KR101557459B1

KR101557459B1 - 델로비브리오 박테리오보루스 hd 100을 포함하는 유전자 변형 미생물 또는 재조합 dna 제거용 조성물 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101557459B1
Application number: KR1020130072600A
Authority: KR
Inventors: 로버트 제임스 미첼; 칼란자나 몬나파 아제이; 드위다르 모하메드
Original assignee: 국립대학법인 울산과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2015-10-15
Also published as: KR20150000311A

Abstract

본 발명은 델로비브리오 박테리오보루스(Bdellovibrio bacteriovorus) HD 100 (NCBI Genbank등록번호 BX842601.2)를 이용한 토양, 토양 슬러리, 수계 환경 또는 무산소 환경 내의 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거용 조성물 및 제거 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 균주를 이용한 유전자 변형 미생물로부터 토착 미생물로의 재조합 DNA 전이 억제용 조성물 및 전이 억제 방법에 관한 것이다.

Description

델로비브리오 박테리오보루스 HD 100을 포함하는 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거용 조성물 및 이의 이용 {Composition comprising Bdellovibrio bacteriovorus HD 100 for removing genetically modified microorganism or recombinant DNA and using the same}

재조합 DNA 기술이 도입됨에 따라, 보건, 진단, 화학산업과 식품산업이 급격하게 발달하였다. 재조합 DNA 기술이 적용되어 개발된 재조합 유기체에는 아미노산, 비타민 및 알코올과 같은 일차 대사산물; 소마토스타틴(somatostatin), 인슐린(insulin), 및 인터페론(interferons)과 같은 재조합 단백질; 및 항생제와 항암제와 같은 2차 대사산물 등이 있다.

이러한 재조합 기술의 발달로 목적하는 생산물의 생산성과 수율은 높아졌지만, 재조합 유기체들이 환경에 유출되는 경우 재조합 유기체들 및 토착 미생물 종들 사이에 수평적인 유전자 교환(horizontal gene transfer)이 일어나 생태계 내에 항생제 저항성 유전자와 같은 위험한 특성이 퍼질 수 있기 때문에, 생태학적으로 재조합 유기체들의 무분별한 유출을 제어해야 하는 것이 새로운 기술적 과제로 대두되고 있다.

수평적인 유전자 교환은 접합(conjugation), 형질전환(transformation) 또는 형질도입(transduction)의 다양한 방법으로 일어날 수 있다. 최근 한 연구는 세균들은 세포 사이에 세포질을 연결할 수 있는 생물막(biofilm)을 이용한 나노채널을 형성하여 접합이 안되는 플라스미드라도 공유할 수 있다고 발표했다(Dubey, G.P., Ben-Yehuda, S., 2011. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell 144, 590-600.). 또한, 다양한 환경 조건에서 접합성 유전자 교환이 일어날 수 있고, 그에 따라 자연적으로 형질전환이 가능한 세균의 형질전환능력이 발달할 수 있고 토착환경에서 DNA를 흡수할 수 있는 것이 밝혀졌다(Droge, M., Puhler, A., Selbitschka, W., 1999. Horizontal gene transfer among bacteria in terrestrial and aquatic habitats as assessed by microcosm and field studies. Biology and Fertility of Soils 29, 221-245.).

또한, 자연적으로 형질전환 능력이 뛰어난 토양 세균의 몇몇 종들은 환경에서 DNA를 간단하게 흡수한다. 예를 들어, 아시네토박터(Acinetobacter)는 세포 외 DNA를 쉽게 흡수하는 속(genus)으로 알려져 있다. 아시네토박터 베일리아이(Acinetobacter baylyi)는 균주의 게놈 서열과 상동성(homology)이 전혀 없는 DNA라도 상대적으로 높은 빈도로 게놈에 도입할 수 있다. 이러한 능력으로 인해 이 균주들은 항생제 저항성 및 기타 종들간에 유전적으로 변형된 유전자들을 전달하는 매개체가 될 수도 있다.

따라서, 환경에 유출된 유전자 변형 미생물 또는 이들이 가지고 있는 재조합 DNA 를 제거함으로써, 토착 미생물로의 유전자 교환(전이)를 억제하는 기술의 개발이 필요한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 토양 및 수계 환경에서 재조합 미생물 및 이들이 보유한 재조합 DNA 모두를 유의적으로 감소시키기 위해 포식성 세균을 활용하는 기술을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 델로비브리오 박테리오보루스(Bdellovibrio bacteriovorus) HD 100 (NCBI Genbank 등록번호 BX842601.2)를 포함하는, 토양, 토양 슬러리 또는 수계 환경 내의 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100를 포함하는, 유전자 변형 미생물로부터 토착 미생물로의 재조합 DNA 전이 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100 및 질산염을 포함하는, 무산소 환경 내의 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 본 발명의 조성물을 토양, 토양 슬러리 또는 수계 환경에 처리하는 단계를 포함하는, 토양, 토양 슬러리 또는 수계 환경 내에서 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 본 발명의 조성물을 유전자 변형 미생물 포함 환경에 처리하는 단계를 포함하는, 유전자 변형 미생물로부터 토착 미생물로의 재조합 DNA 전이 억제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 본 발명의 조성물을 무산소 환경에 처리하는 단계를 포함하는, 무산소 환경 내에서 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100을 포함하는, 토양, 토양 슬러리 또는 수계 환경 내의 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거용 조성물에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 유전자 변형 미생물은 유전자 변형 대장균일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100를 포함하는, 유전자 변형 미생물로부터 토착 미생물로의 재조합 DNA 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100 및 질산염을 포함하는, 무산소 환경 내의 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거용 조성물에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명의 조성물을 토양 또는 토양 슬러리에 처리하는 단계를 포함하는, 토양 슬러리 내에서 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 토양에 처리하는 단계는 4일 ~ 8 일 동안 수행될 수 있다.

바람직하게, 상기 토양 슬러리에 처리하는 단계는 24 ~ 72시간 동안 수행될 수 있다.

또한 바람직하게, 상기 토양 슬러리는 물 10ml을 기준으로 토양이 0g 초과 2g 이하가 포함될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명의 조성물을 수계 환경에 처리하는 단계를 포함하는, 수계 환경 내에서 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 수계 환경에 처리하는 단계는 12 ~ 48시간 동안 수행될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명의 조성물을 유전자 변형 미생물 포함 환경에 처리하는 단계를 포함하는, 유전자 변형 미생물로부터 토착 미생물로의 재조합 DNA 전이 억제 방법에 관한 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명의 조성물을 무산소 환경에 처리하는 단계를 포함하는, 무산소 환경 내에서 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거 방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 방법은, 무산소 환경에 질산염의 농도가 1 ~ 5mM 이 되도록 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

더욱 바람직하게, 상기 처리하는 단계는 24 ~ 72시간 동안 수행될 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100이 토양 슬러리, 수계 환경 또는 질산염을 포함하는 무산소 환경 내에서 유전자 변형 미생물을 포식하고 재조합 DNA를 분해하여 제거한다는 것을 최초로 규명하였다. 따라서, 어떤 경로에 의해서건 생태계로 유전자 변형 미생물이나 재조합 DNA가 유출된 경우, 이를 제거하여 유전자 변형 미생물로부터 토착 미생물로의 재조합 DNA 전이를 억제할 수 있는 조성물 및 방법을 제공함을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 생태계 내에 존재하는 다양한 환경조건에서 유전자 변형 미생물 및 재조합 DNA가 존재하는 경우 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100이 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 토양, 수계, 토양 슬러리에서 포식 실험을 진행하였다. 이를 위하여, 청록색 형광 단백질을 암호화하는 cfp 유전자와 엠피실린 저항성 단백질을 암호화하는 bla 유전자가 존재하는 플라스미드를 도입한 유전자 변형 미생물을 제조하여, 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100를 처리하기 전과 처리한 후의, 앰피실린이 존재하는 배지 내에서 CFU(colony forming units) 또는 PFU(plaque forming units)의 감소여부, qPCR을 이용한 유전자 농도 감소여부, 및 형광 현미경을 통한 형광 세포 감소여부를 조사하였다.

그 결과, 토양에서 재조합 개체군의 감소를 확인하였고, 토양 자체보다는 토양 샘플에 액체를 첨가한 토양 슬러리 환경에서 재조합 개체군의 감소가 보다 많이 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 수계환경에서 재조합 개체군이 유의적으로 감소하였고, 무산소 조건에서도 질산염이 존재하는 경우 재조합 개체군이 유의적으로 감소하였다.

따라서, 토양 슬러리 또는 수계 환경에 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100 균주를 적용하여, 환경 내 존재하는 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA를 제거함으로써, 종국적으로는 유전자 변형 미생물로부터 토착 미생물로의 재조합 DNA의 전이를 억제할 수 있음이 입증되었다.

본원에서 "델로비브리오 박테리오보루스 HD 100"균주란, 분류학적으로 델로비브리오 속에 속하는 그람 음성 세균 및 호기성 세균을 말하며, 다른 그람 음성 세균들을 포식하는 포식성 균주인 것으로 알려져 있다. 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100의 게놈은 2004년에 완전히 해독되었으며 (Science vol.303, p.689-692, 2004), 전체 게놈 서열에 대한 정보는 NCBI Genbank 등록번호 BX842601.2 에 공개되어 있다. 또한, 상기 균주는 기탁번호 ATCC 15356, DSM 50701, NCIB 9529 등으로 기탁되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100는 당업계에서 자명하게 통용되는 용어로 볼 수 있으며, 이를 입수하는데 별다른 어려움이 없다.

본원에서 "유전자 변형 미생물"이라 함은, 유전자 재조합 기술을 이용하여 어떤 생물체의 유용한 유전자를 다른 미생물의 유전자와 결합시켜 특정한 목적에 맞도록 유전자 일부를 변형시켜 만든 미생물을 말한다. 상기 용어는, "재조합 미생물", "재조합 균주" 등의 용어로 대체하여 사용할 수 있음이 당업자에게 자명하다.

유전자 변형 미생물은, 예를 들어, 항생제 저항성 유전자가 도입된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 다른 미생물의 유전자가 도입되어 유전자가 변형된 미생물은 모두 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 미생물에는 조류(algae), 세균류(bacteria), 원생동물류(protozoa), 사상균류(fungi), 효모류(yeast) 등이 포함될 수 있고, 바람직하게 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100이 포식 가능한 미생물, 보다 바람직하게 그람 음성 세균류, 더욱 바람직하게 대장균이 본 발명의 범위에 포함된다.

또한, 상기 유전자 변형 미생물은 각종 산업적 또는 실험적 목적으로 유전공학적으로 제조된 것일 수 있다. 예를 들어, 생물학적 비료로 사용하기 위해 제조된 재조합 균주, 식물 병원성 균주를 제어하기 위해 제조된 재조합 균주, 또는 난분해성 물질의 생물학적 분해를 위해 제조된 재조합 균주 등을 포함한다. 이러한 유전자 변형 미생물들은 본래의 재조합 목적에 따라 산업에 응용될 경우 많은 이점을 가져다 주지만, 고의적으로 또는 우연히 생태계에 방출될 경우 토착 미생물에게로 재조합 DNA를 전이할 수 있는 잠재적인 가능성을 가지므로, 본 발명은 생태계에 방출된 유전자 변형 미생물을 제거하는 것을 목적으로 한다.

따라서, 바람직하게 상기 유전자 변형 미생물은 생태계에 방출된 유전자 변형 미생물일 수 있으며, 상기 생태계란 토양, 토양 슬러리, 수계 생태계 또는 무산소 환경임이 바람직하다.

본원에서 "재조합 DNA"라 함은, 숙주 미생물에 도입되는 외래 DNA 를 말한다. 재조합 DNA 는 플라스미드의 형태를 가지는 경우가 많기 때문에, 본원에서는 "재조합 DNA"와 "재조합 플라스미드"를 혼용하여 사용하기도 한다. 상기 재조합 DNA는, 예를 들어, 제한 효소를 사용해서 DNA의 사슬을 여러 곳에서 끊어서 만든 DNA 단편을, 연결효소(ligase)를 사용하여 다른 DNA에 연결하여 제조할 수 있다. 바람직하게 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100이 분해하여 제거할 수 있는 DNA 라면 특별한 제한 없이 본 발명의 범위에 포함된다.

본원에서 용어 "토착 미생물"이라 함은, 주어진 환경에서 자연적으로 존재하는 미생물로, 당해 환경에서 양분을 획득 및 번식하는 미생물군을 포함하는 생태적 미생물상을 의미한다. 상기 미생물에는 조류(algae), 세균류(bacteria), 원생동물류(protozoa), 사상균류(fungi), 효모류(yeast) 등이 포함될 수 있다. 바람직하게는 접합, 형질전환, 형질도입 또는 나노채널 형성 등으로 외부의 유전자를 도입할 수 있는 미생물을 말한다.

본원에서 "재조합 DNA 전이 억제"라 함은, 유전자 변형 미생물이 가지고 있는 재조합 DNA가 접합, 형질전환, 형질도입 또는 나노채널 형성 등을 통하여 토착 미생물로 이동(transfer)되는 것을 방지하는 것을 의미한다. 바람직하게, 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100이 유전자 변형 미생물을 포식하거나 재조합 DNA를 분해함으로써 토착 미생물로 재조합 DNA가 이동하는 것을 방지하는 것을 포함한다.

바람직한 일 구현예로, 본 발명의 조성물은 토양, 토양 슬러리 또는 수계 환경에 유전자 변형 미생물이 유출되었을 경우, 이를 제거하기 위해 사용될 수 있다.

토양 슬러리 (Slurry)란 토양과 액체의 혼합물을 말하며, 토양 이외에 다른 불순물을 포함할 수 있다. 본 발명의 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100 균주가 토양 슬러리에 적용되는 경우, 포식 활성을 보다 높이기 위해서는 액체와 토양의 혼합 비율은 바람직하게 물 10ml을 기준으로 토양이 4g이하, 보다 바람직하게는 토양이 2g이하, 더욱 바람직하게는 토양이 1g이하로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 액체는 자연 환경에 존재할 수 있는 액체로, 바람직하게 물을 말하나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.

수계 환경이란 물이 존재하는 환경을 말하며, 자연적으로 물이 있는 하천, 강, 호수, 시냇가, 개울, 늪지, 우물 등 뿐만 아니라, 인공적으로 물이 있는 환경인, 하수처리시설, 공장폐수처리시설, 실험실, 화장실 등을 말하나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100 균주의 처리 기간은 토양, 토양 슬러리 또는 수계 환경에 존재하는 유전자 변형 미생물 및 재조합 DNA 를 제거하기에 충분한 기간 동안 처리할 수 있고, 이는 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 토양에 처리하는 경우 1일 이상, 보다 바람직하게는 4일 내지 8 일 동안 수행될 수 있고, 토양 슬러리에 처리하는 경우 1시간 이상, 보다 바람직하게는 24 내지 72시간 동안 수행될 수 있고, 수계 환경에서는 1시간 이상, 보다 바람직하게는 12 시간 내지 48시간 동안 수행될 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 일 구현예로, 본 발명의 조성물은 무산소 환경에 유전자 변형 미생물이 유출되었을 경우, 이를 제거하기 위해 사용될 수 있다.

무산소 환경이라 함은, 산소 농도가 희박하거나 존재하지 않는 환경으로, 수중에서는 용존산소(dissolved oxygen)가 희박하거나 없는 상태를 말한다. 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100 균주는 호기성 세균이므로 무산소 환경에서 포식 활성을 나타내지 못하나, 본 발명자들은 질산염이 존재하는 조건에서는 무산소 환경에서도 상기 균주가 재조합 균주를 포식할 수 있음을 확인하였다. 질산염으로는 질산칼륨(KNO₃), 질산철(Fe(NO₃)₂)등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, NO₃ ^－를 포함하는 화합물이면 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에 따른 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100을 포함하는 조성물은, 총 중량 100에 대하여 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100을 0.1중량% 내지 99.9 중량%로 포함할 수 있고, 물 또는 질산염 등 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100이 포식하기에 유리한 조건을 만들어 주는 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 토양 슬러리, 수계 환경 또는 무산소 환경 내의 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA를 제거하기 위하여, 델로비브리오 박테리오보루스 HD 100 를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 이용한 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA를 제거방법을 제공하며, 이를 이용하면, 토양 슬러리, 수계 환경 또는 무산소 환경 내의 유전자 변형 미생물 또는 재조합 DNA 제거함으로써 유전자 변형 미생물로부터 토착 미생물로의 재조합 DNA 전이 억제하여 재조합 균주와 야생의 미생물상 사이의 수평적인 유전자 전달의 가능성을 제한하는 것이 가능하다.

각 도면에서, Control은 대조군, Predated는 피식자인 E. coli MG1655/pAmCyan, Predator는 포식자인 B. bacteriovorus HD 100을 나타낸다.
도 1a는 수계 환경 내에서 48시간 동안 B. bacteriovorus HD 100의 재조합 대장균 개체군 포식에 의한 대장균 E. coli MG1655/pAmCyan의 CFU의 변화를 나타낸다. ***p < 0.001.
도 1b는 수계 환경 내에서 B. bacteriovorus HD 100의 재조합 대장균 개체군 포식에 의한 bla 및 cfp 유전자의 농도의 변화를 나타낸다. ***p < 0.001.
도 2는 포식자(B. bacteriovorus HD 100)가 첨가된 멸균된 토양(Sterile)과 멸균되지 않은 토양(Non-sterile)에서 살아있는 대장균 균주(E. coli strain MG1655/pAmCyan)의 CFU를 나타낸다. ***p < 0.001.
도 3은 B. 다른 양의 토양을 포함하는 토양 슬러리 내에서 bacteriovorus HD 100의 포식에 따른 재조합 대장균 개체군의 CFU 변화를 나타낸다. 토양의 양이 증가할수록 재조합 대장균 개체군에 대한 포식자의 포식능력이 감소함을 나타낸다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
도 4a는 토양 슬러리에서 1g, 2g 및 4g의 토양 샘플 내 포식자를 첨가하고 24시간 후 샘플 내 재조합 대장균 세포의 형광 사진을 나타낸다.
도 4b는 토양 슬러리에서 1g, 2g 및 4g의 토양 샘플 내 포식자를 첨가하고 48시간 후 샘플 내 재조합 세포의 형광 사진을 나타낸다.
도 5는 토양 존재 하 멸균된 HEPES 버퍼에 B. bacteriovorus HD 100을 첨가한 후 1시간 및 48시간 후 PFU(plaque-forming units)를 나타낸다.
도 6a 표준 플라스미드 DNA의 농도와 형질전환 후 집락 수의 상관관계를 나타낸다.
도 6b는 각각의 DNA 샘플에 대해 48시간 포식 후, DNA를 정제하여 형질전환 후 집락 수를 나타낸 것이다.
도 7a는 무산소 조건에서 다양한 질산염 농도(0, 1, 5, 10 및 20mM) 하 B. bacteriovorus HD 100의 대장균 포식에 의한 광학밀도(optical density)의 변화를 나타내고, '+HD 100'은 B. bacteriovorus HD 100이 첨가된 것을 나타낸다.
도 7b는 무산소 조건에서 다양한 질산염 존재 하 B. bacteriovorus HD 100의 대장균 48시간 포식 동안 CFU 변화를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험예 1. 재조합 대장균 균주의 증식

청록색 형관 단백질(cyan fluorescent protein, CFP)을 발현시킨 대장균 균주 MG1655/pAmCyan 를 이용하여 일련의 실험을 하였다. 이 균주는 -80℃에서 글리세롤에 냉동 보관하였고 필요 시 엠피실린(ampicillin)을 100mg/ml 포함하는 LB 한천 플레이트에 도말(streaking)하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 개개의 콜로니는 엠피실린(ampicillin)을 100mg/ml 포함하는 LB broth 3ml에 무균접종하여 250rpm, 30℃에서 12시간 동안 배양하였다. 배양한 샘플은 수계 및 토양 슬러리 샘플에 섞어 사용하였다.

실험예 2. B. bacteriovorus HD 100 준비 및 증식

B. bacteriovorus HD 100의 배양 시 대장균 균주 MG1655/pAmCyan를 피식자로 사용하였다. 대장균은 상기 언급한 LB broth(앰피실린, 100mg/ml)에서 배양 후, 1ml을 취하여 원심분리(16,000g, 1분)하였다. 상층액을 제거한 후, 대장균 펠릿(pellet)을 HEPES 버퍼(25 mM, pH 7.2) 9ml에서 다시 섞어주었다. 모든 포식 실험에서, MgCl₂와 CaCl₂를 HEPES 버퍼에 첨가하여 각각 최종 농도가 2mM 및 4mM이 되도록 하였다.

B. bacteriovorus HD 100는 -80℃에서 글리세롤에 냉동 보관하였다. 필요 시, 바닥 층(bottom layer)(15ml)에 1.2%의 한천(agar)과 상위층(top layer)(10ml)에 0.6%의 한천을 포함하는 희석한 영양 배지(10- fold dilution of nutrient broth, DNB)로 구성된 top agar plate 에서 배양하였다. 상위층의 준비를 위해, 1ml의 대장균 MG1655(12시간 LB 배양)을 녹은 top agar(45℃)에 첨가하였고, 이 현탁액을 응고된 바닥 한천 플레이트에 부었다. 상위층(top agar)이 응고 되면, 냉동 보관한, B. bacteriovorus HD 100 10ml을 도말(streaking) 하였다. 30℃에서 2일간 배양 후, 포식이 일어난 증거인 빈 공간이 있는 한천의 작은 조각을 무균상태에서 잘라내어 1ml의 HEPES 버퍼(25 mM, pH 7.2)로 옮겨 담았다. 이 샘플을 흔들어(voltex) 한천을 분산시키고 남아있는 대장균과 한천을 제거하기 위해 0.45mm 주사기 필터를 통해 여과하였다. 여과과정을 통해 준비한 1ml을 상기와 같이 준비한 대장균 MG1655의 재현탁액을 포함하는 9ml의 HEPES 버퍼에 참가하였다.

B. bacteriovorus HD 100의 계대배양(subculturing)을 위해, 포식된 배양액을 0.45mm 필터로 여과한 1ml을 상기 언급한 대장균 MG1655의 재현탁액을 포함한 9ml의 HEPES 버퍼에 첨가하였다. 이러한 방법으로 12시간 마다 계대배양 하였다. 포식자 배양물은 2-3주 마다 새롭게 준비하였다.

실시예 1. 토양 포식 실험

캠퍼스 근처 나무가 우거진 지역의 토양을 다양한 그물눈(mesh) 크기의 체를 이용하여 2mm보다 작은 입자를 가려내었다. 멸균상태의 토양을 준비하기 위해, 고온 고압에서 멸균(autoclave)하고 60℃의 오븐에서 2일동안 건조하였다. 건조 후에, 멸균된 50ml의 튜브(conical polypropylene tubes (SPL Labs, Korea)) 내에서 무게를 측정하고 즉시 사용하였다.

LB 배지에서 밤새 배양시킨 대장균 균주 MG1655/pAmCyan 4ml을 40g의 멸균된 토양과 멸균되지 않은 토양에 각각 첨가하였다. 샘플 내에 대장균을 분산시키기 위해 골고루 섞었다. 30℃에서 1시간 배양 후에, 준비한 B. bacteriovorus HD 100 배양액 8ml을 첨가하였다. 대조군에는, 포식자 없이 HEPES 버퍼 8ml만을 첨가하였다. 샘플 내 포식자를 분산시키기 위해 한번 더 골고루 섞었다. 샘플은 섞거나 흔들지 않은 상태로 30℃에서 배양하였다. 정해진 시간(1 시간, 1일, 2일, 4일 및 6일)에, 무균상태에서 1g의 토양샘플을 취하여 살아있는 대장균 균주 MG1655/pAmCyan의 수를 측정하였다. 이를 위해, 1g의 토양샘플을 10ml의 멸균 수에 넣고 20초간 섞어(voltex) 주었다. 현탁액은 단계적으로 희석하여 앰피실린을 포함하는 LB 한천 플레이트에 도말(spreading) 하였다. 30℃에서 밤새 배양 후, 콜로니 수를 측정하였다.

실시예 2. 수계 포식 실험

수돗물을 멸균기(autoclave)에서 20분동안 멸균하였다. 수돗물을 식힌 다음, LB 배지에 밤새 배양시킨 대장균 균주 MG1655/pAmCyan 1ml을 멸균처리 한 수돗물 10ml에 첨가하였다. 샘플(0.1 ml)을 취하여 단계적 희석과 도말(plating)을 통해 샘플 내 대장균 농도를 측정하였고, 그 농도는 평균 4ⅹ108 CFU/ml 이었다. 그 다음, 포식을 시작하기 위해 여과된 포식자 1ml을 첨가하였다. 최종 포식자 농도는 평균 4ⅹ10⁸cells/ml 이었고, 포식자와 먹이의 감염다중도(multiplicity of infection, MOI) 의 비는 1:1로 하였다. 30℃, 250rpm에서 48시간 동안 계속 배양하면서, 정해진 시간에 샘플을 취하여 포식자가 살아있는 재조합 개체군에 미치는 영향을 평가하였다.

또한, 24시간 및 48시간 샘플에 존재하는 플라스미드를 제조업체의 프로토콜에 따라 Plus Plasmid Mini Kit (Nucleogen, USA)을 사용하여 정제하고 50ml의 버퍼로 추출하였다. 이 샘플들은 형질전환이나 실시간 qPCR 분석에 필요할 때까지 -20℃에 보관하였다.

실시예 3. 토양 슬러리 포식 실험

LB 배지에서 밤새 배양한 대장균 균주 MG1655/pAmCyan 1ml(약 4ⅹ10⁹CFU)을 각각의 토양 샘플(1, 2 또는 4g)에 첨가하고 10ml의 살균한 수돗물을 첨가하였다. 토양과 세균은 30℃, 250rpm의 진탕배양기(shaking incubator)에서 1시간동안 혼합한 후에 포식자 B. bacteriovorus HD 100 1ml을 첨가하였다. 포식자와 피식자의 농도는 수계 포식 실험과 동일하게 하였다. 혼합한 배양액은 30℃에서 계속 진탕하였다.

포식자 첨가 직전(0시간)과 첨가 후 정해진 시간에, 토양 슬러리의 1ml을 취해서 엠피실린을 100mg/ml을 포함하고 있는 LB 한천 플레이트에 단계적 희석(plating serial dilutions)을 통해 살아있는 CFU를 측정하였다. 샘플 슬러리의 일부는 토양 DNA 정제와 형광 현미경 분석(fluorescent microscopy analyses)에 사용하였다.

실시예 4. 형광 현미경 이미지

칩(chips)의 모든 형광 현미경 사진은 Andor Luca 658 카메라에 연결되고 Metamorph software (v. 7.07, Molecular Devices, USA)에 의해 작동되는 반전 DIC/형광 현미경을 사용하여 촬영하였다. 토양 슬러리 내의 세균을 시각화하기 위해, 10ul을 슬라이드 글라스(glass slide)에 등분하고 커버 글라스(cover glass)로 덮었다. 이미지는 Metamorph software를 사용하여 20ⅹ렌즈(UPLFLN)로 촬영하였고 ImageJ의 분석에 사용하였다.

실시예 5. 토양 DNA 정제

토양 슬러리 0.25ml로부터 재조합 플라스미드를 포함한 전체 DNA를, 제조업체의 프로토콜에 따라 MoBio Soil DNA kit (USA)를 사용하여 정제하였다. 2ul 샘플을 사용하여, 각각 샘플의 DNA 농도를 나노드랍 분광광도계(Nano-Drop spectrophotometer)를 통해 측정하였고 필요 시까지 -20℃에 보관하였다.

실시예 6. 실시간 qPCR 을 통한 플라스미드 정량

수계 실험에서 정제한 DNA 샘플 내 플라스미드의 양은 엠피실린 저항성 유전자(bla)와 cfp 유전자의 프로브를 이용한 실시간 qPCR을 통해 측정하였다. 프라이머는 Tm을 58±1℃로 앰플리콘(amplicon)의 길이는 약 150-200bp로 디자인하였다. β-lactamase 유전자에 대한 프라이머 서열은 blaF-5' -AATAAATCATAAAGTGGGTTACATCGAACTGG-3'(서열목록 1)이고 blaR-5'-AATAAATCATAATCATGCCATCCGTAAGATGC-3'(서열목록 2)이다. 또한, cfp 프라이머에 대한 서열은 cfpF-5'-AATAAATCATAAGGAGTTGCTACAGCCAGTTG-3'(서열목록 3)이고 cfpR -5'-AATAAATCATAACATCTGTAATTGCCACCTCC-3'(서열목록 4)이다. 각각의 프라이머는 형광 반응 및 RT-PCR 실험(Afonina et al., 2007)의 신뢰도를 향상시키기 위해 5'을 포함하는 추가 서열 플랩(5'-AATAAATCATAA)을 포함하도록 디자인하였다.

모든 RT-qPCR은 ABI Biosystems (USA)의 SybrGreen Supermix를 사용하여 LightCycler (Roche, USA)로 분석하였다. 각각 반응용량은 20ul로 다음의 사이클링 프로그램으로 수행하였다: 95℃에서 5분간 반응 후 95℃에서 10초, 56℃에서 15초, 62℃에서 15초로 50회 반복하고 95℃에서 5초동안 분리(dissociation) 단계 후 65℃에서 1분 유지 후 0.11℃/s의 속도로 97℃까지 서서히 증가시켰다. SigmaPlot v.11을 이용하여 데이터 플롯(plot)을 준비하면서 Microsoft Excel로 데이터를 분석하고, TIFF 파일로 변환하여 내보냈다(export). 그 결과는 세 번의 반복실험에서 계산한 평균 농도와 독립한 샘플들 사이의 표준 편차를 나타낸다.

실시예 7. 형질전환

수계 및 토양 샘플의 플라스미드 DNA를 정제하여 제조업자의 프로토콜에 따라 HIT competent JM109 cells(RBC Biosciences, USA)로 형질전환 하였다. 형질전환된 세포를 양성 클론(clones) 선택을 위해 엠피실린 100mg/ml이 첨가된 LB 한천 플레이트에 도말하였다. 37℃에서 밤새 배양시킨 다음, 클론의 수를 측정하였다.

실시예 8. 질산염이 존재 하 무산소 조건에서의 포식

MgCl2과 CaCl2가 첨가된 HEPES 버퍼(20 ml, 25 mM, pH 7.2)를 60ml 시럼 병(serum bottle)에 등분하고 KNO₃ 형태의 질산염을 필요한 농도(0,1, 5, 10 또는 20 mM)로 첨가하였다. 산소를 제거하기 위해, 배지를 30분간 멸균 아르곤 가스로 처리한 후, 시럼 병을 밀폐하고 고온가압멸균(autoclave)하였다. 식힌 다음, 대장균 균주 MG1655/pAmCyan를 무균상태에서 첨가하였다. 이를 위해, 상기 언급한 바와 같이 LB 배지에서 밤새 배양한 피식자 샘플 2ml을 원심분리 하였다. 세포 펠릿은 1ml의 HEPES 버퍼에 재현탁하고 1ml의 주사기를 이용하여 각각의 시럼 병에 첨가하였다. 그 뒤에, 아르곤 처리된 포식자 배양액(culture) 1ml을 여과하여 포식(initiate predation)을 시작하기 위해 첨가하였다. 대조군 시럼 병에는 아르곤 처리된 HEPES 버퍼 1ml을 대신 첨가하였다. 포식 실험을 위하여, 배양액 샘플 1ml 취하여 광학 밀도 측정 및 살아있는 대장균 수를 측정하기 위한 도말(plating)에 사용하였다.

실시예 9. 데이터 분석

각각의 실험은 오류 분석을 위해 최소 세 번씩 수행하였다. 평균 값은 오차 막대로 표시된 표준편차와 함께 도면에 나타냈다. 결과는 GraphPad Prism 5.01의 unpaired, two-tailed student t-test를 이용하여 통계적으로 분석하였다.

실험결과

1. 수계에서 B. bacteriovorus 에 의한 살아있는 재조합 대장균 수의 감소

초기 포식 실험은 대장균 MG1655/pAmCyan 균주의 재조합 세균 배양액을 첨가한 물을 이용하여 수행하였다. 피식자 균주의 생존력(viability)는 48시간 동안 관찰하였고, 도 1a에 CFU 수를 나타내었다. 처음 12시간 동안, 6-log 이상의 생존도(viability) 감소와 더불어 대장균의 수가 급격하게 감소하였다. 개체군은 24시간 후에 평균 7 CFU/ml이 될 때까지 계속 감소하였다. 배양을 계속하면, 재조합 세균의 수는 다소 증가하여 48시간 배양 후에는 평균 180 CFU/ml를 나타내었다.

2. 수계 환경에서 포식에 의한 재조합 플라스미드 농도의 감소

본 발명에서, 각각의 샘플 내 플라스미드의 상대적인 농도를 측정하기 위하여 실시간 qPCR을 사용하였다. 결과는 도 1b에 나타내었다. 분석을 위해 플라스미드 내 청록색 형광 단백질을 암호화하는 cfp 유전자와 엠피실린 저항성 단백질을 암호화하는 bla 유전자를 이용하였다. 24시간 샘플에서 cfp와 bla 유전자의 농도는 정량적으로 유사하였는데, cfp 유전자와 bla 유전자 농도는 상대적으로 각각 856배와 715배 감소하였다. 유사하게, 48시간 샘플에서는 cfp 복제 유전자 수는 710배 감소하였고, bla 유전자는 865배 감소하였다.

3. 토양에서의 세균 포식의 효과

멸균하지 않은 토양 샘플을 사용하여 델로비브리오(Bdellovibrio)와 유사한 미생물, 원생생물, 선충과 같은 토착 포식자가 재조합 대장균의 생존에 미치는 영향을 평가하였다. 또한, 멸균 토양 샘플로 똑같이 병행 실험을 수행하여 포식자 첨가 시 구별되는 영향을 판단하였다. 6일까지는 포식자의 첨가나 토양의 멸균 여부가 살아있는 대장균 수에 에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 6일 후에, 멸균하지 않은 토양 샘플에서는 포식자를 첨가한 군이 대조군에 비하여 살아있는 대장균 수가 2배 더 감소했음에 반하여, 멸균한 토양 샘플에서는 포식자를 첨가한 군이 대조군에 비하여 살아있는 대장균 수가 11배 더 감소한 것으로 나타났다 (도 2).

4. 토양 슬러리에서 재조합 대장균의 포식

토양에서 포식을 통한 재조합 개체군의 감소에 최고의 조건을 결정하기 위해서, 동일한 양의 물을 갖는 다른 농도의 토양을 이용하여 특성 연구를 하였다. 토양의 양이 증가할수록, 포식에서 살아남은 대장균의 수도 증가하였다(도 3). 토양이 존재하는 경우, 포식자를 포함하는 물 10ml에 토양을 1g 첨가 시 가장 좋은 결과를 나타내었다. 이러한 조건에서, 살아있는 재조합 대장균의 수는 십만배까지 감소하였다. 대조적으로 4g의 토양을 첨가한 경우에는 포식이 방해받아 재조합 개체군에 대한 영향이 줄어들었다.

5. 형광 현미경을 통한 토양 입자에서 재조합 대장균 개체군의 감소 확인

포식에 의해 토양 대장균 개체군이 감소한 것을 형광 현미경을 통해 한번 더 확인할 수 있었다. 24시간 동안의 포식 실험에서 토양의 양이 1g 에서 4g으로 증가할수록 눈에 보이는 형광 대장균의 수도 증가하였다(도 4a). 대조적으로, 대조군 샘플에서 형광 세포의 수는 동일하게 남아있었다. 48시간 후에, 대조군은 상대적으로 변화가 없음에 반하여, 1g 또는 2g의 토양을 첨가한 샘플의 형광 세균은 유의적으로 감소하였다(도 4b). 이러한 결과는 1g의 토양 첨가가 포식에 대해 가장 적게 영향을 나타낸 도 3의 결과와 일치하였다. 마찬가지로, 2g의 토양을 첨가한 샘플은 포식을 방해받아 24시간 경과 시 반복 실험사이에 큰 변동성을 나타내었지만(도 3), 48시간 배양한 것은 대장균 생존도가 연속하여 80배 감소하였다(도 4b).

6. 토양 입자에 의한 포식 활동의 감소

포식 활성의 감소는 시간과 첨가된 토양의 양에 의해 결정되었다(도 5). 수계 샘플에서 살아있는 포식자 수, 즉, 플라크 형성 단위(plaque-forming units, PFU)는 실험기간 동안 200배 이상 감소하였다. 이러한 모든 실험은 피식자 없이 실시하였기 때문에, B. bacteriovorus HD 100의 굶주림(starvation)에 의해 생존도가 감소하였을지 모른다. 그러나, 토양의 존재는 이러한 활성의 더 빠른 감소를 일으켰다. 살아있는 포식자의 수는 토양이 첨가된 모든 샘플에서 단 1시간만에 거의 65%까지 감소하였다. 48시간 샘플에서 PFU는 더 감소하였다. 1g의 토양으로 실험한 경우, 원래의 PFU 중 단 2%만이 남아있었다. 4g의 토양의 경우, PFU의 수는 0.05%까지 더 감소하였다. 비록 토양의 존재가 어떠한 메커니즘으로 살아있는 PFU 수를 감소시키는지, 즉, 포식자에 결합(binding), 포식자를 죽임(killing) 또는 어떤 방해 메커니즘인지 명백하지는 않으나, PFU 수의 빠른 감소와 감소의 정도로 보아 토양 입자의 존재가 B. bacteriovorus HD 100의 활성에 부정적인 영향을 미치는 것은 확실히 알 수 있었다.

7. 토양에서 포식에 의한 재조합 플라스미드 농도의 감소

수계 샘플과 같이, 본 발명의 주된 관심은 유전적으로 변형된 미생물이 환경으로 도입되었을 때 토착 토양 미생물과 일어나는 수평적인 유전자 전달의 가능성을 감소시키는 것이다. 그러나 수계 샘플과는 대조적으로, DNA 샘플 내 토양으로부터의 방해요인(inhibitor) 때문에 RT-qPCR을 실시하지 못하였다. 그에 따라, 토양 DNA 샘플 내 재조합 플라스미드의 양은 대장균을 형질전환하고 CFU를 계수함으로써 측정하였다. 비교를 위해, 수계 실험에서 정제한 플라스미드로도 실험하였다.

포식자를 첨가하지 않은 대조군 샘플들은 평균 74,000의 형질전환체(transformant)로 샘플 사이에 유의적인 차이가 없었다. 그러나, 48시간 동안 B. bacteriovorus HD 100의 포식한 경우 콜로니 수가 698배 감소하였다. 마찬가지로, 1g의 오염된 토양을 처리하였을 때 콜로니가 170배 감소하였다(도 6b). 2g의 토양이 존재 시, 형질전환 가능한 플라스미드가 2.7배 감소함에 따라 콜로니가 평균 25,000으로 감소한 반면에, 4g의 토양이 존재할 때 감소가 없어, 토양의 양이 높아짐에 따라, 플라스미드 제거 정도가 감소하였다. 이러한 결과는 포식을 최적화하고 포식자의 재조합 개체군과 DNA를 제거하는 능력을 향상시키기 위해서 적절한 수계 환경이 필요함을 다시 한 번 보여주는 것이었다.

8. 무산소 조건에서 B. bacteriovorus 의 포식 가능성

B. bacteriovorus HD 100이 질산염이 존재하는 무산소 조건에서 포식이 가능한지 판단하기 위하여, 멸균 아르곤 처리된 HEPES 버퍼 내에서 대장균을 피식자로 하여 수계 실험을 한번 더 수행하였다. 질산염이 첨가되지 않은 배양액의 광학 밀도는 변하지 않은 채로 남아있었고, B. bacteriovorus HD 100이 첨가된 경우에도 동일하였다. 그러나, HEPES 버퍼에 질산염이 첨가되었을 때, B. bacteriovorus HD 100이 대장균을 포식하는 것을 알아내었다(도 7a). 최소 1mM부터 포식이 시작되었고 5mM에서 최대속도를 보였으나, 모든 질산염 농도에서 48시간 후에는 비슷한 광학 밀도를 나타내었다.

각각의 샘플에서 살아있는 대장균 세포 수는 도 7b에 나타내었다. B. bacteriovorus HD 100 이 첨가되지 않은 대조군 샘플들에서 CFU 수는 모두 비슷하였다. 질산염이 첨가된 조건에서 포식자의 첨가는 살아있는 대장균 수를 각 샘플마다 비슷한 수준으로 감소시켰다. 도 7a에서 알 수 있듯이, 질산염 없이 한 실험은 생존도 감소가 없었고, 이는 질산염이 없는 무산소 조건에서 B. bacteriovorus HD 100은 대장균을 포식하지 못함을 나타낸다. 결과적으로, 질산염 존재 하 무산소 조건에서 B. bacteriovorus HD 100이 포식가능함을 보여주었다.

<110> UNIST Academy-Industry Research Corporation <120> Composition comprising Bdellovibrio bacteriovorus HD 100 for removing genetically modified microorganism or recombinant DNA and using the same <130> DPP20132015 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blaF primer <400> 1 aataaatcat aaagtgggtt acatcgaact gg 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blaR primer <400> 2 aataaatcat aatcatgcca tccgtaagat gc 32 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cfpF primer <400> 3 aataaatcat aaggagttgc tacagccagt tg 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cfpR <400> 4 aataaatcat aacatctgta attgccacct cc 32

Claims

델로비브리오 박테리오보루스(Bdellovibrio bacteriovorus) HD 100 (NCBI Genbank 등록번호 BX842601.2)를 포함하는,
물 10ml을 기준으로 토양이 0g 초과 2g 이하가 포함된 토양 슬러리 내에서, 청록색 형광 단백질을 암호화하는 cfp 유전자 및 엠피실린 저항성 단백질을 암호화하는 bla 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균 MG1655의 제거 및 상기 재조합 플라스미드의 제거용 조성물.
삭제
델로비브리오 박테리오보루스(Bdellovibrio bacteriovorus) HD 100 (NCBI Genbank 등록번호 BX842601.2)를 포함하는,
수돗물 내에서, 청록색 형광 단백질을 암호화하는 cfp 유전자 및 엠피실린 저항성 단백질을 암호화하는 bla 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균 MG1655의 제거 및 상기 재조합 플라스미드의 제거용 조성물.
삭제
삭제
삭제
델로비브리오 박테리오보루스 HD 100 (NCBI Genbank 등록번호 BX842601.2) 및 질산염을 포함하는,
무산소 환경 내에서, 청록색 형광 단백질을 암호화하는 cfp 유전자 및 엠피실린 저항성 단백질을 암호화하는 bla 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 MG1655의 제거용 조성물.
삭제
제1항의 조성물을 물 10ml을 기준으로 토양이 0g 초과 2g 이하가 포함된 토양 슬러리에 처리하는 단계를 포함하는,
토양 슬러리 내에서, 청록색 형광 단백질을 암호화하는 cfp 유전자 및 엠피실린 저항성 단백질을 암호화하는 bla 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균 MG1655을 제거 및 상기 재조합 플라스미드를 제거하는 방법.
삭제
제9항에 있어서, 상기 토양 슬러리에 처리하는 단계는 24 내지 72시간 동안 수행되는 것인, 방법.
삭제
제3항의 조성물을 수돗물에 처리하는 단계를 포함하는,
수돗물 내에서, 청록색 형광 단백질을 암호화하는 cfp 유전자 및 엠피실린 저항성 단백질을 암호화하는 bla 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균 MG1655을 제거 및 상기 재조합 플라스미드를 제거하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 수돗물에 처리하는 단계는 12 내지 48시간 동안 수행되는 것인, 방법.
삭제
제7항의 조성물을 무산소 환경에 처리하는 단계를 포함하는,
무산소 환경 내에서, 청록색 형광 단백질을 암호화하는 cfp 유전자 및 엠피실린 저항성 단백질을 암호화하는 bla 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 대장균 MG1655을 제거하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 무산소 환경에 질산염의 농도가 1 내지 5mM이 되도록 처리하는 단계를 더 포함하는, 방법.
제16항에 있어서, 상기 처리하는 단계는 24 내지 72시간 동안 수행되는, 방법.