KR101546482B1 - 골수유래억제세포 분화 유도용 조성물 및 이의 분화 유도방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골수유래억제세포 (myeloid-derived suppressor cell; MDSC) 분화 유도용 조성물 및 이의 분화 유도방법에 관한 것으로서, 대식세포 콜로니 자극 인자(Macrophage-colony stimulating factor; M-CSF) 및 인터페론-γ (interferon-γ; IFN-γ)를 유효성분으로 포함하는 골수유래억제세포 (myeloid-derived suppressor cell; MDSC)로의 분화 유도용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 골수세포에 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 인터페론-γ (IFN-γ)을 처리하여 골수유래억제세포 (MDSC)로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 골수유래억제세포 (MDSC)로의 분화 유도 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기의 분화 유도 방법에 의해 분화된 골수유래억제세포 (MDSC) 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역반응 억제용 약학 조성물을 제공한다.

Description

골수유래억제세포 분화 유도용 조성물 및 이의 분화 유도방법{Composition for inducing differentiation into myeloid-derived suppressor cell and method of inducing the same}

본 발명은 골수유래억제세포(myeloid-derived suppressor cell; MDSC) 분화 유도용 조성물 및 이의 분화 유도방법에 관한 것이다.

억제성 골수 세포(Suppressive myeloid cell)는 20년 전에 암을 유발시킨 동물모델에서 증가된다고 보고되었으며, 암의 진행 및 전이에 영향을 준다고 알려졌다. 최근 이들 세포들은 면역반응에서 기능적으로 중요한 역할을 한다고 평가되어져 왔다. 암세포에 의해 유도되는 면역 억제 기전 중 하나는 암에 의한 골수(myeloid) 계열의 CD11b⁺Gr-1⁺ 표현형을 갖는 세포인 골수유래억제세포(myeloid-derived suppressor cell; MDSC)의 증가이다. MDSC는 미성숙한 골수계 세포로 종양이나, 자가 면역 질환, 감염에서 과립구 등이 완전히 분화가 이루어지지 않아 미성숙한 상태로 존재한다. 이들 MDSC는 암 환자뿐만 아니라 급성 염증 질환, 외상, 패혈증, 기생충 및 진균 감염에서도 증가한다고 알려져 있다.

MDSC의 기능은 활성화된 T 세포를 효과적으로 억제하는 역할을 한다. MDSC가 T 세포를 조절하는 기전은 산화질소 합성효소 (nitric oxide synthase)와 활성 산소종 (reactive oxygen species; ROS), 그리고 아르기나제(arginase)라는 효소가 필수아미노산인 L-아르기닌(L-arginine)의 대사를 극대화함으로써 T 세포 활성을 억제한다고 알려져 있다. 즉, 필수아미노산인 아르기닌(arginine)을 소비하는 효소인 아르기나제-1(arginase-1)을 높은 수준으로 발현하여 주변의 아르기닌(arginine)의 농도를 효과적으로 낮춘다. 아르기닌(Arginine)이 낮은 수준으로 존재하면 면역세포인 T 세포가 제 기능을 하지 못하게 되며, 아르기닌(arginine)에 의존하는 효소인 iNOS가 면역기능에 중요한 매개물인 산화질소 (Nitric oxide, NO)를 더 이상 만들지 못하게 될 뿐만 아니라 면역을 억제하는 강력한 독성 산화성물질인 과산화질소 (NO₂)가 만들어져 대식세포와 다른 세포계에서 세포막인지질에 산화성 손상을 야기한다. 따라서, 아르기나제(Arginase)와 NOS 활성화를 통해 T 림프구의 증식을 억제하고 ROS의 형성을 통해 T 림프구의 기능을 억제한다고 알려져 있다.

MDSC는 공통적으로 세포표면 항원인 CD11b와 Gr-1을 발현하지만, 그 발현 정도가 차이가 있는 이형 개체군(heterogeneous population)의 집합이다. Gr-1은 Ly-6G와 Ly-6C라는 2개의 항원 결정기를 가지며, 이로 인해 CD11b⁺Ly-6G⁺Ly-6C^low를 가지는 과립형인 MDSC와 CD11b⁺Ly-6G^-Ly-6C^hi를 가지는 단구 형태인 MDSC로 나뉜다. 암 환자의 경우 과립형인 MDSC가 70∼80%, 단구 형태인 MDSC가 20∼30%를 차지한다고 알려져 있다. 두 개의 MDSC는 다른 억제 기전으로 T 세포를 억제시킨다. 과립형인 MDSC는 ROS의 발현이 높게 나타나고 단구 형태의 MDSC는 NO의 생성이 높게 나타난다.

최근 연구에서는 MDSC가 암세포나 바이러스에 감염된 세포를 죽이는 면역기능에 중요한 CD8 T 세포의 기능을 억제한다고 보고되었으며, 염증반응 및 패혈증 질환에서도 MDSC가 증가하여 면역억제기능을 나타낸다고 보고되었다. 하지만 이들 세포의 세포학적 특성 및 세포분화유도 기전에 관한 연구는 미비한 실정이다.

C57BL/6 생쥐를 이용한 염증반응연구에서 지질다당체(Lipopolysaccharide; LPS) 주사 후 비장 및 혈액내에 MDSC의 증가를 확인할 수 있었다. 이 과정에서 IL-1β, TNF-α, IL-6, IFN-γ, IL-10, IL-12, MCP-1등 다양한 사이토카인이 발현되며, 이들 중 특정 사이토카인이 골수유래 대식세포를 MDSC로 분화 유도함을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명자들은 대식세포 콜로니 자극 인자(Macrophage-colony stimulating factor; M-CSF) 유도 골수유래대식세포 및 비장유래 대식세포에 다양한 사이토카인을 처리하여 MDSC 분화에 미치는 영향을 분석하고, 이들 사이토카인 중 인터페론-γ (interferon-γ; IFN-γ)에 의해 유도된 MDSC의 특성을 분석하였다. 또한 분리된 MDSC는 autologous MLR을 이용하여 이들 세포의 기능을 분석하고 본 발명을 완성하였다.

한편, 미국공개특허 US2012/0082688에서는 배아줄기세포(embryonic stem cells; ES) 및 조혈모세포(hematopoietic stem cells; HSCs)로부터 MDSC를 분리, 배양 및 분화시키는 방법에 대해 개시하고 있지만, 본원 발명의 M-CSF 유도 골수유래대식세포에서 MDSC 분화를 유도하기 위한 조성물 및 분화 유도방법에 대한 언급은 없다.

본 발명의 목적은 대식세포 콜로니 자극 인자(Macrophage-colony stimulating factor; M-CSF) 및 인터페론-γ(interferon-γ; IFN-γ)를 유효성분으로 포함하는 골수유래억제세포(myeloid-derived suppressor cell; MDSC)로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 골수세포에 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 인터페론-γ(IFN-γ)을 처리하여 골수유래억제세포(MDSC)로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 골수유래억제세포(MDSC)로의 분화 유도 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 분화 유도 방법에 의해 분화된 골수유래억제세포(MDSC) 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역반응 억제용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대식세포 콜로니 자극 인자(Macrophage-colony stimulating factor; M-CSF) 및 인터페론-γ(interferon-γ; IFN-γ)를 유효성분으로 포함하는 골수유래억제세포(myeloid-derived suppressor cell; MDSC)로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.

상세하게는, 상기 골수유래억제세포(MDSC)는 CD11b⁺Gr-1⁺ 또는 CD11b⁺Gr-1⁺Ly-6G^-Ly-6C⁺의 세포표현형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 명세서의 "골수유래억제세포(myeloid-derived suppressor cell; MDSC)"는 미성숙한 골수계세포로 종양이나, 자가 면역 질환, 감염에서 과립구 등이 완전히 분화가 이루어지지 않아 미성숙한 상태로 존재하며, 암 환자뿐만 아니라 급성 염증 질환, 외상, 패혈증, 기생충·진균 감염에서도 증가한다고 알려져 있다. MDSC의 기능은 활성화된 T 세포를 효과적으로 억제하는 역할을 한다. MDSC가 T 세포를 조절하는 기전은 산화질소 합성효소 (nitric oxide synthase)와 활성 산소종 (reactive oxygen species; ROS) 및 아르기나제(arginase)라는 효소가 필수아미노산인 L-아르기닌(L-arginine)의 대사를 극대화함으로써 T 세포 활성을 억제한다고 알려져 있다.

또한, 본 발명은 골수세포에 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 인터페론-γ(IFN-γ)을 처리하여 골수유래억제세포(MDSC)로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 골수유래억제세포(MDSC)로의 분화 유도 방법을 제공한다.

상세하게는, (1) 골수세포를 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)로 처리하여 골수유래대식세포로 분화시키는 단계; 및 (2) 상기 분화된 골수유래대식세포를 인터페론-γ(IFN-γ)로 처리하여 골수유래억제세포로(MDSC) 분화를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

보다 상세하게는, 상기 (1) 단계의 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)는 10 ng/ml 내지 30 ng/ml로 24시간 내지 48시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하고, 상기 (2) 단계의 인터페론-γ (IFN-γ)은 1 ng/ml 내지 500 ng/ml로 24시간 내지 48시간 동안 처리하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 분화 유도 방법에 의해 분화된 골수유래억제세포(MDSC)를 제공한다. 상세하게는, 상기 골수유래억제세포(MDSC)는 CD11b⁺Gr-1⁺ 또는 CD11b⁺Gr-1⁺Ly-6G^-Ly-6C⁺의 세포표현형을 갖고, T 세포 활성억제능을 갖는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 골수유래억제세포(MDSC)를 유효성분으로 포함하는 면역반응 억제용 약학 조성물을 제공한다. 상세하게는 상기 약학 조성물은 조혈모세포이식, 조직이식, 장기이식 또는 자가면역질환의 면역 거부반응을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 “자가면역질환”은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 아토피 피부염, 천식, 중증 근무력증, 그레브스병, 하시모토씨 갑상선염, 애디슨병, 백반증, 경피증, 굿패스쳐 신드롬, 베제트병, 크론병, 강직성 척추염, 포도막염, 혈소판 감소성 자반증, 심상성 천포창, 소아 당뇨병, 자가면역성 용혈성 빈혈, 크라일로글로불린증, 부신백질이영양증 또는 전신성 홍반성 낭창 일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

상기 약학적 조성물은 상기 골수유래억제세포(MDSC) 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 면역 거부반응의 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 경고제, 로션제, 연고제 등의 형태일 수 있다.

본 발명은 골수유래억제세포(myeloid-derived suppressor cell; MDSC) 분화 유도용 조성물 및 이의 분화 유도방법에 관한 것으로서, 생쥐 골수세포를 분리하여 사이토카인 M-CSF를 포함하는 조건에서 배양하면 골수유래대식세포로 분화되고, 이들 세포에 사이토카인 IFN-γ를 포함하는 조건에서 추가배양하여 분화시킨 MDSC에 대한 것이다. 이렇게 분화시켜 배양된 MDSC를 이용하여 이들 세포를 표적으로 하는 항체를 개발하여 MDSC의 세포사멸을 유도할 수 있다면 암 면역치료에 탁월한 효과를 나타낼 것이며, T세포 활성억제능을 가진 MDSC는 조혈모세포이식, 조직이식, 자가면역반응 등 면역반응이 억제되어야하는 조건에서 세포치료제로 사용될 수 있다.

도 1은 LPS 유도 생쥐로부터 분리된 비장세포 및 혈액에서의 세포군 분석결과이다. (A) C57BL/6 생쥐의 복강에 LPS (10 mg/kg)를 24시간 동안 주사하였다. 유세포 분석기를 이용하여 비장세포를 분석하였다. (B) C57BL/6 생쥐의 복강에 LPS (10 mg/kg)를 24시간 동안 주사하였다. 정맥동(venous sinus)으로부터 혈액을 수집하였다. Ficoll-hypaque를 사용하여 적혈구를 제거하였고, 세포들은 유세포 분석기로 분석하였다.
도 2는 LPS 유도 생쥐로부터 분리된 혈청에서의 사이토카인 분석 결과이다. C57BL/6 생쥐의 복강에 LPS (10 mg/kg)를 주사하고, 24시간 동안 표준 사육 조건을 유지하였다. 혈액은 여러 시간 조건에서 분리하였다 (1, 대조군; 2, 3 h; 3, 6 h; 4, 12 h). 혈청은 혈액으로부터 얻어졌고, 혈청 내의 여러 사이토카인은 BD cytometric bead array (CBA) 및 유세포 분석기를 사용하여 분석되었다. B7-H1 KO 생쥐는 LPS 유도동물모델의 양성대조군으로 이용하였다.
도 3은 LPS 유도 생쥐로부터 분리된 비장세포 및 골수에서의 세포군 분석결과이다. C57BL/6 생쥐의 복강에 LPS (10 mg/kg)를 24시간 동안 주사하였다. 비장세포 및 골수세포를 CD11b 및 Gr-1 항체 (Antibody; Ab)로 염색하여 유세포 분석기로 분석하였다.
도 4는 생쥐 골수 세포를 다양한 사이토카인으로 처리한 후 세포군 분석결과이다. C57BL/6 생쥐의 골수 세포를 분리한 후 48 h 동안 M-CSF를 첨가하여 배양하였다. M-CSF 유도 골수유래대식세포에 IL-1β (10 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml), TNF-α (25 ng/ml) 및 IFN-γ (100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 세포는 CD11b 및 Gr-1 항체로 염색되었고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 5는 IFN-γ 농도에 따른 생쥐 골수세포의 세포군 분석 결과이다. 골수세포는 C57BL/6 생쥐로부터 분리되었고, M-CSF를 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. M-CSF-유도 골수유래대식세포는 IFN-γ (1 ng/ml, 10 ng/ml, 30 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 세포를 CD11b 및 Gr-1 항체로 염색하였고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 6은 M-CSF-유도 골수유래대식세포에서 CD11b 양성 세포를 분석한 결과이다. 골수세포는 C57BL/6 생쥐로부터 분리되었고, M-CSF (30 ng/ml)를 첨가하여 2일 동안 배양하였다. M-CSF-유도 골수유래대식세포는 IFN-γ (100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 (A) 또는 48시간 (B) 동안 자극하였다. 세포를 CD11b 및 Gr-1 항체로 염색하였고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 7는 IFN-γ에 의한 비장세포의 분화를 분석한 결과이다. 비장은 C57BL/6 생쥐로부터 분리되었다. (A) 총 비장세포에 IFN-γ (100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 세포는 CD11b 및 Gr-1 항체로 염색되었고, 유세포 분석기로 분석하였다. (B) 비장세포를 4시간 동안 배양한 후 부착세포만을 분리하였고, IFN-γ (100 ng/ml)를 24시간 동안 첨가하여 배양하였다. 세포는 CD11b 및 Gr-1 항체로 염색되었고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 8은 M-CSF-유도 골수유래대식세포에서 CD11b 양성 세포를 분석한 결과이다. 골수세포는 C57BL/6 생쥐로부터 분리되었고, M-CSF (30 ng/ml)를 첨가하여 2일 동안 배양하였다. M-CSF-유도 골수유래대식세포는 IFN-γ (100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 동안 자극하였다. 세포를 CD11b 및 Gr-1 (A), CD11b 및 Ly-6G (B) 또는 CD11b 및 Ly-6C (C) 항체로 염색하였고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 9는 M-CSF-유도 골수유래대식세포에서 Gr-1 양성 세포를 분석한 결과이다. 골수세포는 C57BL/6 생쥐로부터 분리되었고, M-CSF (30 ng/ml)를 첨가하여 2일 동안 배양하였다. M-CSF-유도 골수유래대식세포는 IFN-γ(100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 동안 분화하였다. 세포를 Gr-1 및 Ly-6G (A) 또는 Gr-1 및 Ly-6C (B) 항체로 염색하였고, 유세포 분석기로 분석하였다.
도 10은 자가 혼합 림프구 반응 (Autologous MLR) 상에서 IFN-γ-유도 Gr-1 양성세포에 대한 효과를 나타낸다. 골수세포는 C57BL/6 생쥐로부터 분리되었고, M-CSF (30 ng/ml)를 첨가하여 2일 동안 배양하였다. M-CSF-유도 골수유래대식세포는 IFN-γ (100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 동안 분화하였다. Gr-1 양성세포는 biotin-conjugated Gr-1 항체로 1차 반응 후 anti-biotin-microbead MACS column를 이용하여 분리하였다. 대조군은 골수세포중 Gr-1 양성세포만을 분리하여 사용하였다. T 세포는 C57BL/6 비장세포로부터 분리 후 CFSE-염색하여 반응 T 세포 (2 x 10⁵)를 얻었으며, 둥근 바닥 96-well plate에 Gr-1 양성 자극 세포와 1:2 (A) 또는 1:4 (B)의 비율로 혼합되었다. 혼합된 세포군은 anti-CD3 항체를 첨가하여 3일 동안 배양하였다. T 세포의 활성은 유세포 분석기로 분석하였다. 도 10C은 자가 혼합 림프구 반응(Autologous MLR) 상에서 NO의 생성을 분석한 결과이다. 상기 도 10의 반응중 반응 T 세포와 Gr-1 양성 자극세포를 1:2로 혼합하여 anti-CD3 항체로 자극하여 반응시킨 상등액을 얻은 후 NO의 농도를 NO 분석방법을 이용하여 분석하였다.
도 11은 M-CSF-유도된 골수유래대식세포에서의 RT-PCR 분석 결과이다. 골수세포는 C57BL/6 생쥐로부터 분리되었고, M-CSF (30 ng/ml)를 첨가하여 2일 동안 배양하였다. M-CSF-유도 골수유래대식세포는 LPS (100 ng/ml), IFN-γ (100 ng/ml) 또는 LPS (100 ng/ml)와 IFN-γ (100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 동안 자극하였다. 총 mRNA는 각 세포로부터 분리하였고, RT-PCR은 아르기나제(agrinase-1), iNOS 및 GAPDH를 이용하여 수행하였다.
도 12는 M-CSF-유도 골수유래대식세포에 IFN-γ 처리 후 Ly-6C 양성세포와 음성세포의 구조를 비교 분석한 결과이다. 골수세포는 C57BL/6 생쥐로부터 분리되었고, M-CSF (30 ng/ml)를 첨가하여 2일 동안 배양하였다. M-CSF-유도 골수유래대식세포는 IFN-γ (100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 동안 분화하였다. Ly-6C 양성세포는 biotin-conjugated Ly-6C 항체로 1차 반응 후 anti-biotin-microbead MACS column를 이용하여 분리하였다. Ly-6C 양성세포와 음성세포의 구조를 현미경을 이용하여 200 배율에서 비교분석 하였다.
도 13은 자가 혼합 림프구 반응 (Autologous MLR) 상에서 IFN-γ-유도 Ly-6C 양성세포에 대한 효과를 나타낸다. 골수세포는 C57BL/6 생쥐로부터 분리되었고, M-CSF (30 ng/ml)를 첨가하여 2일 동안 배양하였다. M-CSF-유도 골수유래대식세포는 IFN-γ (100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 동안 분화하였다. Ly-6C 양성세포는 biotin-conjugated Ly6-C 항체로 1차 반응 후 anti-biotin-microbead MACS column를 이용하여 분리하였다. T 세포는 C57BL/6 비장세포로부터 분리 후 CFSE-염색하여 반응 T 세포 (2 x 10⁵)를 얻었으며, 둥근 바닥 96-well plate에 Ly-6C 양성 자극 세포 또는 Ly-6C 음성세포와 1:2 비율로 혼합되었다. 혼합된 세포군은 anti-CD3 항체를 첨가하여 3일 동안 배양하였다. T세포의 활성은 유세포 분석기로 분석하였다.
도 14는 도 13의 자가 혼합 림프구 반응 (Autologous MLR) 상등액내 IFN-γ의 농도를 분석 결과이다. CFSE-염색된 반응 T 세포 (2 x 10⁵)와 Ly-6C 양성 자극 세포 또는 Ly-6C 음성세포를 1:2 비율로 혼합되었다. 혼합된 세포군은 anti-CD3 항체를 첨가하여 3일 동안 배양하였다. 배양 상등액을 분리하고 상등액내 IFN-γ의 농도를 CBA kit를 이용하여 분석하였다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > LPS 유도 염증반응 동물모델에서 증가하는 면역세포 특성분석

1. 시약 및 항체

대식세포 콜로니 자극 인자 (Macrophage-colony stimulating factor; M-CSF)는 Pepro Tech (Rocky Hill, USA)에서 구입하였고, Escherichia coli serotype Lipopolysaccharide (026:B6)는 Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)에서, 인터페론-γ (interferon-γ; IFN-γ)는 R & D systems (San Diego, US)에서 구입하였다. FITC-conjugated anti-mouse CD11b, PE-conjugated anti-mouse Gr-1은 eBioscience (San Diego, USA)에서 구입하였다. FITC-conjugated anti-mouse Ly-6G, PE-conjugated anti-mouse Ly-6C는 BD Pharamingen (San Diego, USA)에서 구입하였다. 골수 세포에서 MDSC를 분리하기 위해 anti mouse Ly6G-Biotin, anti mouse Ly-6C-Biotin, anti Biotin microbead는 Miltenyi Biotec (Auburn, USA)에서 구입하였다.

2. 비장세포 및 골수세포의 배양

비장 세포는 생쥐의 비장을 적출하여 파쇄한 후, 여과기 (strainer)에 거른 세포를 1600 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 ACK lysis Buffer (150 mM NH₄Cl, 1 mM KHCO₃, 0.1 mM Na₂ EDTA)로 적혈구를 제거하여 얻었다. 골수 세포는 생쥐의 다리뼈를 적출하여 뼈 안의 골수세포를 분리한 뒤, 1600 rpm에서 5 분 동안 원심분리하고 ACK lysis Buffer로 적혈구를 제거하고 여과기 (strainer)에 거른 후 세포를 얻었다. 이렇게 얻어진 골수 세포는 기질 (stromal) 세포 제거 후 Ficoll 증층원심분리법 이용하여 단핵구 (monocyte)로 분리하고 30 ng/ml 농도의 M-CSF을 주어 이틀간 분화시켰다. M-CSF 분화유도 세포는 95 % 이상이 CD11b⁺ 세포이며, 이들세포에 IFN-γ를 처리하여 분화를 유도한 후 Gr-1⁺ 세포들은 Gr-1 항체, Ly-6C⁺ 세포들은 Ly-6C 항체로 1차 반응 후 anti-biotin-microbead MACS column를 이용하여 각각 분리하였다. 세포는 10% 열-불활화된 우태아혈청(heat-inactivated fetal calf serum), 100 U/ml 페니실린 (penicillin), 및 100ug/ml 스트렙토마이신 (streptomycin; HyClone, USA)을 포함한 RPMI 1640 (HyClone, USA) 배지에 37℃, 5 %의 CO₂ 조건에서 배양하였다.

3. 실험동물

이 발명에 사용된 8주령 수컷 C57BL/6 생쥐의 실험계획은 인제대학교 의과학 대학 동물 실험실의 연구 승인을 받아 (승인번호 2011-061, 060) 오리엔트바이오 (Daejeon, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 패혈증 동물 모델은 LPS를 10 mg/kg로 복강에 주사하여 만들었다.

4. 유세포 분석

다양한 실험조건에서 배양한 세포를 FACS buffer (PBS containing 1% FCS and 0.1% NaN₃)로 씻고 비특이적인 결합을 막기 위해 Fc blocker (mIgG, Sigma-Aldrich)로 4℃에서 15 분 동안 반응시킨다. 그리고 PE, FITC-conjugated antibody를 4℃에서 20 분간 반응시킨 후 FACSort와 CellQuestPro software (BD science, USA)로 분석하였다.

5. 생쥐 염증 사이토카인 분석

C57BL/6 생쥐에 LPS 10 mg/kg를 복강에 주사하여 시간별로 혈액을 뽑고 1시간 실온에 둔 후 7,000 rpm 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 얻은 혈청은 BD^TM Cytometric Bead Array (CBA) Mouse Inflammation Kit를 이용하여 반응시킨 후 분비된 사이토카인의 양을 유세포 분석기로 분석하였다.

6. 결과

지질다당체 (Lipopolysaccharide; LPS) 유도 패혈증 동물모델실험에서 C57BL/6 생쥐 LPS 유도시 특정 면역세포가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이들 세포가 골수유래억제세포 (Myeloid-derived suppressor cells; MDSC) 인지 확인하기 위하여 C57BL/6 생쥐의 복강에 LPS (10 mg/kg)를 주사하고 24시간 후 혈액 및 비장을 분리하여 면역세포의 변화를 유세포 분석기를 이용하여 확인하여 보았다. LPS 유도된 C57BL/6 생쥐의 비장세포에는 대조군에 비해 특정 면역세포가 약 4배 정도 증가되었음을 알 수 있었다 (도 1A). 또한 LPS 유도된 C57BL/6 생쥐의 혈액에 존재하는 면역세포를 분석한 결과 이들 면역세포가 10배 정도 증가되어 있음을 확인할 수 있었다 (도 1B). 이 연구결과를 근거로 이들 특정면역세포의 증가가 혈액 내 존재하는 사이토카인의 증가와 연관이 있는지 알아보기 위하여 LPS 유도된 C57BL/6 생쥐의 혈액을 분리하고 혈청 내에 존재하는 사이토카인의 변화를 분석하여 보았다.

C57BL/6 생쥐를 LPS로 3, 6, 12시간 동안 주사한 후 혈액에서 혈청을 분리하고 Mouse inflammation kit를 이용하여 사이토카인의 변화를 분석하여 보았다. 도 2의 분석결과에서 알 수 있듯이 IL-6, TNF-α, MCP-1는 LPS에 의해 3 시간째부터 크게 유도되었다. 이에 반해 IFN-γ는 LPS에 의해 6시간째 최대의 발현을 나타내었으며, 그 농도는 약 3500 ∼ 5000 pg/ml 정도로 높게 나타났다. IL-10은 C57BL/6 생쥐에서 매우 높게 증가하였으며, IL-12p70의 경우 생쥐개체마다 발현에 차이를 나타내었으며, 실험마다 변화의 정도가 심하게 나타나 유의한 판단을 하기 어려웠다. LPS에 의한 혈액내 사이토카인의 증가는 부분적인 차이를 보이기도 하지만 양성대조군인 B7-H1 KO 생쥐의 발현형태와 유사한 양상을 나타내었다.

LPS 유도 염증반응시 CD11b⁺Gr1^(int)의 세포특성을 보이는 조절 골수(regulatory myeloid) 세포들이 증가된다고 보고되었는데, 이 연구결과를 바탕으로 본 발명에서 증가한 특정면역세포가 CD11b⁺Gr1⁺ 세포의 특성을 나타내는지 확인하기 위하여 C57BL/6 생쥐의 복강에 LPS를 주사한 후 비장세포 및 골수세포를 대상으로 CD11b 및 Gr-1의 발현정도를 유세포분석기를 이용하여 분석하여 보았다. LPS 유도된 C57BL/6 생쥐의 비장세포에는 대조군에 비해 CD11b⁺Gr-1⁺ 세포수가 1.5배 정도 증가되었음을 알 수 있었다 (도 3). 이에 반해 골수세포내의 CD11b⁺Gr-1⁺ 세포의 수는 대조군에 비해 크게 감소되었음을 알 수 있었다. 골수세포내의 CD11b⁺Gr-1⁺ 세포의 감소는 혈액내 증가와 연관이 있음을 알 수 있다.

본 발명에서는 LPS 유도시 혈액 내에 다양한 사이토카인의 증가를 확인할 수 있었다 (도 2). 따라서 이들 사이토카인들이 Gr-1 양성 세포의 분화에 영향을 주는지 추가적인 실험을 통하여 알아보고자 하였다.

< 실시예 2 > IFN-γ 유도 골수유래 대식세포의 특성분석

C57BL/6 생쥐의 골수세포를 분리하고 M-CSF를 24시간 및 48시간 동안 처리하여 대식세포로 분화시켰다. 이들 대식세포들의 95% 이상이 CD11b+의 표현형을 나타내었다. 이들 세포를 다양한 사이토카인으로 처리하여 Gr-1의 발현 변화를 유세포분석기를 이용하여 분석하여 보았다. M-CSF를 24시간 동안 처리한 대조군에는 10% 정도의 Gr-1 양성세포가 존재하고 있었으며, IFN-γ (100 ng/ml)가 처리되었을 때 65% 정도의 Gr-1 양성세포가 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 4). 이에 반해 IL-1β 및 IL-6 사이토카인들은 Gr-1 양성세포의 분화에 미미한 영향을 주고 있으며, TNF-α 사이토카인은 35% 정도의 Gr-1 양성세포의 분화를 유도함을 알 수 있었다.

골수유래 대식세포에서 IFN-γ에 의해 Gr-1 발현이 증가됨을 확인하였기 때문에 (도 4), 이들 세포의 IFN-γ 농도에 따른 분화정도를 분석하여 보았다. C57BL/6 생쥐에서 골수세포를 분리하여 M-CSF 유도 골수유래대식세포로 48시간 동안 분화시킨 후 다양한 농도의 IFN-γ (1, 10, 50, 100 ng/ml)를 24시간 처리하여 Gr-1의 발현 변화를 유세포분석기를 이용하여 분석하여 보았다. 골수유래 대식세포에 1 ng/ml의 IFN-γ를 처리시 56%가 CD11b⁺Gr-1⁺세포로 분화하였으며, IFN-γ의 농도에 의존해 CD11b⁺Gr-1⁺세포의 수는 증가하였고, 100 ng/ml 농도의 IFN-γ에서는 60% 이상의 CD11b⁺Gr-1⁺세포임을 확인할 수 있었다 (도 5). 따라서, IFN-γ는 매우 낮은 농도에서 M-CSF 유도 골수유래대식세포를 CD11b⁺Gr-1⁺ 세포로 분화 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한 IFN-γ를 처리하였을 때 Gr-1^(high)인 세포수는 24시간에 11.5% (도 6A), 48시간에는 17.7% (도 6B)로 크게 증가함을 알 수 있었다 .

IFN-γ가 비장유래 대식세포의 분화에도 영향을 미치는지 알아보기 위하여 전체 비장세포 및 비장유래대식세포를 분리하여 24 시간 동안 IFN-γ (100ng/ml)를 처리한 후 Gr-1 양성세포를 유세포분석기를 이용하여 분석하여 보았다. 전체 비장세포에 IFN-γ 처리시 대조군에 비해 약 1.5 배의 CD11b⁺Gr-1⁺세포의 증가를 확인할 수 있었다 (도 7A). 비장유래 대식세포에 IFN-γ (100 ng/ml)를 24 시간 처리시 에는 CD11b⁺Gr-1⁺세포가 약 4배 증가되었음을 확인할 수 있었다 (도 7B). 생쥐의 활성화된 CD11b⁺Gr-1⁺ 골수유래억제세포 (myeloid-derived suppressor cell; MDSC)은 공통적으로 Ly-6C 와 Ly-6G 분자를 발현한다고 보고하였다. 따라서 이들 IFN-γ로 처리하여 분화된 CD11b⁺Gr-1⁺ 대식세포 (도 8A)의 특성을 자세히 분석하여 보았다. 이들 세포를 CD11b 및 Ly-6G 항체로 염색한 결과 대부분 CD11b⁺Ly-6G^- 세포임을 알 수 있었다 (도 8B). 또한 이들 세포를 CD11b 및 Ly-6C 항체로 염색한 결과 CD11b⁺Ly-6C⁺ 세포는 26%에 달했다 (도 8C). 이들 IFN-γ로 처리하여 분화된 Gr-1⁺ 대식세포의 특성을 Ly-6G 및 Ly-6C 항체로 염색하여 확인하여 보았다. 이들 세포들 중 Gr-1+Ly-6C+ 표현형 (도 9B)을 나타내는 비율은 50%에 달했으나, Gr-1+Ly-6G+ 표현형 (도 9A)의 세포는 거의 존재하지 않았다. 이상의 연구결과를 종합하면 IFN-γ에 의해 분화된 세포들은 CD11b⁺Gr-1⁺의 특성을 나타내었으며, 이들 중 대부분의 세포는 CD11b⁺Gr-1⁺Ly-6G^-Ly-6C⁺의 특징을 나타내었다. 이들 세포들은 IFN-γ유도 골수유래억제세포 (Myeloid-derived suppressor cells; MDSC)라고 명명 하였다.

< 실시예 3 > IFN-γ 유도 MDSC의 기능연구

1. 자가 혼합 림프구 반응 (Autologous MLR)

반응 세포 (Responder cell)는 C57BL/6 생쥐의 비장에서 분리하였다. MACS mouse CD90.2 isolation kit (Miltenyi Biotec Auburn, USA)을 이용해 비장에서 T 세포를 분리하여 CFSE로 염색해 두었다. 얻어진 세포는 95% 이상 CD3⁺ 세포였다. C57BL/6 생쥐의 골수세포에서 M-CSF를 이용해 대식세포로 분화시킨 후 IFN-γ 100 ng/ml을 처리하여 24시간 배양한 CD11b⁺Gr-1⁺ 세포 및 CD11b⁺Ly-6C⁺ 세포를 MACS anti-Gr-1-biotin 및 MACS anti-Ly-6C-biotin (Miltenyi Biotec Auburn, USA)을 이용 Micro Bead를 이용해 세포를 분리한 후 자극세포 (stimulator cell)로 사용하였다. Responder T 세포 (2 x 10⁵)와 자극세포는 1:2 또는 1:4의 비율로 섞어 round bottom 96-well plate에 배양하였다. 혼합된 세포를 3일 동안 배양 후 유세포 분석기 (flow cytometry)로 T 세포의 증식을 측정하였다.

2. NO 분석

NO의 생성은 NO의 대사물인 아질산염 (nitrite)의 양을 측정하는 Griess assay (Sigma, USA)를 이용하였다. 골수 세포를 대식세포로 분화시킨 후 LPS 100 ng/ml, IFN-γ 100 ng/ml을 24시간 처리한 상등액을 얻고 동량의 Griess 반응액을 섞은 후 96 well plate에 옮겨 흡광기로 570 mm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 표준곡선을 구하기 위해 아질산나트륨 (sodium nitrite; Sigma, USA)을 단계적으로 희석하여 사용하였다.

3. 세포형태 분석

골수유래대식세포에 IFN-γ (100 ng/ml)를 24 시간 처리한 후 Ly-6C 항체로 염색하여 Ly-6C 양성세포와 음성세포를 MACS column system을 이용하여 분리하고 현미경적 관찰로 확인하였다.

4. 결과

앞서 수행한 연구결과에서 IFN-γ유도 골수유래억제세포 (Myeloid-derived suppressor cells; MDSC)의 표현형을 확인하였기 때문에 이들 세포의 기능을 분석하여 보았다. MDSC의 특징은 세포독성 T 세포의 기능을 억제한다고 알려져 있다. MDSC가 T 세포를 조절하는 기전 중 하나는 산화질소 합성효소와 (nitric oxide synthase)와 아르기나제 (arginase)라는 효소가 필수아미노산인 L-아르기닌(L-arginine)의 대사를 조절함으로써 이루어진다. 기존의 보고에 의하면 이들 세포들은 산화질소 (nitric oxide)를 생성하며, T 세포의 활성을 억제한다고 보고 하였다. 따라서 IFN-γ에 의해 유도된 CD11b⁺Gr-1⁺ 및 CD11b⁺Gr-1⁺Ly-6G^-Ly-6C⁺ 세포들이 MDSC의 기능을 나타내는지 알아보고자 하였다.

IFN-γ로 유도된 MDSC가 T 세포활성을 억제하는지 확인하기 위해서 자가 혼합 림프구 반응 (Autologous MLR) 반응을 수행하여 보았다. C57BL/6 생쥐에서 골수세포를 분리하여 M-CSF를 이용해 대식세포로 분화시킨 후 IFN-γ (100 ng/ml)을 처리하여 24시간 배양한 CD11b⁺Gr-1⁺세포 (IFN-γ MDSC)를 Gr-1 Microbead를 이용해 분리하여 자극 세포 (stimulator cell)로 사용하였다. 또한 골수세포에서 Gr-1 양성세포를 분리하여 대조군 (naive Gr-1⁺)으로 사용하였다. 반응 세포 (responder cell)는 C57BL/6 생쥐의 비장에서 T 세포를 분리하여 CFSE로 염색하였다. 반응 T 세포 (2 x 10⁵)와 자극세포는 1:2 (도 10A) 또는 1:4 (도 10B)의 비율로 섞고 anti-CD3 항체를 이용해 T 세포를 자극하며 배양하였다. 혼합된 세포는 3일 동안 배양 후 유세포분석기를 이용하여 T 세포의 증식을 측정하여 보았다. 대조군 (naive Gr-1+)은 T 세포 단독 배양군과 비교시 큰 차이가 보이지 않았다 (도 10A, 10B). 하지만 IFN-γ로 유도된 CD11b⁺Gr-1⁺ (IFN-γ MDSC) 세포군의 T 세포의 활성은 대조군에 비해 크게 억제됨을 확인할 수 있었다 (도 10A, 10B). 이들 반응 상등액을 분리하여 NO의 농도를 측정한 결과 IFN-γ로 유도된 CD11b⁺Gr-1⁺ (IFN-γ MDSC) 세포군의 반응 상등액에는 22 uM에 해당하는 높은 농도의 NO가 존재함을 알 수 있었다 (도 10C).

CD11b⁺Gr-1⁺ (IFN-γ MDSC) 세포군의 T 세포의 활성억제 기전이 arginase-1 및 iNOS 발현과의 연관성을 규명하기 위하여 M-CSF-유도된 골수유래대식세포에 BM cells (negative control), LPS (100 ng/ml) 처리군 (positive control), IFN-γ (100 ng/ml) 처리군 (IFN-γ MDSC) 또는 LPS (100 ng/ml)와 IFN-γ (100 ng/ml)를 첨가하여 24시간 동안 자극한 후 유전자 발현을 RT-PCR로 확인하여 보았다. 골수세포 자체는 아르기나제 (agrinase-1) 및 iNOS의 발현이 없었으나 LPS 처리군 및 FN-γ MDSC군은 아르기나제 (agrinase-1) 및 iNOS의 발현이 현저하게 증가되었음을 확인할 수 있었다.

CD11b⁺Gr-1⁺ (IFN-γ MDSC) 세포들 중 Gr-1⁺Ly-6C⁺ 표현형을 나타내는 세포만을 분리하여 세포형태학적 차이를 비교하여 보았다. Gr-1⁺Ly-6C⁺ 세포들은 Gr-1⁺Ly-6C^- 세포에 비하여 작고 둥근형태의 세포구조를 하고 있었다 (도 12). 또한 이들 세포들을 이용하여 자가 혼합 림프구 반응 (Autologous MLR) 반응을 수행한 결과 IFN-γ 처리된 전체세포 (IFN-γ cell) 및 Gr-1⁺Ly-6C^- (Ly6C N) 세포들은 T세포의 활성을 억제하지 못한 반면 Gr-1⁺Ly-6C⁺ (Ly-6C P) 세포들은 T 세포의 성장을 크게 억제하였다 (도 13). 또한 이들 반응액내에 T 세포의 활성에 따라 분비되는 IFN-γ의 농도를 측정한 결과 대조군에 비해 Gr-1⁺Ly-6C^- 세포 반응군의 상등액에서 IFN-γ의 농도가 크게 감소되었음을 확인할 수 있었다 (도 14).

본 실험결과를 종합하면 IFN-유도 CD11b⁺Gr-1⁺ 세포군 및 CD11b⁺Gr-1⁺Ly-6G^-Ly-6C⁺ 세포군은 MDSC의 세포특징을 가지고 있으며, 또한 T 세포 활성 억제능도 보유하고 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (11)

1. 대식세포 콜로니 자극 인자 (Macrophage-colony stimulating factor; M-CSF) 및 인터페론-γ (interferon-γ; IFN-γ)를 유효성분으로 포함하며, 골수세포에서 CD11b⁺Gr-1⁺Ly-6G^-Ly-6C⁺의 세포표현형을 갖는 골수유래억제세포 (myeloid-derived suppressor cell; MDSC)로의 분화 유도용 조성물.
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4. (1) 골수세포를 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)로 처리하여 골수유래대식세포로 분화시키는 단계; 및
   (2) 상기 분화된 골수유래대식세포를 인터페론-γ (IFN-γ)로 처리하여 CD11b⁺Gr-1⁺Ly-6G^-Ly-6C⁺의 세포표현형을 갖는 골수유래억제세포 (MDSC)로 분화를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 골수유래억제세포 (MDSC)로의 분화 유도 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 (1) 단계의 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)는 10 ng/ml 내지 30 ng/ml로 24시간 내지 48시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 골수유래억제세포 (MDSC)로의 분화 유도 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 (2) 단계의 인터페론-γ (IFN-γ)은 1 ng/ml 내지 500 ng/ml로 24시간 내지 48 시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 골수유래억제세포 (MDSC)로의 분화 유도 방법.
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