well and the aA of the TLR6 TIR domain was longer than that of other TIR domains (see Figures 5B-5G). The presence of this long BB loop is characteristic of the TIR domain from the TLR family. However, the TIR domain derived from the adapter protein, including MyD88 and MAL, does not contain a long BB loop (see Figures 5F and 5G). These structural differences will play an important role in functional differences between TIR domain containing proteins.

5. 단백질 상호작용에 중요한 보존 5. Preservation important for protein interaction 잔기의Residue 맵핑Mapping

TLR6 구조에서 BB 루프는 호모 이합체성 상호작용에 중요하지 않으며, 대신 Cys712를 포함한 αC가 이러한 상호작용에 중요한 역할을 수행한다. TLR6 TIR 도메인 구조에서 확인된 이합체성 상호작용과 관련된 잔기를 확인하기 위하여, TLR6 TIR 도메인 서열을 다른 알려진 TIR 함유 단백질들과 정렬시켰다(도 6A 참조). In the TLR6 structure, the BB loop is not critical for homodimeric interactions, but instead, αC, including Cys712, plays a crucial role in this interaction. To identify residues associated with the dimeric interactions identified in the TLR6 TIR domain structure, the TLR6 TIR domain sequence was aligned with other known TIR containing proteins (see FIG. 6A).

TRAF4, TRAF2, TRAF3, TRAF6를 이용하여 수용체 상호작용에 참여하는 표면 잔기를 서열 상에 표시하였다(도 6A 참조). 종래 알려진 TLR2/TLR1 신호 연구에서는 TLR 신호전달경로에 대한 아댑터와 상호작용에 참여하는 것으로 알려진 표면 잔기들은 TLR2에서 Pro681, Phe679, Cys713, Leu717 및 Arg748(Fig. 6A)을 포함하였다. 본 발명에서 TLR6에서의 호모 이합체성 상호작용에 참여하는 중요한 잔기로서 His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu 716, Tyr717 및 Cys712을 확인하였다. TLR2의 표면 상에 존재하는 수많은 잔기들은 TLR6에서도 보존되었다(도 6A 및 도 6B 참조). 이러한 결과로부터, TLR6은 TLR1과 유사하게 TLR2 및 MyD88과 상호작용을 함을 알 수 있었다.TRAF4, TRAF2, TRAF3, and TRAF6 were used to display surface residues that participated in receptor interaction (see FIG. 6A). In the known TLR2 / TLR1 signaling studies, surface residues known to participate in adapter interaction with the TLR signaling pathway include Pro681, Phe679, Cys713, Leu717 and Arg748 (Fig. 6A) in TLR2. In the present invention, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu716, Tyr717 and Cys712 were identified as important residues involved in the homodimeric interaction in TLR6. Numerous residues present on the surface of TLR2 were also conserved in TLR6 (see Figures 6A and 6B). These results suggest that TLR6 interacts with TLR2 and MyD88 similar to TLR1.

그러나, TLR1 단백질 복합체의 조립 기전은 BB 루프의 Phe678과 Pro680이 TLR6과 상호작용에 관여하지 않는다는 점에서 차이가 있다.
However, the mechanism of assembly of the TLR1 protein complex differs in that the BB loop Phe678 and Pro680 are not involved in the interaction with TLR6.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Three-dimensional structure of TLR6 TIR domain and method of screening drug using the same <130> ADP-2014-0088 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Gln Phe His Ala Phe Ile Ser Tyr Ser Glu His Asp Ser Ala Trp 1 5 10 15 Val Lys Ser Glu Leu Val Pro Tyr Leu Glu Lys Glu Asp Ile Gln Ile 20 25 30 Cys Leu His Glu Arg Asn Phe Val Pro Gly Lys Ser Ile Val Glu Asn 35 40 45 Ile Ile Asn Cys Ile Glu Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser 50 55 60 Pro Asn Phe Val Gln Ser Glu Trp Cys His Tyr Glu Leu Tyr Phe Ala 65 70 75 80 His His Asn Leu Phe His Glu Gly Ser Asn Asn Leu Ile Leu Ile Leu 85 90 95 Leu Glu Pro Ile Pro Gln Asn Ser Ile Pro Asn Lys Tyr His Lys Leu 100 105 110 Lys Ala Leu Met Thr Gln Arg Thr Tyr Leu Gln Trp Pro Lys Glu Lys 115 120 125 Ser Lys Arg Gly Leu Phe Trp Ala Asn Ile Arg Ala Ala Phe Asn Met 130 135 140 Lys Leu Thr Leu Val Thr Glu Asn Asn Asp Val Lys Ser 145 150 155 <110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Three-dimensional structure of TLR6 TIR domain and method of          screening drug using the same <130> ADP-2014-0088 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Gln Phe His Ala Phe Ile Ser Tyr Ser Glu His Asp Ser Ala Trp   1 5 10 15 Val Lys Ser Glu Leu Val Pro Tyr Leu Glu Lys Glu Asp Ile Gln Ile              20 25 30 Cys Leu His Glu Arg Asn Phe Val Pro Gly Lys Ser Ile Val Glu Asn          35 40 45 Ile Ile Asn Cys Ile Glu Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser      50 55 60 Pro Asn Phe Val Gln Ser Glu Trp Cys His Tyr Glu Leu Tyr Phe Ala  65 70 75 80 His His Asn Leu Phe His Glu Gly Ser Asn Asn Leu Ile Leu Ile Leu                  85 90 95 Leu Glu Pro Ile Pro Gln Asn Ser Ile Pro Asn Lys Tyr His Lys Leu             100 105 110 Lys Ala Leu Met Thr Gln Arg Thr Tyr Leu Gln Trp Pro Lys Glu Lys         115 120 125 Ser Lys Arg Gly Leu Phe Trp Ala Asn Ile Arg Ala Ala Phe Asn Met     130 135 140 Lys Leu Thr Leu Val Thr Glu Asn Asn Asp Val Lys Ser 145 150 155

Claims (7)

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 단사정계의 공간 그룹(monoclinic space group)이 C2이고, 유니트 셀 차원(unit-cell dimension)이 a=127.60 Å, b=44.20 Å, c=75.72 Å이고, 4개 또는 5개의 α-헬릭스에 둘러싸인 5개 또는 4개 가닥의 동일방향 β-시트로 이루어지며, 비대칭 유니트 내에서 2개의 단량체가 이합체를 형성하는 것을 특징으로 하는, TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 갖는 결정.1, the monoclinic space group is C2, the unit cell dimension is a = 127.60 Å, b = 44.20 Å, c = 75.72 Å, Of the TLR6 TIR domain, consisting of five or four stranded in-beta-sheets surrounded by four or five alpha -helices, and two monomers in the asymmetric unit forming a duplex. Crystalline structure. 청구항 1에 있어서, 상기 비대칭 유니트 중 사슬 A 상에 있는, GenBank no. BAA78631.1의 TLR6 단백질 아미노산 서열 중 Ile684, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu 716 및 Tyr717과, 사슬 B 상에 있는, GenBank no. BAA78631.1의 TLR6 단백질 아미노산 서열 중 Ile684, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu 716 및 Tyr717 간에 형성된 하나 이상의 수소결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 갖는 결정. 4. The method of claim 1, wherein the asymmetric unit is on GenBank no. Ile684, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu716 and Tyr717 in the TLR6 protein amino acid sequence of BAA78631.1, and GenBank no. A crystal having a tertiary structure of the TLR6 TIR domain, characterized in that it comprises at least one hydrogen bond formed between Ile684, His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu716 and Tyr717 in the TLR6 protein amino acid sequence of BAA78631.1. 청구항 1에 있어서, 상기 비대칭 유니트 중 사슬 A 상에 있는, GenBank no. BAA78631.1의 TLR6 단백질 아미노산 서열 중 Cys712와, 사슬 B 상에 있는, GenBank no. BAA78631.1의 TLR6 단백질 아미노산 서열 중 Cys712 간 형성된 이황화결합을 포함하는 것을 특징으로 하는, TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 갖는 결정. 4. The method of claim 1, wherein the asymmetric unit is on GenBank no. Cys712 in the TLR6 protein amino acid sequence of BAA78631.1 and GenBank no. A crystal having a tertiary structure of the TLR6 TIR domain, characterized in that it comprises a disulfide bond formed between Cys712 in the TLR6 protein amino acid sequence of BAA78631.1. 청구항 1에 있어서, 상기 TLR6 TIR 도메인의 이합체 계면은 한 단량체의 CD 루프, DD 루프 및 αC의 말단을 다른 이웃 단량체의 동일 영역에 패킹하여 형성되는 것을 특징으로 하는, TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 갖는 결정. 2. The method of claim 1, wherein the dimer interface of the TLR6 TIR domain is formed by packing the CD loop, the DD loop and the end of? C of one monomer into the same region of the other neighboring monomer. The decision to have. 청구항 1에 있어서, 상기 TLR6 TIR 도메인의 표면 상의 보존 잔기로서, GenBank no. BAA78631.1의 TLR6 단백질 아미노산 서열 중 His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu 716, Tyr717 및 Cys712를 포함하는 것을 특징으로 하는, TLR6 TIR 도메인의 3차 구조를 갖는 결정.3. The method according to claim 1, wherein as conserved residues on the surface of the TLR6 TIR domain, as described in GenBank no. A crystal having a tertiary structure of the TLR6 TIR domain, characterized in that it comprises His713, Lys747, Asn746, Gln708, Leu 716, Tyr717 and Cys712 in the TLR6 protein amino acid sequence of BAA78631.1. 삭제delete 삭제delete
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