KR101550101B1 - Preparation method of fatty acid phytosterol ester using immobilized lipase derived from candida rugosa - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고정화된 리파아제를 이용하여 피토스테롤 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 칸디다 루고사 (Candida rugosa) 유래 고정화 리파아제를 이용한 지방산 피토스테롤 에스테르의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조 방법에 따르면 향상된 수율의 피토스테롤 에스테르를 얻을 수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a method for producing phytosterol esters using immobilized lipase, and more particularly to a method for producing phytosterol esters using Candida The present invention relates to a method for producing fatty acid phytosterol esters using immobilized lipase derived from rugosa . According to the preparation method of the present invention, an improved yield of phytosterol ester can be obtained.
Description
본 발명은 피토스테롤 에스테르의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 칸디다 루고사 (Candida rugosa) 유래 고정화 리파아제를 이용한 지방산 피토스테롤 에스테르의 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing phytosterol esters, and more specifically, to Candida The present invention relates to a method for producing fatty acid phytosterol esters using immobilized lipase derived from rugosa .
피토스테롤은 탄소 사슬 이 결합되어 있는 고리형 구조를 가진 식물성 화합물로, 고리형 구조 내 이중결합의 유무에 따라 스테롤과 스탄올로 나뉜다. 피토스테롤로 베타시토스테롤 (β-sistosterol) 캠페스테롤 (campesterol), 스티그마스테롤 (stigmasterol)이 가장 대표적이다. 피토스테롤은 콜레스테롤과 구조적 유사성을 갖기 때문에 체내 콜레스테롤의 흡수를 저해하여 혈중 콜레스테롤 수치를 낮추는 효과를 갖는다고 알려져 있다. 그러나 유리 형태 피토스테롤은 물과 기름에의 낮은 용해도와 높은 융점 때문에 식품에 적용하기가 쉽지 않다. 또한 물에 대한 낮은 용해도 때문에 피토스테롤은 체내에서의 낮은 반응성을 나타내므로 효과를 나타내게 하기 위해서는 과량을 섭취하여야만 하는 문제점이 있다.
Phytosterol is a phytochemical compound with a cyclic structure in which a carbon chain is bonded. The phytosterol is divided into sterols and stanols, depending on the presence or absence of double bonds in the cyclic structure. Phytosterol β-sistosterol Campesterol and stigmasterol are the most representative. It is known that phytosterol has structural similarity to cholesterol and therefore has the effect of inhibiting the absorption of cholesterol in the body and lowering the blood cholesterol level. However, the free form of phytosterol is not easy to apply to food because of its low solubility in water and oil and its high melting point. In addition, because of its low solubility in water, phytosterol exhibits low reactivity in the body, and therefore, there is a problem that an excessive amount of phytosterol must be consumed in order to exhibit its effect.
유리 형태 피토스테롤과는 달리 피토스테롤 에스테르는 기름에 대한 높은 용해도를 나타내므로 유지 성분의 식품에의 적용이 용이하다. 이 때문에 이전 많은 연구에서 화학적 촉매를 통한 피토스테롤 에스테르의 합성 방법이 보고 되었다 (KR 2000-0012176). 하지만 화학적 방법은 높은 에너지를 요구한다는 점과 3,5-다이엔 스테로이드 유도체 등의 부산물을 생성시킬 수 있다는 점에서 단점을 갖는다. 따라서 피토스테롤 에스테르의 합성 방법으로 효소적 방법이 높지 않은 온도에서 적은 부산물을 생성하기 때문에 더 유리하다.
Unlike glassy phytosterols, phytosterol esters exhibit high solubility in oil, making it easy to apply the preservative ingredients to food. Because of this, many previous studies have reported the synthesis of phytosterol esters via chemical catalysts (KR 2000-0012176). However, chemical methods have disadvantages in that they require high energy and can produce by-products such as 3,5-dienesteroid derivatives. Therefore, the method of synthesis of phytosterol ester is more advantageous because the enzymatic method produces less byproducts at a high temperature.
또한, 종래 유리된 리파아제를 이용하여 피토스테롤 에스테르를 합성한 것이 개시되어 있다. (KR 10-2007-0018528) 그러나, 유리된 리파아제를 이용하는 경우 반응시스템의 제어가 용이하지 않고, 효소에 의한 생성물의 오염이 발생할 수 있으며, 반응기 선택의 폭이 좁은 단점이 있다.
In addition, it has been disclosed that phytosterol esters are synthesized by using a previously liberated lipase. (KR 10-2007-0018528) However, when the liberated lipase is used, the control of the reaction system is not easy, contamination of the product by the enzyme may occur, and the selection of the reactor is narrow.
상기와 같은 선행기술의 문제점을 극복하기 위하여 본 발명은 고정화 리파아제 존재 하에 피토스테롤과 불포화 지방산을 기질로 하여 반응시켜 수율이 향상된 피토스테롤 에스테르 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.In order to overcome the problems of the prior art as described above, it is an object of the present invention to provide a method for producing phytosterol ester having improved yield by reacting phytosterol and an unsaturated fatty acid as a substrate in the presence of immobilized lipase.
본 발명자들은 고정화 효소의 사용이 유리 형태 효소의 사용에 비하여 반응시스템의 제어가 용이하고, 효소에 의한 생성물의 오염을 최소화 하며, 반응기 선택의 폭을 넓힐 수 있다는 점에서 장점을 갖는다는 것을 알게 되었다. The present inventors have found that the use of an immobilized enzyme is advantageous in that the reaction system can be easily controlled as compared with the use of a free form enzyme, the contamination of the product by the enzyme can be minimized, and the range of the reactor selection can be widened .
다만, 효소를 이용하여 피토스테롤 에스테르를 제조하는 경우, 그 효소의 종류 및 조건에 따라 그 수율이 현저하게 달라지게 된다. 따라서, 본 발명자들은 고정화 리파아제를 이용하여 피토스테롤 에스테르를 합성 시 수율을 상승시키는 방법을 연구한 끝에 본 발명을 완성하였다.
However, when an enzyme is used to produce phytosterol ester, the yield varies markedly depending on the type and condition of the enzyme. Therefore, the present inventors completed the present invention after studying a method for increasing the yield in the synthesis of phytosterol ester using immobilized lipase.
본 발명의 해결하고자 하는 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to accomplish the object of the present invention,
a) 리파아제를 고정화 담체에 고정화하여 고정화 리파아제를 제조하는 단계; 및a) immobilizing the lipase on the immobilizing carrier to prepare immobilized lipase; And
b) 상기 고정화 리파아제 하에서 피토스테롤 및 불포화 지방산을 교반하여 피토스테롤 에스테르를 합성하는 단계b) synthesizing a phytosterol ester by stirring phytosterol and an unsaturated fatty acid under the immobilized lipase
를 포함하는 피토스테롤 에스테르의 제조 방법을 제공한다.
≪ RTI ID = 0.0 > phytosterol < / RTI >
본 발명의 제조 방법에 따르면 향상된 수율로 피토스테롤 에스테르를 얻을 수 있는 장점이 있다.
According to the production method of the present invention, there is an advantage that the phytosterol ester can be obtained in an improved yield.
도 1은 리파아제 종류에 따른 피토스테롤 에스테르 전환율을 나타낸 도이다.
도 2는 고정화 담체에 따른 리파아제의 고정화율을 나타낸 도이다.
도 3은 고정화 담체에 따른 피토스테롤 에스테르의 전환율을 나타낸 도이다.
도 4는 고정화 리파아제의 양에 따른 피토스테롤 에스테르의 전환율을 나타낸 도이다.
도 5는 온도에 따른 피토스테롤 에스테르의 전환율을 나타낸 도이다.
도 6은 기질 몰비율에 따른 피토스테롤 에스테르의 전환율을 나타낸 도이다.
도 7은 진공도에 따른 피토스테롤 에스테르의 전환율을 나타낸 도이다.FIG. 1 shows the conversion of phytosterol ester according to the type of lipase.
2 is a graph showing the immobilization rate of lipase according to the immobilized carrier.
3 shows the conversion of phytosterol ester according to the immobilized carrier.
4 shows the conversion of phytosterol ester according to the amount of immobilized lipase.
5 shows the conversion of phytosterol ester according to temperature.
6 shows the conversion of phytosterol ester according to the molar ratio of the substrate.
7 is a graph showing the conversion of phytosterol ester according to the degree of vacuum.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 리파아제 존재 하에 피토스테롤과 불포화 지방산을 기질로 하여 반응시켜 피토스테롤 에스테르를 제조하는 방법에 있어서, The present invention relates to a method for producing phytosterol ester by reacting phytosterol and an unsaturated fatty acid as a substrate in the presence of lipase,
a) 리파아제를 고정화 담체에 고정화하여 고정화 리파아제를 제조하는 단계; 및a) immobilizing the lipase on the immobilizing carrier to prepare immobilized lipase; And
b) 상기 고정화 리파아제 하에서 피토스테롤 및 불포화 지방산을 교반하여 피토스테롤 에스테르를 합성하는 단계b) synthesizing a phytosterol ester by stirring phytosterol and an unsaturated fatty acid under the immobilized lipase
를 포함하는 피토스테롤 에스테르의 제조 방법을 제공한다.≪ RTI ID = 0.0 > phytosterol < / RTI >
본 명세서에서 의미하는 고정화 리파아제란 고정화 담체(i)에 고정된 리파아제(ii) 전체를 의미하는 것으로서, 상기 리파아제와 상기 담체가 결합된 형태(i+ii)를 의미한다.
Immobilized lipase means the entire lipase (ii) immobilized on the immobilization support (i), and means the form (i + ii) in which the lipase and the carrier are combined.
상기 리파아제는 고정화 담체에 고정화 되지 않은 유리 상태에서 100,000U/g~600,000U/g, 바람직하게는 300,000U/g~500,000U/g, 더 바람직하게는 350,000U/g의 활성을 가진 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. The lipase preferably has an activity of 100,000 U / g to 600,000 U / g, preferably 300,000 U / g to 500,000 U / g, more preferably 350,000 U / g in a free state immobilized on the immobilization support , But is not limited thereto.
상기 리파아제는 바람직하게는 칸디다 루고사(Candida rugosa) 유래인 것 (상품명: Lipase OF)이 좋다. The lipase is preferably selected from the group consisting of Candida rugosa (trade name: Lipase OF).
본 발명의 일 실시예에서, 여러 리파아제에 대한 활성 스크리닝 결과, 칸디다 루고사 유래의 리파아제(이하, CRL과 동의어로 사용함)는 다른 균주 유래의 리파아제 (Candida Antarctica: 상품명 Novozym 435, Thermomyces lanuginosus: 상품명 Lipozyme TL IM, Rhizomucor miehei: 상품명 Lipozyme RM IM, Pseudomonas fluorescens: 상품명 Amano lipase AK, Burkholderia cepacia: 상품명 Amano lipase PS, Genus Penicillium: 상품명 Amano lipase G)에 비하여 기본 조건에서 현저하게 높은 피토스테롤 에스테르의 전환율을 보였다. (도 1 참조)
In one embodiment of the present invention, as a result of active screening for various lipases, lipase derived from Candida rosacea (hereinafter, used as a synonym of CRL) can be obtained from Candida Antarctica (trade name: Novozym 435, Thermomyces lanuginosus : Product name Lipozyme TL IM, Rhizomucor miehei : Product name Lipozyme RM IM, Pseudomonas fluorescens : Product name Amano lipase AK, Burkholderia cepacia : Product name Amano lipase PS, Genus The conversion of phytosterol ester was remarkably higher than that of Penicillium (trade name Amano lipase G) under basic conditions. (See Fig. 1)
상기 불포화 지방산은 피놀렌산, 올레인산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid), 에루신산(erucic acid), 카프릴산(caprylic acid) 및 카프르산(capric acid)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 피놀렌산이 좋다.The unsaturated fatty acid may be at least one selected from the group consisting of phenolic acid, oleic acid, linoleic acid, erucic acid, caprylic acid and capric acid. And preferably phenolic acid.
피놀렌산은 잣기름에 많이 함유되어 있으며, 피놀렌산이 혈중 LDL 콜레스테롤 함량을 낮춘다는 연구 결과가 보고된 바 있다. 또한 많은 연구로부터 피놀렌산이 콜레시스토키닌 (cholecyctokinin)과 글루카곤 유사 펩티드-1 (glucagon like peptide-1)의 분비를 촉진시켜 식욕을 억제한다는 효과가 있다는 사실이 밝혀졌다. 따라서, 피놀렌산 피토스테롤 에스테르는 피놀렌산과 피토스테롤의 장점을 모두 가질 수 있는 장점이 있다.
Phenolenic acid is contained in a large amount of nuts, and phenolenic acid has been reported to lower blood LDL cholesterol levels. In addition, many studies have shown that phenolenic acid has the effect of inhibiting appetite by promoting the secretion of cholecyctokinin and glucagon-like peptide-1. Thus, the phy- nonenoic acid phytosterol ester has the advantage of having both the advantages of phenolic acid and phytosterol.
본 발명의 피토스테롤 에스테르의 제조 방법에 있어서, 리파아제를 고정화 할 수 있는 담체는 매우 중요하다. 본 발명에서 리파아제를 고정화하기 위한 고정화 담체는 바람직하게는 Lewatit VP OC 1600이 바람직하다.In the method for producing the phytosterol ester of the present invention, the carrier capable of immobilizing the lipase is very important. The immobilized carrier for immobilizing the lipase in the present invention is preferably Lewatit VP OC 1600.
본 발명의 일 실시예에서 여러 고정화 담체에 대해 고정화율과 피토스테롤 에스테르의 전환율을 측정한 결과, Lewatit VP OC 1600 고정화 담체가 가장 바람직한 것으로 확인되었다. (도 2 및 도 3 참조)
In one embodiment of the present invention, immobilization rate and conversion of phytosterol ester to various immobilized carriers were measured, and it was confirmed that Lewatit VP OC 1600 immobilized carrier was the most preferable. (See Figs. 2 and 3)
상기 a) 단계의 고정화 리파아제의 양은 총 기질(피토스테롤 및 불포화 지방산) 무게 기준으로 5~15 중량%인 것이 바람직하다. The amount of the immobilized lipase in step a) is preferably 5 to 15% by weight based on the weight of total substrate (phytosterol and unsaturated fatty acid).
본 발명의 일 실시예에서 고정화 리파아제의 양에 따른 피토스테롤 에스테르의 전환율을 측정한 결과, 고정화 리파아제의 양은 총 기질 무게 기준으로 5~15 중량%인 것이 바람직하고, 더 바람직한 것으로는 10~15 중량%인 것으로 확인되었다. (도 4 참조)In one embodiment of the present invention, the conversion of phytosterol ester according to the amount of immobilized lipase was measured. As a result, the amount of immobilized lipase was preferably 5 to 15 wt%, more preferably 10 to 15 wt% Respectively. (See Fig. 4)
상기 a) 단계의 고정화 리파아제의 양이 총 기질 무게 기준으로 5 중량% 보다 낮은 경우에는 피토스테롤 에스테르의 전환율이 낮으며, 15 중량% 보다 높은 경우에는 소요되는 리파아제의 양이 증가함에 따라, 피토스테롤 에스테르 합성 시 경제성이 떨어지는 단점이 있다.
When the amount of immobilized lipase in step a) is lower than 5 wt% based on the total substrate weight, conversion of phytosterol ester is low. When the amount of lipase is higher than 15 wt%, phytosterol ester synthesis There is a disadvantage that the economy is poor.
반응 온도는 반응 속도 및 효소의 잔존 활성에도 영향을 미치므로 효소 반응에서 중요한 요소이다. The reaction temperature is an important factor in the enzyme reaction since it affects the reaction rate and the residual activity of the enzyme.
본 발명의 일 실시예에서 반응 온도가 피토스테롤 에스테르의 합성에 미치는 영향을 측정한 결과, 60~70oC의 온도 범위에서 반응하는 것이 가장 적합한 것으로 확인되었다. (도 5 참조)In one embodiment of the present invention, the effect of the reaction temperature on the synthesis of phytosterol esters was investigated. As a result, it was confirmed that the reaction was most suitable in the temperature range of 60 to 70 ° C. (See Fig. 5)
상기 반응온도가 60oC 보다 낮은 경우에는 피토스테롤 에스테르의 전환율이 감소하며, 70oC보다 높은 경우에는 효소가 변질될 우려가 있다.
When the reaction temperature is lower than 60 ° C, the conversion of phytosterol ester decreases. When the reaction temperature is higher than 70 ° C, the enzyme may be degraded.
피토스테롤 에스테르 합성에 미치는 기질간의 몰비율 역시 효소 반응에서 중요한 요소이다. The molar ratio of substrate to phytosterol ester synthesis is also an important factor in the enzyme reaction.
본 발명의 일 실시예에서 피토스테롤 에스테르 합성 시 기질간의 몰비율이 미치는 영향을 측정한 결과, 피토스테롤 및 불포화 지방산의 비율이 1:4~1:5인 것이 바람직한 것으로 확인되었다. (도 6 참조)In one embodiment of the present invention, the effect of molar ratio between substrates on the synthesis of phytosterol ester was measured, and it was confirmed that the ratio of phytosterol and unsaturated fatty acid was preferably 1: 4 to 1: 5. (See Fig. 6)
피토스테롤 및 불포화 지방산의 비율이 1:4보다 낮은 경우에는 피토스테롤 에스테르의 전환율이 감소하며, 1:5보다 큰 경우에는 더 이상 피토스테롤 에스테르의 전환율에 영향을 미치지 않으므로 효율이 떨어질 우려가 있다.
When the ratio of phytosterol and unsaturated fatty acid is lower than 1: 4, the conversion of phytosterol ester decreases. When the ratio of phytosterol and unsaturated fatty acid is higher than 1: 5, the conversion efficiency of phytosterol ester is not affected.
일반적으로 수용액 상태가 아닌 효소 매게 에스테르화 반응에서 물은 반응에 매우 큰 영향을 주는 요인으로 알려져 있다. 효소마다 효소의 활성을 유지시키는 데에 필수적인 수분량이 존재하는데, 이 수분은 효소의 3차원적 구조를 유지시키는데 필요하다. 따라서 이 수분량 이하에서는 효소마다 그 활성을 잃는 경우도 있다. 반면, 피토스테롤과 지방산이 각각 1몰씩 반응하여 피토스테롤 에스테르 1몰을 생성할 때, 에스테르화 반응에서 1몰의 물이 함께 생성된다. 따라서 과량의 물은 에스테르화 반응의 역반응인 가수분해 반응의 반응물로 작용하여 에스테르화 반응에서 바람직하지 못한 영향을 준다. 따라서, 진공도는 효소 매게 에스테르화 반응에서 매우 중요한 요소이다.Generally, water is known to be a very important factor in the enzyme hydrolysis reaction, not in aqueous solution. Each enzyme has a water content that is essential for maintaining the activity of the enzyme, which is needed to maintain the three-dimensional structure of the enzyme. Therefore, the activity may be lost for each enzyme below this water content. On the other hand, when 1 mole of phytosterol and 1 mole of fatty acid are reacted to produce 1 mole of phytosterol ester, 1 mole of water is produced together in the esterification reaction. Thus, excess water acts as a reactant in the hydrolysis reaction, which is the reverse reaction of the esterification reaction, which has an undesirable effect on the esterification reaction. Therefore, the degree of vacuum is a very important factor in the enzymatic mercesterylation reaction.
본 발명의 일 실시예에서 진공도가 피토스테롤 에스테르의 전환율에 미치는 영향을 측정한 결과, 13 내지 80 kPa의 압력에서 진행되는 것이 바람직한 것으로 확인되었다. (도 7 참조)As a result of measuring the effect of vacuum degree on the conversion of phytosterol ester in one embodiment of the present invention, it was confirmed that it is preferable to proceed at a pressure of 13 to 80 kPa. (See Fig. 7)
상기 b 단계에서 피토스테롤 에스테르를 합성할 때 13 kPa 보다 낮은 압력에서 합성이 진행되는 경우에는 전환율에 큰 차이가 없어 낮은 압력을 유지하기 위한 에너지가 낭비되는 단점이 있으며, 80 kPa보다 높은 압력하에서는 전환율이 감소되는 단점이 있다.
In the synthesis of phytosterol ester in step b), when the synthesis proceeds at a pressure lower than 13 kPa, there is not a large difference in the conversion rate, and energy for maintaining the low pressure is wasted. Under the pressure higher than 80 kPa, .
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. However, the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.
실시예 1.Example 1.
피토스테롤Phytosterol
에스테르 합성에 최적화된 리파아제의 스크리닝 Screening of lipases optimized for ester synthesis
피토스테롤과With phytosterol 잣기름 지방산 간의 Liver oil 에스테르화Esterification 반응 reaction
Candida rugosa 유래의 리파아제 (상품명 Lipase OF), Candida antarctica 유래의 리파아제 (상품명 Novozym 435), Thermomyces lanuginosus 유래의 리파아제 (상품명 Lipozyme TL IM), Rhizomucor miehei 유래의 리파아제 (상품명 Lipozyme RM IM), Pseudomonas fluorescens 유래의 리파아제 (상품명 Amano lipase AK), Burkholderia cepacia 유래의 리파아제 (상품명 Amano lipase PS) 및 Genus Penicillium 유래의 리파아제 (상품명 Amano lipase G)과 함께, 총 5g의 피토스테롤과 잣기름 지방산을 1:4 (피토스테롤:지방산)의 몰비율로 50 mL 유리 반응기에 넣고 반응을 수행하여 효소 활성을 스크리닝 하였다. 반응은 50oC에서 수행하였고 효소량은 전체 기질 무게를 기준으로 5%였다. Candida rugosa Derived lipase (trade name: Lipase OF), Candida lipase derived from antarctica (trade name: Novozym 435), Thermomyces of lanuginosus derived lipase (trade name: Lipozyme TL IM), Rhizomucor miehei origin of lipase (trade name: Lipozyme RM IM), Pseudomonas fluorescens origin of lipase (trade name Amano lipase AK), Burkholderia cepacia Origin of lipase (trade name Amano lipase PS) and Genus Penicillium derived (Product name: Amano lipase G) were added to a 50 mL glass reactor in a molar ratio of 1: 4 (phytosterol: fatty acid) in total of 5 g of phytosterol and nutshell fatty acid, and the reaction was carried out to screen the enzyme activity. The reaction was carried out at 50 ° C and the enzyme content was 5% based on the total substrate weight.
반응물은 300rpm으로 교반하였고 대기압에서 반응을 진행하였다. 반응은 고정된 시간 1시간 동안 진행하였고, 50 ㎕의 샘플을 채취하여 가스크로마토그래피로 분석하였다.
The reaction was stirred at 300 rpm and the reaction proceeded at atmospheric pressure. The reaction proceeded for 1 hour at a fixed time, and 50 μl of sample was collected and analyzed by gas chromatography.
시료의 분석Analysis of Samples
반응 후 합성된 피토스테롤 에스테르와, 반응하지 않고 남은 피토스테롤, 및 지방산은 일정 간격으로 채취된 샘플에서 10mg을 1mL 클로로포름에 녹여 가스크로마토그래피 (Model 3800; Varian, Palo Alto, CA, USA)로 분석되었다. 디텍터로는 Flame ionization detector (FID)를 사용하였고, 컬럼은 fused silica capillary column (DB-1ht, 15 m X 0.25 mm i.d. X 0.15 ㎛ film thickness, J&W Scientific, Folsom, CA, USA)를 사용하였다. 샘플 1 ㎕가 split mode (split ratio 50:1)로 autosampler를 통해 주입되었고, 컬럼의 온도는 120oC에서 3분간 유지된 후 20oC/min의 속도로 370oC까지 올라간 후 370oC에서 5분간 유지되도록 프로그래밍 되었다. 캐리어 가스로는 헬륨을 사용하여 2.0 mL/min으로 흘려주었다. 인젝터와 디텍터 모두 370oC에서 유지되었다. 합성된 피토스테롤 에스테르의 검출을 위하여 순도 98.0%의 피토스테롤 에스테르 스탠다드 (ADM, Decatur, IL, USA)를 사용하였다.10 mg of the synthesized phytosterol ester and unreacted phytosterol and fatty acid were sampled at regular intervals and dissolved in 1 mL of chloroform and analyzed by gas chromatography (Model 3800; Varian, Palo Alto, CA, USA). A flame ionization detector (FID) was used as the detector. The column was a fused silica capillary column (DB-1ht, 15 m x 0.25 mm id x 0.15 μm film thickness, J & W Scientific, Folsom, CA, USA).
피토스테롤과 잣기름 지방산으로부터 합성된 피토스테롤 에스테르의 전환율은 다음의 식으로부터 계산되었다.
The conversion of phytosterol ester synthesized from phytosterol and natto oil fatty acid was calculated from the following equation.
h: 합성된 피토스테롤 에스테르의 몰수 (mol)h: molar number of synthesized phytosterol ester (mol)
i: 반응하지 않고 남은 잣기름 지방산의 몰수 (mol)
i: the number of moles of unreacted natutinic fatty acid remaining (mol)
위 실험에 따른 결과를 도 1에 도시하였다. 도 1에 따르면, Candida rugosa 유래의 리파아제가 일정 시간 동안 최적의 합성 효율을 보이는 것을 알 수 있다.
The results of the above experiment are shown in Fig. According to Figure 1, Candida It can be seen that the lipase derived from rugosa shows optimal synthesis efficiency for a certain period of time.
실시예 2.Example 2. 고정화 Immobilization 담체에On the carrier 따른 리파아제의 고정화율 및 전환율 Immobilization rate and conversion rate of lipase
리파아제의 고정화Immobilization of lipase
담체의 선별 실험을 위해, 가루 형태의 칸디다 루고사 유래 리파아제를 75mg/mL의 농도로 sodium phosphate buffer solution (100mM, pH 7.0)에 3시간 동안 교반하여 분산시킨 후 용액을 3100xg, 25oC 에서 30분간 원심 분리하였다. 이 때 얻어진 상층을 고정화에 사용하고 이 효소 용액 (상층)의 단백질 농도는 로우리법을 이용하여 측정되었다. 담체 선별을 위해 시험된 담체는 Lewatit VP OC 1600, Dowex 50w 95 x8, Celite 545, Duolite A568, Amberlite XAD 7HP, Accrurel MP 1000, Amberlite XAD4, Octylsilica, Zeolite로, 총 9종이었다. 고정화 전에 소수성 담체들 (Lewatit VP OC 1600, Accrurel MP 1000, Amberlite XAD4, Octylsilica)은 에탄올에 미리 적시는 과정 (pre-wetting)을 거쳤고, 이 후 담체는 효소 용액을 가하기 전에 60mL 완충 용액으로 담체에 남아있는 에탄올이 헹궈졌다. 15mL의 효소 용액을 1.5g의 담체와 함께 삼각플라스크에 넣은 후, orbital shaker에 장착되어 30oC 에서 15시간 동안 200rpm으로 교반되었다. 고정화가 끝난 후 남은 효소용액은 채취되어 단백질 농도를 측정하는데 쓰이고, 담체에 고정화된 효소는 여과 후 75mL의 완충 용액을 사용하여 헹궈졌다. 고정화된 효소는 상온에서 12시간 동안 말린 후 다시 40oC 감압 오븐에서 12시간 동안 말린 후 사용 전까지 4oC 에서 냉장보관 되었다. For the selective screening of carriers, powdered Candida lucosa-derived lipase was dispersed in a sodium phosphate buffer solution (100 mM, pH 7.0) at a concentration of 75 mg / mL for 3 hours and dispersed in a solution of 3100 xg at 25 o C Minute centrifugation. The upper layer thus obtained was used for immobilization and the protein concentration of the enzyme solution (upper layer) was measured using the Lowry method. The carriers tested for carrier selection were Lewatit VP OC 1600, Dowex 50w 95 x 8, Celite 545, Duolite A568, Amberlite XAD 7HP, Accrurel MP 1000, Amberlite XAD4, Octylsilica and Zeolite. Prior to immobilization, the hydrophobic carriers (Lewatit VP OC 1600, Accrurel MP 1000,
고정화율 (%)와 고정화 리파아제 무게 당 고정화된 효소량 (mg/g)은 다음의 식으로부터 계산되었다.
The percent immobilization (%) and the amount of immobilized enzyme (mg / g) per immobilized lipase weight were calculated from the following equation.
a: 고정화 과정 전 효소 용액 속의 단백질 양 (mg)a: Amount of protein in the enzyme solution (mg)
b: 고정화 과정 후 담체에 고정화 되지 않고 용액 속에 남아있는 단백질의 양 (mg)
b: Amount of protein (mg) remaining in solution after immobilization but not immobilized on carrier
고정화 리파아제의 활성 테스트Activity test of immobilized lipase
고정화 리파아제의 활성을 테스트 하기 위하여 피토스테롤과 잣기름 지방산의 에스테르화 반응을 시행하였다. 지방산 (3.614g, 13.66 mmols)과 피토스테롤 (1.386g, 3.41 mmols)을 50mL 유리 반응기에 넣고 300rpm으로 교반하였다. 유리반응기는 반응 시작 전에 워터 베스 순환기를 이용하여 50oC 로 유지되었다. 전체 기질의 5%에 해당하는 고정화 리파아제 (0.25g)를 반응기에 넣는 것으로 반응을 시작하여, 정해진 시간마다 50 ㎕만큼의 샘플을 채취하여, 생성된 피토스테롤에스테르와 남은 지방산, 피토스테롤을 가스크로마토그래피로 분석하였다.
In order to test the activity of immobilized lipase, esterification reaction of phytosterol and nut oil fatty acid was carried out. Fatty acid (3.614 g, 13.66 mmols) and phytosterol (1.386 g, 3.41 mmols) were placed in a 50 mL glass reactor and stirred at 300 rpm. The glass reactor was maintained at 50 < 0 > C using a Waterbath circulator prior to the start of the reaction. The reaction was started by adding immobilized lipase (0.25 g) corresponding to 5% of the total substrate to the reactor. Samples of 50 μl were taken at predetermined intervals, and the resulting phytosterol ester, remaining fatty acid and phytosterol were analyzed by gas chromatography Respectively.
시료의 분석Analysis of Samples
반응 후 합성된 피토스테롤 에스테르와 반응하지 않고 남은 피토스테롤, 지방산은 일정 간격으로 채취된 샘플에서 10mg을 1mL 클로로포름에 녹여 가스크로마토그래피 (Model 3800; Varian, Palo Alto, CA, USA)로 분석되었다. 디텍터로는 Flame ionization detector (FID)를 사용하였고, 컬럼은 fused silica capillary column (DB-1ht, 15 m X 0.25 mm i.d. X 0.15 ㎛ film thickness, J&W Scientific, Folsom, CA, USA)를 사용하였다. 샘플 1 ㎕가 split mode (split ratio 50:1)로 autosampler를 통해 주입되었고, 컬럼의 온도는 120oC 에서 3분간 유지된 후 20oC/min 의 속도로 370oC까지 올라간 후 370oC에서 5분간 유지되도록 프로그래밍 되었다. 캐리어 가스로는 헬륨을 사용하여 2.0 mL/min으로 흘려주었다. 인젝터와 디텍터 모두 370oC에서 유지되었다. 합성된 피토스테롤 에스테르의 검출을 위하여 순도 98.0%의 피토스테롤 에스테르 스탠다드 (ADM, Decatur, IL, USA)를 사용하였다.The remaining phytosterols and fatty acids that did not react with the synthesized phytosterol ester after the reaction were analyzed by gas chromatography (Model 3800; Varian, Palo Alto, Calif., USA) A flame ionization detector (FID) was used as the detector. The column was a fused silica capillary column (DB-1ht, 15 m x 0.25 mm id x 0.15 μm film thickness, J & W Scientific, Folsom, CA, USA).
피토스테롤과 잣기름 지방산으로부터 합성된 피토스테롤 에스테르의 전환율은 다음의 식으로부터 계산되었다.
The conversion of phytosterol ester synthesized from phytosterol and natto oil fatty acid was calculated from the following equation.
h: 합성된 피토스테롤 에스테르의 몰수 (mol)h: molar number of synthesized phytosterol ester (mol)
i: 반응하지 않고 남은 잣기름 지방산의 몰수 (mol)
i: the number of moles of unreacted natutinic fatty acid remaining (mol)
위 실험에 따른 결과를 도 4에 도시하였다. 도 2 및 도 3에 따르면, Lewatit VP OC 1600을 고정화 리파아제를 제조하기 위한 담체로 사용하는 것이 효소의 고정화 및 피토스테롤 에스테르 합성을 위해 가장 바람직한 것을 알 수 있다.
The results of the above experiment are shown in Fig. 2 and 3, it can be seen that the use of Lewatit VP OC 1600 as a carrier for the preparation of immobilized lipase is most desirable for the immobilization of enzymes and the synthesis of phytosterol esters.
실시예 3.Example 3. 고정화 리파아제의 양에 따른 전환율Conversion rate according to the amount of immobilized lipase
총 5g의 피토스테롤과 잣기름 지방산을 1:4 (피토스테롤:지방산)의 몰비율로 50 mL 유리 반응기에 넣고 반응을 수행하였다. 반응 온도는 50oC로 고정하고, 고정화 리파아제의 양은 전체 기질 무게를 기준으로 2.5부터 15%까지 테스트 되었다. 반응물은 300rpm으로 교반하였고, 대기압에서 반응을 진행하였다. 반응 중간 일정 시간 간격으로 50 ㎕의 샘플을 채취하여 가스크로마토그래피로 분석하였다.
A total of 5 g of phytosterol and nut oil fatty acid were placed in a 50 mL glass reactor at a molar ratio of 1: 4 (phytosterol: fatty acid) and the reaction was carried out. The reaction temperature was fixed at 50 ° C and the amount of immobilized lipase was tested from 2.5 to 15% based on the total substrate weight. The reaction was stirred at 300 rpm and the reaction proceeded at atmospheric pressure. 50 [mu] l of the sample was collected at an interval of the reaction at a predetermined time interval and analyzed by gas chromatography.
합성된 피토스테롤 에스테르는 실시예 2와 동일한 방법으로 분석하였다.
The synthesized phytosterol ester was analyzed in the same manner as in Example 2.
위 실험에 따른 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4에 따르면, 고정화 리파아제의 양이 총 기질 무게 기준으로 10~15 중량%의 범위일 때 피토스테롤 에스테르 합성에 가장 바람직한 것을 알 수 있다.
The results of the above experiment are shown in Fig. According to FIG. 4, it can be seen that it is most preferable for the synthesis of phytosterol ester when the amount of immobilized lipase is in the range of 10 to 15% by weight based on the total substrate weight.
실시예 4.Example 4. 피토스테롤Phytosterol 에스테르의 합성 시 온도의 최적화 Optimization of temperature during ester synthesis
총 5g의 피토스테롤과 잣기름 지방산을 1:4 (피토스테롤:지방산)의 몰비율로 50 mL 유리 반응기에 넣고 반응을 수행하였다. 본 실험에서 테스트 된 온도의 범위는 30~70oC였다. 반응은 고정화 리파아제를 전체 기질 무게를 기준으로 5 중량%를 넣고 이 시점으로부터 반응이 시작되는 것으로 하였다. 반응물은 300rpm으로 교반하였고 대기압에서 반응을 진행하였다. 반응 중간 일정 시간 간격으로 50 ㎕의 샘플을 채취하여 가스크로마토그래피로 분석하였다.
A total of 5 g of phytosterol and nut oil fatty acid were placed in a 50 mL glass reactor at a molar ratio of 1: 4 (phytosterol: fatty acid) and the reaction was carried out. The range of temperatures tested in this experiment was 30-70 ° C. In the reaction, 5% by weight of immobilized lipase was added based on the weight of the whole substrate, and the reaction was started from this point. The reaction was stirred at 300 rpm and the reaction proceeded at atmospheric pressure. 50 [mu] l of the sample was collected at an interval of the reaction at a predetermined time interval and analyzed by gas chromatography.
합성된 피토스테롤 에스테르는 실시예 2와 동일한 방법으로 분석하였다.
The synthesized phytosterol ester was analyzed in the same manner as in Example 2.
위 실험에 따른 결과를 도 5에 도시하였다. 도 5에 따르면, 피토스테롤 에스테르의 합성 시 그 온도 조건은 60~70oC일 때 피토스테롤 에스테르 합성에 가장 바람직한 것을 알 수 있다.
The results of the above experiment are shown in Fig. According to Fig. 5, it can be seen that the synthesis of phytosterol ester is most preferable for the synthesis of phytosterol ester at a temperature of 60 to 70 ° C.
실시예 5.Example 5. 피토스테롤Phytosterol 에스테르의 합성 시 기질 비율의 최적화 Optimization of substrate ratio in the synthesis of esters
총 5g의 피토스테롤과 잣기름 지방산을 1:1 부터 1:5 (피토스테롤:지방산)의 몰비율로 50 mL 유리 반응기에 넣고 반응을 수행하였다. 반응 온도는 50oC, 고정화 리파아제의 양은 전체 기질 무게를 기준으로 5%로 하였다. 반응물은 300rpm으로 교반하였고, 대기압에서 반응을 진행하였다. 반응 중간 일정 시간 간격으로 50 ㎕의 샘플을 채취하여 가스크로마토그래피로 분석하였다.
A total of 5 g of phytosterol and nut oil fatty acid were added to a 50 mL glass reactor at a molar ratio of 1: 1 to 1: 5 (phytosterol: fatty acid). The reaction temperature was 50 ° C and the amount of immobilized lipase was 5% based on the weight of the whole substrate. The reaction was stirred at 300 rpm and the reaction proceeded at atmospheric pressure. 50 [mu] l of the sample was collected at an interval of the reaction at a predetermined time interval and analyzed by gas chromatography.
합성된 피토스테롤 에스테르는 실시예 2와 동일한 방법으로 분석하였다.
The synthesized phytosterol ester was analyzed in the same manner as in Example 2.
위 실험에 따른 결과를 도 6에 도시하였다. 도 6에 따르면, 피토스테롤 에스테르의 합성 시 피토스테롤과 불포화 지방산의 몰 비율은 1:4~1:5일 때 피토스테롤 에스테르 합성에 가장 바람직한 것을 알 수 있다.
The results of the above experiment are shown in Fig. According to FIG. 6, it can be seen that the synthesis of phytosterol ester is most preferable for the synthesis of phytosterol ester when the molar ratio of phytosterol to unsaturated fatty acid is 1: 4 to 1: 5.
실시예 6.Example 6. 피토스테롤Phytosterol 에스테르의 합성 시 진공도의 최적화 Optimization of vacuum during ester synthesis
총 5g의 피토스테롤과 잣기름 지방산을 1:4 (피토스테롤:지방산)의 몰비율로 50 mL 유리 반응기에 넣고 반응을 수행하였다. 반응 온도는 50oC, 고정화 효소량은 전체 기질 무게를 기준으로 5%로 하였다. 반응물은 300rpm으로 교반하였고, 진공도는 micrometering valve (Swagelok, solon, OH, USA)로 조절하였으며, digital vacuum gauge (Teledyne, Thaousand Oaks, CA, USA)를 사용하여 진공도를 확인하였다. 테스트된 진공도의 범위는 0.7 내지 100kPa 이었다. 반응 중간 일정 시간 간격으로 50 ㎕의 샘플을 채취하여 가스크로마토그래피로 분석하였다.
A total of 5 g of phytosterol and nut oil fatty acid were placed in a 50 mL glass reactor at a molar ratio of 1: 4 (phytosterol: fatty acid) and the reaction was carried out. The reaction temperature was 50 ° C and the amount of immobilized enzyme was 5% based on the total substrate weight. The reaction was stirred at 300 rpm and the degree of vacuum was controlled with a micrometering valve (Swagelok, Solon, OH, USA) and the degree of vacuum was checked using a digital vacuum gauge (Teledyne, Thaosand Oaks, CA, USA). The range of vacuum tested was 0.7 to 100 kPa. 50 [mu] l of the sample was collected at an interval of the reaction at a predetermined time interval and analyzed by gas chromatography.
합성된 피토스테롤 에스테르는 실시예 2와 동일한 방법으로 분석하였다.
The synthesized phytosterol ester was analyzed in the same manner as in Example 2.
위 실험에 따른 결과를 도 7에 도시하였다. 도 7에 따르면, 피토스테롤 에스테르의 합성 시 그 압력은 13 내지 80 kPa일 때 피토스테롤 에스테르 합성에 가장 바람직한 것을 알 수 있다. The results of the above experiment are shown in Fig. According to Fig. 7, it can be seen that the synthesis of phytosterol ester is most preferable for the synthesis of phytosterol ester at a pressure of 13 to 80 kPa.
Claims (9)
a) 리파아제를 고정화 담체에 고정화 하여 고정화 리파아제를 제조하는 단계; 및
b) 상기 고정화 리파아제 하에서 피토스테롤 및 불포화 지방산을 교반하여 피토스테롤 에스테르를 합성하는 단계를 포함하며,
상기 a) 단계의 리파아제는 고정화 담체에 고정화 되지 않은 유리 상태에서 100,000U/g~600,000U/g의 활성을 가지고,
상기 b) 단계의 고정화 리파아제의 양은 상기 기질 무게 기준으로 10~15중량%이고,
상기 b) 단계에서 피토스테롤 및 불포화 지방산은 1:4~1:5의 몰비율로 반응시키는 것이고,
상기 b) 단계의 반응 온도는 50~70℃인 것이며,
상기 b) 단계는 13 내지 80 kPa의 압력에서 진행하는 것이고,
상기 고정화 담체는 Lewatit VP OC 1600인 것을 특징으로 하는, 피토스테롤 에스테르의 제조 방법.A method for producing a phytosterol ester by reacting phytosterol and an unsaturated fatty acid as a substrate in the presence of a lipase,
a) immobilizing the lipase on the immobilizing carrier to prepare immobilized lipase; And
b) synthesizing a phytosterol ester by stirring phytosterol and an unsaturated fatty acid under the immobilized lipase,
The lipase in step a) has an activity of 100,000 U / g to 600,000 U / g in a free state immobilized on the immobilized carrier,
The amount of the immobilized lipase in the step b) is 10 to 15% by weight based on the weight of the substrate,
In the step b), the phytosterols and the unsaturated fatty acids are reacted in a molar ratio of 1: 4 to 1: 5,
The reaction temperature in step b) is 50 to 70 ° C,
The step b) is carried out at a pressure of 13 to 80 kPa,
Wherein the immobilizing carrier is Lewatit VP OC 1600.
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