KR101556765B1 - Novel compound and Antibiotic Composition comprising the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 항생활성 화합물 및 그 화합물을 포함하는 항생 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 미생물 지질합성을 저해하는 화합물 및 그 화합물의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to novel antibiotic active compounds and antibiotic compositions comprising the compounds, and more particularly to compounds and their use for inhibiting microbial lipid synthesis.
Description
본 발명은 신규한 항생활성 화합물 및 그 화합물을 포함하는 항생 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 미생물 지질합성을 저해하는 화합물 및 그 화합물의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to novel antibiotic active compounds and antibiotic compositions comprising the compounds, and more particularly to compounds and their use for inhibiting microbial lipid synthesis.
전세계적으로 감염성 질병을 치료하기 위해 항생제를 사용하는 것이 지난 수 십년간 현저히 증가하였다. 1954년에, 미국에서만 이백만 파운드의 항생제가 생산되었다. 오늘날, 그 수치는 오천만 파운드를 넘어섰다. 중앙 질병 통제 센터(CDC)에 따르면, 사람들은 연간 2억 3천 5백만개의 항생제를 소비하고 있는 실정이다.The use of antibiotics to treat infectious diseases worldwide has increased significantly over the past several decades. In 1954, only two million pounds of antibiotics were produced in the United States. Today, the figure has exceeded 50 million pounds. According to the Centers for Disease Control (CDC), people consume 235 million antibiotics a year.
항생제의 만연된 남용 또는 과용으로 항생제 내성이 길러지고 있으며, 이는 심각한 공중 위생 문제에 기여한다. 항생제 내성은 감염을 야기하는 박테리아가 감염을 중지하고자 사용한 항생제에 의해 구제되지 않을때 생긴다. 박테리아는 살아남게 되고 증식하여 더 해로워진다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)는 역학적으로, 반코마이신 항생제에 만족할만하게 반응하는 병원으로부터 감염되는 주 요인이다. 그러나, 최근 많은 스타필로코쿠스 아우레우스 균주가 반코마이신에 내성이 있는 것으로 나타났다. 더우기, 부분적으로 항생제에 대한 세균 내성때문에 결핵과 같은 일부 전염성 질병의 사망율이 다시 증가하고 있다.Pervasive abuse or overuse of antibiotics increases antibiotic resistance, contributing to serious public health problems. Antibiotic resistance occurs when the bacteria causing the infection are not rescued by the antibiotic used to stop the infection. Bacteria survive, multiply, and become more harmful. For example, Staphylococcus aureus is epidemiologically the main factor that infects a hospital that responds satisfactorily to vancomycin antibiotics. However, many Staphylococcus aureus strains have recently been shown to be resistant to vancomycin. Moreover, the mortality rate of some infectious diseases such as tuberculosis is increasing again due to bacterial resistance to antibiotics, in part.
항생제는 세균 감염을 치료하기 위해 치료적으로 사용되고 있다. 그의 작용 기전에 따라 분류되는 다수 타입의 항생제가 현재 이용되고 있다. 알려진 타입의 항생제에는, 예컨대 세포벽 합성 저해제, 세포막 저해제, 단백질 합성 저해제 및 DNA 또는 RNA 합성에 영향을 미치거나 이에 결합하는 저해제가 포함된다.Antibiotics are being used therapeutically to treat bacterial infections. Many types of antibiotics are currently used that are classified according to their mechanism of action. Known types of antibiotics include, for example, cell wall synthesis inhibitors, cell membrane inhibitors, protein synthesis inhibitors, and inhibitors that affect or bind DNA or RNA synthesis.
베타 락탐 항생제와 같은 세포벽 합성 저해제는 일반적으로 세균성 펩티도글리칸의 일부 합성 단계를 저해한다. 페니실린은 일반적으로 비내성 연쇄구균(streptococcus), 임균(gonococcus) 및 포도상구균(staphylococcus)에 효과적이다. 아목시실린 및 암피실린은 그램-음성균에 광범한 스펙트럼을 나타낸다. 세팔로스포린이 외과적 예방조치 및 그램-음성균에 대한 페니실린 대체물로 일반적으로 사용되고 있다. 모노박탐은 앨러지성 개체 치료에 일반적으로 유용하다.Cell wall synthesis inhibitors such as beta-lactam antibiotics generally inhibit some synthetic steps of bacterial peptidoglycan. Penicillin is generally effective against non-resistant streptococcus, gonococcus, and staphylococcus. Amoxicillin and ampicillin represent a broad spectrum of gram-negative bacteria. Cephalosporin is commonly used as a surgical precautions and penicillin replacement for gram-negative bacteria. Monobactam is generally useful for allergic subjects.
세균-관련 질병 및 장애 치료에 사용하기에 적합한 다수의 항생제가 예컨대 The Physician's Desk Reference(PDR),Medical Economics Company(Montvale, NJ),(53rd Ed.), 1999; Mayo Medical Center Formulary, Unabridged Version, Mayo Clinic(Rochester, MN), January 1998; Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals,(11th Ed. ), Merck & Co., Inc.(Rahway, NJ), 1989; University of Wisconsin Antimicrobial Use Guide,http://www.medsch. wisc.edu/clinsci/5amcg/amcg.html: Introduction on the Use of the Antibiotics Guideline, of Specific Antibiotics Classes, Thomas Jefferson University, http://jeffiine.tju.edu/CWIS/OAC/antibiotics guide/intro.html;에 공지되고 개시되었다.A number of antibiotics suitable for use in the treatment of bacterial-related diseases and disorders are described, for example, in The Physician's Desk Reference (PDR), Medical Economics Company (Montvale, NJ), (53rd Ed.), 1999; Mayo Medical Center Formulary, Unabridged Version, Mayo Clinic (Rochester, MN), January 1998; Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, (11th Ed.), Merck & Co., Inc. (Rahway, NJ), 1989; University of Wisconsin Antimicrobial Use Guide, http: //www.medsch. wisc.edu/clinsci/5amcg/amcg.html: Introduction on the Use of the Antibiotics Guideline, of Specific Antibiotics Classes, Thomas Jefferson University, http://jeffiine.tju.edu/CWIS/OAC/antibiotics guide / intro.html Lt; / RTI >
Xoo0880인, fabD는 Xoo의 가장 중요한 약물 타겟 효소 중 하나이다. FabD 유전자는 Malonyl-CoA-acyl carrier protein transacylase (MCAT) 효소(EC 2.3.1.39)를 발현한다. 이 단백질은 박테리아의 타입 II 지방산 합성에서 malonyl-ACP 중간체를 형성하는 홀로-아실 운반 단백질에 말로닐 부위를 전달한다 (Ruch, F. E., and Vagelos, P. R. (1973). J Biol Chem 248, 8086-94.). 이 중간체인 malonyl-ACP는 지방산 합성의 연장 단계에서 두개의 탄소를 제공한다. 지방산 합성(FAS)은 생명체의 생존에 필수적이다 (Magnuson, K., Jackowski, S., Rock, C. O., and Cronan, J. E., Jr. (1993). Micro biol Rev 57, 522-42.; White, S. W., Zheng, J., Zhang, Y. M., and Rock (2005). Annu Rev Biochem 74, 791-831.), MCAT는 아실 체인의 길이가 탄소 두개단위로 연장되는 것을 돕는다. 또한 MCAT는 아실-ACP 싸이오에스테르를 형성하여 tetracyclines 및 erythromycins과 같은 2차 대산산물의 가장 큰 부문 중 하나를 생산하는 생산하는 폴리케타이드 생합성에 관여하는 것으로 보고되었다 (Keatinge-Clay, A. T. 등 (2003). Structure 11, 147-54.; Summers, R. G. 등 (1995). Biochemistry 34, 9389-402.). 따라서, FAS 과정에서 관여하는 효소들중 박테리아 대사 활성에서 MCAT는 필수적인 효소로 간주되고, 항박테리아 약물의 개발을 위한 잠재적인 약 타겟으로 이용된다 (Campbell, J. W. and Cronan, J. E. Jr. (2001). J Bacteriol. 183, 5982-90.; Miesel, L., J. Greene, and T.A. Black. (2003). Nature. 4, 442-456.; White, S. W. 등 (2005). Annu Rev Biochem 74, 791-831.).FabD, which is Xoo0880, is one of Xoo's most important drug targeting enzymes. The FabD gene expresses the Malonyl-CoA-acyl carrier protein transacylase (MCAT) enzyme (EC 2.3.1.39). This protein transfers the malonyl moiety to the holo-acyl transfer protein, which forms the malonyl-ACP intermediate in bacterial type II fatty acid synthesis (Ruch, FE, and Vagelos, PR (1973). J Biol Chem 248 , 8086-94 .). This intermediate, malonyl-ACP, provides two carbons at the extended stage of fatty acid synthesis. Fatty acid synthesis (FAS) is essential for the survival of organisms (Magnuson, K., Jackowski, S., Rock, CO, and Cronan, JE, Jr. (1993) Microbiol Rev 57 , 522-42; SW, Zheng, J., Zhang, YM, and Rock (2005) Annu Rev Biochem 74 , 791-831). MCAT helps extend the length of the acyl chain to two carbon units. It has also been reported that MCAT is involved in polyketide biosynthesis that produces acyl-ACP thioester to produce one of the largest moieties of secondary metabolites such as tetracyclines and erythromycins (Keatinge-Clay, AT et al. 2003), Structure 11 , 147-54, Summers, RG et al. (1995), Biochemistry 34 , 9389-402). Thus, among the enzymes involved in the FAS process, MCAT is considered to be an essential enzyme in bacterial metabolism and is used as a potential drug target for the development of antibacterial drugs (Campbell, JW and Cronan, JE Jr. (2001). J Bacteriol, 183 , 5982-90 .; Miesel, L., J. Greene, and TA Black, 2003. Nature , 4 , 442-456; White, SW et al ., (2005) Annu Rev Biochem 74 , 791 -831.).
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항생활성을 가지는 화합물을 제공하는 것이다.Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made in view of the above-mentioned needs, and an object of the present invention is to provide a compound having antibiotic activity.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a composition comprising said compound.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 화학식 1 내지 화학식 4 중 어느 하나의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
In order to achieve the above object, the present invention provides a compound of any one of formulas (1) to (4) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[화학식 1][Chemical Formula 1]
[화학식 2](2)
[화학식 3](3)
[화학식 4]
[Chemical Formula 4]
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화합물은 말로닐-CoA: 아실 캐리어 프로틴 트랜스아실레이즈(MCAT) 활성을 저해하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the compound inhibits malonyl-CoA: acyl carrier protein transactase (MCAT) activity, but is not limited thereto.
또 본 발명은 상기 본 발명의 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 병원균에 의한 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating infection by a pathogenic bacterium comprising the compound of any one of Chemical Formulas 1 to 4 of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 화합물 및 사료학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 병원균에 의한 감염 예방 또는 치료용 사료 조성물을 제공한다.The present invention also provides a feed composition for preventing or treating infection by a pathogenic bacterium comprising the compound of any one of formulas 1 to 4 of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
또 본 발명은 상기 본 발명의 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 감염 예방 또는 치료용 농약 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pesticidal composition for preventing or treating infection, which comprises the compound of any one of Chemical Formulas 1 to 4 of the present invention and a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 미생물 지질 합성 저해 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.In one embodiment of the present invention, the composition preferably has a microbial lipid synthesis inhibitory activity, but is not limited thereto.
또한 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise pharmaceutically acceptable excipients, carriers, diluents and the like.
본 발명에서 사용가능한 담체로는 리포좀, 다당, 폴리락트산, 폴리글리콜산,중합체성아미노산, 및 아미노산 공중합체와 같이 천천히 대사되는 거대분자를 들 수 있다. 예를 들면, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트와 같이 무기산의 염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트와 같은 유기산의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 염; 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체, 및 수화제, 유화제 또는 pH 완충 물질과 같은 보조적 물질을 사용할 수 있다.Examples of carriers that can be used in the present invention include macromolecules that are slowly metabolized, such as liposomes, polysaccharides, polylactic acid, polyglycolic acid, polymeric amino acids, and amino acid copolymers. Salts of inorganic acids such as, for example, hydrochloride, hydrobromide, phosphate and sulfate; Pharmaceutically acceptable salts such as salts of organic acids such as acetate, propionate, malonate and benzoate; Liquids such as water, saline, glycerol and ethanol, and auxiliary materials such as wetting agents, emulsifying agents or pH buffering substances may be used.
약제학적으로 허용가능한 담체에 관해서는 문헌 [Remingtion's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 1991]에 기재되어 있다.Pharmaceutically acceptable carriers are described in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, 1991.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제, 바람직하게는 화합물 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 수막강내, 심실내, 폐, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 소화관내, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.In addition, the composition may be formulated into a unit dosage form suitable for intra-body administration of a patient according to a conventional method in the pharmaceutical field, preferably a formulation useful for administration of a compound drug, Or intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, pulmonary, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual, vaginal or rectal But are not limited to, the parenteral route of administration.
세균 치료에 유효한 화합물 용량은 1일 수용체 체중 1kg 당 약 0.1 내지 50 0mg 또는 0.1 내지 200 mg,보다 일반적으로 수용체 체중 1 kg 당 1일 0.1 내지 약 100mg 이다. 약제학적으로 허용되는 염 및 프로드럭의 유효 용량 범위는 전달되는 모 화합물의 중량에 기초하여 산출될 수 있다. 염 또는 프로드럭이 자체적으로 활성을 나타내는 경우, 유효 용량은 염 또는 프로드럭의 중량을 이용하여 상기 언급된 바와 같이, 또는 당업자들에 공지된 다른 수단에 의해 추정될 수 있다.Effective compound doses for bacterial therapy are from about 0.1 to about 50 mg or from 0.1 to 200 mg per kilogram of body weight per day of receptor body, more typically from about 0.1 to about 100 mg per kilogram of body weight per day of receptor body. The effective dose range of the pharmaceutically acceptable salts and prodrugs can be calculated based on the weight of the parent compound delivered. If the salt or prodrug exhibits activity on its own, the effective dose can be estimated as described above using the weight of the salt or prodrug, or by other means known to those skilled in the art.
경구 치료 투여의 경우, 활성 화합물은 하나 이상의 부형제와 배합되어 섭취가능한 정제, 협측 정제, 트로키, 캅셀, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 와퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. For oral therapeutic administration, the active compounds may be used in the form of tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wipers etc. in combination with one or more excipients.
정제, 트로키제, 환제, 캅셀제 등은 하나 이상의 하기 성분을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들어 미정질 셀룰로즈, 트라가칸트검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 인산이칼슘, 전분 또는 락토스; 붕해제, 예를 들어 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 프리모겔(Primogel) 등; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes); 활제, 예를 들어 콜로이드성 이산화규소; 감미료, 예를 들어 수크로스, 프럭토스, 락토스, 사카린 또는 아스파탐; 향미제, 예를들어 페퍼민트, 메틸살리실레이트, 윈터그린 오일 또는 체리향; 및 펩티드 항균제, 예를 들어 엔부비르타이드(FuzeonTM).Tablets, troches, pills, capsules etc. may contain one or more of the following ingredients: binders such as microcrystalline cellulose, tragacanth gum, acacia, corn starch or gelatin; Excipients such as dicalcium phosphate, starch or lactose; Disintegrants such as corn starch, potato starch, alginic acid, Primogel and the like; Lubricants such as magnesium stearate or Sterotes; Lubricants such as colloidal silicon dioxide; Sweeteners such as sucrose, fructose, lactose, saccharin or aspartame; Flavorings such as peppermint, methyl salicylate, wintergreen oil or cherry flavor; And peptide antimicrobials such as Enbuviride (Fuzeon (TM)).
단위 제형이 캅셀제인 경우, 이는 상기 타입의 물질 이외에, 식물성 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 기타 다양한 물질이 코팅제로 또는 고체 단위 제형의 물리적 형태를 변경시키기 위하여 존재할 수 있다.When the unit dosage form is a capsule, it may contain a liquid carrier such as vegetable oil or polyethylene glycol, in addition to materials of this type. Various other materials may be present as coatings or to modify the physical form of the solid unit dosage form.
본 발명의 약제학적 조성물은 직장 투여용으로 적합한 제제로 제조, 포장 또는 시판될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 좌제, 정체 관장 제제 및 직장 또는 결장 세척용 용액 형태일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 질 투여용으로 적합한 제제로 제조, 포장 또는 시판될 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들어, 좌제, 함입 또는 코팅된 질 삽입용 물질, 예컨대 탐폰, 세척 제제, 질 세척용 용액 형태일 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be manufactured, packaged, or marketed as a formulation suitable for rectal administration. Such compositions may be, for example, in the form of suppositories, rectal preparations and solutions for rectal or colon cleansing. The pharmaceutical composition of the present invention may also be manufactured, packaged, or marketed as a formulation suitable for vaginal administration. Such compositions may be, for example, in the form of suppositories, implants or coated vaginal inserts such as tampons, detergents, solutions for vaginal cleaning.
본 발명의 약제학적 조성물은 눈에 투여하기에 적합한 제제로 제조, 포장 또는 시판될 수 있다. 국소 투여의 경우, 본 발명의 화합물은 순수한 형태, 즉 액체로 적용될 수 있다. 그러나, 전형적으로, 화합물은 피부과적으로 허용되는 담체와 배합된 조성물 또는 제제로서 피부에 투여될 수 있다. 유용한 고체 담체는 미분 고체, 예컨대 활석, 점토, 미결정성 셀룰로즈, 실리카, 알루미나 등을 포함한다. 유용한 액체 담체는 물, 알콜, 글리콜, 및 두개 이상의 이들 혼합물을 포함하며, 이때 본 발명의 화합물은 임의로 비독성 계면활성제를 사용하여 유효 수준으로 용해 또는 분산될 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention may be manufactured, packaged, or marketed as a formulation suitable for administration to the eye. For topical administration, the compounds of the present invention can be applied in pure form, i.e., as a liquid. Typically, however, the compound may be administered to the skin as a composition or formulation combined with a dermatologically acceptable carrier. Useful solid carriers include finely divided solids such as talc, clay, microcrystalline cellulose, silica, alumina and the like. Useful liquid carriers include water, alcohols, glycols, and mixtures of two or more thereof, wherein the compounds of the present invention may optionally be dissolved or dispersed to an effective level using a non-toxic surfactant.
본 발명에 따른 농약 조성물은 다른 추가의 성분, 예컨대 농업적으로 허용되는 지지체, 담체 또는 충전제를 추가로 포함할 수 있다.The pesticidal composition according to the present invention may further comprise other additional components such as an agriculturally acceptable support, carrier or filler.
본 명세서에서, "지지체"란 용어는, 특히 식물의 일부에 적용이 용이하도록 하기 위해 활성 물질이 결합되는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 물질을 나타낸다. 따라서, 이 지지체는 일반적으로 불활성이고 농업적으로 허용적이어야 한다. As used herein, the term "support " refers to a natural or synthetic organic or inorganic material to which the active material is bound, in particular to facilitate its application to parts of plants. Thus, this support should be generally inert and agriculturally acceptable.
지체는 고체 또는 액체일 수 있다. 적절한 지지체의 예에는, 점토, 천연 또는 합성 실리케이트, 실리카, 수지, 왁스, 고체 비료, 물, 알콜, 특히 부탄올, 유기 용매, 광유 및 식물성 오일 및 그 유도체가 포함된다. 상기 지지체의 혼합물도 사용될 수 있다.The retard can be solid or liquid. Examples of suitable supports include clays, natural or synthetic silicates, silica, resins, waxes, solid fertilizers, water, alcohols, especially butanol, organic solvents, mineral oils and vegetable oils and their derivatives. Mixtures of the supports may also be used.
농약 조성물은 또한 다른 추가 성분을 함유할 수도 있다. 특히, 농약 조성물은 계면활성제를 추가로 함유할 수 있다. 계면활성제는 이온성 또는 비이온성 유화제, 분산제 또는 습윤제 또는 이들 계면활성제의 혼합물일 수 있다. 이들로는 예를 들어, 폴리아크릴산염, 리그노설폰산염, 페놀설폰산염 또는 나프탈렌설폰산염, 에틸렌 옥사이드와 지방 알콜 또는 지방산 또는 지방 아민과의 중축합물, 치환된 페놀(특히 알킬페놀 또는 아릴페놀), 설포숙신산에스테르염, 타우린 유도체(특히 알킬 타우레이트), 폴리옥시에틸화 알콜 또는 페놀의 인산 에스테르, 폴리올의 지방산 에스테르, 및 설페이트, 설포네이트 및 포스페이트 작용기를 가지는 상기 화합물들의 유도체를 들 수 있다. 활성 물질 및/또는 불활성 지지체가 수불용성이고, 적용을 위한 벡터 시약이 물인 경우, 일반적으로 적어도 하나의 계면활성제가 존재하는 것은 필수적이다. 바람직하게, 계면활성제 함량은 조성물의 5 내지 40 중량%일 수 있다.The pesticidal composition may also contain other additional ingredients. In particular, the pesticidal composition may further contain a surfactant. Surfactants may be ionic or nonionic emulsifiers, dispersants or wetting agents or mixtures of these surfactants. These include, for example, polyacrylates, lignosulfonates, phenol sulfonates or naphthalene sulfonates, polycondensates of ethylene oxide with fatty alcohols or fatty acids or fatty amines, substituted phenols (especially alkyl phenols or aryl phenols) , Sulfosuccinic ester salts, taurine derivatives (especially alkyl taurates), phosphoric esters of polyoxyethylated alcohols or phenols, fatty acid esters of polyols, and derivatives of the above compounds having sulfate, sulfonate and phosphate functionalities. When the active substance and / or inert support is water-insoluble and the vector reagent for application is water, it is generally necessary that at least one surfactant is present. Preferably, the surfactant content may be from 5 to 40% by weight of the composition.
추가 성분에는 또한, 예를 들어, 보호 콜로이드, 점착제, 증점제, 요변제(thixotropic agent), 침투제, 안정화제, 격리제가 포함될 수 있다. 더욱 일반적으로, 활성 물질은 통상적인 제제화 기술에 따라 임의의 고체 또는 액체 첨가제와 배합될 수 있다.Additional components may also include, for example, protective colloids, tackifiers, thickeners, thixotropic agents, penetrants, stabilizers, sequestering agents. More generally, the active material may be combined with any solid or liquid additive according to conventional formulation techniques.
일반적으로, 본 발명에 따른 농약 조성물은 0.05 내지 99%(중량), 바람직하게는 10 내지 70 중량%의 활성 물질을 함유할 수 있다.In general, the pesticidal composition according to the present invention may contain 0.05 to 99% (by weight), preferably 10 to 70% by weight of active substance.
본 발명에 따른 조성물은 에어로졸 디스펜서, 캡슐 현탁액, 냉무 농축물, 분제(dustable powder), 유화성 농축액, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 캡슐화 과립, 세립제, 종자 처리용 유동성 농축액, 가스(가압하), 가스 발생 제품, 과립, 온무 농축물, 거대과립, 미소과립, 오일 분산성 분말, 오일 혼화성 유동 농축액, 오일 혼화성 액체, 페이스트, 식물의 작은 대(plant rodlet), 건조 종자 처리용 분말, 농약으로 코팅된 종자, 가용성 농축액, 가용성 분말, 종자 처리용 용액, 현탁 농축물(유동성 농축액), 극소 용적(ultra low volume; ulv) 액,극소 용적(ulv) 현탁액, 수분산성 과립 또는 정제, 슬러리 처리용 수분산성 분말, 수용성 과립 또는 정제, 종자 처리용 가용성 분말 및 수화제와 같은 다양한 형태로 사용될 수 있다.The composition according to the present invention can be used as an aerosol dispenser, a capsule suspension, a chrysanthemum concentrate, a dustable powder, an emulsifiable concentrate, an oil-in-water emulsion, a water-in-oil emulsion, an encapsulated granule, a fine granule, a fluid concentrate for seed treatment, Oil-miscible liquids, oil-miscible liquids, pastes, plant rodlets, powders for dry seed treatment, etc.), gas generant products, granules, hotmelt concentrate, macrogranules, microgranules, oil dispersible powders, Suspension concentrates (fluid concentrates), ultra low volume (ulv) solutions, microvolume suspensions, water-dispersible granules or tablets, water-soluble granules or tablets, Water-dispersible powders for slurry treatment, water-soluble granules or tablets, soluble powders for seed treatment, and wettable powders.
이들 조성물은 분무 또는 살포 장치와 같은 적절한 장치를 이용하여 처리될 식물 또는 종자에 직접 적용할 중비가 되어 있는 조성물뿐 아니라, 작물에 적용되기 전에 희석되어야 하는 시판용 농축 조성물도 포함한다.These compositions include not only those compositions that are to be applied directly to plants or seeds to be treated using suitable equipment such as spraying or spraying equipment but also commercial concentrated compositions that must be diluted before application to crops.
본 발명의 농약 조성물은 작물의 식물병원성균의 치료적 또는 예방적 구제뿐만 아니라 곤충의 치료 또는 예방적 구제에 사용될 수 있다.The pesticidal composition of the present invention can be used for the therapeutic or prophylactic remedy of insects, as well as the therapeutic or prophylactic remedy of plant pathogenic bacteria of crops.
따라서, 본 발명의 추가적 측면에 따라, 상기 정의된 바와 같은 조성물의 유효한 비식물독성 양을 종자 처리,잎 적용, 줄기 적용, 또는 종자, 식물 및/또는 식물의 과실 또는 식물이 생장하고 있거나 이를 생장시키고자 하는 토양 및/또는 불활성 기재(예: 유기 기재(예: 모래, 암면, 유리울, 팽창성 광물(예: 펄라이트, 질석, 제올라이트, 팽창성 점토)), 속돌, 화쇄암 물질/응회암, 합성 유기 기재(예: 폴리우레탄), 유기 기재(예: 이탄, 퇴비,임목 폐기물(예: 코이어, 목재 섬유/칩, 나무 껍질)) 및/또는 액체 기재(예: 부유 수경 시스템, Nutrient Film Technique, Aeroponics)에 관주/점적(drench/drip) 적용(관개)을 통해 적용하는 것을 특징으로 하는, 작물의 식물병원성균을 치료적 또는 예방적으로 구제할 뿐만 아니라 곤충을 치료 또는 예방적으로 구제하는 방법이 제공된다.Accordingly, in accordance with a further aspect of the present invention there is provided a method for the treatment of seeds, leaves, stem application, or seed, plant and / or plant fruit or plant growth, (Eg, sand, rock wool, glass wool, expansive minerals such as pearlite, vermiculite, zeolite, expansive clay), plows, incineration rocks / tuff, synthetic organic matter (Eg, floats, compost, wood waste (eg coir, wood fiber / chip, bark)) and / or liquid substrates (eg float water systems, Nutrient Film Technique, A method of treating or prophylactically relieving insects as well as therapeutically or prophylactically rescue a phytopathogenic fungus of a crop, characterized in that it is applied through drench / drip application (irrigation) / RTI >
"유효한 비식물독성 양" 이란 표현은 작물에 존재하거나 그에 출현하기 쉬운 해충 및/또는 질병을 구제하거나 박멸하기에 충분하면서, 상기 작물에 어떤 상당한 식물독성 증상도 수반하지 않는 본 발명에 따른 조성물의 양을 의미한다. 이러한 양은 퇴치 또는 구제할 해충 및 질병, 작물의 종류, 기후 조건 및 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 화합물에 따라 광범위하게 변할 수 있다. 상기 양은 당업자들이 정할 수 있는 것으로, 조직적인 현장 실험으로 결정할 수 있다.The expression "effective non-phytotoxic amount" refers to the amount of a composition according to the invention which is sufficient to rescue or eradicate pests and / or diseases present or present in the crop and which does not involve any significant plant toxic symptoms It means quantity. This amount can vary widely depending on the insect and disease to be eliminated or remedied, the type of crop, the climatic conditions and the compound contained in the composition according to the present invention. The amount may be determined by those skilled in the art and may be determined by systematic field trials.
본 발명에 따른 처리 방법은 번식 물질, 예컨대, 괴경 또는 근경의 처리뿐만 아니라, 종자, 묘목 또는 이식 묘목 및 식물 또는 이식 식물의 처리에 유용할 수 있다. 상기 처리 방법은 또한 뿌리의 처리에도 유용할 수 있다. 본 발명에 따른 처리 방법은 또한 관련 식물의 본체, 줄기 또는 자루, 잎, 꽃 및 과실과 같은 식물의 지상 부위를 처리하는 데에도 유용할 수 있다.The treatment methods according to the present invention may be useful for the treatment of seeds, seedlings or transplanted seedlings and plants or grafted plants as well as treatment of propagation material such as tubers or rhizomes. The treatment method may also be useful in the treatment of roots. The method of treatment according to the present invention may also be useful for treating surface areas of plants such as the body, stem or sack, leaf, flower and fruit of the relevant plant.
본 발명의 방법에 의해 보호될 수 있는 식물로는 목화; 아마; 덩굴 식물(vine); 과실 또는 채소 작물, 묘목, 주요 작물, 예컨대 벼과 종(Graminae sp.)(예를 들어 옥수수, 잔디 또는 밀, 쌀, 보리 및 라이밀과 같은 곡물), 꽃, 원예 및 산림 작물; 뿐 아니라 이들 작물의 유전자적으로 변형된 상동체가 언급될 수 있다.Plants that can be protected by the method of the present invention include cotton; maybe; Vine; Fruit or vegetable crops, seedlings, major crops such as Graminae sp. (Eg corn, grass or wheat, cereals such as rice, barley and lime), flowers, horticulture and forest crops; As well as genetically modified homologues of these crops.
또한 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 첨가하여 이루어지는 사료 조성물은, 포유류, 조류,파충류, 양서류, 어류 등의 동물, 바람직하게는 포유류에 대한 사료로서 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 사료는 개, 고양이, 쥐 등의 애완 동물용 사료, 소, 돼지 등의 가축용 사료, 닭, 칠면조 등의 가금용 사료, 도미, 방어 등의 양식어용 사료 등으로서 사용되고, 바람직하게는 애완 동물용 사료 또는 가축용 사료로서 사용된다.In addition, the feed composition comprising the compound of the present invention or a salt thereof is used as feed for animals such as mammals, birds, reptiles, amphibians and fishes, preferably mammals. For example, the feed of the present invention is used as feed for pets such as dogs, cats, rats, cattle feed such as cows and pigs, feed for poultry such as chickens and turkeys, feed for breeding fish such as sea breams and defenses , Preferably used as feed for pets or feed for livestock.
본 발명의 사료는 사료 원료에 본 발명의 화합물 또는 그의 염을 적절하게 배합하여 만들 수 있다. 사료 원료로서는 곡물류, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 들 수 있다.The feed of the present invention can be prepared by appropriately compounding the compound of the present invention or a salt thereof in feed materials. Examples of feed materials include cereal grains, crude steel, vegetable oils, animal feedstuffs, other feedstuffs, and refined products.
곡물류로서는, 예를 들면 마이로, 밀, 보리, 귀리, 호밀, 현미, 메밀, 조, 수수, 피, 옥수수, 대두 등을 들 수 있다.Examples of cereals include maize, wheat, barley, oats, rye, brown rice, buckwheat, buckwheat, sorghum, blood, corn, soybeans and the like.
조강류로서는, 예를 들면 쌀겨, 탈지 쌀겨, 밀기울, 말분, 밀, 배아, 보리겨, 스크리닝, 펠렛, 옥수수겨, 옥수수 배아 등을 들 수 있다.Examples of the crude steel include rice bran, defatted rice bran, wheat bran, horse meal, wheat, embryo, barley bran, screening, pellets, corn bran, and corn embryo.
식물성 유박류로서는, 예를 들면 대두박, 콩가루, 아마박, 면실박, 낙화생 박, 홍화박, 야자박, 팜박, 호마박, 해바라기박, 유채박, 케이폭박, 겨자박 등을 들 수 있다.Examples of vegetable oils include soybean meal, soybean meal, flaxseed meal, cottonseed meal, groundnut meal meal, safflower meal, palm oil palm, palm oil, fomarak, sunflower oil, rapeseed meal, cowpea oil and mustard oil.
동물성 사료 원료로서는, 예들 들면 어분(북양 밀, 수입 밀, 홀 밀, 연안 밀), 피쉬솔불, 육분, 어골분, 혈분, 분해모, 골분, 가축용 처리 부산물, 페더 밀, 누에, 탈지 분유, 카제인, 건조 유장 등을 들 수 있다.Examples of raw animal feeds include fish meal (bean mill, imported wheat, hall mill, coastal wheat), fish shavings, meat meal, fish meal, blood meal, Casein, dry whey, and the like.
그 밖의 사료 원료로서는 식물 경엽류(알팔파, 헤이큐브, 알팔파잎 분말, 유사 아카시아 분말 등), 옥수수 가공 공업부산물(콘 글루텐, 밀, 콘 글루텐 피드, 콘스테이프리카 등), 전분 가공품, 설탕, 발효 공업 산물(효모, 맥주박, 맥아근,알코올박, 장유박 등), 농산 제조 부산물(감귤 가공박, 두부박, 커피박, 코코아박 등), 그 외(카사바, 잠두콩, 구아밀, 해조, 크릴, 스피룰리나, 클로렐라, 광물 등) 등을 들 수 있다.Examples of other feed materials include plant foliage (alfalfa, heukube, alfalfa leaf, and similar acacia powder), corn processing industry by-products (conglutin, wheat, conglutinfeed, constay prima etc.), starch products, (Cassava, bean curd, bean curd, bean curd, malt bean curd, alcohol bean curd, jangyu bean curd), agricultural production byproducts (citrus processing, tofu, coffee, cocoa, Krill, spirulina, chlorella, minerals, etc.).
정제품으로서는 단백질(카제인, 알부민 등), 아미노산, 당질(전분, 셀룰로오스, 슈크로우스, 글루코오스 등), 미네랄,비타민 등을 들 수 있다.Examples of the purified product include proteins (casein, albumin, etc.), amino acids, saccharides (starch, cellulose, sucrose, glucose, etc.), minerals and vitamins.
본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 ~ ug/ml 범위에서 박테리아 세포 성장을 저해하는 4종의 리드 화합물을 발견하였다.
As can be seen from the present invention, the present inventors have found four kinds of lead compounds which inhibit bacterial cell growth in the range of ~ ug / ml.
도 1은 타입 II 박테리아 지방산 합성 경로를 나타낸 그림이다.
도 2a는 정제 된 fabD (Xoo0880)의 SDS-PAGE 사진이고, 2b는 0.1 M CHES pH9.0, 1.5M NH4SO4, 및 0.2M NaCl에서 성장한 결정 사진이다.
도 3a는 XoMCAT의 전체 구조이고, 3b는 그것의 활성 부위의 상세도이다.
도 4는 특정 타겟 단백질에 대한 길항제 약물을 검색하기 위한 VLS 실험을 도식화한 그림이다.
도 5는 VLS로부터 유래한 선택된 화합물을 가지고 박테리아 세포 성장 저해 분석의 과정을 나타낸 그림이다. Figure 1 shows the synthesis pathway of Type II bacterial fatty acids.
FIG. 2A is an SDS-PAGE photograph of purified fab D (Xoo0880), and 2b is a crystal photograph of 0.1 M CHES pH 9.0, 1.5 M NH 4 SO 4 , and 0.2 M NaCl.
Figure 3a shows the overall structure of XoMCAT, and 3b is a detail view of its active site.
FIG. 4 is a diagram illustrating a VLS experiment for searching for an antagonist drug for a specific target protein. FIG.
FIG. 5 is a diagram showing a process of analyzing bacterial cell growth inhibition with a selected compound derived from VLS. FIG.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재한 것으로서 보 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.The present invention will now be described in more detail by way of non-limiting examples. The following examples are provided for the purpose of illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not construed as being limited by the following examples.
제조예: 본 발명의 화합물의 제조Preparation Example: Preparation of the compound of the present invention
본 발명에 사용된 화합물들은 미국 소재 ChemBridge Corporation(16981Via Tazon, Suite G, San Diego, CA, 92127, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 해당 회사 web site : http://www.chembridge.com/이다.
The compounds used in the present invention were purchased from ChemBridge Corporation (16981 Via Tazon, Suite G, San Diego, CA, 92127, USA) in the United States and are available from the company's web site: http://www.chembridge.com/ .
실시예 1:Example 1: Xanthomona soryzae Xanthomona soryzae pv. pv. oryzaeoryzae (Xoo)로부터 유래한 XoMCAT의 클로닝, 발현, 정제, 결정화, 결정 구조 결정Expression, purification, crystallization, crystal structure determination of XoMCAT derived from (Xoo)
클로닝 Cloning
Xoo0880의 FAD 코딩 서열을 주형으로 박테리아 세포 (Xoo KACC10331 균주) 유전체를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 통하여 증폭하였다. 올리고뉴크레오타이드 프라이머 서열들은 기존 보고된 유전자 서열에 기초하여 고안되었다 (Lee, B. M., 등 (2005) Nucleic Acids Res 33, 577-86.). 포워드 및 리버스 프라이머는 각각: 5'GGG GGG CAT ATG ACC GAA TCC ACT CTC GCC TTC A-3및 5'-GGG GGG GGA TCC TCA GTG GCC CCA CGC GTC GAG A-3' 으로 제작되었다. NdeI 및 BamHI 제한 부위는 볼드체로 표시하였다. 그 PCR 앰플리콘을 NdeI 및 BamHI로 이중 처리하고 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 pET11a 벡터(Novagen)에서 NdeI 부위 앞에 tobacco etch virus (TEV) 프로테이즈 절단 부위 및 6xHis의 부가 잔기를 가지게 고안된 변형된 pET11a 벡터(His-TEV-pET11a)로 라이게이션하였다.The FAD coding sequence of Xoo0880 was amplified by polymerase chain reaction using a bacterial cell (Xoo KACC10331 strain) as a template. Oligonucleotide primer sequences have been designed based on previously reported gene sequences (Lee, BM, et al. (2005) Nucleic Acids Res 33 , 577-86.). The forward and reverse primers were constructed as: 5'GGG GGG CAT ATG ACC GAA TCC ACT CTC GCC TTC A-3 and 5'-GGG GGG GGA TCC TCA GTG GCC CCA CGC GTC GAG A-3 'respectively. Nde I and Bam HI restriction sites are indicated in bold. The PCR amplicon was double-treated with Nde I and Bam HI and the tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site and an additional residue of 6xHis were added to the Nde I site in the pET11a vector (Novagen) in order to facilitate the purification of the expressed protein Lt; RTI ID = 0.0 > pET11a < / RTI > vector (His-TEV-pET11a).
과발현 및 정제 Over-expression and purification
Xoo0880의 코딩 서열을 포함하는 His-TEV-pET11a 발현벡터를 E.coli BL21(DE3)에 넣었다. 세포를 50㎍ /ml 앰피실린을 포함하는 Luria-Bertani 배지에서 OD600 가 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 성장시켰다. 단백질 발현은 배양액에 0.5 mM Isopropyl-베타-D-thiogalactopyranoside를 첨가하여 유도되었다. 유도 후에, 그 세포들을 같은 온도에서 추가적으로 16시간 배양하였다. 배양된 대장균을 277K에서 6,000 rpm에서 20분간 원심분리(Vision VS24-SMTi V5006A rotor)하여서 수집하였다. 그 후 수집된 대장균을 온도를 낮춘 세포 파쇄용 완충용액 A [25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10mM Imidazole]에 재부유하고 얼음 상에서 초음파(Sonomasher, S & T Science, Korea)를 사용하여 파쇄 하였다. 그 후 세포 추출물을 얻기 위해서 그 파쇄액을 277K, 12,000 rpm에서 30분간 원심분리 하였다 (Vision VS24-SMTi V508A rotor). 전체 발현된 Xoo0880의 단지 10%가 수용성 이었다 (도시 안함). 친화 정제법을 이용하기 위해 수용성 fabD를 포함하는 상등액을 Ni-NTA 레진(Novagen)에 로딩하였다. 친화 정제는 제조업자의 프로토콜에 따라서 4℃에서 수행되었다. 그 다음에 6xHis-tag이 있는 fabD 단백질을 200 mM 이미다졸을 포함하는 파쇄용 완충용액 A를 사용하여 용출하고, 6XHis-tag을 제거하기 위해서 4℃에서 TEV 프로테이즈로 하룻밤동안 처리하였다. 이렇게 처리된 단백질 용액을 4℃에서 완충용액 B [25 mM Tris-HCl pH 7.5, 15 mM NaCl]를 이용하여 6시간 동안 투석을 하고, UNO6 Q 컬럼(Bio-Rad)을 이용하여 추가적으로 정제하였다. SDS-PAGE를 사용하여 정제된 단백질의 순수도를 분석하였다(도 2). 그 정제된 단백질을 7 mg ml-1로 농축하였고 결정화 과정에 사용하였다.
A His-TEV-pET11a expression vector containing the coding sequence of Xoo0880 was introduced into E. coli BL21 (DE3). The cells were grown in Luria-Bertani medium containing 50 / / ml ampicillin at 37 째 C until OD 600 reached 0.5. Protein expression was induced by adding 0.5 mM Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside to the culture medium. After induction, the cells were incubated at the same temperature for an additional 16 hours. The cultured E. coli was collected by centrifugation (Vision VS24-SMTi V5006A rotor) at 277K for 20 minutes at 6,000 rpm. Then, the collected E. coli was resuspended in a temperature-lowered buffer for cell disruption A [25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazole] and sonicated in ice (Sonomasher, S & T Science, Korea) Lt; / RTI > Then, to obtain a cell extract, the disruption was centrifuged at 277K and 12,000 rpm for 30 minutes (Vision VS24-SMTi V508A rotor). Only 10% of the entire expressed Xoo0880 was water soluble (not shown). To use the affinity purification method, the supernatant containing the water-soluble fab D was loaded onto Ni-NTA resin (Novagen). The affinity purification was carried out at 4 캜 according to the manufacturer's protocol. The FabD protein with the 6xHis-tag was then eluted using a buffer A for disruption containing 200 mM imidazole and treated with TEV protease at 4 ° C overnight to remove the 6XHis-tag. The protein solution thus treated was dialyzed at 4 ° C. for 6 hours using buffer solution B [25 mM Tris-HCl pH 7.5, 15 mM NaCl], and further purified using a UNO 6 Q column (Bio-Rad). The purity of the purified protein was analyzed using SDS-PAGE (Fig. 2). The purified protein was concentrated to 7 mg ml -1 and used for crystallization.
결정화 및 X-레이 회절 데이터 수집Crystallization and X-ray diffraction data collection
XoMCAT의 결정화는 Crystal screen HT, Index HT, 및 Salt Rx HT (Hampton Research)와 같은 여러 스크리닝 키트를 사용하여 자동화된 피펫팅 시스템인 Hydra II e-drop (Matrix)를 통해서 수행되었고, 283K에서 고효율 [high throughput(HT)] 결정 스크리닝이 시작되었다. 처음에는 매우 얇은 바늘 모양 결정을 Wizard G-5 조건(0.1 M CHES pH9.5, 1.25M NH4SO4, 및 0.2M NaCl)로 얻었고, 변형된 조건 (0.1 M CHES pH9.0, 1.5M NH4SO4, 및 0.2M NaCl)에서 최적화 되었다. 행잉드롭 (hanging drops) 방법을 이용하여 재생되었으며, 일주일동안 결정들이 만들어졌다. 성장이 끝난 결정을 결정화 조건에 부동액 20% (v/v) 글리세롤을 첨가한 후 액체 질소에서 100K로 냉동하였고. 데이터 수집에 사용하였다. 일본 포톤 팩토리의 빔라인 17A에서 ADSC Quantum 270 CCD 디텍터를 사용하여 1.9 해상도까지 결정 데이터를 수집하였다. 데이터 세트를 통합하여서 DENZO 및 SCALEPACK를 사용하여 계산 하였다(Otwinowski, Z. and Minor, W. (1997). Methods Enzymol 276, 307-326.). 오토-인덱싱과정을 통해 P212121의 결정 공간 그룹과 단위 셀 파라미터 a=41.4,b=74.6,c=98.5가 추론되었다.
Crystallization of XoMCAT was performed through the Hydra II e-drop (Matrix) automated pipetting system using several screening kits such as Crystal screen HT, Index HT, and Salt Rx HT (Hampton Research) high throughput (HT)] determination Screening started. Initially, a very thin needle-like crystals Wizard G-5 obtained in conditions (0.1 M CHES pH9.5, 1.25 M NH 4 SO 4, and 0.2 M NaCl), the modified conditions (0.1 M CHES pH9.0, 1.5 M NH 4 SO 4 , and 0.2 M NaCl). They were reproduced using the hanging drops method, and crystals were made for a week. The grown crystals were frozen at 100 K in liquid nitrogen after addition of
XoMCAT의 결정 구조 및 그것의 활성부위 잔기는 도 3에 도시하였다. XoMCAT의 전체 구조는 더큰 도메인과 더 작은 도메인인 두 도메인으로 구성되고 안정적으로 폴드되었다. 그 활성 부위는 이들 도메인 사이에 협곡에 위치한다. 더 큰 도메인은 DSSP 프로그램 (Kabsch, W. and Sander, C. (1983). Biopolymers 22, 2577-637.)으로부터 계산된 12585Å2의 물분자가 접근 가능한 표면적을 가진 14개의 알파-나선 구조 및 8개의 베타-선형구조로 구성되어 있다. 뉴크레오필릭 활성화 잔기인 Ser-94은 더 큰 도메인의 알파-나선 구조 및 베타-선형구조 사이에 위치한 샤프 턴에 위치하였고 다른 활성 부위 잔기 Gln 13, Arg 119 및 His 203은 뉴크레오필릭 잔기 근처에 위치한다.
The crystal structure of XoMCAT and its active site residues are shown in Fig. The overall structure of XoMCAT consisted of two domains, a larger domain and a smaller domain, and folded reliably. The active site is located in the canyon between these domains. Larger domains were calculated from the DSSP program (Kabsch, W. and Sander, C. (1983). Biopolymers 22, 2577-637.) Water molecules of 12585 A 2 had 14 alpha-helical structures with accessible surface area and 8 Beta-linear structure. Ser-94, the nucleophilic activating residue, is located in the sharp turn located between the alpha-helical structure and the beta-linear structure of the larger domain and the other active site residues Gln 13, Arg 119 and His 203 are located near the nucleophilic residue Located.
실시예 2: 타겟 효소 XoMCAT에 대한 버츄얼 라이브러리 스크리닝(VLS) 과정Example 2: Virtual library screening (VLS) process for target enzyme XoMCAT
Xoo0880 (XoMCAT)은 GlaxoSmithKline (GSK)에 기반한 벼흰잎마름병에 대한 가능성있는 타겟된 유전자 중 하나이므로, 고효율(HT) 버츄얼 라이브러리 스크리닝(VLS, 도 4)을 통해 XoMCAT 효소의 기질 결합부위에 대한 길항적 약물 리드 화합물을 검색하였다. Since Xoo0880 (XoMCAT) is one of the potential target genes for rice blight blight based on GlaxoSmithKline (GSK), it is antagonistic to the substrate binding site of XoMCAT enzyme through high efficiency (HT) virtual library screening (VLS, The drug lead compound was searched.
약물 스크리닝을 위해 ICM Molsoft 모델링 슈트(suite)에 있는 1천8백만 화합물 데이터베이스를 이용하여 컴퓨터 모의실험인 VLS를 수행하였다. VLS중 Lipinski 공식을 통해 찾아진 화합물 데이터베이스에 존재하는 각각의 유연성을 갖는 구조의 기질을 ICM을 이용해 XoMCAT의 기질 결합 포켓 그리드로 도킹하였고, 복합체의 퀄리티를 반영한 스코어를 할당하였다. 각 기질 결합 결과의 재생성을 체크하기 위하여 동시에 병렬로 3회 수행하였다. 탑 스코어를 갖는 1991개의 화합물을 선택하여 각각의 그것의 복합체를 형태 상보성(shape complementarity), 수소 결합 네트워크 및 리간드의 유연성(flexibility)과 같은 계수로 가시화 (수치화) 하여 조사하였다. 실험적인 분석을 통해 특성화하기 위하여 상기 최종 선택 단계에 기초하여서 500 개의 화합물을 얻었다.
A computer simulation VLS was performed using a database of 18 million compounds in the ICM Molsoft modeling suite for drug screening. The substrate of each flexible structure present in the compound database found in the Lipinski formula of the VLS was docked to the substrate bonded pocket grid of XoMCAT using ICM and assigned a score reflecting the quality of the complex. In order to check the regeneration of each substrate binding result, they were simultaneously run in parallel three times. 1991 compounds with top scores were selected and their complexes were visualized (quantified) by coefficients such as shape complementarity, hydrogen bonding network and ligand flexibility. 500 compounds were obtained based on the final selection step for characterization through experimental analysis.
실시예 3:Xoo, Example 3: Xoo, E.coliE. coli , 및 , And pseudomonaspseudomonas ,에 대한 합성된 화학적 화합물의 박테리아 세포 성장 저해 분석 및 각 효과적인 스크리닝된 화합물의 MIC (최소 저해 농도) 측정, Analysis of bacterial cell growth inhibition of the synthesized chemical compounds against each other and measurement of MIC (minimum inhibitory concentration) of each effective screened compound
하룻밤 동안 배양된 3 ml의 Xoo를 100 ml의 NB 배지에 접종하였다. 박테리아 배양액을 OD600가 0.6에 도달할 때까지 배양하였다. 150 ㎕의 박테리아 배양을 VLS로부터 검색된 1mM의 스크리닝된 화합물을 포함하는 96 웰 ELISA 플레이트로 옮겼다. 화합물을 30 mM 농도의 스톡 화합물로 용해하는데 DMSO를 사용하였다. DMSO 농도는 모든 박테리아 성장 분석에 대하여 5% 이하로 유지하였고, 음성 대조군은 단지 동일한 농도의 DMSO를 사용하였다. 그 플레이트를 연속 진탕을 하면서 28에서 배양하고 흡광도 600 nm에서 0, 3, 6, 9, 및 12 시간의 일정한 간격으로 측정하였다. 그 화합물의 MIC50 값을 측정하기 위하여 50% 이상의 Xoo 성장을 저해하는 화합물들을 선택하였다.
3 ml of Xoo incubated overnight were inoculated into 100 ml of NB medium. The bacterial culture was incubated until an OD 600 of 0.6 was reached. 150 [mu] l of bacterial culture was transferred to a 96 well ELISA plate containing 1 mM of screened compound retrieved from VLS. DMSO was used to dissolve the compound into a 30 mM concentration of the stock compound. The DMSO concentration was kept below 5% for all bacterial growth assays and the negative control used only the same concentration of DMSO. The plates were incubated at 28 with continuous shaking and absorbance was measured at constant intervals of 0, 3, 6, 9, and 12 hours at 600 nm. Compounds that inhibit more than 50% Xoo growth were selected to measure the MIC 50 value of the compound.
MICMIC 5050 방법(마이크로타이터 플레이트-기반 항박테리아 분석) Method (microtiter plate-based anti-bacterial assay)
하룻밤 동안 배양된 3 ml의 Xoo를 100 ml의 NB 배지에 접종하였다. 박테리아 배양액을 0.5 McFarland 스탠다드의 세포 밀도까지 배양하였다. 그 배양액을 10배 희석하고, 150㎕의 희석된 배양액을 멸균된 96-웰 클리어 플랫 바텀 플레이트에 분액 하였다. 높은 박테리아 세포 성장 저해 활성을 가지는 선택된 화합물을 연속적으로 희석하여 600 M부터 9.5 M까지의 농도로 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 동일한 농도의 DMSO만을 가지는 박테리아 배양액을 음성 대조군으로 사용하였다. 28℃에서 이 플레이트를 배양하고, 20시간 후에 OD600 측정을 수행하였다. 박테리아 성장의 저해 퍼센트는 아래와 같은 식에 의하여 계산되었다. 3 ml of Xoo incubated overnight were inoculated into 100 ml of NB medium. The bacterial culture was cultured to a cell density of 0.5 McFarland standards. The culture was diluted 10-fold and 150 [mu] l of the diluted culture broth was divided into sterilized 96-well clear flat bottom plates. Selected compounds with high bacterial cell growth inhibitory activity were serially diluted and added to 96-well plates at a concentration of 600 M to 9.5 M. A bacterial culture having only the same concentration of DMSO was used as a negative control. The plate incubated at 28 ℃, which was carried out the OD 600 measured after 20 hours. Percent inhibition of bacterial growth was calculated by the equation below.
저해 퍼센트= 100 x (ODnc - ODtc ) /(ODnc - ODpc) Inhibition Percent = 100 x (OD nc - OD tc ) / (OD nc - OD pc )
[ODnc : 음성 대조군의 OD600, ODtc : 테스트 화합물의 OD600, ODpc : 양성대조군(공지된 저해제)의 OD600]. [OD nc: the negative control OD 600, OD tc: OD 600 of the positive control (a known inhibitor): OD 600, OD pc of the test compound.
MIC50 값들을 50%의 박테리아 세포 성장을 저해하는 최소 화합물 농도로 결정하였다. MIC 50 values were determined as the minimum compound concentration that inhibited 50% bacterial cell growth.
표 1은 박테리아 세포 성장 저해 분석으로부터 유래한 리드 화합물의 MICs에 관한 표이다.Table 1 is a table for MICs of lead compounds derived from bacterial cell growth inhibition assay.
(㎍/mL) (쨉 g / mL)
68704426870442
68234636823463
68515006851500
Claims (8)
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]1. A pesticidal composition for preventing blight of rice blossom blight comprising a compound of any of Chemical Formulas 1 to 4 as an active ingredient.
[Chemical Formula 1]
(2)
(3)
[Chemical Formula 4]
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]1. A pharmaceutical composition comprising Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo).
[Chemical Formula 1]
(2)
(3)
[Chemical Formula 4]
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