KR101556011B1 - Human Monoclonal Antibody against Jagged 1 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변부위 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위를 포함하는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 J1J1 인간 단일클론항체는 암세포에서 특이적으로 과발현되는 Notch 1의 리간드인 Jagged 1에 특이적으로 타켓팅 할 수 있도록 파아지디스플레이를 통해 인간항체 라이브러리에서 스크리닝되어, 마우스에서 만들어진 단일클론항체에서 요구되는 인간화과정이 필요하지 않고 바로 인간에 적용할 수 있으며, 암세포의 성장, 전이(migration) 및 침윤(invasive)능력을 저하시키는 것을 확인하였으므로, Jagged 1 시그널과 관련 암 진단 및 치료용 항체로 용이하게 활용할 수 있다.The present invention relates to a human monoclonal antibody against Jagged 1, more particularly to a CDR1 site consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a CDR2 site consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a CDR3 site consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: And a CDR2 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a heavy chain variable region comprising a CDR2 region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
The J1J1 human monoclonal antibody according to the present invention is screened in a human antibody library through a phage display so that it can specifically target Jagged 1, a ligand of Notch 1 that is specifically overexpressed in cancer cells, It has been confirmed that it does not require the humanization process required and can be applied to human beings and reduces the growth, migration and invasive ability of cancer cells. Therefore, it can be used as an antibody for diagnosing and treating cancer related to Jagged 1 signal .
Description
본 발명은 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변부위 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것이다.
The present invention relates to a human monoclonal antibody against Jagged 1, more particularly to a CDR1 site consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a CDR2 site consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a CDR3 site consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: A CDR1 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, a CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and a heavy chain variable region comprising the heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: Lt; RTI ID = 0.0 > monoclonal < / RTI >
단일클론항체(monoclonal antibody)를 만들어내는 기술이 개발된 이래로 이를 질병의 진단이나 치료에 이용하려는 시도가 지속적으로 이어져 왔다. 그에 따라 진단용 단일클론항체의 경우에는 이미 많은 제품이 개발되어 판매되고 있으나, 치료용 단일클론항체의 경우 여러 가지 제약 조건 때문에 제품화가 늦어지고 있는데, 그 중의 하나가 바로 인체의 면역반응이다.Since the development of monoclonal antibody-producing technologies, attempts have been made to use them in the diagnosis and treatment of diseases. Accordingly, many monoclonal antibodies for diagnosis have been developed and marketed. However, monoclonal antibodies for treatment are delayed in commercialization because of various constraints. One of them is the immune response of the human body.
항체 치료제의 개발은 면역원성을 줄이는 방향으로 진행되어 왔다. 가장 먼저 상업화에 성공한 Orthoclone-OKT3 은 신장이식의 거부반응을 억제하는 면역억제제로 마우스 서열을 가지고 있는 마우스 항체이다. 마우스 항체가 유발할 수 있는 HAMA(human anti-mouse antibody) 반응을 줄이기 위하여 항체의 variable domain의 서열을 제외한 나머지 서열은 인간서열을 포함하고 있는 chimeric antibody가 개발 되었고, CDR(complementarity determining region)을 제외한 나머지 서열이 모두 인간서열을 보유하고 있는 humanized antibody가 순차적으로 개발되었다.The development of antibody therapeutics has been directed towards reducing immunogenicity. Orthoclone-OKT3, the first to succeed in commercialization, is an immunosuppressant that inhibits the rejection of kidney transplantation and is a mouse antibody with mouse sequences. In order to reduce the HAMA (human anti-mouse antibody) reaction that can be induced by the mouse antibody, chimeric antibodies containing human sequences other than the antibody variable domain sequence have been developed and the CDR (complementarity determining region) Humanized antibodies, all of which have human sequences, have been developed in sequence.
이 기술이 개발된 이래 현재까지 약 10개의 인간화 항체 치료제가 FDA 승인을 받게 되었고 현재 암 및 자가면역질환의 치료제와 바이러스 감염 예방제로 사용되고 있으며, 특히 Her2 결합항체인 Herceptin과 VEGF 중화항체인 Avastin은 암치료제로서 blockbuster 항체 제품이다.Since the development of this technology, about 10 humanized antibody therapeutics have been approved by the FDA and are currently being used as a therapeutic agent for cancer and autoimmune diseases and as a preventive agent for viral infections. Herceptin, a Her2 binding antibody, and Avastin, a VEGF neutralizing antibody, It is a blockbuster antibody product as a therapeutic agent.
이와 같이 생쥐에서 유래한 항체를 조작하여 최대한 인간 항체와 유사하도록 바꾸어 주는 방법 외에도 아예 인간의 항체서열을 가진 인간 단일클론항체(fully human monoclonal antibody)를 제조하려는 노력도 이루어지고 있다. As such, efforts have been made to produce a fully human monoclonal antibody having a human antibody sequence in addition to a method of manipulating an antibody derived from a mouse to maximally resemble a human antibody.
완전인간항체를 개발하는 방법은 크게 phage display를 이용하는 방법과 transgenic mouse를 이용하는 방법이 있는데, 기존에 개발된 인간항체기술 중 Cambridge Antibody Technolgy(CAT)와 Dyax등이 보유하고 있는 Phage display 기술은 phage coat protein을 구성하는 pIII 단백질의 일부분에 CDR 서열을 포함하고 있는 항체 단편이 발현되도록 유전자 조작하여 특정 항원에 결합하는 항체 단편을 찾는 방법이며, 반면에 Medarex와 Abgenix등이 보유하고 있는 transgenic mouse 기술은 mouse 항체 발현 유전자를 인간 항체 발현 유전자로 치환시킨 형질전환 mouse를 이용하는 방법이다. VEGFR-2의 항체를 예로 볼 때, Tanibirumab은 phage display 기술을 이용하여 개발된 완전인간항체로 현재 개발되고 있는 다른 VEGFR-2 중화항체와 가장 큰 차이점은 mouse/rat VEGFR-2에 반응한다는 것이며, 현재 개발되고 있는 Imclone사의 Ramucirumab 이나, UCB pharma의 CDP-791의 경우는 모두 mouse의 VEGFR-2와 결합하지 못한다. 따라서, 이 두 개의 항체는 동물모델을 이용한 효과를 제대로 평가하기가 어려운 반면, Tanibirumab의 마우스 VEGFR-2에 대한 결합능력은 동물모델에서의 신생혈관억제 효과를 평가할 수 있다. 이러한 특징은 임상시험개발 과정에서 Tanibirumab에 가장 적절한 indication을 선정하는데 큰 도움이 될 것으로 기대하고 있다. 그 외에 파지 디스플레이 방법에 의하여 제조된 인간 단일클론항체는 TNF-α에 대한 항체(adalimumab, 상품명 Humira)로서 2002년 FDA의 승인을 받아 관절염 치료제로 사용되고 있는 강력한 항체 제품이다.Phage display technologies such as Cambridge Antibody Technolgy (CAT) and Dyax, among the existing human antibody technologies, have been applied to phage coat The transgenic mouse technology, which Medarex and Abgenix have, is a method for finding an antibody fragment that binds to a specific antigen by genetically manipulating an antibody fragment containing a CDR sequence to a part of the pIII protein constituting the protein, A transgenic mouse in which an antibody-expressing gene is substituted with a human antibody-expressing gene is used. Taking the antibody of VEGFR-2 as an example, Tanibirumab is a fully human antibody developed using phage display technology. The major difference from other VEGFR-2 neutralizing antibodies currently being developed is that it reacts with mouse / rat VEGFR-2, Both Ramucirumab of Imclone and CDP-791 of UCB pharma are unable to bind to mouse VEGFR-2. Thus, the ability of the two antibodies to bind to mouse VEGFR-2 in Tanibirumab can be assessed for neovascular inhibitory effects in animal models, while it is difficult to assess the efficacy of these two antibodies in animal models. This feature is expected to be of great help in selecting the most appropriate indication for Tanibirumab during clinical trial development. In addition, the human monoclonal antibody produced by the phage display method is an antibody against TNF-α (adalimumab, product name: Humira), a strong antibody product approved by the FDA in 2002 for treating arthritis.
Notch 신호전달은 진화적으로 잘 보존된 신호전달 체계로 세포 결정, 분화, 증식 및 사멸을 조절하는 것으로 알려져 있으며, Notch 단백질은 단일 막관통 단백질로 세포표면 수용체와 핵 전사조절제의 역할을 한다. Notch 유전자는 초파리 표현형 연구시 초파리 날개끝에 홈(notches)이 있는 것을 발견하고 그와 관련된 유전자를 Notch로 명명하면서 처음 발견되었다. 포유동물은 네 개의 Notch를 가지고 있으며(Notch 1, 2, 3, 4), 각각의 Notch는 300-350 kDa 크기의 단백질로 합성되며 골지체에서 furin-like convertase에 의해 S1 자리가 잘리면서 세포표면에서 heterodimer를 형성한다.Notch signaling is an evolutionarily well - preserved signaling system that is known to regulate cell crystallization, differentiation, proliferation and death. The Notch protein is a single membrane penetrating protein that acts as a cell surface receptor and nuclear transfer modulator. The Notch gene was first discovered in the Drosophila phenotypic study when it found that there was a notch at the end of the flapping wings and named the related gene Notch. The mammal has four Notch (Notch 1, 2, 3, 4), each Notch is synthesized with a protein of 300-350 kDa in size, and the S1 is cleaved by furin-like convertase in the Golgi, to form a heterodimer.
활성화된 Notch 신호전달은 여러 암 모델에서 종양형성을 유발하는 것으로 알려져 있다 (Wang Z. et al ., Anticancer Res ., 28:3621, 2008; Santagata S. et al., Cancer Res ., 1;64:6854, 2004). 종양형성 과정과 배아 기관 발달은 유사한 방법으로 일어날 것이라는 가설이 있으며, 활성 Notch인 NICD를 쥐의 조혈세포에 발현시켰더니 T-cell leukemia/lymphomas를 일으키고, T-cell acute lymphoblastic leukemia(T-ALL)에선 활성화 된 Notch 1이 50% 정도 발견되었다 (Weng AP. et al ., Science, 306:269, 2004). 또한 유방암 쥐 모델에서도 Notch의 발암효과가 보고 되어있다.Activated Notch signaling is known to induce tumorigenesis in several cancer models (Wang Z. et < RTI ID = 0.0 > al ., Anticancer Res . , ≪ / RTI > 28: 3621, 2008; Santagata S. et al., Cancer Res . , 1; 64: 6854, 2004). T-cell leukemia / lymphomas are caused by expression of NICD, an active Notch, in murine hematopoietic cells, and T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is caused by tumor growth and embryo development. About 50% of activated Notch 1 was found (Weng AP et al ., Science, 306: 269, 2004). In addition, notch carcinogenic effects have been reported in breast cancer rat models.
한편, Notch의 리간드인 Jagged 1은 유방암 환자에 있어서는 안 좋은 예후(Reedijk M. et al ., Cancer Res ., 15;65:8530, 2005)와, 전립선암에서는 암 전이와 관련이 있다고 알려져 있으며(Santagata S. et al., Cancer Res., 64:6854, 2004), Notch/리간드 결합으로 시작되는 Notch 신호전달 체계는 kinase 같은 효소적 신호 증폭이 없어 비교적 정확하게 신호강도를 조절할 수 있어 Notch 신호전달이 암 연구에서 주목을 받고 있다. Notch 신호전달은 Notch/리간드 결합을 방해하는 단일클론항체를 이용해 Notch 신호전달 초기단계에서 억제할 수 있으며, Notch 리간드인 Dll4를 타켓으로 하는 단일클론항체가 개발되어 내피세포에서의 Notch 신호전달을 억제해 혈관 생성을 제한한다는 보고가 있고(Ridgway J. et al ., Nature , 444:1083, 2006), 현재 Notch와 관련된 암 진단을 위한 항체 및 Notch 신호전이를 방해할 수 있는 많은 단일클론항체들이 개발중이다 (Yan M. et al ., Nature, 464:1052, 2010).On the other hand, Notch's ligand, Jagged 1, has a poor prognosis in breast cancer patients (Reedijk M. et al ., Cancer Res, 15; 65:.. . 8530, 2005) and in prostate cancer is known to be associated with cancer metastasis and (Santagata S. et al, Cancer Res , 64: 6854, 2004), beginning with the Notch / ligand binding Notch signal transduction systems do not require enzymatic signal amplification such as kinase, so that signal intensity can be adjusted relatively accurately, and Notch signal transduction is attracting attention in cancer research. Notch signaling can be inhibited at the early stage of Notch signaling using a monoclonal antibody that interferes with Notch / ligand binding, and a monoclonal antibody targeting the Notch ligand, Dll4, has been developed to inhibit Notch signaling in endothelial cells There have been reports of limiting the production of angiogenic blood vessels (Ridgway J. et al ., Nature , 444: 1083, 2006), many monoclonal antibodies are now being developed that can interfere with Notch-related antibodies for cancer diagnosis and Notch signaling (Yan M. et al ., Nature , 464: 1052, 2010).
이에, 본 발명자들은 새로운 항암치료의 주요 타겟이 될 수 있는 Notch 1의 리간드인 Jagged 1의 단일클론항체를 제공하기 위하여 예의 노력한 결과, 인간 항체 라이브러리에서 Jagged 1에 특이적으로 결합하는 항체 J1J1을 선별하여 암세포의 성장, 전이(migration) 및 침윤(invasive)능력을 저하시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
Therefore, the present inventors have made intensive efforts to provide a monoclonal antibody of Jagged 1, which is a ligand of Notch 1, which can be a main target of new chemotherapy, and as a result, it has been found that antibody J1J1 specifically binding to Jagged 1 in a human antibody library is selected Migration, and invasive ability of cancer cells, thereby completing the present invention.
본 발명의 목적은 Jagged 1에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론항체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공하는데 있다. An object of the present invention is to provide a human monoclonal antibody that specifically binds to Jagged 1, a gene encoding the same, a recombinant vector containing the gene, and a recombinant cell transformed with the gene or the recombinant vector.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 세포를 배양하여 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다. It is yet another object of the present invention to provide a method for producing a human monoclonal antibody against Jagged 1 by culturing the recombinant cells.
본 발명의 또 다른 목적은 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물 및 암 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
It is still another object of the present invention to provide a cancer diagnostic composition comprising a human monoclonal antibody against Jagged 1 and a composition for treating cancer.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변부위 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a CDR1 region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a CDR2 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a light chain variable region comprising the CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: Comprising a CDR1 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, a CDR2 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, a human monoclonal antibody to Jagged 1 do.
본 발명은 또한, 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 코딩하는 유전자를 제공한다. The present invention also provides a gene encoding a human monoclonal antibody to Jagged 1.
본 발명은 또한, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 숙주미생물에 도입되어 있는 것을 재조합 세포 및 상기 재조합 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체의 제조방법을 제공한다. The present invention also relates to a method for producing a human monoclonal antibody against Jagged 1, wherein the recombinant vector containing the gene, the gene or the recombinant vector is introduced into the host microorganism, and the recombinant cell and the recombinant cell are cultured .
본 발명은 또한, 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 암 진단용 조성물 및 암 치료용 조성물을 제공한다.
The present invention also provides a composition for diagnosing cancer comprising the human monoclonal antibody against Jagged 1 and a composition for treating cancer.
본 발명에 따른 J1J1 인간 단일클론항체는 암세포에서 특이적으로 과발현되는 Notch 1의 리간드인 Jagged 1에 특이적으로 타켓팅 할 수 있도록 파아지디스플레이를 통해 인간항체 라이브러리에서 스크리닝되어, 마우스에서 만들어진 단일클론항체에서 요구되는 인간화과정이 필요하지 않고 바로 인간에 적용할 수 있으며, 암세포의 성장, 전이(migration) 및 침윤(invasive)능력을 저하시키는 것을 확인하였으므로, Jagged 1 시그널과 관련 암 진단 및 치료용 항체로 용이하게 활용할 수 있다.
The J1J1 human monoclonal antibody according to the present invention is screened in a human antibody library through a phage display so that it can specifically target Jagged 1, a ligand of Notch 1 that is specifically overexpressed in cancer cells, It has been confirmed that it does not require the humanization process required and can be applied to human beings and reduces the growth, migration and invasive ability of cancer cells. Therefore, it can be used as an antibody for diagnosing and treating cancer related to Jagged 1 signal .
도 1은 3차 및 4차 패닝으로부터 Jagged 1- 펩타이드에 선택적으로 결합하는 J1J1 항체를 선별한 데이터이다.
도 2는 J1J1 항체의 경쇄 가변부위 및 중쇄 가변부위 아미노산 서열과 CDR 부위를 나타낸 모식도이다.
도 3은 Fab형태의 J1J1항체를 whole Ig 형태로 전환한 후 정제한 결과를 나타낸 데이터이다.
도 4는 J1J1항체에 의한 OVCAR3 세포주의 성장억제정도를 나타낸 데이터이다.
도 5는 J1J1항체에 의한 SKOV 3 세포주의 성장억제정도를 나타낸 데이터이다.
도 6은 J1J1항체에 의한 OVCAR3 세포주의 전이 및 침윤 억제정도를 나타낸 데이터이다.
도 7은 J1J1항체에 의한 SKOV 3 세포주의 전이 및 침윤 억제정도를 나타낸 데이터이다.
도 8은 Notch 시그널을 나타낸 모식도이다.
도 9는 OVCAR3 세포주에서 J1J1항체 의한 Notch 시그널의 mRNA 발현 저해정도를 나타낸 데이터이다.
도 10은 SKOV 3 세포주에서 J1J1항체 의한 Notch 시그널의 mRNA 발현 저해정도를 나타낸 데이터이다.
도 11은 OVCAR3 세포주에서 J1J1항체 의한 Notch 시그널의 단백질 발현 저해정도를 나타낸 데이터이다.
도 12는 in vivo 상에서 J1J1 항체의 항암효과 확인한 데이타이다.FIG. 1 shows data of J1J1 antibody selectively binding to Jagged 1-peptide from third and fourth order panning.
Fig. 2 is a schematic diagram showing the light chain variable region and heavy chain variable region amino acid sequence and CDR region of the J1J1 antibody.
Fig. 3 shows data showing the results of purification of the Fab-type J1J1 antibody after conversion to whole Ig form.
Fig. 4 is data showing the degree of inhibition of growth of OVCAR3 cell line by J1J1 antibody.
FIG. 5 is data showing the degree of inhibition of growth of SKOV 3 cell line by J1J1 antibody.
6 is data showing the degree of inhibition of metastasis and invasion of OVCAR3 cell line by J1J1 antibody.
FIG. 7 is data showing the degree of inhibition of metastasis and invasion of SKOV 3 cell line by J1J1 antibody.
8 is a schematic diagram showing a Notch signal.
Fig. 9 is data showing the degree of inhibition of mRNA expression of the Notch signal by the J1J1 antibody in the OVCAR3 cell line.
10 is data showing the degree of inhibition of mRNA expression of Notch signal by J1J1 antibody in SKOV 3 cell line.
FIG. 11 is data showing inhibition of protein expression of Notch signal by J1J1 antibody in OVCAR3 cell line.
Fig. 12 shows data of anti-cancer effect of J1J1 antibody in vivo.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 경쇄 가변부위 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체에 관한 것이다. The present invention provides, in one aspect, a CDR1 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a CDR2 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, a light chain variable region comprising the CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, A CDR1 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
본 발명에 있어서, 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the human monoclonal antibody to Jagged 1 may include a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
본 발명에서 'Jagged 1'은 노치 리셉터(notch receptor) 리간드(ligand)에 해당하며, 'Jagged 1'은 본 명세서에서 사용되는 용어 'Jag 1'과 혼용된다.In the present invention, 'Jagged 1' corresponds to a notch receptor ligand, and 'Jagged 1' is used in combination with the term 'Jag 1' as used herein.
본 발명에서 '항체(antibody)'는 항원(antigen)과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하는 면역단백질을 의미한다. 항체에는 immunoglobulin(Ig)M, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 5종류가 있으며, 각각 중쇄 불변영역 유전자 μ, δ, γ, α, ε로부터 만들어진 중쇄를 포함한다. 항체기술에서는 주로 IgG가 사용되는데 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 4종류의 isotype이 있으며, 각각의 구조 및 기능적 특성은 다르다.The term " antibody " in the present invention refers to an immune protein that binds to an antigen and interferes with the action of the antigen or eliminates the antigen. There are five types of antibodies, immunoglobulin (Ig) M, IgD, IgG, IgA and IgE, each containing a heavy chain made up of heavy chain constant region genes μ, δ, γ, α, and ε. In antibody technology, IgG is mainly used. There are four types of isotypes, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, and their structural and functional characteristics are different.
IgG는 중쇄(heavy chain, 50 kDa) 단백질 2개와 경쇄(light chain, 25 kDa) 단백질 2개로 만들어진 Y자 모양의 매우 안정된 구조(분자량, 150 kDa)를 형성하고 있다. 항체의 경쇄와 중쇄는 아미노산 서열이 항체들마다 서로 다른 가변영역(variable region)과 아미노산 서열이 같은 불변영역(constant region)으로 나뉘어져 있으며, 중쇄 불변영역에는 CH1, H(hinge), CH2, CH3 도메인이 존재한다. 각 도메인은 두 개의 β-sheet로 구성되어 있고 이들사이에 intramolecular disulfide bond가 연결되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역 두 개가 합쳐져 항원 결합 부위(antigen binding site)가 형성되며, 이 부위는 Y자 모양의 양 팔에 각각 한 개씩 존재하는데 이러한 항원과 결합할 수 있는 부분을 Fab(antibody binding fragment)이라 하고, 항원과 결합하지 못하는 부분을 Fc(crystalizable fragment)라고 한다. Fab과 Fc은 유연한 hinge region으로 연결되어 있다. IgG has a very stable structure (molecular weight, 150 kDa) with two heavy chain (50 kDa) proteins and two light chain (25 kDa) proteins. The light and heavy chains of the antibody are divided into constant regions having the same amino acid sequence as the variable region in which the amino acid sequences of the antibodies differ from each other. The heavy chain constant region includes CH1, H (hinge), CH2, CH3 domains Lt; / RTI > Each domain consists of two β-sheets and an intramolecular disulfide bond is connected between them. Two variable regions of the heavy chain and the light chain are combined to form an antigen binding site. Each of these regions has one Y-shaped arm, which can bind to the antigen binding fragment ), And the part that can not bind antigen is called Fc (crystalizable fragment). Fab and Fc are connected by a flexible hinge region.
항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역 안에는 항체마다 아미노산 서열이 특히 다른 부분이 있는데 이를 hypervariable region이라고 부르며, 항원과 결합하는 부위를 구성하고 있기 때문에 상보성 결정영역 (complementarity determining regions, CDRs)이라고도 부른다. 항체의 입체 구조를 살펴보면, 이들 CDRs은 항체의 표면에서 고리(loop) 모양을 하고 있고 고리 아래에는 이를 구조적으로 지지해주는 FR(framework region)이 존재한다. 중쇄와 경쇄에는 각각 세 개씩의 고리구조가 존재하며, 이들 여섯 개의 고리 지역 구조는 서로 합쳐져서 항원과 직접적으로 접촉하고 있다.Within the heavy and light chain variable regions of the antibody, there are different portions of the antibody that differ in amino acid sequence. These are called hypervariable regions and are called complementarity determining regions (CDRs) because they form binding sites for antigens. As for the stereostructure of the antibody, these CDRs have a loop shape on the surface of the antibody, and below the ring there exists a framework region (FR) that structurally supports the CDRs. There are three ring structures in each of the heavy chain and the light chain, and these six ring structures combine with each other to directly contact the antigen.
본 발명의 인간 항체는 공지의 단일클론항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 단일클론항체를 제조하는 방법은 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나, 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The human antibody of the present invention can be easily produced by a known monoclonal antibody production technique. For example, a method for producing a monoclonal antibody can be performed by preparing a hybridoma using B lymphocytes obtained from an immunized animal, or by using a phage display technique, It is not.
파지 디스플레이는 1985년 G. Smith에 의해 처음 도입된 개념으로, 1990년 영국 MRC에 의해 처음으로 항체의 제조에 응용되었다. 박테리오파지(bacteriophage)란 대장균(Escherichia coli)에 기생하는 바이러스의 일종으로 이 기술에서는 주로 실사형 박테리오파지(filamentous bacteriophage)인 M13이 사용되고 있다. Phage display was first introduced by G. Smith in 1985 and first applied to the manufacture of antibodies by MRC in the UK in 1990. Bacteriophage is a kind of virus parasitic to Escherichia coli. In this technology, M13, which is a filamentous bacteriophage, is mainly used.
항체의 phage display는 인체 내에 수많이 존재하는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 각각 PCR로 증폭시켜 phagemid vector 안에 들어있는 파지 표면 단백질(pIII)에 융합시킨 형태로 클로닝하여 대장균에서 발현시킨 후 helper 파지를 감염시키면, 파지의 표면에 display된 다양한 조합의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 항체 라이브러리(library)를 제작할 수 있는 기술을 말한다. 이때 사용하는 항체의 형태는 scFv나 Fab이다. 이 라이브러리로부터 패닝(panning) 방법에 의하여 특정 항원에 결합하는 인간 단일클론항체를 분리 제작할 수 있다. 패닝은 특정 항원(target antigen)에 파지를 결합시키고 결합하지 않은 파지를 제거한 후, 결합된 파지를 회수하여 대장균에 감염시킴으로써 파지 수를 증폭하고, 이 과정을 2-4회 반복하는 과정이다. 이 기술을 이용하면 단 몇 주만 인간 단일클론항체를 분리할 수 있다. 위와 같이 인체에 이미 존재하는 항체 유전자로부터 항체의 다양성을 창조한 것을 naive antibody library라 하고, 항체의 CDRs에 무작위 합성 서열을 넣어 다양성을 창조한 것을 synthetic antibody library라고 한다. Native library는 분리한 항체의 친화력이 그리 높지 않지만 제작비용이 많이 들지 않고, synthetic library는 분리한 항체의 친화력이 높은 반면 제작비용이 많이 든다. 분리된 항체클론들의 친화력이 높지 않을 경우, 항체의 CDRs 및 FRs의 잔기들을 변이시킨 후 파지 디스플레이 방법을 사용하여 친화력이 보다 높은 항체 클론들을 다시 선별하는 친화력 성숙 과정(in vitro affinity maturation)을 거친다.The phage display of the antibody amplifies the heavy and light chain variable regions of the antibody in the human body by PCR. The antibody is cloned into the phage surface protein (pIII) contained in the phagemid vector and expressed in E. coli. The helper phage Refers to a technique capable of producing an antibody library of various combinations of heavy and light chain variable regions displayed on the surface of the phage upon infection. The type of antibody used here is scFv or Fab. From this library, a human monoclonal antibody that binds to a specific antigen can be separately prepared by a panning method. Panning is a process of binding a phage to a target antigen and removing the unbound phage, collecting the bound phage, infecting the E. coli to amplify the phage number, and repeating this process 2-4 times. With this technology, human monoclonal antibodies can be isolated in only a few weeks. The synthetic antibody library is called a naive antibody library, in which antibody diversity is created from an antibody gene already present in the human body, and randomization sequences are added to the CDRs of antibodies to create diversity. The native library does not have a high affinity for the separated antibody, but it does not cost much to produce. The synthetic library has a high affinity for the separated antibody, but is expensive to produce. If the affinity of the separated antibody clones is not high, the affinity maturation is performed in which residues of the CDRs and FRs of the antibody are mutated and then the antibody clones having higher affinity are selected again using the phage display method.
본 발명에서 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파지는, 예를 들면 필라멘트성 파지(filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파지가 있으나, 상기 예들에 의하여 본 발명에서 사용 가능한 파지의 종류가 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터의 예로는, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8, pKRIBB-Fab 또는 pSEX 등의 파지미드 벡터가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명에서는 pKRIBB-Fab 파지미드 벡터를 사용하였다. The phages that can be used to construct the antibody library in the present invention include, for example, filamentous phages, such as fd, M13, f1, If1, Ike, Zj / Z, Ff, Xf, Pf1 or Pf3 phage , But the types of phage that can be used in the present invention are not limited by the above examples. Examples of the vector that can be used for expression of the heterologous gene on the surface of the filamentous phage include a phage vector such as fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 or fdtetDOG, or a phage vector such as pHEN1, pComb3, pComb8, pKRIBB- , But the present invention is not limited thereto. In the present invention, the pKRIBB-Fab phagemid vector was used.
또한, 증폭을 위한 재조합 파지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파지에는, 예를 들어 M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Helper phage that can also be used to provide the wild-type coat protein required for successful reinfection of the recombinant phage for amplification include, but are not limited to, for example, M13K07 or VSCM13.
본 발명의 일 양태에서는 Jagged 1의 항원을 인간항체 라이브러리를 디스플레이하고 있는 파지와 1시간 동안 반응시켰고, 1차 패닝의 경우 10회, 2차 패닝의 경우 20회, 3차 패닝의 경우 30회, 4차 패닝의 경우 40회 세척하였다. 세척 후 항원에 결합하고 있던 파지-항체들을 분리시킨 다음 TG1 대장균에 감염시키고 하룻밤 배양하였다. 이때 각 패닝 초기에 사용한 파지의 수를 인풋(input)으로, 세척과정을 마친 이후 글라이신 용액에 의하여 분리된 후 TG1 대장균을 통하여 만들어진 콜로니의 수를 아웃풋(output) 파지의 수로 계산하여, 항원결합능이 있는 항체의 증폭 정도의 지표로 삼았고, 1차 패닝 결과 얻어진 콜로니들을 모아 배양한 후 같은 방법으로 보조 파지를 넣고 배양하여 항체가 디스플레이드된 파지를 만들었고, 동일한 양의 항원에 대하여 2차, 3차, 4차 패닝을 진행하였다. 패닝 횟수가 증가됨에 따라 항원결합능이 높은 항체들이 증폭되고 있는지 확인하기 위하여, 라이브러리와 1차, 2차, 3차 패닝 후에 정제한 항체들의 항원결합능을 간접 ELISA 방법으로 측정하였고, 그 결과, 3차 패닝 후 Jagged 1-peptid에 특이적인 항체가 농축되는 것을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, the antigen of Jagged 1 was reacted with a phage displaying a human antibody library for 1 hour, 10 times for the first panning, 20 times for the second panning, 30 times for the third panning, In the case of 4th panning, it was washed 40 times. After washing, the phage-antibodies bound to the antigen were separated and then infected with TG1 E. coli and cultured overnight. At this time, the number of the phage used at the beginning of each panning was input, and after the washing process, the number of colonies formed by the TG1 Escherichia coli after being separated by the glycine solution was calculated as the number of output phage, And the colonies obtained as a result of the first panning were cultured and then cultured in the same manner as described above to prepare the phage on which the antibody was displayed. The same amount of antigens were subjected to secondary and tertiary , And 4th panning. In order to confirm that the antibodies having high antigen binding ability were amplified as the number of panning was increased, the antigen binding ability of the antibodies purified after the library and the first, second and third panning was measured by an indirect ELISA method. As a result, After panning, it was confirmed that the antibody specific for Jagged 1-peptid was concentrated.
또한, 대조군(negative control)에는 결합하지 않고 Jagged 1-펩타이드에 선택적으로 결합하는 7개의 양성 클론을 선별하였으며, 그 중에서도 Jagged 1-펩타이드에 결합력이 뛰어난 클론을 선택하여 J1J1으로 명명하고(도 1), 선별된 J1J1 항체의 염기서열 및 아미노산 서열을 분석한 결과, J1J1 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위로 구성되며, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 중쇄 가변부위를 포함하는 것을 확인하였다. 또한, 경쇄 가변부위는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하고, 중쇄 가변부위는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 것으로 분석되었다 (도 2). Seven positive clones that selectively bind to the Jagged 1-peptide without binding to the control (negative control) were selected. Among them, a clone having a strong binding ability to the Jagged 1-peptide was selected and named J1J1 (FIG. 1) As a result of analyzing the base sequence and amino acid sequence of the selected J1J1 antibody, the J1J1 antibody was composed of a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 9, and a heavy chain variable region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10. The light chain variable region comprises a CDR1 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a CDR2 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: A CDR1 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (FIG. 2).
본 발명의 J1J1 항체의 염기서열을 인간 점라인(germline) 염기서열과 비교 분석한 결과, J1J1의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 IMGT 데이터 베이스(IMGT data base)에 있는 어느 중쇄 및 경쇄 서열과 100% 동일하지는 않아, J1J1이 점라인 항체가 아니고 인체 내에서 성숙과정을 거친 새로운 항체임을 확인하였다.As a result of comparing the base sequence of the J1J1 antibody of the present invention with the human germline base sequence, it was found that the heavy and light chain variable region sequences of J1J1 corresponded to any heavy and light chain sequences in the IMGT database (IMGT data base) Not identical, it was confirmed that J1J1 was not a pointline antibody but a new antibody that had undergone maturation in the human body.
항체절편은 항체 분자에서 effector function을 나타내는 Fc region을 제외한 항원결합 도메인들을 말하며, 주로 Fab, single-chain antibody fragment(scFv) 및 3세대 항체절편(예, single domain, minibody 등)이 포함된다.Antibody fragments are antigen binding domains except for the Fc region that exhibits an effector function in the antibody molecule, and mainly include Fab, single-chain antibody fragment (scFv) and third-generation antibody fragment (eg, single domain, minibody, etc.).
항체절편은 whole IgG에 비하여 크기가 작기 때문에 조직이나 종양으로의 침투율이 좋고, 박테리아에서 생산할 수 있으므로 생산 비용이 적게 드는 장점이 있으며, Fc가 없기 때문에 effector function을 원하지 않는 경우에 사용한다. 항체절편은 인체 내에서의 반감기가 짧아 생체 진단용으로 적합하지만, 항체를 이루고 있는 아미노산 중 일부 염기성, 산성 혹은 중성 아미노산을 상호 교체할 경우 그 항체만의 고유한 등전점(isoelectric point)이 바뀔 수 있는데, 이러한 항체의 등전점 변화가 항체의 생체 내 독성 부작용을 경감한다거나 수용성을 증가시키는 등의 변화를 유도할 수 있으므로 치료용 항체의 경우 친화도나 구조적 형태를 고려하여 whole Ig를 사용하게 된다. Since antibody fragments are small in size compared to whole IgG, they have good permeability to tissues and tumors, can be produced in bacteria, have a low production cost, and have no effector function because they do not have Fc. Antibody fragments are suitable for biopsy because of their short half-life in the human body. However, when replacing some basic, acidic or neutral amino acid among the amino acids constituting the antibody, the unique isoelectric point of the antibody alone may be changed. The change in isoelectric point of the antibody may induce changes such as toxicity side effects of the antibody in vivo or increase the water solubility. Therefore, in the case of the therapeutic antibody, the whole Ig is used considering the affinity and the structural form.
본 발명은 다른 관점에서, Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.In another aspect, the invention relates to a gene encoding a human monoclonal antibody to Jagged 1.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 9의 DNA 서열로 코딩되는 경쇄 가변부위와 서열번호 10의 DNA 서열로 코딩되는 중쇄 가변부위를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the gene may include a light chain variable region encoded by the DNA sequence of SEQ ID NO: 9 and a heavy chain variable region encoded by the DNA sequence of SEQ ID NO: 10.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체 생산능을 가지는 재조합 세포에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a recombinant vector having the ability to produce a human monoclonal antibody against Jagged 1, wherein the recombinant vector containing the gene, the gene or the recombinant vector is introduced into a host cell will be.
본 발명에서, '벡터 (vector)'는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 '플라스미드(plasmid)' 및 '벡터(vector)'는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션 (ligation)할 수 있다. In the present invention, a "vector" means a DNA product containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing the DNA in an appropriate host. The vector may be a plasmid, phage particle or simply a potential genome insert. Once transformed into the appropriate host, the vector may replicate and function independently of the host genome, or, in some cases, integrate into the genome itself. Since the plasmid is the most commonly used form of the current vector, 'plasmid' and 'vector' are sometimes used interchangeably in the present invention. For the purpose of the present invention, it is preferable to use a plasmid vector. Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a cloning start point that allows replication to be efficiently made to include several hundred plasmid vectors per host cell, (b) a host cell transformed with the plasmid vector And (c) a restriction enzyme cleavage site into which the foreign DNA fragment can be inserted. Even if an appropriate restriction enzyme cleavage site is not present, using a synthetic oligonucleotide adapter or a linker according to a conventional method can easily ligate the vector and the foreign DNA.
본 발명에 따른 상기 재조합 세포는 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 숙주세포의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터를 숙주세포의 플라스미드(plasmid) 상에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.The recombinant cell according to the present invention can be produced by inserting the gene on a chromosome of a host cell according to a conventional method, or introducing the recombinant vector onto a plasmid of a host cell.
본 발명에 따른 인간 단일클론항체를 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열이 포함된다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC 벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, gt10과 gt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다. A variety of expression host / vector combinations may be used to express human monoclonal antibodies according to the invention. Suitable expression vectors for eukaryotic hosts include, but are not limited to, expression control sequences derived from SV40, cow papilloma virus, adenovirus, adeno-associated virus, cytomegalovirus and retrovirus. Expression vectors that can be used for bacterial hosts include bacterial plasmids obtained from Escherichia coli such as pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC vector, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 and derivatives thereof, , Phage DNA which may be exemplified by a wide variety of phage lambda derivatives such as gt10 and gt11, NM989, and other DNA phages such as M13 and filamentous single stranded DNA fragments. An expression vector useful for yeast cells is 2 plasmid and its derivatives. The vector useful for insect cells is pVL941.
본 발명의 재조합 벡터를 적절한 숙주세포, 예를 들어 효모 세포, 동물 세포 등에 형질전환시킨 후 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명의 인간 항체 또는 이의 단편을 대량 생산할 수 있다.The recombinant vector of the present invention may be transformed into an appropriate host cell such as a yeast cell, an animal cell, etc., and then the transformed host cell may be cultured to mass-produce the human antibody or fragment thereof of the present invention.
상기 벡터의 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 또한 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장 세포7(COS7:monkey kidney cells)세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO:chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않으며, 더 바람직하게는 HEK293 세포이다.A suitable host cell of the vector is E. coli, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), genus Streptomyces (Streptomyces sp.), Pseudomonas species (Pseudomonas sp.), Proteus ( Proteus mirabilis ) or Staphylococcus sp.). < / RTI > In addition, the genus Aspergillus sp.), fungi such as Pichia pastoris), Celebi as Saccharomyces My jiae access (Saccharomyces S. cerevisiae , Schizosaccharomyces eukaryotic cells such as yeast such as Neurospora crassa , other lower eukaryotic cells, and cells of higher eukaryotes such as cells from insects. It can also be derived from plants and mammals. Preferably, the cells are selected from the group consisting of monkey kidney cells (COS7), NSO cells, SP2 / 0, Chinese hamster ovary (CHO) cells, W138, baby hamster kidney (BHK) MDCK, myeloma cell line, HuT 78 cell, and HEK293 cell, but are not limited thereto, and more preferably HEK293 cells.
본 발명의 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리적인 방법으로서, microinjection(세포에 DNA를 직접 넣는 것), liposome, directed DNA uptake, receptor~mediated DNA transfer 또는 Ca++을 이용한 DNA 운반 방법 등이 있으며, 최근에는 바이러스(virus)를 이용한 유전자 운반 방법이 많이 사용되고 있다. 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 방법 등이 있으며, 특히, 레트로바이러스는 유전자 전달 효율이 높고 gross deletion이나 숙주 DNA와 재정렬(rearrangement : 숙주 DNA 중 자기 DNA와 유사한 부위를 바꾸는 것으로 숙주 DNA 기능의 변화를 초래함)에 의한 결합 없이 넓은 범위의 세포들에서 사용할 수 있다.As a method of introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell and transforming it, a commonly known gene manipulation method can be used. For example, microinjection (direct insertion of DNA into cells), liposome, directed DNA uptake, receptor ~ mediated DNA transfer, or DNA transport using Ca ++ . Is widely used. Examples include retrovirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated viral vectors, herpes simplex virus vectors, poxvirus vectors, or lentiviral vectors. Particularly, retroviruses have a high gene transfer efficiency, gross deletion It can be used in a wide range of cells without binding by host DNA and rearrangement (resulting in alteration of host DNA function by altering the region of the host DNA similar to that of the host DNA).
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 '작동가능하게 연결(operably linked)'된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, '작동가능하게 연결된'은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다. A nucleic acid is "operably linked" when placed in a functional relationship with another nucleic acid sequence. This may be the gene and regulatory sequence (s) linked in such a way as to enable gene expression when a suitable molecule (e. G., Transcriptional activator protein) is attached to the regulatory sequence (s). For example, DNA for a pre-sequence or secretory leader is operably linked to DNA for a polypeptide when expressed as a whole protein participating in the secretion of the polypeptide; A promoter or enhancer may be operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; Or the ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it affects the transcription of the sequence; Or a ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if positioned to facilitate translation. Generally, " operably linked " means that the linked DNA sequence is in contact, and in the case of a secretory leader, is in contact and present in the reading frame. However, the enhancer need not be in contact. The linkage of these sequences is carried out by ligation (linkage) at convenient restriction sites. If such a site does not exist, a synthetic oligonucleotide adapter or a linker according to a conventional method is used.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체 생산능을 가지는 재조합 세포를 배양하여 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 회수하는 단계를 포함하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체의 제조방법에 관한 것이다. In another aspect, the present invention provides a method for producing Jagged 1 comprising: (a) culturing a recombinant cell having the ability to produce human monoclonal antibody against Jagged 1 to produce a human monoclonal antibody against Jagged 1; And (b) recovering the human monoclonal antibody against the resulting Jagged 1.
본 발명의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득하는 것이 바람직한데, 구체적으로는 항체의 중쇄 가변영역 또는 중쇄 전체 영역을 코딩하는 유전자 서열 및 경쇄 가변영역 또는 경쇄 전체 영역을 코딩하는 유전자 서열을 하나의 벡터 또는 2개의 벡터에서 따로 발현시킬 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. The human monoclonal antibody to Jagged 1 of the present invention is preferably obtained by expressing and purifying by a recombinant method. Specifically, the human monoclonal antibody for Jagged 1 is obtained by expressing the gene sequence encoding the heavy chain variable region or the entire heavy chain region of the antibody and the light chain variable region The gene sequence encoding the region may be expressed separately in one or two vectors, but is not limited thereto.
구체적으로, 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체의 제조방법은 본 발명의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 배양하는 단계; 상기 배양된 형질전환체로부터 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 분리, 정제하는 단계를 포함할 수 있다. Specifically, the method for producing a human monoclonal antibody against Jagged 1 comprises the steps of: preparing a recombinant vector by inserting a gene encoding a human monoclonal antibody against Jagged 1 of the present invention into a vector; Transforming the recombinant vector into a host cell and culturing it; And separating and purifying a human monoclonal antibody against Jagged 1 from the cultured transformant.
구체적으로, 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양함으로써 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.Specifically, a human monoclonal antibody against Jagged 1 can be produced in large quantities by culturing the transformant expressing the recombinant vector in a nutrient medium. The medium and culture conditions can be suitably selected depending on the host cell. The conditions such as the temperature, the pH of the medium and the incubation time can be appropriately adjusted so as to be suitable for cell growth and mass production of the protein at the time of culturing.
상기와 같이 재조합적으로 생산된 펩타이드 또는 단백질은 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액(예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다.Such recombinantly produced peptides or proteins can be recovered from the medium or cell lysate. If membrane bound, it can be liberated from the membrane by using a suitable surfactant solution (e.g., Triton-X 100) or by enzymatic cleavage.
항체 발현에 사용된 세포는 동결-해동 순화, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다.Cells used for antibody expression can be disrupted by various physical or chemical means such as freeze-thawing, sonication, mechanical disruption or cell disruption, and can be isolated and purified by conventional biochemical separation techniques (Sambrook . et al, Molecular Cloning:. .. A laborarory Manual, 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol 182. Academic Press Inc., San Diego, CA (1990)). Electrophoresis, centrifugation, gel filtration, precipitation, dialysis, chromatography (ion exchange chromatography, affinity chromatography, immuno adsorption chromatography, size exclusion chromatography, etc.), isoelectric focusing and various variations and combinations thereof But are not so limited.
본 발명의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 생산하기 위한 재조합 세포의 배양 및 회수과정은 당업계에 통상적으로 알려진 배양 방법 및 재조합 단백질의 분리 정제 방법이라면 특별한 제한 없이 모두 적용가능하다. The culture and recovery of the recombinant cells for producing the human monoclonal antibody against Jagged 1 of the present invention can be applied to any culture method and separation and purification method of recombinant proteins conventionally known in the art without any particular limitation.
본 발명의 또 다른 양태에서는 Fab 형태의 J1J1을 whole Ig 형태로 전환하기 위하여 J1J1로부터 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭시켰고, HEK293T 세포에 형질전환시켜 J1J1 항체를 정제하였다 (도 3).In another embodiment of the present invention, the J1J1 heavy chain variable region and the light chain variable region were amplified by polymerase chain reaction to transform Fab-type J1J1 into whole Ig form, and J1J1 antibody was purified by transforming HEK293T cells 3).
본 발명은 다른 관점에서 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체(J1J1)를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a composition for treating cancer comprising a human monoclonal antibody (J1J1) for Jagged 1 containing a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 1 and a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 2 from another viewpoint.
본 발명에서 용어, '항암'이란 '예방' 및 '치료'를 포함하며, 여기서 '예방'이란 본 발명의 항체를 포함하는 조성물 투여에 의해 암이 억제되거나 지연되는 모든 행위을 의미하고, '치료'란 본 발명의 항체 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term 'anti-cancer' includes 'prevention' and 'treatment'. Here, 'prevention' means all actions in which cancer is suppressed or delayed by administration of a composition containing an antibody of the present invention, Quot; means any action that improves or alleviates the symptoms of cancer by administration of the antibody of the present invention.
본 발명에 있어서, 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암 및 전립선암으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, Notch, 특히 Jagged 1를 리간드로 포함하는 Notch 1의 시그널이 비정상적으로 발현되는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 포함한다. In the present invention, the cancer may be selected from the group consisting of cervical cancer, lung cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, breast cancer and prostate cancer. However, the present invention is not limited thereto, and the Notch, particularly Jagged 1, The cancer or carcinoma in which the signal of
본 발명의 다른 양태에서는 Jagged 1에 대한 인간항체인 J1J1 항체가 암 치료 효과가 있는지 확인하기 위하여, 난소선암(ovarian adenocarcinoma) 세포인 OVCAR-3 세포주와 난소 암종(ovarian carcinoma) 세포인 SKOV3 세포주를 이용하여 암세포의 성장(proliferation), 전이(migration) 및 침윤(invasion) 능력의 저해 효과를 확인하였다. J1J1항체를 암세포에 처리하여 24 시간, 48시간, 72시간 후에 세포 생존율을 확인해 본 결과, 대조군에 비해 OVCAR 세포는 약 70% 정도 생존율이 감소하는 것을 확인하였으며(도 4), SKOV 3 세포는 약 60% 정도 생존율이 감소하는 것을 확인하여(도 5), J1J1 항체에 의해 암세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, in vitro상에서 J1J1항체에 의한 암세포의 전이 및 침윤 능력을 확인해본 결과, J1J1항체를 처리하였을 때, 대조군에 비해 OVCAR3(도 6) 및 SKOV3(도 7) 의 전이 및 침윤이 억제된 것을 확인하여, J1J1 항체에 의해 암세포의 전이 및 침윤 능력이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. In another embodiment of the present invention, in order to confirm the therapeutic effect of J1J1 antibody as a human antibody against Jagged 1, ovarian adenocarcinoma cells OVCAR-3 cells and ovarian carcinoma cells SKOV3 cells are used Proliferation, migration and invasion of cancer cells were observed. J1J1 antibody was treated with cancer cells to observe cell viability after 24 hours, 48 hours, and 72 hours. As a result, it was confirmed that the survival rate of OVCAR cells was reduced by about 70% as compared with the control (Fig. 4) It was confirmed that the survival rate was reduced by about 60% (FIG. 5), and it was confirmed that the growth of cancer cells was inhibited by the J1J1 antibody. Also, in After checking the metastasis and invasion ability of cancer cells by J1J1 antibody on vitro, when processing the J1J1 antibody, confirming that the metastasis and invasion of OVCAR3 (FIG. 6) and SKOV3 (Fig. 7) compared to the control is suppressed, J1J1 It was confirmed that the ability of the antibody to inhibit metastasis and invasion of cancer cells was inhibited.
본 발명의 또 다른 양태에서는 J1J1 항체에 의한 Notch 시그널의 저해정도를 확인하기 위해, Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, Jagged 1, Hes 1의 mRNA 및 단백질 발현정도를 확인하였다. 도 8에서 나타낸 바와 같이, 활성화된 Notch 신호전달은 NICD 1, Hes 1를 활성화 시키므로, J1J1 항체에 의해 Notch 1의 리간드인 Jagged 1이 차단되면, Notch 1, NICD 1 및 Hes 1의 발현이 감소하게 된다. 본 발명의 J1J1 항체를 처리하였을 때, OVCAR3(도 9) 및 SKOV3(도 10)에서 Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, Jagged 1, Hes 1의 mRNA 발현이 크게 감소하는 것을 확인하였으며, OVCAR3에서 Notch 1, NICD 1, Notch 3, Jagged 1, Hes 1의 단백질 발현이 크게 감소하는 것을 확인하였다 (도 11). In another embodiment of the present invention, the degree of mRNA and protein expression of
본 발명의 또 다른 양태에서 난소선암(ovarian adenocarcinoma) 세포인 OVCAR-3를 이종이식한 마우스 모델에서의 J1J1 항체의 항암효과를 확인한 결과, H&E 염색을 통해, J1J1 항체를 처리한 군에서 세포의 핵이 줄어든 것을 확인하였으며, TUNEL 염색을 통해 J1J1 항체를 처리한 군에서 세포사멸(apoptisis)이 일어나는 것을 확인하였다 (도 12).In another embodiment of the present invention, the anticancer effect of the J1J1 antibody in a mouse model xenografted with ovarian adenocarcinoma cells OVCAR-3 was examined. As a result, H & E staining revealed that in the group treated with J1J1 antibody, And TUNEL staining revealed apoptosis in the group treated with J1J1 antibody (FIG. 12).
즉, 본 발명의 J1J1 항체는 암 세포의 성장, 전이 및 침윤 능력을 감소시키고, Notch 시그널을 저해하므로, 암 치료제로 활용될 수 있음을 확인하였다. That is, it was confirmed that the J1J1 antibody of the present invention reduces cancer cell growth, metastasis and infiltration ability and inhibits Notch signal, and thus can be used as a cancer therapeutic agent.
본 발명의 항암 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 상기 항암 조성물은 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 스테로이드에서 유도된 것이거나 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA) 등의 양이온성 지질, 또는 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글리세롤 등의 각종 화합물 등이 있다. The anti-cancer composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier. In the case of oral administration, a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a pigment and a flavoring agent may be used. , A stabilizer, and the like. In case of topical administration, a base, an excipient, a lubricant, a preservative, etc. may be used. Formulations of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in a variety of ways by mixing with pharmaceutically acceptable carriers as described above. For example, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers and the like in the case of oral administration, and in the case of injections, unit dosage ampoules or a plurality of dosage forms. In addition, the anti-cancer composition may typically comprise a surfactant that facilitates migration through the membrane. Such surfactants are those derived from steroids or cationic lipids such as N- [1- (2,3-dioloyl) propyl-N, N, N-trimethylammonium chloride (DOTMA), or cholesterol hemi- , Phosphatidylglycerol, and the like.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체, 또는 인간 단일클론항체를 포함한 조성물을 개체에 투여하여 암을 치료하고 암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 포함하는 조성물은 암세포 또는 그들의 전이를 치료하기 위하여, 또는 암의 성장을 억제하기 위하여 약학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 암 종류, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.In another aspect, the present invention provides a method for treating cancer and inhibiting cancer growth by administering a composition comprising the human monoclonal antibody or the human monoclonal antibody to the Jagged 1. A composition comprising a human monoclonal antibody to Jagged 1 according to the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount to treat cancer cells or their metastasis or to inhibit cancer growth. The type of cancer, the age and weight of the patient, the nature and severity of symptoms, the type of current treatment, the number of treatments, the route and route of administration, and can be readily determined by those skilled in the art. The composition of the present invention may be administered together with the above-described pharmacological or physiological components or may be administered sequentially, or may be administered in combination with additional conventional therapeutic agents, and administered sequentially or concurrently with conventional therapeutic agents. Such administration may be single or multiple administrations. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art.
본 발명에서, '개체'는 본 발명의 항체를 투여하여 경감, 억제 또는 치료될 수 있는 상태 또는 질환을 앓고 있거나 그러한 위험이 있는 포유동물을 의미하며, 바람직하게 사람을 의미한다. In the present invention, the term 'individual' means a mammal having or at risk for a condition or disease that can be alleviated, suppressed or treated by administering an antibody of the present invention, preferably a human.
본 발명에서, '투여'는 어떠한 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하면 본 발명의 항체를 포함하는 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.In the present invention, 'administering' means introducing a predetermined substance into a subject by any suitable method, so that the administration route of the composition comprising the antibody of the present invention is administered through any conventional route so long as it can reach the target tissue . But are not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal, oral, topical, intranasal, intrathecal, rectal. However, at the time of oral administration, since the protein is digested, it is preferable to formulate the oral composition so as to coat the active agent or protect it from decomposition at the top. In addition, the pharmaceutical composition may be administered by any device capable of transferring the active substance to the target cell.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체(J1J1)를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a cancer diagnostic composition comprising a human monoclonal antibody (J1J1) for Jagged 1 of the present invention.
본 발명에서 Jagged 1의 발현을 검출하여 진단 가능한 암은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 난소암, 유방암, 전립선암 등을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 J1J1은 Jagged 1 또는 Jagged 1 펩타이트를 고민감도로 인지할 수 있으므로, Notch, 특히 Jagged 1를 리간드로 포함하는 Notch 1의 시그널과 관련된 질병을 진단할 수 있다. In the present invention, the cancer that can be diagnosed by detecting the expression of Jagged 1 may include cervical cancer, lung cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, breast cancer, prostate cancer, etc. However, the present invention is not limited thereto, Because Jagged 1 or Jagged 1 peptides can be recognized with hyper sensitivity, it is possible to diagnose a disease associated with the
본 발명의 진단용 조성물은 서열번호 1로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2로 표시되는 중쇄 가변부위를 함유하는 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 포함함을 특징으로 하는, Jagged 1 또는 그 발현의 억제제, 촉진제 및/또는 억제제를 처리한 환자를 모니터링하는데 사용할 수 있다.The diagnostic composition of the present invention comprises a human monoclonal antibody against Jagged 1 containing a light chain variable region represented by SEQ ID NO: 1 and a heavy chain variable region represented by SEQ ID NO: 2. Inhibitors, < / RTI > accelerators and / or inhibitors.
또한, 본 발명의 암 진단은 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 면역침강법(immunoprecipitation), 이뮤노 도트(immunodot) 또는 글라스 칩(glass chip) 등을 이용한 바이오센서를 이용하여 수행할 수 있으며, 특히 표면 플라즈몬 공명을 이용하는 바이오센서는 정성적인 정보(두 분자들이 특이적으로 결합을 하는지)와 정량적인 정보(반응 속도, Kinetics와 평형상수, equilibrium constants)를 제공할 뿐만 아니라 형광으로 표지할 필요 없이 실시간으로 감지할 수 있어, 항원과 항체 결합을 측정하는데 특히 유용하다.
The cancer diagnosis of the present invention can be performed using a biosensor using surface plasmon resonance, immunoprecipitation, immunodot or glass chip, In particular, biosensors using surface plasmon resonance provide qualitative information (whether two molecules specifically bind) and quantitative information (reaction rate, kinetics, equilibrium constants) It can be detected in real time and is particularly useful for measuring antigen and antibody binding.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.
인간항체 라이브러리 제조 및 Jagged 1에 결합하는 항체 선별Preparation of human antibody libraries and screening of antibodies binding to Jagged 1
1-1 : 파지 디스플레이 인간 항체 라이브러리 제조1-1: Preparation of phage display human antibody library
Jagged 1에 결합하는 항체를 선별하기 위해 인간 항체 라이브러리를 클로닝법을 이용하여 제조하였으며, pKB-Fab100 파지미드 벡터를 제한효소 Apa(New England Biolabs)와 EcoR-HF(New England Biolabs)으로 절단한 후 경쇄, 중쇄 유전자들을 그 자리에 클로닝하여 라이브러리를 제조하여 클로닝하였다.To select antibodies binding to Jagged 1, a human antibody library was prepared by cloning. The pKB-Fab100 phagemid vector was digested with restriction enzymes Apa (New England Biolabs) and EcoR-HF (New England Biolabs) The light and heavy chain genes were cloned in situ to prepare and clone the library.
먼저, 라이브러리를 구축하기 위하여 pKB-Fab100 파지미드 벡터에 제한 효소 Apa(New England Biolabs)을 25℃에서 1시간, EcoR-HF(New England Biolabs)를 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단하고, 1.5% 아가로스 젤(Agarose gel(Cambrex))을 이용하여 분리 정제하였다. 정제된 벡터와 정제된 유전자들을 몰/2몰 비율로 사용하여 20㎕의 10 x 리가아제(ligase) 완충용액, 10㎕의 T4 DNA 리가아제(ligase)와 살균 증류수를 넣어 200㎕가 되도록 한 후, 16℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날 라이게이션(ligation) 산물을 글리코겐을 가하고 에탄올 침전법으로 농축한 후 대장균의 형질전환에 사용하였다.First, the pKB-Fab100 phagemid vector was digested with restriction enzyme Apa (New England Biolabs) at 25 ° C for 1 hour and EcoR-HF (New England Biolabs) at 37 ° C for 2 hours to prepare a library. % Agarose gel (Cambrex). Using the purified vector and purified genes at a molar ratio of 2, 20 l of 10 x ligase buffer, 10 l of T4 DNA ligase and sterile distilled water were added to make 200 l , And reacted overnight at 16 ° C. The next day, the ligation product was added with glycogen, concentrated by ethanol precipitation, and then used for transformation of E. coli.
대장균의 형질전환(transformation)은 전기천공(electoporation)을 이용하였다. 전기천공 수용성 대장균(Electrocompetent E.coli ; TG1)에 상기에서 만들어진 라이게이션 산물을 2.5 kV, 200 O, 25 D 조건으로 엘렉트로포레이션(BioRad Gene Pulser Xcell 이용) 하였다. 이렇게 형질전환된 대장균은 23.5 cm x 23.5 cm x20.0 cm 의 암피실린(ampicilin)과 글루코오스(glucose), 마그네슘(magnesium)을 함유하고 있는 SOB 고형 배지 플레이트에 도말하여 밤새 37℃에서 키운 후 암피실린과 글루코즈, 마그네슘을 함유하고 있는 2YT 액체 배지를 이용하여 회수하였고 글리세롤을 최종 농도 20%로 가하여 -80℃에 보관하였다. 이때 만들어진 라이브러리의 크기는 전기천공 후 얻어진 대장균을 다단계로 희석하여 암피실린을 함유한 2YT 플레이트에 도말한 다음 37℃에서 밤새 키운 후 얻어진 cfu(colony forming unit)의 개수를 측정함으로써 결정하였으며, 2 x 109cfu의 라이브러리를 얻을 수 있었다.Transformation of E. coli was performed by electroporation. Electrocompetent E. coli (TG1) was electroporated (using BioRad Gene Pulser Xcell) under the conditions of 2.5 kV, 200 O and 25 D in the above-described ligation product. The transformed Escherichia coli was cultured on an SOB solid culture plate containing 23.5 cm x 23.5 cm x 20.0 cm of ampicillin, glucose and magnesium and incubated overnight at 37 ° C. Ampicillin and glucose , And 2YT liquid medium containing magnesium. Glycerol was added to a final concentration of 20% and stored at -80 ° C. The size of the prepared library was determined by measuring the number of cfu (colony forming units) obtained after electroporation, multiplying the obtained Escherichia coli by a multi-stage dilution, plating on a 2YT plate containing ampicillin, incubating overnight at 37 ° C, I was able to get a library of 9 cfu.
인간 항체 library(CDR3-24)를 포함하고 있는 대장균 세포를 OD600 값이 0.6-0.7이 되도록 배양한 후, 헬퍼 파지(helper phage; VCSM13)를 첨가하여 약 30분 동안 방치(standing), 약 30분 동안 흔들어(shaking) 준 다음, 카나마이신(70㎍/㎖)을 넣은 뒤 하룻밤 동안 배양하였다. 배양한 다음, 배양액으로 부터 라이브러리 파지를 회수하였다. The E. coli cells containing the human antibody library (CDR3-24) were cultured to an OD 600 value of 0.6-0.7, added with a helper phage (VCSM13), allowed to stand for about 30 minutes, Shaking for one minute, kanamycin (70 μg / ml), and then cultured overnight. After culturing, the library phage was recovered from the culture solution.
1-2 : 제조된 항체 라이브러리로부터 Jagged 1 펩타이드에 결합하는 항체의 선발1-2: Selection of antibody binding to Jagged 1 peptide from prepared antibody library
Jagged 1-펩타이드 100㎍을 코팅 완충용액 (15mM Na2CO3, 34.84 mM NaHCO3, pH 9.6) 1㎖에 섞어 면역튜브 (Maxisorp Immunotube, Nunc 사) 에 넣고 4℃에서 밤새 코팅한 다음, 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS 용액(PBST)으로 2번 세척하고 4% 탈지분유로 1시간 동안 실온에서 블로킹하였다. 다시 2번 세척한 후, 실시예 1에서 제조된 항원과 인간 항체 라이브러리를 디스플레이하고 있는 파지(3.8 x 1012)를 최종 농도 2% 탈지분유에 섞어 1㎖ 면역튜브에 넣고 37℃에서 1시간 동안 항원과 반응시켰다. 다음 0.5% Tween20이 첨가된 PBS로 1차 패닝의 경우 10회, 2차 패닝의 경우 20회, 3차 패닝의 경우 30회, 4차 패닝의 경우 40회 세척하였다, 1회 세척은 1㎖의 세척용액을 넣은 후 1㎖용 피펫만(pipetman) 을 사용하여 용액을 파이펫팅(up and down) 10번 한 후 4㎖의 세척 용액을 더 넣고 5분간 정치하여 두는 것을 의미한다. 세척 후 항원에 결합하고 있던 파지-항체들을 0.1M 글라이신(pH 2.5) 1㎖을 사용하여 분리시킨 다음 60㎕의 2 M Tris HCl pH 9.0를 가하여 중화한 후 즉시 OD600 값이 0.8이 되도록 키운 TG1 대장균에 감염시키고 암피실린(100㎍/㎖)을 함유하고 있는 2YT(2YTA) 고체배지에 도말한 후 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 때 각 패닝 초기에 사용한 파지의 수를 인풋(input)으로, 세척과정을 마친 이후 글라이신 용액에 의하여 분리된 후 TG1 대장균을 통하여 만들어진 콜로니의 수를 아웃풋(output) 파지의 수로 계산하여, 항원결합능이 있는 항체의 증폭 정도의 지표로 삼았다. 100 μg of Jagged 1-peptide was mixed with 1 ml of a coating buffer solution (15 mM Na 2 CO 3 , 34.84 mM NaHCO 3 , pH 9.6), and the mixture was coated overnight at 4 ° C. in an immune tube (Maxisorp Immunotube, Nunc) Tween 20-added PBS solution (PBST) and blocked with 4% skim milk for 1 hour at room temperature. After two washes again, the phage (3.8 x 10 12 ) displaying the antigen prepared in Example 1 and the human antibody library were mixed in a final concentration of 2% skim milk and placed in a 1 ml immune tube and incubated at 37 ° C for 1 hour And reacted with the antigen. The following 0.5% Tween 20-added PBS was washed 10 times for the first panning, 20 times for the second panning, 30 times for the third panning, and 40 times for the fourth panning. After adding the washing solution, the solution is pipetted up and down 10 times using a pipette pipetman, then 4 ml of washing solution is added, and the solution is allowed to stand for 5 minutes. After washing, phage that was bound to the antigen-antibody were separated by the use of 0.1M glycine (pH 2.5) and immediately 1㎖ OD 600 value was neutralized by adding 2 M Tris HCl pH 9.0 in a 60㎕ 0.8, cultured in 2YT (2YTA) solid medium containing ampicillin (100 μg / ml), and then cultured overnight at 37 ° C. The number of the phages used at the beginning of each panning was input, and after the washing process, the number of colonies made by the TG1 Escherichia coli after being separated by the glycine solution was calculated as the number of output phage, Was used as an indicator of the degree of amplification of the antibody.
1차 패닝 결과 얻어진 콜로니들을 모아 배양한 후 같은 방법으로 보조 파지를 넣고 배양하여 항체가 디스플레이드된 파지를 만들었고, 동일한 양의 항원에 대하여 2차, 3차, 4차 패닝을 진행하였다. 패닝 횟수가 증가됨에 따라 항원결합능이 높은 항체들이 증폭되고 있는지 확인하기 위하여, 라이브러리와 1차, 2차, 3차, 4차 패닝 후에 선택된 콜로니들을 모아 OD600 값이 0.8이 되도록 37℃에서 키운 후 IPTG를 최종농도 1mM로 가하여 28℃에서 밤새 발현시킨 다음 상층액에 존재하는 항체들의 항원결합능을 간접 ELISA 방법으로 측정하였다.The colonies obtained as a result of the first panning were collected and cultured, and the second phage was added in the same manner and cultured to prepare the phage displayed with the antibody, and the second, third and fourth panning was performed on the same amount of antigen. In order to confirm the amplification of antibodies with high antigen binding ability as the number of panning increases, the library and the selected colonies after the 1st, 2nd, 3rd and 4th panning were collected and OD 600 value 0.8, IPTG was added to the final concentration of 1 mM and expressed overnight at 28 ° C. Then, the antigen binding ability of the antibodies present in the supernatant was measured by an indirect ELISA method.
간접 ELISA는, Jagged 1-펩타이드를 96 웰 플레이트(MaxiSorp, Nunc)에 코팅한 후 상기 배양 상층액 100㎕를 각 웰에 넣고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이어서 PBST로 3번 세척한 다음, 1차 항원인 KR127을 0.05% PBST 에 1:3000으로 희석한 후 37℃에서 1시간 동안 부착시킨 다음, PBST로 3번 세척하였고, 2차 항원 mouse Fc-HRP(2nd antibody mouse Fc-HRP)를 0.05% PBST 에 1:3000으로 희석한 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음 다시 PBST로 3번 세척한 후, TMB(BD) 와 과산화수소수를 1:1의 비율로 섞어 100㎕ 씩 웰에 넣고 5분간 반응시킨 다음 2M H2SO4를 50㎕ 가하여 반응을 정지시켰다. 흡광 분석기(VERSA max 사의 microplate reader)를 이용하여 450nm 파장에서의 흡광도를 읽어 항체의 발현을 측정하였다.In an indirect ELISA, Jagged 1-peptide was coated on a 96-well plate (MaxiSorp, Nunc), and 100 쨉 l of the culture supernatant was added to each well, followed by reaction at room temperature for 30 minutes. After washing three times with PBST, the primary antigen KR127 was diluted 1: 3000 in 0.05% PBST, and attached at 37 ° C for 1 hour. Then, it was washed 3 times with PBST, and secondary antigen mouse Fc-HRP (2 nd antibody mouse Fc-HRP) was reacted at 37 ° C for 1 hour with 1: 3000 dilution in 0.05% PBST. After washing three times with PBST, 100 μl of TMB (BD) and hydrogen peroxide solution were mixed at a ratio of 1: 1, and reacted for 5 minutes. Then, 50 μl of 2 M H2SO4 was added to stop the reaction. Absorbance was read at 450 nm wavelength using a spectrophotometer (VERSA max microplate reader) and antibody expression was measured.
그 결과, 3차 패닝 후, Jagged 1-펩타이드에 특이적인 항체가 농축되는 것을 확인하였다. As a result, it was confirmed that the antibody specific to the Jagged 1-peptide was enriched after the third panning.
1-3 : 양성 항체 선발1-3: Selection of positive antibodies
Jagged 1-펩타이드에 결합하는 클론들을 선별하기 위해, 3차, 4차 패닝 후 용출된 파지들을 희석하여 TG1 대장균에 감염시킨 후 2YTA 고체배지에 도말하여 37℃ 항온기에 넣고 약 1000개의 단일 콜로니가 되도록 배양하였다. 단일 콜로니를 각각 2YTA 액체 배지 3㎖에 접종하고 37℃ 항온기에서 진탕 배양하면서 각 클론의 흡광도가 600nm에서 0.6 과 0.7 사이가 될 때까지 배양하였다. 다음, IPTG를 최종 농도 1 mM로 가하고 28℃ 항온기에서 밤새 진탕 배양한 후, 배양 상층액을 회수하였다. In order to screen clones bound to Jagged 1-peptide, the phages eluted after the 3rd and 4th panning were diluted, infected with TG1 E. coli, plated on 2 YTA solid medium, placed in a 37 ° C thermostat, and about 1000 single colonies Lt; / RTI > Single colonies were each inoculated into 3 ml of 2 YTA liquid medium and incubated at 37 ° C in a shaking incubator until the absorbance of each clone was between 0.6 and 0.7 at 600 nm. Next, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, incubated overnight at 28 ° C in a shaking incubator, and then the culture supernatant was recovered.
상층액에 존재하는 항체들의 항원결합능을 측정하기 위해, 실시예 1-2의 간접 ELISA 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. In order to measure the antigen binding ability of the antibodies present in the supernatant, an experiment was conducted in the same manner as in the indirect ELISA method of Example 1-2.
이러한 ELISA 과정을 통하여 대조군(negative control)에는 결합하지 않고 Jagged 1-펩타이드에 선택적으로 결합하는 7개의 양성 클론을 선별하였으며, 그 중에서도 Jagged 1-펩타이드에 결합력이 뛰어난 클론을 선택하여 J1J1으로 명명하고(도 1), 플라스미드 DNA를 분리한 후 염기서열을 분석하였다. Through these ELISA procedures, seven positive clones were selectively selected for binding to the Jagged 1-peptide without binding to the control (negative control). Among them, a clone having a strong binding ability to the Jagged 1-peptide was selected and named as J1J1 1), the plasmid DNA was isolated and the nucleotide sequence was analyzed.
그 결과, 선별된 J1J1 항체는 서열번호 9의 DNA 서열로 코딩되는 경쇄 가변부위와 서열번호 10의 DNA 서열로 코딩되는 중쇄 가변부위를 포함하는 것으로 분석되었으며, 아미노산 서열을 분석한 결과, J1J1 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변부위와 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변부위로 구성되는 것을 확인하였다. 또한, 경쇄 가변부위는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하고, 중쇄 가변부위는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 CDR1 부위, 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 CDR2 부위, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성된 CDR3 부위를 포함하는 것으로 분석되었다 (도 2). As a result, the selected J1J1 antibody was analyzed to include a light chain variable region encoded by the DNA sequence of SEQ ID NO: 9 and a heavy chain variable region encoded by the DNA sequence of SEQ ID NO: 10. As a result of amino acid sequence analysis, the J1J1 antibody A light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The light chain variable region comprises a CDR1 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a CDR2 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: A CDR1 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (FIG. 2).
JaggedJagged
1에 대한 항체의 염기서열 및 아미노산 서열 분석 1 < / RTI > < RTI ID = 0.0 >
실시예 1에서 선별한 J1J1 항체의 염기서열을 IMGT 소프트웨어(http://imgt.cines.fr/ IMGT_vquest /share/textes/)를 이용하여 인간 점라인 (germline) 염기서열과 비교 분석한 결과, 경쇄 가변영역은 인간 항체 점라인 카파 (Kappa) 그룹의 IGKV1-5*03(93.55% 동일) 으로부터 유래된 것으로 분석되었다. J1J1의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 IMGT 데이터 베이스(IMGT data base)에 있는 어느 중쇄 및 경쇄 서열과 100% 동일하지는 않았다. 이는 J1J1이 점라인 항체가 아니고 인체 내에서 성숙과정을 거친 새로운 항체임을 증명하는 것이다.
The nucleotide sequence of the J1J1 antibody selected in Example 1 was compared with a human germline base sequence using IMGT software (http://imgt.cines.fr/ IMGT_vquest / share / textes /). As a result, The variable region was analyzed to be derived from IGKV1-5 * 03 (93.55% identical) of the human antibody dotted line Kappa group. The heavy and light chain variable region sequences of J1J1 were not 100% identical to any heavy and light chain sequences in the IMGT data base. This demonstrates that J1J1 is not a pointline antibody but a new antibody that has undergone maturation in the human body.
J1J1J1J1
의 of
wholewhole
IgGIgG
로 전환 및 생산Conversion and production
선택된 J1J1을 보다 정밀하게 분석하기 위해, 먼저 이를 whole form으로 전환하여 293T cell에서 transfection expression 한 뒤, protein A column을 이용하여 정제하였다. In order to analyze the selected J1J1 more precisely, it was first transformed into whole form, transfected at 293T cell, and purified using protein A column.
Fab 형태의 J1J1을 whole form 형태로 전환하기 위하여 Fab J1J1로부터 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 중합효소연쇄반응에 의하여 증폭시켰고 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex) 을 통하여 분리한 다음 Zymo 겔 추출 키트(Zymoresearch, 미국)을 이용하여 정제하였다. 이때 사용한 프라이머는 경쇄 가변영역의 경우 서열번호 12와 서열번호 13이었고, 중쇄 가변영역의 경우 서열번호 14와 서열번호 15였다.
The heavy chain variable region and the light chain variable region were amplified by polymerase chain reaction from Fab J1J1 in order to convert the Fab form of J1J1 into a whole form form, separated through 1.5% agarose gel (Cambrex), and then transferred to a Zymo gel extraction kit , USA). The primers used herein were SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13 for the light chain variable region and SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15 for the heavy chain variable region.
[서열번호 12] 5'-TTGTCTGGTGTTGAAGGAGACATCCAGATGACCCAG-3'[SEQ ID NO: 12] 5'-TTGTCTGGTGTTGAAGGAGACATCCAGATGACCCAG-3 '
[서열번호 13] 5'-GCAGCCGCCGTACGTTTGATCTCCACTTTGGTCCCTTGGCC-3'[SEQ ID NO: 13] 5'-GCAGCCGCCGTACGTTTGATCTCCACTTTGGTCCCTTGGCC-3 '
[서열번호 14] 5'-ACTACAGGTGTCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGGAG-3'[SEQ ID NO: 14] 5'-ACTACAGGTGTCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGGAG-3 '
[서열번호 15] 5'-CACCGGTTCGGGGAAGT-3'
[SEQ ID NO: 15] 5'-CACCGGTTCGGGGAAGT-3 '
다음 항체를 동물세포에서 발현 생산할 수 있도록 pdCMV-dhfrC(대한민국 특허 등록번호 제10-0476363호)로부터 중쇄와 경쇄의 리더 시퀀스를 PCR에 의하여 합성하고 분리하고 1.5% 아가로즈 겔(Cambrex) 과 Zymo 겔 추출 키트 (Zymoresearch)을 통하여 분리 정제하였다. 이때 사용한 프라이머는 경쇄 리더 시퀀스의 경우 서열번호 16과 서열번호 17이었고, 중쇄 리더 시퀀스의 경우 서열번호 18과 서열번호 19였다. 다음 중쇄 리더 시퀀스와 중쇄 가변영역을, 경쇄 리더 시퀀스와 경쇄 가변영역을 각각 재조합(recombination) PCR을 이용하여 연결시켰고, 1.5% 아가로즈 겔(Cambrex)과 Zymo 겔 추출 키트를 통하여 분리 정제하였다.
The following heavy chain and light chain leader sequences were synthesized and separated from pdCMV-dhfrC (Korean Patent Registration No. 10-0476363) by PCR in order to express the following antibodies in animal cells: 1.5% agarose gel (Cambrex) and Zymo gel And extracted and purified through an extraction kit (Zymoresearch). The primers used herein were SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 for the light chain leader sequence and SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 for the heavy chain leader sequence. The following heavy chain leader sequences and heavy chain variable regions were ligated to the light chain leader sequence and the light chain variable region using recombination PCR, respectively, and purified by 1.5% agarose gel (Cambrex) and Zymo gel extraction kit.
[서열번호 16] 5'-TGCAAAGCTTCGGCACGAGCA-3'[SEQ ID NO: 16] 5'-TGCAAAGCTTCGGCACGAGCA-3 '
[서열번호 17] 5'-TCCTTCAACACCAGACAAC-3' [SEQ ID NO: 17] 5'-TCCTTCAACACCAGACAAC-3 '
[서열번호 18] 5'-GACGAATTCACTCTAACCATGGAA-3'[SEQ ID NO: 18] 5'-GACGAATTCACTCTAACCATGGAA-3 '
[서열번호 19] 5'-GGAGTGGACACCTGTAG-3'
[SEQ ID NO: 19] 5'-GGAGTGGACACCTGTAG-3 '
이것을 중쇄는 제한효소 EcoRI(Roche, 스위스)과 ApaI(Roche, 스위스)으로, 경쇄는 HindⅢ(Roche, 스위스)와 BsiWI(Roche, 스위스)로 잘라 동일한 제한효소로 절단하고 정제한 pdCMV-dhfrC 벡터의 중쇄와 경쇄 불변영역 위쪽에 각각 클로닝하고 pdCMV-dhfrC-J1J1라 명명하였다. The light chain was digested with restriction enzymes EcoRI (Roche, Switzerland) and ApaI (Roche, Switzerland) and the light chain was cut with HindIII (Roche, Switzerland) and BsiWI (Roche, Switzerland) and digested with the same restriction enzymes to obtain pdCMV-dhfrC vector Cloned at the top of the heavy and light chain constant regions, respectively, and named pdCMV-dhfrC-J1J1.
상기 pdCMV-dhfrC-J1J1 DNA를 HEK293T 세포에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 미국)을 사용하여 형질전환하였다. 4-6시간 동안 37℃ 5% CO2 항온 배양기에서 배양한 후 혈청을 함유하고 있지 않은 배지 CD293(Gibco,미국)로 바꾸어 3일간 동일한 항온 배양기에서 배양하여 J1J1 생산하는 상청액을 모으기 시작했다. 상기에서 얻어진 상청액 으로부터 protein A 아가로즈 컬럼(Upstate, 미국)을 통하여 J1J1 항체를 정제하였다. 그 결과, 이 항체를 환원시켰을 때에 항체의 중쇄 및 경쇄의 분자량으로 알려진 55 KDa, 25 KDa의 분자량을 갖는 단백질 밴드를 관찰하였다 (도 3).
The pdCMV-dhfrC-J1J1 DNA was transformed into HEK293T cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA). After incubation for 4 to 6 hours at 37 ° C in a 5% CO2 incubator, the medium was replaced with serum-free medium CD293 (Gibco, USA) and incubated for 3 days in the same incubator to collect the supernatant from J1J1. The J1J1 antibody was purified from the supernatant obtained above through a protein A agarose column (Upstate, USA). As a result, when this antibody was reduced, a protein band having a molecular weight of 55 KDa and 25 KDa, which is known as the molecular weight of the heavy chain and the light chain of the antibody, was observed (FIG. 3).
J1J1J1J1
항체의 암세포 성장 억제능력 확인 Identification of antibody's ability to inhibit cancer cell growth
실시예 3에서 정제한 whole form의 J1J1항체의 암세포 성장 억제 능력을 확인하였다. The ability of the whole form of J1J1 purified in Example 3 to inhibit cancer cell growth was confirmed.
먼저, OVCAR3(KCLB No. 30161), SKOV3(KCLB No. 30077) 각각의 세포를 96 웰 플레이드의 각 웰 당 1x103이 되도록 깔아준 후, 대조군 항체 IgG(Thermo Cat No.31414)와 J1J1항체의 농도가 20㎍/㎖이 되도록 1% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지와 혼합하여 100㎕/well로 처리하였다. 그 다음, 5% CO2 , 37℃조건의 배양기에서 배양하였으며, 배양 24시간, 48시간, 72시간 후에 MTT assay를 통해 세포 생존율을 확인해 보았다. First, each cell of OVCAR3 (KCLB No. 30161) and SKOV3 (KCLB No. 30077) was plated to be 1 × 10 3 per well of a 96 well plate. Then, a control antibody IgG (Thermo Cat No.31414) and a J1J1 antibody Was mixed with RPMI 1640 (WEL GENE Cat No. LM011-01) medium containing 1% FBS (HyClone Cat No. SH30919.03) at a concentration of 20 μg / ml and treated with 100 μl / well. Then, the cells were cultured in a 5
MTT assay는 MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)를 DPBS에 0.5㎎/㎖이 되도록 녹인 후, 1% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지에 6배 희석하여 각 웰에 120㎕/well로 처리하였으며, 그 다음 5% CO2 , 37℃조건의 배양기에서 4시간 동안 배양한 후, 배지 제거 후, 100㎕/well의 DMSO를 처리하여 562nm에서 흡광도 측정하였다.MTT assay was performed by dissolving Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) in DPBS to a concentration of 0.5 mg / ml, and then culturing in RPMI 1640 (WEL GENE Cat No. LM011-01) medium containing 1% FBS (HyClone Cat No. SH30919.03) after a six-fold dilution was treated with 120㎕ / well to each well and then were incubated for 4 hours in an incubator of 5
J1J1항체를 처리하여 24 시간, 48시간, 72시간 후에 세포 생존율을 확인해 본 결과, 대조군에 비해 OVCAR3 세포는 약 70% 정도 생존율이 감소하는 것을 확인하였으며(도 4), SKOV3 세포는 약 60% 정도 생존율이 감소하는 것을 확인하여(도 5), J1J1 항체에 의해 암세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였다.
The cell survival rate after 24 hours, 48 hours, and 72 hours after treatment with J1J1 antibody was confirmed to be about 70% that of OVCAR3 cells compared to the control (Fig. 4). SKOV3 cells showed about 60% It was confirmed that the survival rate was decreased (Fig. 5), and it was confirmed that the growth of cancer cells was inhibited by the J1J1 antibody.
J1J1J1J1
항체의 암세포 전이( Cancer cell metastasis of antibody (
migrationmigration
) 및 침윤() And infiltration (
invasiveinvasive
)능력 저해 효과확인 ) Confirmation of ability inhibition effect
in vitro상에서 J1J1항체에 의한 암세포의 전이 및 침윤 능력을 확인해 보았다. 전이와 침윤은 침윤 현상을 관찰하기 위해서 Matrigel(BD Science Cat No. 356234)를 DPBS에 100배 희석하여 Transwell(Corning costar Cat No. 3422) 위쪽 면에 상온에서 1시간 동안 코팅한 후에 실험을 수행하였다. The ability of J1J1 antibody to metastasize and infiltrate cancer cells in vitro was examined. Transfection and infiltration were performed by diluting a 100-fold dilution of Matrigel (BD Science Cat No. 356234) in DPBS and coating it on the upper surface of Transwell (Corning costar Cat No. 3422) for 1 hour at room temperature to observe the infiltration phenomenon .
OVCAR3(KCLB No. 30161), SKOV3(KCLB No. 30077) 각각의 세포를 코팅한 tranwell에 2x104 cells/well로 깔아준 후 대조군 항체 IgG(Thermo Cat No.31414)와 J1J1항체의 농도가 20㎍/㎖이 되도록 1% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지와 혼합하여 150㎕/well로 처리하였다. 그 다음 5% CO2 , 37℃조건의 배양기에서 4시간 동안 배양한 후 암세포의 전이 및 침윤 정도를 현미경으로 관찰하였다. Each of the cells was coated with 2 × 10 4 cells / well in a tranwell coated with OVCAR3 (KCLB No. 30161) and SKOV3 (KCLB No. 30077), and the concentration of the control antibody IgG (Thermo Cat No. 31414) and J1J1 antibody was 20 μg / ML and mixed with RPMI 1640 (WEL GENE Cat No. LM011-01) medium containing 1% FBS (HyClone Cat No. SH30919.03), and treated with 150 μl / well. After incubation for 4 hours in a 5
J1J1항체에 의한 암세포의 전이 및 침윤 능력을 확인해본 결과, J1J1항체를 처리하였을 때, 대조군에 비해 OVCAR3(도 6) 및 SKOV3(도 7) 의 전이 및 침윤이 억제된 것을 확인하여, J1J1 항체에 의해 암세포의 전이 및 침윤 능력이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
J1J1 antibody inhibited the metastasis and infiltration of OVCAR3 (Fig. 6) and SKOV3 (Fig. 7) compared to the control group, indicating that the J1J1 antibody inhibited the metastasis and infiltration of the J1J1 antibody It was confirmed that the ability of metastasis and invasion of cancer cells was inhibited.
J1J1J1J1
항체에 의한 By antibody
notchnotch
시그널 변화 확인 Signal change confirmation
6-1 : 6-1:
notchnotch
시그널의 Of signal
mRNAmRNA
발현 변화 확인 Identification of expression changes
Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, Jagged 1, Hes 1의 mRNA 발현정도를 관찰하기 위해, 각각의 OVCAR3(KCLB No. 30161) 및 SKOV3(KCLB No. 30077) 세포를 10% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지를 사용하여 5% CO2 , 37℃조건의 배양기에서 1주일 안정화시켰다. 그 후, 각각의 세포를 6well plate(Coning Costar Cat No. CLS3516)에 2x105 cells/well로 깔아준 후 대조군 항체 IgG(Thermo Cat No.31414)와 J1J1항체의 농도가 20㎍/㎖이 되도록 1% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지와 혼합하여 2㎖/well로 처리하였다. 그 다음 5% CO2 , 37℃조건의 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 RNA를 추출하였다.Each of OVCAR3 (KCLB No. 30161) and SKOV3 (KCLB No. 30077) cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (HyClone) (WEL GENE Cat No. LM011-01) medium containing 5
RNA는 RIzol®RNA Isolation Reagents(ambion Life technology Cat No. 15596018)를 사용하였으며, 그에 준하는 프로토콜에 의해 추출하였다. 추출 후, SuperScript First-Strand(Invitrogen Cat No. 11904-018)를 사용하여 역전사 (Reverse Transcription) 시켜 생성된 DNA 50ng을 주형가닥으로 하여, 각 유전자들에 2㎕의 2pmol 프라이머와 aldAmp GT PCR Master Mix(TaKaRa Cat No. RR310A)를 섞어 94℃에서 5분간 전처리반응을 시킨 다음, 94℃에서 30초간 DNA를 변성시키고, 55℃에서 30초간 프라이머를 결합시킨다. 72℃에서 30초간 DNA를 합성시키는 과정을 25회 반복하였고, 마지막 단계에서는 72℃에서 7분간 반응시켜 효소가 충분히 활성을 발휘하도록 하여 유전자를 증폭하였다. The RNA was extracted using the RIzol® RNA Isolation Reagents (Ambion Life technology Cat No. 15596018) and a protocol similar thereto. After extraction, 50 ng of DNA generated by reverse transcription using SuperScript First-Strand (Invitrogen Cat No. 11904-018) was used as a template strand and 2 μl of 2 pmol primer and aldAmp GT PCR Master Mix (TaKaRa Cat No. RR310A), followed by pretreatment at 94 ° C for 5 minutes, denaturing the DNA at 94 ° C for 30 seconds, and binding the primer at 55 ° C for 30 seconds. The process of synthesizing DNA at 72 ° C for 30 seconds was repeated 25 times. In the final step, the reaction was carried out at 72 ° C for 7 minutes to amplify the gene so that the enzyme exhibited sufficient activity.
유전자 증폭에 사용한 프라이머는 각 유전자를 증폭할 수 있도록 디자인하여 합성하였다 (바이오니아, 한국)
Primers used for gene amplification were designed and synthesized to amplify each gene (Bioneer, Korea)
Human GAPDH 프라이머Human GAPDH primer
[서열번호 20] 5'-GAGCTGAACGGGAAGCTCACTGG-3'[SEQ ID NO: 20] 5'-GAGCTGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '
[서열번호 21] 5'-CAACTGTGAGGAGGGGAGATTCAG-3'
[SEQ ID NO: 21] 5'-CAACTGTGAGGAGGGGAGATTCAG-3 '
Human β-actin 프라이머Human β-actin primer
[서열번호 22] 5'-GCGAGAAGATGACCCAGATCATGTT-3'[SEQ ID NO: 22] 5'-GCGAGAAGATGACCCAGATCATGTT-3 '
[서열번호 23] 5'-GCTTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'
[SEQ ID NO: 23] 5'-GCTTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3 '
Human Jagged-1 프라이머Human Jagged-1 Primer
[서열번호 24] 5'-CAACCGTGCCAGTGACTATTTCTGC-3'[SEQ ID NO: 24] 5'-CAACCGTGCCAGTGACTATTTCTGC-3 '
[서열번호 25] 5'-TGTTCCCGTGAAGCCTTTGTTACAG-3'
[SEQ ID NO: 25] 5'-TGTTCCCGTGAAGCCTTTGTTACAG-3 '
Human Hes1 프라이머Human Hes1 primer
[서열번호 26] 5'-TACCTCTCTCCTTGGTCCTGGAAC-3'[SEQ ID NO: 26] 5'-TACCTCTCTCCTTGGTCCTGGAAC-3 '
[서열번호 27] 5'-CAGATGCTGTCT TTGGTTTATCCG-3'
[SEQ ID NO: 27] 5'-CAGATGCTGTCT TTGGTTTATCCG-3 '
Human NOTCH3 프라이머Human NOTCH3 primer
[서열번호 28] 5'-gttcatgcattgacctcgtg-3'[SEQ ID NO: 28] 5'-gttcatgcattgacctcgtg-3 '
[서열번호 29] 5'-gtagccaggaagacactcac-3'
[SEQ ID NO: 29] 5'-gtagccaggaagacactcac-3 '
Human NOTCH1 프라이머Human NOTCH1 primer
[서열번호 30] 5'-tccaccagtttgaatggtca-3'[SEQ ID NO: 30] 5'-tccaccagtttgaatggtca-3 '
[서열번호 31] 5'-ggacttgcccaggtcatcta-3'
[SEQ ID NO: 31] 5'-ggacttgcccaggtcatcta-3 '
Human NICD3 프라이머Human NICD3 primer
[서열번호 32] 5'-AGCACTTTGGGAATTCTGGA-3'[SEQ ID NO: 32] 5'-AGCACTTTGGGAATTCTGGA-3 '
[서열번호 33] 5'-ACGTCCTTGTGCAGTGAGAA-3'
[SEQ ID NO: 33] 5'-ACGTCCTTGTGCAGTGAGAA-3 '
Human NICD1 프라이머Human NICD1 primer
[서열번호 34] 5'-cctgagggcttcaaagtgtc-3'[SEQ ID NO: 34] 5'-cctgagggcttcaaagtgtc-3 '
[서열번호 35] 5'-cggaacttcttggtctccag-3'
[SEQ ID NO: 35] 5'-cggaacttcttggtctctagag-3 '
상기 증폭된 유전자를 전기영동(1.5% Agarose gel, 100V 15분)하여, Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, Jagged 1, Hes 1의 mRNA 발현정도를 확인해본 결과, J1J1 항체를 처리하였을 때, 대조군에 비해 OVCAR3(도 9) 및 SKOV3(도 10)의 Notch 1, NICD 1, Notch 3, Jagged 1, Hes 1의 mRNA 발현이 크게 감소하는 것을 확인하여, 본 발명의 J1J1 항체가 Notch 시그널을 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
The amplified gene was subjected to electrophoresis (1.5% agarose gel, 100 V for 15 minutes) to examine the mRNA expression level of
6-2 : 6-2:
notchnotch
시그널의 단백질 발현 변화 확인 Identification of protein expression changes in signal
Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, Jagged 1, Hes 1의 단백질 발현정도를 관찰하기 위해, 각각의 OVCAR3(KCLB No. 30161) 세포를 10% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지를 사용하여 5% CO2 , 37℃조건의 배양기에서 1주일 안정화시켰다. 그 후, 각각의 세포를 6well plate(Coning Costar Cat No. CLS3516)에 2x105 cells/well로 깔아준 후 대조군 항체 IgG(Thermo Cat No.31414)와 J1J1항체의 농도가 20㎍/㎖이 되도록 1% FBS(HyClone Cat No. SH30919.03)가 포함된 RPMI 1640(WEL GENE Cat No. LM011-01) 배지와 혼합하여 2㎖/well로 처리하였다. 그 다음 5% CO2 , 37℃조건의 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 단백질을 추출하였다.To observe protein expression levels of
단백질은 Laemmli's Sample Buffer Reducing(GenDEPOT Cat No. L1100-011)와 3:1비율로 섞어 95℃에서 5분 반응하여, 전기영동(10% acrylamide gel, 90V 180분)하였다. 그 후 PVDF membrane(Roche Cat No. 03010040001)으로 옮겨 웨스턴 블럿을 하였다. 이때, 1차 항체는 NOTCH1(Santacruz SC-37389), NOTCH3(Santacruz SC-5596), Jaggeg1(Santacruz SC-135955), Hes1(Santacruz SC-166410), NICD1(Cellsignaling 2421S) 및 GAPDH(Santacruz SC-166574)를 사용하였으며, 2차 항체는 goat anti-rabbit IgG-HRP(Santacruz SC-2004) 및 goat anti-mouse IgG-HRP(Santacruz SC-2005)르 사용하였다.The proteins were mixed with Laemmli's Sample Buffer Reducing (GenDEPOT Cat No. L1100-011) at a ratio of 3: 1 and reacted at 95 ° C for 5 minutes and electrophoresed (10% acrylamide gel, 90V for 180 minutes). Then, it was transferred to a PVDF membrane (Roche Cat No. 03010040001) and Western blotted. The primary antibodies were notCH1 (Santacruz SC-37389), NOTCH3 (Santacruz SC-5596), Jaggeg1 (Santacruz SC-135955), Hes1 (Santacruz SC-166410), NICD1 (Cellsignaling 2421S) and GAPDH ) And goat anti-rabbit IgG-HRP (Santacruz SC-2004) and goat anti-mouse IgG-HRP (Santacruz SC-2005) were used as secondary antibodies.
Notch 시그널 관련된 Notch 1, NICD 1, Notch 3, Jagged 1, Hes 1의 단백질 발현정도를 확인해본 결과, J1J1 항체를 처리하였을 때, 대조군에 비해 OVCAR3 세포에서 Notch 1, NICD 1, Notch 3, Jagged 1, Hes 1의 단백질 발현이 크게 감소하는 것을 확인하여(도 11), 본 발명의 J1J1 항체가 Notch 시그널을 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
inin
vivovivo
상에서 On
J1J1J1J1
항체의 항암효과 확인 Antitumor effect of antibodies
난소선암(ovarian adenocarcinoma) 세포인 OVCAR-3를 이종이식한 마우스 모델(nude mouse; 5주령 BALB/c-nu)에서의 J1J1 항체의 항암효과를 확인하였다. The anticancer effect of J1J1 antibody in nude mice (5-week-old BALB / c-nu) transplanted with ovarian adenocarcinoma cells OVCAR-3 was confirmed.
인간 암세포는 난소선암(ovarian adenocarcinoma) 세포인 OVCAR-3 세포주를 사용하였으며, 종양 세포 주입은 (day 0) 4 x 106 세포 (DPBS) / 100㎕의 세포농도로 마우스의 좌측 옆구리에 피하주사(s.c. inject) 하였다.The human cancer cells were OVCAR-3 cells, which were ovarian adenocarcinoma cells. Tumor cells were injected subcutaneously (sc 0) at the left side of the mouse at a cell concentration of 4 x 10 6 cells (DPBS) / 100 μl injected.
J1J1 항체는 정맥주사(I. V. injection)하였으며, 종양 세포를 주사한 'day 0'으로 부터 24시간 후의 'day 1'으로 하여 day 7부터 항체를 주사를 시작하였으며, 주 당 3회의 스케줄로 행하였다. 마우스 5 마리를 1 그룹으로 하여, 2 가지 그룹으로 나누어 실험을 실시하였다. 그룹 1은 FC 그룹(대조군)(= 10㎎/㎏)을 주사하였고, 그룹 2는 100㎍/ea (= 10㎎/㎏)으로 J1J1 항체를 주사하였다. 마우스에 나타난 종양의 크기는 격일로 다음과 같은 공식으로 4주 측정하였다.The J1J1 antibody was injected intravenously (I V. injection) and the injection of antibody was started from day 7 using 'day 1' after 24 hours from 'day 0' injection of tumor cells, and was performed with three schedules per week. Five mice were used as one group and the experiment was divided into two groups.
그 후, 마우스의 조직을 분리하였으며, 분리된 조직은 30% 포르말린에 고정한 후, 70% EtOH 1시간, 80% EtOH 1시간, 90% EtOH 1시간, 100% EtOH 1시간, 100% EtOH 1시간, EtOH 1 : Xylene 1 1시간, Xylene 1시간, Paraffin 1 : Xylene 1 1시간의 탈수 및 투명과정을 거친 후 paraffin으로 블록을 만들었다. 이 후, 10㎛로 박절하였다. 박절한 조직을 ottix plus 5분, ottix plus 15분, ottix shaper 3분, runing water 5분, hematoxylin 10분, running water 30초, ottix shaper 1분, eosin 20초, ottix shaper 3분, ottix plus 5분, ottix plus 10분 과정을 통해 H&E staining하였다. TUNEL staining은 박절한 조직을 10mM citric acid로 370W 5분 반응한 후, In situ Cell Death Detection Kit, POD(Roche Cat No. 11684817910)로 TUNEL staining하였다.The tissues of mouse were then separated and fixed in 30% formalin, followed by 1 hour in 70% EtOH, 1 hour in 80% EtOH, 1 hour in 90% EtOH, 1 hour in 100% EtOH, 1 hour in 100% EtOH , EtOH 1: Xylene for 1 hour, Xylene for 1 hour, Paraffin 1: Xylene for 1 hour. After dehydration and transparency, the block was made with paraffin. Thereafter, it was separated into 10 mu m. Hematoxylin 10 min, running water 30 sec, ottix shaper 1 min,
그 결과, H&E 염색을 통해, J1J1 항체를 처리한 군에서 세포의 핵이 줄어든 것을 확인하였으며, TUNEL 염색을 통해 J1J1 항체를 처리한 군에서 세포사멸(apoptisis)이 일어나는 것을 확인하였다 (도 12).
As a result, it was confirmed through H & E staining that the nuclei of the cells were reduced in the group treated with the J1J1 antibody, and apoptisis was observed in the group treated with the J1J1 antibody through TUNEL staining (Fig. 12).
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments, It will be obvious. It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.
<110> korea research institute of bioscience and biotechnology <120> Human Monoclonal Antibody against Jagged 1 <130> P13-B155 <160> 35 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable light chain <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Asn Phe Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable heavy chain <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Cys Asp Asn Ser Arg Arg Ala Cys Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable light chain CDR1 <400> 3 Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable light chain CDR2 <400> 4 Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable light chain CDR3 <400> 5 Gln Gln His Ser Asn Phe Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 1 5 10 15 Glu Ile Lys <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable Heavy chain CDR1 <400> 6 Ser Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable Heavy chain CDR2 <400> 7 Arg Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable Heavy chain CDR3 <400> 8 Phe Cys Asp Asn Ser Arg Arg Ala Cys Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 1 5 10 15 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 20 25 <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable light chain <400> 9 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgcgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gattgtttct tcttggctgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatagg gcatccaact tggcaagtgg ggtcccatca 180 cgcttcagtg gcagtggatc tgggacggat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cattccaact ttcctgtcac gttcggccaa 300 gggaccaaag tggagatcaa a 321 <210> 10 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable heavy chain <400> 10 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggagggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttctct tcttactgga tgagctgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttctagg atttctccgg ctggcggtta tactaactac 180 gcagactctg tgaagggccg tttcaccatc tcccgggaca actctaagaa cactctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtct attactgtgc gagattctgc 300 gacaacagcc ggcgcgcctg ctatgcgatg gattattggg gccaaggcac cctggtcacc 360 gtctcctcgg ccagc 375 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Jagged 1 peptide <400> 11 Arg Cys Gly Pro Asp Cys Phe Asp Asn Tyr Gly Arg Tyr Lys Tyr Cys 1 5 10 15 Phe <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL primer forward <400> 12 ttgtctggtg ttgaaggaga catccagatg acccag 36 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL primer reverse <400> 13 gcagccgccg tacgtttgat ctccactttg gtcccttggc c 41 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH primer forward <400> 14 actacaggtg tccactccga agtgcagctg gtggag 36 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH primer reverse <400> 15 caccggttcg gggaagt 17 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL leader sequence primer forward <400> 16 tgcaaagctt cggcacgagc a 21 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL leader sequence primer reverse <400> 17 tccttcaaca ccagacaac 19 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH leader sequence primer forward <400> 18 gacgaattca ctctaaccat ggaa 24 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH leader sequence primer reverse <400> 19 ggagtggaca cctgtag 17 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH primer forward <400> 20 gagctgaacg ggaagctcac tgg 23 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAPDH primer reverse <400> 21 caactgtgag gaggggagat tcag 24 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human b-actin primer forward <400> 22 gcgagaagat gacccagatc atgtt 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human b-actin primer reverse <400> 23 gcttctcctt aatgtcacgc acgat 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Jagged-1 primer forward <400> 24 caaccgtgcc agtgactatt tctgc 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Jagged-1 primer reverse <400> 25 tgttcccgtg aagcctttgt tacag 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Hes1 primer forward <400> 26 tacctctctc cttggtcctg gaac 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Hes1 primer reverse <400> 27 cagatgctgt ctttggttta tccg 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH3 primer forward <400> 28 gttcatgcat tgacctcgtg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH3 primer reverse <400> 29 gtagccagga agacactcac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH1 primer forward <400> 30 tccaccagtt tgaatggtca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH1 primer reverse <400> 31 ggacttgccc aggtcatcta 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NICD3 primer forward <400> 32 agcactttgg gaattctgga 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NICD3 primer reverse <400> 33 acgtccttgt gcagtgagaa 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NICD1 primer forward <400> 34 cctgagggct tcaaagtgtc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NICD1 primer reverse <400> 35 cggaacttct tggtctccag 20 <110> korea research institute of bioscience and biotechnology <120> Human Monoclonal Antibody against Jagged 1 <130> P13-B155 <160> 35 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable light chain <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Ser Asn Phe Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable heavy chain <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 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Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable Heavy chain CDR3 <400> 8 Phe Cys Asp Asn Ser Arg Arg Ala Cys Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 1 5 10 15 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 20 25 <210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable light chain <400> 9 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgcgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gattgtttct tcttggctgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatagg gcatccaact tggcaagtgg ggtcccatca 180 cgcttcagtg gcagtggatc tgggacggat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag cattccaact ttcctgtcac gttcggccaa 300 gggaccaaag tggagatcaa a 321 <210> 10 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> J1J1 variable heavy chain <400> 10 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggagggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttctct tcttactgga tgagctgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttctagg atttctccgg ctggcggtta tactaactac 180 gcagactctg tgaagggccg tttcaccatc tcccgggaca actctaagaa cactctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtct attactgtgc gagattctgc 300 gacaagaccc ggcgcgcctg ctatgcgatg gattattggg gccaaggcac cctggtcacc 360 gtctcctcgg ccagc 375 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Jagged 1 peptide <400> 11 Arg Cys Gly Pro Asp Cys Phe Asp Asn Tyr Gly Arg Tyr Lys Tyr Cys 1 5 10 15 Phe <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL primer forward <400> 12 ttgtctggtg ttgaaggaga catccagatg acccag 36 <210> 13 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL primer reverse <400> 13 gcagccgccg tacgtttgat ctccactttg gtcccttggc c 41 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH primer forward <400> 14 actacaggtg tccactccga agtgcagctg gtggag 36 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH primer reverse <400> 15 caccggttcg gggaagt 17 <210> 16 <211> 21 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primer reverse <400> 23 gcttctcctt aatgtcacgc acgat 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Jagged-1 primer forward <400> 24 caaccgtgcc agtgactatt tctgc 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Jagged-1 primer reverse <400> 25 tgttcccgtg aagcctttgt tacag 25 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Hes1 primer forward <400> 26 tacctctctc cttggtcctg gaac 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Hes1 primer reverse <400> 27 cagatgctgt ctttggttta tccg 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH3 primer forward <400> 28 gttcatgcat tgacctcgtg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH3 primer reverse <400> 29 gtagccagga agacactcac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NOTCH1 primer forward <400> 30 tccaccagtt tgaatggtca 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA 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Claims (13)
A CDR1 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; a light chain variable region comprising the CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5; and a CDR1 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: A human monoclonal antibody against Jagged 1 comprising a heavy chain variable region comprising a CDR2 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and a CDR3 region consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO:
2. The human monoclonal antibody for Jagged 1 according to claim 1, which comprises a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
A gene encoding a human monoclonal antibody against Jagged 1 of claim 1 or 2.
The gene according to claim 3, which comprises a light chain variable region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 and a heavy chain variable region represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
A recombinant vector containing the gene of claim 3.
A recombinant cell having the ability to produce human monoclonal antibody against Jagged 1, characterized in that the gene of claim 3 or a recombinant vector containing said gene is introduced into the host cell.
7. The recombinant cell of claim 6, wherein said host cell is HEK293.
(a) 제7항의 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체 생산능을 가지는 재조합 세포를 배양하여 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 생성하는 단계; 및
(b) 생성된 Jagged 1에 대한 인간 단일클론항체를 회수하는 단계.
A method for producing a human monoclonal antibody against Jagged 1 comprising the steps of:
(a) culturing a recombinant cell having the ability to produce human monoclonal antibodies against Jagged 1 of claim 7 to produce a human monoclonal antibody to Jagged 1; And
(b) recovering the human monoclonal antibody against the resulting Jagged 1.
The method according to claim 8, wherein the human monoclonal antibody to Jagged 1 is further purified using FPLC with a Protein A affinity column, SP-sepharose column and size exclusion chromatography, Lt; / RTI > antibody.
A composition for treating cancer comprising a human monoclonal antibody against Jagged 1 of claim 1 or 2.
11. The composition according to claim 10, wherein the cancer is selected from the group consisting of cervical cancer, lung cancer, pancreatic cancer, ovarian cancer, breast cancer and prostate cancer.
A cancer diagnostic composition comprising a human monoclonal antibody directed against Jagged 1 of claim 1 or 2.
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