KR101545183B1 - Aptamers for mature white adipocytes and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 성숙지방세포에 특이적으로 결합하는 앱타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 FACS 기반 SELEX 방법을 이용하여 앱타머 라이브러리 중 3T3-L1 성숙지방세포(mature adipocyte cells)에 대해 결합 친화도가 높은 앱타머를 선별하였고, 상기 선별된 앱타머가 초기성숙백색지방세포(primary mature white adipocyte)에는 결합하지만 초기성숙갈색지방세포(primary mature brown adipocyte)에는 결합하지 못하는 것을 확인함으로써, 상기 선별된 앱타머는 성숙백색지방세포의 검출 및 정량, 또는 비만 예방 및 치료제 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to an aptamer specifically binding to mature adipocytes and a use thereof. More specifically, the present invention relates to a method for screening 3T3-L1 mature adipocyte cells in an aptamer library using a FACS-based SELEX method, , And confirmed that the selected aptamer binds to primary mature white adipocytes but not to primary mature brown adipocytes so that the selected aptamers bind to primary mature white adipocytes, Can be usefully used for the detection and quantification of mature white adipocytes, or for the prevention and treatment of obesity.
Description
성숙백색지방세포(mature white adipocytes)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머(aptamer), 및 상기 앱타머를 성숙백색지방세포 검출 및 정량, 또는 비만 예방 및 치료제 스크리닝에 이용하는 용도에 관한 것이다.It relates to a nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes, and a use of the aptamer for detection and quantification of mature white adipocytes, or for screening for obesity prevention and treatment.
오늘날, 많은 사람들은 다양한 대사장애(metabolic disorders)로 고통받고 있다. 비만(obesity)은 많은 대사 장애와 관련된 주된 원인으로 가장 논란이 되고 있는 동시대 사회적 문제 중 하나이다. 비만은 이형 당뇨(type II diabetes), 이상지질혈증(dyslipidemia) 및 고혈압(hypertension)을 유발하고, 심장혈관계 질병(cardiovascular diseases)으로 발달할 수 있는 위험성을 야기한다. 다양한 연구를 통해 비만대사 수술(bariatric surgery), 항비만 치료제(오르리스타트(orlistat), 리모나반트(rimonabant) 및 시부트라민(sibutramine)) 및 줄기세포 치료법과 같은 비만과 관련된 치료 방법이 제안되고 있다. 그러나, 현존하는 방법들 모두 잠재적인 부작용을 가지고 있어, 여전히 비만을 치료하기 위한 더욱 효과적인 방법의 발달이 요구되고 있다. 특히, 성숙지방세포(mature adipocyte cell)에 특이적인 분자 프로브(probe)는 잠재적 부작용을 완화할 수 있어, 이에 대한 관심이 높아지고 있다.Today, many people suffer from a variety of metabolic disorders. Obesity is one of the most controversial contemporary social problems as a leading cause associated with many metabolic disorders. Obesity causes type II diabetes, dyslipidemia, and hypertension, and causes a risk of developing cardiovascular diseases. Through various studies, treatment methods related to obesity such as bariatric surgery, anti-obesity treatments (orlistat, rimonabant and sibutramine) and stem cell therapy have been proposed. However, all of the existing methods have potential side effects, and there is still a need to develop more effective methods for treating obesity. In particular, molecular probes specific for mature adipocyte cells can alleviate potential side effects, and thus, interest in this is increasing.
앱타머(aptamer)는 다양한 질병의 진단 및 치료에 광범위하게 적용되고 있다. 앱타머는 단백질, 화학 물질 또는 이종 세포(heterogeneous cells) 등과 같은 표적을 인식하기 위한 3차 구조를 가지는 올리고핵산(oligonucleic acid) 또는 펩티드 분자이다(Famulok M et al., Chem Rev, 2007; 107: 3715-3743). 앱타머는 SELEX(Systemic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) 방법으로 라이브러리 풀(pool)(올리고 핵산 또는 펩티드; 1014-15 크기의 시작 풀)로부터 분리된다. SELEX 기술은 시험관 내에서(in vitro) T4 DNA 폴리머라아제(polymerase)에 대한 RNA 리간드를 선별한, Dr.Larry Gold에 의해 개발되었다(Tuerk C, Gold L. Sciencen , 1990; 249: 505-10). 1990년대에, SELEX 기술은 CE-SELEX(cell SELEX capillary electrophoresis SELEX), Counter-SELEX 및 Toggle SELEX 기술로 향상되었다. OSI Pharmaceuticals에서 시판하고 미국 식약청(U.S Food and Drug Administration, FDA)에 승인된 최초 앱타머 기반 약물인 마큐젠(Macugen)은 노인황반변성(age-related macular degeneration, ADM) 치료제로 사용되고 있다. 또한, NeoVentures Biotechnology Inc.에서는 진균독(mycotoxin)을 검출하는 최초 앱타머 기반 진단 키트를 성공적으로 상품화하였다. 그러나, 아직까지 비만 진단 및 치료에 적용되는 앱타머는 잘 알려져 있지 않다.Aptamer is widely applied to diagnosis and treatment of various diseases. Aptamers are oligonucleotides or peptide molecules that have a tertiary structure for recognizing targets such as proteins, chemicals or heterogeneous cells (Famulok M et al., Chem Rev , 2007; 107: 3715-3743). Aptamers are separated from library pools (oligo nucleic acids or peptides; starting pools of size 10 14-15 ) by the SELEX (Systemic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) method. The SELEX technology was developed by Dr. Larry Gold, which screened RNA ligands for T4 DNA polymerase in vitro (Tuerk C, Gold L. Sciencen , 1990; 249: 505-10). ). In the 1990s, SELEX technology was enhanced with cell SELEX capillary electrophoresis SELEX (CE-SELEX), Counter-SELEX and Toggle SELEX technologies. Macugen, the first aptamer-based drug sold by OSI Pharmaceuticals and approved by the US Food and Drug Administration (FDA), is being used as a treatment for age-related macular degeneration (ADM). In addition, NeoVentures Biotechnology Inc. successfully commercialized the first aptamer-based diagnostic kit to detect mycotoxin. However, the aptamer applied to the diagnosis and treatment of obesity is not yet well known.
지방세포를 구성하는 지방조직(Adipose tissue)은 에너지 항상성(energy homeostasis)의 조절에 관여하는 중요한 대사 기관이다. 비만은 신체의 에너지 균형이 깨졌을 경우 발생한다. 포유류에서, 지방조직은 기능 및 형태에 따라 일반적으로 백색지방조직(white adipose tissue, WAT) 및 갈색지방조직(brown adipose tissue, BAT)으로 분류된다. 백색지방조직은 여분의 에너지를 저장하기 위해 사용되며 세포에 단일 거대 지방방울(lipid droplet)을 포함하고 있다. 갈색지방조직은 특성화된 형태의 지방조직으로 열역학 기관으로서 에너지 소비를 위한 열을 발생시킨다. 갈색지방세포는 여러 작은 지방방울을 포함하고 있다. 이들 지방조직의 특징을 통해 백색지방세포의 분화가 비만의 발달과 밀접한 관련이 있음을 알 수 있다.Adipose tissue constituting adipocytes is an important metabolic organ involved in the regulation of energy homeostasis. Obesity occurs when the body's energy balance is broken. In mammals, adipose tissue is generally classified into white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue (BAT) according to function and shape. White adipose tissue is used to store excess energy and contains a single large lipid droplet in the cell. Brown adipose tissue is a specialized type of adipose tissue that generates heat for energy consumption as a thermodynamic organ. Brown fat cells contain several small fat droplets. It can be seen that the differentiation of white adipocytes is closely related to the development of obesity through the characteristics of these adipose tissues.
이에, 본 발명자들은 새로운 앱타머를 발굴하기 위해 노력한 결과, 성숙백색지방세포(mature white adipocyte)에 대해 결합 친화도 및 특이성이 높은 앱타머를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have completed the present invention by developing an aptamer having high binding affinity and specificity for mature white adipocytes as a result of trying to discover a new aptamer.
본 발명의 목적은 성숙백색지방세포(mature white adipocytes)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머(aptamer)를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes.
또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는 성숙백색지방세포의 검출 또는 정량용 키트, 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention is to provide a kit for detection or quantification of mature white adipocytes comprising the nucleic acid aptamer of the present invention, and a method of using the same.
아울러, 본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 핵산 앱타머를 포함하는 비만 예방 및 치료제 스크리닝용 키트 및 이를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention is to provide a kit for screening for prevention and treatment of obesity comprising the nucleic acid aptamer of the present invention and a method of using the same.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 성숙백색지방세포(mature white adipocytes)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머(aptamer)를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes.
또한, 본 발명은 성숙백색지방세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 포함하는 성숙백색지방세포 검출 또는 정량용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting or quantifying mature white adipocytes comprising a nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes.
또한, 본 발명은 성숙백색지방세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 포함하는 성숙백색지방세포 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting or quantifying mature white adipocytes comprising a nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes.
또한, 본 발명은 성숙백색지방세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 포함하는 지방세포형성(adipogenesis) 모니터링용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for adipogenesis monitoring comprising a nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes.
또한 본 발명은 In addition, the present invention
1) 성숙백색지방세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머에 검체 시료를 접촉시키는 단계; 및 1) contacting the specimen with a nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes; And
2) 단계 1)에 수득된 세포-앱타머 복합체를 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는 성숙백색지방세포 검출 또는 정량 방법을 제공한다.2) It provides a method for detecting or quantifying mature white adipocytes comprising the step of detecting or quantifying the cell-aptamer complex obtained in step 1).
또한, 본 발명은 성숙백색지방세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 포함하는 비만 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for screening a therapeutic agent and preventing obesity comprising a nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes.
*아울러, 본 발명은 성숙백색지방세포에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머를 포함하는 비만 예방 및 치료제 스크리닝용 키트를 제공한다.*In addition, the present invention provides a kit for screening for obesity prevention and treatment comprising a nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes.
본 발명의 핵산 앱타머(aptamer)는 성숙백색지방세포에 대한 결합 친화도 및 특이도가 우수하고, 지방전구세포와 성숙지방세포를 구별하여 성숙지방세포에 특이적으로 결합하며, 성숙백색지방세포와 성숙갈색지방세포를 구별하여 성숙백색지방세포에 특이적으로 결합하므로, 성숙백색지방세포의 검출 또는 정량, 및 이를 통한 비만 치료제 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.The nucleic acid aptamer of the present invention has excellent binding affinity and specificity for mature white adipocytes, and specifically binds to mature adipocytes by distinguishing between adipocytes and mature adipocytes. Since the mature brown adipocytes are distinguished from each other and specifically bind to the mature white adipocytes, it can be usefully used for detection or quantification of mature white adipocytes, and screening for obesity treatments.
도 1은 성숙지방세포(mature adipocyte)에 결합하는 앱타머(aptamer) 분리를 위한 FACS-CELL SELEX의 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 지방전구세포(pre-adipocyte) 또는 성숙지방세포와 1, 3, 5, 9 및 11 회(round) SELEX 후 앱타머 풀(pool)의 결합 친화도를 나타낸 도이다.
도 3은 분화된 성숙지방세포와 앱타머 라이브러리 및 9 회 SELEX 후 앱타머 풀의 결합친화도를 나타낸 도이다:
control: 대조군;
Library: 앱타머 라이브러리 및 성숙지방세포 혼합군; 및
MA-9 round: 9 회 SELEX 후 앱타머 풀 및 성숙지방세포 혼합군.
도 4a는 3T3-L1 지방전구세포, 3T3-L1 성숙지방세포, HEK-293, C2C12 또는 HeLa 세포와 앱타머 라이브러리 및 12 회 SELEX 후 앱타머 풀(MA-12 round)의 결합 친화도를 나타낸 도이다.
도 4b는 트립신(trypsin) 처리한 성숙지방세포 또는 EDTA 처리한 성숙지방세포와 앱나머 라이브러리 및 12 회 SELEX 후 앱타머 풀(MA-12 round)의 결합 친화도를 나타낸 도이다.
도 5는 선별된 앱타머 MA-33(위) 및 MA-91(아래) 이차구조를 나타낸 도이다.
도 6a는 3T3-L1 지방전구세포 또는 3T3-L1 성숙지방세포와 앱타머 라이브러리, MA-33 및 12 회 SELEX 후 앱타머 풀(MA-12 round)의 결합 친화도를 나타낸 도이다.
도 6b는 3T3-L1 지방전구세포(pre-adipocyte) 또는 3T3-L1 성숙지방세포와 앱타머 라이브러리, MA-91 및 12 회 SELEX 후 앱타머 풀(MA-12 round)의 결합 친화도를 나타낸 도이다.
도 6c는 3T3-L1 지방전구세포 및 3T3-L1 성숙지방세포와 MA-33(위) 또는 MA-91(아래)의 결합 친화도를 나타낸 도이다.
도 6d는 3T3-L1 지방전구세포, 3T3-L1 성숙지방세포, HEK-293, C2C12 또는 HeLa 세포와 MA-33 및 MA-91의 결합 친화도를 나타낸 도이다.
도 6e는 트립신 처리한 성숙지방세포 또는 EDTA 처리한 성숙지방세포와 앱타머 라이브러리, MA-33 및 MA-91의 결합 친화도를 나타낸 도이다.
도 7a는 분화하는 3T3-L1 지방전구세포와 앱타머 라이브러리, 아디포-8(adipo-8), MA-33 및 MA-91의 결합 친화도를 나타낸 도이다.
도 7b는 성숙지방세포와 앱타머 라이브러리, 아디포-8, MA-33 및 MA-91의 결합 친화도를 나타낸 도이다.
도 8a는 초기 백색지방전구세포(primary white pre-adipocyte) 및 분화 유도한 초기 성숙백색지방세포(primary white mature-adipocyte)를 나타낸 도이다.
도 8b는 초기 백색지방전구세포와 앱타머 라이브러리, MA-33 및 MA-91의 결합 친화도를 확인하고(위), 초기 백색지방전구세포와 MA-33 및 MA-91의 결합을 시각화(아래)하여 나타낸 도이다.
도 8c는 초기 성숙백색지방세포와 앱타머 라이브러리, MA-33 및 MA-91의 결합 친화도를 확인하고(위), 초기 백색지방전구세포와 MA-33 및 MA-91의 결합을 시각화(아래)하여 나타낸 도이다.
도 9a는 초기 갈색지방전구세포(primary brown pre-adipocyte) 및 분화 유도한 초기 성숙갈색지방세포(primary brown mature-adipocyte)를 나타낸 도이다.
도 9b는 초기 갈색지방전구세포와 앱타머 라이브러리, MA-33 및 MA-91의 결합 친화도를 확인하고(위), 초기 갈색지방전구세포와 MA-33 및 MA-91의 결합을 시각화(아래)하여 나타낸 도이다.
도 9c는 초기 성숙갈색지방세포와 앱타머 라이브러리, MA-33 및 MA-91의 결합 친화도를 확인하고(위), 초기 갈색지방전구세포와 MA-33 및 MA-91의 결합을 시각화(아래)하여 나타낸 도이다.1 is a diagram showing a schematic diagram of FACS-CELL SELEX for separation of aptamers that bind to mature adipocytes.
2 is a diagram showing the binding affinity of pre-adipocytes or mature adipocytes and aptamer pools after 1, 3, 5, 9 and 11 rounds of SELEX.
3 is a diagram showing the binding affinity of differentiated mature adipocytes and aptamer library and aptamer pool after 9 times SELEX:
control: control;
Library: Aptamer library and mixed group of mature adipocytes; And
MA-9 round: Mixed group of aptamer pool and mature adipocytes after 9 times SELEX.
Figure 4a is a diagram showing the binding affinity of 3T3-L1 adipocytes, 3T3-L1 mature adipocytes, HEK-293, C2C12 or HeLa cells with an aptamer library, and an aptamer pool (MA-12 round) after 12 times SELEX to be.
FIG. 4B is a diagram showing the binding affinity of trypsin-treated mature adipocytes or EDTA-treated mature adipocytes and Abnamer library, and aptamer pool (MA-12 round) after 12 times SELEX.
Figure 5 is a diagram showing the secondary structure of the selected aptamer MA-33 (top) and MA-91 (bottom).
6A is a diagram showing the binding affinity of 3T3-L1 adipocytes or 3T3-L1 mature adipocytes with an aptamer library, MA-33, and an aptamer pool (MA-12 round) after 12 times SELEX.
Figure 6b is a diagram showing the binding affinity of 3T3-L1 pre-adipocyte or 3T3-L1 mature adipocytes and aptamer library, MA-91 and aptamer pool (MA-12 round) after 12 times SELEX to be.
6C is a diagram showing the binding affinity between 3T3-L1 adipocytes and 3T3-L1 mature adipocytes and MA-33 (top) or MA-91 (bottom).
6D is a diagram showing the binding affinity between 3T3-L1 adipocytes, 3T3-L1 mature adipocytes, HEK-293, C2C12 or HeLa cells, and MA-33 and MA-91.
6E is a diagram showing the binding affinity between trypsin-treated mature adipocytes or EDTA-treated mature adipocytes and an aptamer library, MA-33 and MA-91.
7A is a diagram showing the binding affinity of differentiated 3T3-L1 adipocytes and aptamer libraries, adipo-8, MA-33, and MA-91.
7B is a diagram showing the binding affinity of mature adipocytes and aptamer libraries, Adipo-8, MA-33, and MA-91.
8A is a diagram showing primary white pre-adipocytes and primary white mature-adipocytes induced differentiation.
Figure 8b confirms the binding affinity of the initial white adipocytes and the aptamer library, MA-33 and MA-91 (top), and visualizes the binding of the initial white adipocytes to MA-33 and MA-91 (bottom ).
Figure 8c is to confirm the binding affinity of the early mature white adipocytes and the aptamer library, MA-33 and MA-91 (top), and visualize the binding of the early white adipocytes to MA-33 and MA-91 (bottom ).
9A is a diagram showing primary brown pre-adipocytes and primary brown mature-adipocytes induced differentiation.
Figure 9b is to confirm the binding affinity of the initial brown adipose progenitor cells and the aptamer library, MA-33 and MA-91 (top), and visualize the binding of the early brown adipose progenitor cells to MA-33 and MA-91 (bottom ).
Figure 9c is to confirm the binding affinity of the early mature brown adipocytes and the aptamer library, MA-33 and MA-91 (top), and visualize the binding of the early brown adipocytes to MA-33 and MA-91 (bottom ).
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성되는 성숙백색지방세포(mature white adipocytes)에 특이적으로 결합하는 핵산 앱타머(aptamer)를 제공한다.The present invention provides a nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3.
상기 앱타머는 성숙백색지방세포의 막 단백질에 결합하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The aptamer preferably binds to the membrane protein of mature white adipocytes, but is not limited thereto.
상기 "핵산 앱타머"는 짧은 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로 높은 친화도와 특이성으로 표적 물질에 결합할 수 있는 3차원 구조를 형성할 수 있으며, 대부분의 경우에 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있을 뿐 아니라 효율적으로 그 기능을 억제할 수 있어 표적 단백질의 기능을 알아내는데 이용될 수 있다. 반복된 생체 외 선별과정은 임의의 DNA 라이브러리로부터 특이적인 DNA 분자, 즉 앱타머의 선별이 가능하도록 하는데 DNA 라이브러리의 사이즈가 크고(1014-1015) 생체 외 효소 작용에 의해 DNA 분자를 생성하기 쉽기 때문에 DNA 라이브러리는 고 친화도 앱타머를 선별하기 위한 다른 생물학적 라이브러리 또는 합성 라이브러리보다 우수하다.The "nucleic acid aptamer" is a short single-stranded oligonucleotide that can form a three-dimensional structure capable of binding to a target substance with high affinity and specificity, and in most cases, it can only specifically bind to a target protein. In addition, it can effectively inhibit its function, so it can be used to find out the function of the target protein. The repeated in vitro screening process enables the selection of specific DNA molecules, that is, aptamers, from any DNA library. The size of the DNA library is large (10 14 -10 15 ), and DNA molecules are generated by the action of in vitro enzymes. Because of its ease, the DNA library is superior to other biological or synthetic libraries for screening for high affinity aptamers.
앱타머는, 통상적으로 SELEX법, 그 개량법[예컨대 Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al.,(1990) Science, 249, 505-510]을 이용함으로써 제작할 수 있다. SELEX법으로는 회(rourou) 수를 늘리거나, 경합 물질을 사용함으로써, 표적 물질에 대하여 보다 결합력이 강한 앱타머가 농축되고, 선별된다. 따라서, SELEX의 회수를 조절하거나, 경합 상태를 변화시킴으로써, 결합력이 상이한 앱타머, 결합 형태가 상이한 앱타머, 결합력이나 결합 형태는 동일하지만 염기 서열이 상이한 앱타머를 얻을 수 있는 경우가 있다. 또한, SELEX법에는 PCR에 의한 증폭 과정이 포함되지만, 그 과정에서 망간 이온을 사용하는 등으로 변이를 부여함으로써, 보다 다양성이 풍부한 SELEX를 행하는 것이 가능해진다.The aptamer is usually the SELEX method, its improved method [eg, Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510]. In the SELEX method, by increasing the number of rourou or using a competing substance, the aptamer with stronger binding power to the target substance is concentrated and selected. Therefore, by controlling the number of times of SELEX or by changing the race state, aptamers having different binding strengths, aptamers having different binding forms, and aptamers having the same binding power or binding form but different nucleotide sequences may be obtained. In addition, although the SELEX method includes a step of amplification by PCR, it becomes possible to perform SELEX with a greater variety of diversity by imparting mutations in the process by using manganese ions or the like.
앱타머는, mfold 프로그램을 이용하여 2차 구조를 쉽게 예측할 수 있으며 보다 정확한 입체 구조 분석을 위해서는 X선 해석이나 NMR 해석이 필요할 수 있다. 이러한 구조분석과 여러 앱타머 시퀀스상에서 나타나는 동일 시퀀스 영역(conserved region) 분석을 바탕으로, 특정 염기가 치환 또는 결손된 앱타머 연구 (truncation study)를 통해 어떤 뉴클레오티드를 치환 또는 결손하는 것이 가능한지, 또한 어디에 새로운 뉴클레오티드를 삽입 가능한지 어느 정도 예측할 수 있다. 이러한 연구를 통해 보다 안정적이고 강력한 앱타머를 개발할 수 있으며 앱타머의 전체 염기서열 중 결합과 관련된 중요한 부위(binding motif)를 찾아낼 수 있다. 예측된 새로운 서열의 앱타머는 용이하게 화학 합성할 수 있고, 그 앱타머가 활성을 유지하고 있는지의 여부를 기존의 분석계에 의해 확인할 수 있다. Aptamer can easily predict the secondary structure using the mfold program, and X-ray analysis or NMR analysis may be required for more accurate three-dimensional structure analysis. Based on this structural analysis and analysis of the conserved region appearing on multiple aptamer sequences, which nucleotide can be substituted or deleted through a truncation study in which a specific base is substituted or deleted, and where It is possible to predict to some extent whether a new nucleotide can be inserted. Through these studies, a more stable and powerful aptamer can be developed, and an important binding motif can be found out of the total nucleotide sequence of the aptamer. The aptamer of the predicted new sequence can be easily chemically synthesized, and whether or not the aptamer maintains activity can be confirmed by an existing analysis system.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 성숙지방세포(mature adipocyte)에 특이적으로 결합하는 앱타머를 선별하기 위하여, 도 1의 모식도와 같이 FITC 표지된 앱타머 라이브러리를 제조하고 FACS(flow cytomery) 기반 SELEX를 수행한 결과, 성숙지방세포에 특이적으로 결합하는 앱타머 풀(pool)을 선별하였다. 또한, 상기 선별된 앱타머 풀 및 다양한 세포를 이용하여 FACS 및 공초점 현미경 이미징(confocal microscopic imaging)을 수행한 결과, 상기 선별된 앱타머 풀은 3T3-L1 지방전구세포, HEK-293, C2C12 및 HeLa 세포에는 결합하지 않고, 분화된 3T3-L1 성숙지방세포, 특히, 성숙지방세포의 막 단백질에 결합함을 확인하였다(도 2, 도 3, 및 도 4a 및 도 4b 참조).In a specific embodiment of the present invention, in order to select an aptamer that specifically binds to mature adipocytes, the present inventors prepared a FITC-labeled aptamer library as shown in the schematic diagram of FIG. ) As a result of performing SELEX, a pool of aptamers specifically binding to mature adipocytes was selected. In addition, as a result of performing FACS and confocal microscopic imaging using the selected aptamer pool and various cells, the selected aptamer pool was 3T3-L1 adipocytes, HEK-293, C2C12 and It was confirmed that it did not bind to HeLa cells, but bound to the membrane proteins of differentiated 3T3-L1 mature adipocytes, in particular, mature adipocytes (see FIGS. 2, 3, and 4A and 4B).
또한, 본 발명자들은 상기 선별된 앱타머 풀로부터 91 개의 앱타머를 클로닝하고 염기서열 분석, 2차구조 조사 및 해리 평형 상수 계산을 통해 나노몰(nanomolar) 범위에서 성숙지방세포와 결합 친화도를 나타내는 세 개의 앱타머, MA-33(서열번호 1), MA-64(서열번호 2) 및 MA-91(서열번호 3)을 선별하였다(도 5 참조). 또한, 상기 선별된 MA-33 및 MA-91과 다양한 세포와의 결합 친화도를 확인하기 위하여, FACS 및 공초점 현미경 이미징을 수행한 결과, MA-33 및 MA-91은 3T3-L1 지방전구세포, HEK-293, C2C12 및 HeLa 세포에는 결합하지 않고, 분화된 3T3-L1 성숙지방세포, 특히, 성숙지방세포의 막 단백질에 결합함을 확인하였다(도 6a 내지 도 6e 참조). In addition, the present inventors clone 91 aptamers from the selected aptamer pool and show binding affinity with mature adipocytes in a nanomolar range through sequencing analysis, secondary structure investigation, and dissociation equilibrium constant calculation. Three aptamers, MA-33 (SEQ ID NO: 1), MA-64 (SEQ ID NO: 2), and MA-91 (SEQ ID NO: 3) were selected (see Fig. 5). In addition, in order to confirm the binding affinity between the selected MA-33 and MA-91 and various cells, FACS and confocal microscopic imaging were performed. As a result, MA-33 and MA-91 were 3T3-L1 adipocytes. , It was confirmed that it did not bind to HEK-293, C2C12 and HeLa cells, but to the membrane proteins of differentiated 3T3-L1 mature adipocytes, especially mature adipocytes (see FIGS. 6A to 6E).
또한, 본 발명자들은 지방전구세포의 지방형성분화(adipogenic differentiation) 동안 선별된 앱타머와 세포의 결합 변화 및 결합 표적을 확인하기 위해, FACS를 수행한 결과, MA-33 및 MA-91은 분화된 성숙지방세포에 결합하며, 성숙지방세포와 결합하는 앱타머로 잘 알려진 아디포-8(adipo-8)과 다른 표적에 결합함을 확인하였다(도 7a 및 도 7b 참조).In addition, the present inventors performed FACS to confirm the binding change and binding target of the aptamer and cells selected during adipogenic differentiation of adipocytes, as a result of performing FACS, MA-33 and MA-91 are differentiated. It was confirmed that it binds to mature adipocytes and binds to other targets than adipo-8, which is well known as an aptamer that binds to mature adipocytes (see FIGS. 7A and 7B).
또한, 본 발명자들은 선별된 앱타머와 초기 지방세포의 결합을 확인하기 위하여, 대표적인 초기 지방세포인 초기 백색지방세포(primary white adipocyte) 및 초기 갈색지방세포(primary brown adipocyte)를 표적으로 하여 FACS 및 공초점 현미경 이미징을 수행한 결과, MA-33 및 MA-91은 초기 성숙백색지방세에만 결합함을 확인하였다(도 8a 내지 도 8c, 및 도 9a 내지 도 9c 참조).In addition, in order to confirm the binding of the selected aptamer and early adipocytes, the present inventors targeted FACS and targeting primary white adipocytes and primary brown adipocytes, which are representative early adipocytes. As a result of performing confocal microscopy imaging, it was confirmed that MA-33 and MA-91 bind only to the initial mature white fat tax (see FIGS. 8A to 8C, and FIGS. 9A to 9C).
따라서, 본 발명의 선별된 앱타머는 초기성숙백색지방세포에는 결합하지만 초기성숙갈색지방세포에는 결합하지 않으므로, 성숙백색지방세포의 검출 및 정량, 또는 비만 예방 및 치료제 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the selected aptamer of the present invention binds to early-mature white adipocytes but does not bind to early-mature brown adipocytes, so it can be usefully used for detection and quantification of mature white adipocytes, or screening for obesity prevention and treatment.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성되는 핵산 앱타머를 포함하는 성숙백색지방세포 검출 또는 정량용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for detecting or quantifying mature white adipocytes comprising a nucleic acid aptamer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성되는 핵산 앱타머를 포함하는 성숙백색지방세포 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for detecting or quantifying mature white adipocytes comprising a nucleic acid aptamer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성되는 핵산 앱타머를 포함하는 지방세포형성(adipogenesis) 모니터링용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for adipogenesis monitoring comprising a nucleic acid aptamer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3.
본 발명의 선별된 앱타머는 초기성숙백색지방세포에는 결합하지만 초기성숙갈색지방세포에는 결합하지 않으므로, 성숙백색지방세포의 검출 및 정량용 조성물, 키트, 또는 지방세포형성 모티터링용 키트에 유용하게 사용될 수 있다.The selected aptamer of the present invention binds to early-mature white adipocytes but does not bind to early-mature brown adipocytes, so it is usefully used in a composition, kit for detection and quantification of mature white adipocytes, or a kit for adipocyte formation monitoring. I can.
또한, 본 발명은In addition, the present invention
1) 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성되는 핵산 앱타머에 검체 시료를 접촉시키는 단계; 및 1) contacting the specimen with a nucleic acid aptamer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3; And
2) 단계 1)에 수득된 세포-앱타머 복합체를 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는 성숙백색지방세포 검출 또는 정량 방법을 제공한다.2) It provides a method for detecting or quantifying mature white adipocytes comprising the step of detecting or quantifying the cell-aptamer complex obtained in step 1).
상기 단계 2)의 검출 또는 정량은 효소면역측정법(EIA), 방사면역측정법(RIA), 형광면역측정법(FIA), 웨스턴 블럿팅, 면역조직화학적염색법, 세포 분류법(cell sorting), 효소-기질 발색법, 화학발광물질결합법 및 금 입자(gold particle) 착물법으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 검출 또는 정량하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The detection or quantification of step 2) is enzymatic immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), western blotting, immunohistochemical staining, cell sorting, enzyme-substrate coloring. It is preferable to detect or quantify by any one method selected from the group consisting of a method, a chemiluminescent substance binding method, and a gold particle complex method, but is not limited thereto.
상기 단계를 포함하는 성숙백색지방세포 검출 또는 정량 방법은 하기의 군으로부터 선택된 어느 하나에 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:The method for detecting or quantifying mature white adipocytes comprising the above steps is preferably used in any one selected from the following group, but is not limited thereto:
1) 지방전구세포와 성숙지방세포에서 성숙지방세포의 검출 또는 정량; 및1) detection or quantification of mature adipocytes in adipocytes and mature adipocytes; And
2)성숙백색지방세포와 성숙갈색지방세포에서 성숙백색지방세포의 검출 또는 정량.2) Detection or quantification of mature white adipocytes in mature white adipocytes and mature brown adipocytes.
본 발명의 선별된 앱타머는 초기성숙백색지방세포에는 결합하지만 초기성숙갈색지방세포에는 결합하지 않으므로, 성숙백색지방세포의 검출 및 정량에 유용하게 사용될 수 있다.The selected aptamer of the present invention binds to early-mature white adipocytes but does not bind to early-mature brown adipocytes, so it can be usefully used for detection and quantification of mature white adipocytes.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성된 핵산 앱타머를 포함하는 비만 예방 및 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a composition for screening for preventing and treating obesity, comprising a nucleic acid aptamer composed of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 to 3.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 3의 염기서열로 구성된 핵산 앱타머를 포함하는 비만 예방 및 치료제 스크리닝용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for screening for obesity prevention and treatment comprising a nucleic acid aptamer composed of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 3.
본 발명의 선별된 앱타머는 초기성숙백색지방세포에는 결합하지만 초기성숙갈색지방세포에는 결합하지 않으므로, 비만 예방 및 치료제 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.The selected aptamer of the present invention binds to early-mature white adipocytes but does not bind to early-mature brown adipocytes, so it can be usefully used for screening for obesity prevention and treatment.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.
<실시예 1> 앱타머(aptamer) 라이브러리의 제조<Example 1> Preparation of aptamer library
FITC(fluorescein isothiocyanate)로 표지되고, 양 말단에 PCR 증폭 및 클로닝을 위한 보존된 19개 뉴클레오티드(nucleotide, nt) 프라이머 혼성화 부위(primer hybridization) 서열을 가지며, 가운데 무작위의 40개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 단일 가닥 DNA(single strand DNA, ssDNA) 라이브러리를 하기 [표 1]과 같이 설계하였다. 또한 PCR 증폭을 위하여, 하기 [표 2]에 기재된 PCR 증폭용 FITC-표지된 정방향 프라이머 및 PCR 증폭용 역방항 프라이머를 사용하고, 선별된 DNA 풀(pool)의 클로닝(cloning)을 위하여 하기 [표 2]에 기재된 DNA 풀 클로닝용 정방향 프라이머를 사용하였다. 상기 FITC 표지된 앱타머(ssDNA) 라이브러리는 Integrated DNA Technologies, Inc.(Coralville, IA, USA)에 의뢰하여 합성하였다.It is labeled with FITC (fluorescein isothiocyanate), has a conserved 19 nucleotide (nt) primer hybridization sequence at both ends for PCR amplification and cloning, and includes a random 40 nucleotide sequence. A single-stranded DNA (ssDNA) library was designed as shown in Table 1 below. In addition, for PCR amplification, the FITC-labeled forward primer for PCR amplification and the reverse primer for PCR amplification described in the following [Table 2] were used, and for cloning of the selected DNA pool, the following [Table 2] The forward primer for DNA full cloning described in [2] was used. The FITC-labeled aptamer (ssDNA) library was synthesized by commissioning Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA, USA).
GGGGAATTCGCGGAAGCGTGCTGGGCC(서열번호 6)-3'5'-FITC-
GGGGAATTCGCGGAAGCGTGCTGGGCC (SEQ ID NO: 6)-3'
<< 실시예Example 2> 시험관 내에서( 2> In vitro ( in vitroin vitro ) 성숙지방세포(mature ) Mature fat cells adipocytesadipocytes )에 대한 앱타머 분리 및 농축) For aptamer separation and concentration
<2-1> <2-1> FACSFACS 기반 base SELEXSELEX 방법을 이용한 성숙지방세포에 대한 For mature adipocytes using the method 앱타머Aptamer 분리 및 농축 Separation and concentration
본 발명에서는 성숙지방세포에 대한 앰타머 분리를 위하여, Cell SELEX 기술과 FACS 분류 시스템을 통합한 FACS(flow cytomery) 기반 SELEX(FACS-CELL SELEX) 방법을 수행하였다.In the present invention, a flow cytomery (FACS) based SELEX (FACS-CELL SELEX) method incorporating a Cell SELEX technology and a FACS sorting system was performed in order to separate amperes from mature adipocytes.
구체적으로, 도 1의 모식도와 같이 SELEX 동안 앱타머 풀의 농축을 모니터링하기 위하여, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 획득한 FITC-표지된 ssDNA 라이브러리(1014~1016)를 표적 세포와 함께 배양하였다. 그 다음, ssDNA 라이브러리 결합 세포를 FACS로 분류하였다. 다음 회(round)를 위하여 정제된 ssDNA는 [표 2]에 기재된 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하고, 앱타머의 농축을 위하여 상기 과정을 반복하였다. SELEX의 마지막 회 후, 앱타머 후보는 [표 2]에 기재된 프라이머를 이용하여 클로닝하고 서열분석하여 확인하였다.Specifically, in order to monitor the concentration of the aptamer pool during SELEX as shown in the schematic diagram of FIG. 1, the FITC-labeled ssDNA library (10 14 ~ 10 16 ) obtained by the method described in <Example 1> was used with target cells. Incubated together. Then, the ssDNA library-bound cells were sorted by FACS. The purified ssDNA for the next round was amplified by PCR using the primers shown in [Table 2], and the above process was repeated for concentration of the aptamer. After the last round of SELEX, the aptamer candidate was confirmed by cloning and sequencing using the primers shown in [Table 2].
<2-2> <2-2> FACSFACS 기반 base SELEXSELEX 방법을 이용한 성숙지방세포에 대한 For mature adipocytes using the method 앱타머Aptamer 풀 선별 및 농축 Grass sorting and concentration
시험관 내에서(in vitro) 성숙지방세포에 대한 앱타머를 분리 및 농축하기 위하여, 지방세포를 표적 세포로 하여 FACS-CELL SELEX 방법을 수행하였다.In order to isolate and concentrate the aptamer for mature adipocytes in vitro , the FACS-CELL SELEX method was performed using adipocytes as target cells.
구체적으로, 마우스 배아 섬유세포(mouse embryonic fibroblast)에서 유래한 지방전구세포(preadipocyte)인 3T3-L1 세포는 성장배지(1% 항생-항진균 용액 및 10% 우아혈청이 포함된 고-글루코오스(high-glucose) DMEM)로 5% CO2, 37℃ 배양기에서 배양하였다. 또한, 지방형성분화(adipogenic differentiation) 유도를 위하여, 융합하는 3T3-L1 세포에 고-글루코오스 DMEM, 10% FBS 및 MDI(0.5 mM 3-아이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 1 M 덱사메타손(dexamethasone) 및 10 g/㎖ 인슐린(insulin))을 2 일 동안 처리한 후, 고-글루코오스 DMEM, 10% FBS 및 10 g/㎖ 인슐린을 포함한 분화 배지로 이틀에 한번씩 배지를 교체하면서 12 일까지 배양하였다. 그 다음, 상기 실시예 <2-1>과 같이 FACS-CELL SELEX 방법을 수행하였다. 첫 SELEX에서, 상기 방법으로 준비된 3T3-L1 세포의 지방전구세포(0 일; 음성 세포) 또는 성숙지방세포(분화 배지로 12-일 배양된 세포)와 20 ㎕ 멸균수에 용해한 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 획득한 FITC-표지된 앱타머 라이브러리(10 nmol)를 혼합하여 95℃에서 5분 동안 변성시키고 이차구조 형성을 위해 10분 동안 아이스에서 식혔다. 상기 단계 동안, 300 ㎕의 결합 완충용액(4.5 g/L 글루코오스, 5 mM MgCl2 및 10% FBS가 포함된 PBS)으로 용해한 연어 정자(salmon sperm) DNA를 비특이적 결합을 억제하기 위하여 상기 1×106 지방전구세포 또는 성숙지방세포와 배양하였다. 그 다음, 상기 세포를 앱타머 라이브러리(10 nmol) 및 소혈청 알부민(bovine serum albumin, Thermo Inc., Rockford, IL, USA) 1 mg/㎖과 혼합하여 37℃에서 30 분 동안 배양한 후, 원심분리하여 상층액을 제거하고, 1 ㎖ 결합 완충용액으로 5 번 세척하였다. 그 후, 앱타머 라이브러리에 결합된 세포는 FACSAria cell sorter(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 이용하여 분류하고 95℃에서 5 분 동안 가열하여 분류된 세포로부터 결합된 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 페놀-클로로포름(phenol-chloroform, Sigma) 추출, Sephadex G-25 컬럼(Sigma) 및 에탄올 침전으로 정제하여 상기 세포에 대해 특이적인 ssDNA 풀을 선별한 후, [표 3]에 기재된 FITC-표지된 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 ssDNA 풀은 다음 SELEX를 수행하기 위해 사용되었다. 상기 선별은 11회 반복 수행되었으며, 음성 선별은 3 회 및 8 회 SELEX 동안 지방전구세포에 대해 2 번 수행되었다.Specifically, 3T3-L1 cells, which are precipocytes derived from mouse embryonic fibroblasts, are high-glucose containing growth medium (1% antibiotic-antifungal solution and 10% graceful serum). glucose) DMEM) in 5% CO 2 , incubated in an incubator at 37°C. In addition, in order to induce adipogenic differentiation, high-glucose DMEM, 10% FBS and MDI (0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine) were added to the fused 3T3-L1 cells. ), 1 M dexamethasone and 10 g/ml insulin) for 2 days, and then the medium once every two days with a differentiation medium containing high-glucose DMEM, 10% FBS and 10 g/ml insulin. It was cultured up to 12 days while replacing. Then, the FACS-CELL SELEX method was performed as in Example <2-1>. In the first SELEX, 3T3-L1 cells prepared by the above method were dissolved in adipocytes (
<2-3> 성숙지방세포와 선별된 <2-3> mature adipocytes and selected 앱타머Aptamer 풀의 결합 친화도 확인 Check the binding affinity of the pool
상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 선별된 앱타머 풀과 성숙지방세포의 결합 친화도(binding affinity)를 확인하기 위하여, FACS를 수행하였다.In order to confirm the binding affinity between the aptamer pool and mature adipocytes selected by the method described in Example <2-2>, FACS was performed.
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 FACS-CELL SELEX를 수행하는 동안 앱타머 풀의 농축을 모니터하기 위하여, 11 회 SELEX 동안 각 회의 10 pmol ssDNA 풀을 1×106 지방세포와 함께 200 ㎕ 결합 완충용액으로 37℃에서 7 분 동안 배양한 후, 0.4 ㎖ 결합 완충용액으로 5 번 세척하였다. 원심분리 후, 펠렛(pellet)을 20 ㎕ 결합 완충용액으로 현탁하고, 10 ㎕ 세포의 형광을 FACS caliber flow cytometer(BD Bioscience)를 이용하여 측정하였다. 특히, 11 회 선별 동안 4 개의 대표적인 회 풀(3, 5, 9 및 11 회)을 1×106 지방전구세포 및 성숙지방세포와 상기 방법으로 배양한 후, FACS를 이용하여 형광을 측정하였다.Specifically, in order to monitor the concentration of the aptamer pool while performing the FACS-CELL SELEX by the method described in Example <2-2>, each 10 pmol ssDNA pool was added to 1×10 6 adipocytes for 11 times SELEX. Together with 200 µl binding buffer solution at 37° C. for 7 minutes, followed by washing 5 times with 0.4 ㎖ binding buffer solution. After centrifugation, the pellet was suspended in 20 µl binding buffer, and the fluorescence of 10 µl cells was measured using a FACS caliber flow cytometer (BD Bioscience). In particular, four representative pools (3, 5, 9 and 11 times) were cultured with 1×10 6 adipocytes and mature adipocytes in the above method during the 11 screening, and then fluorescence was measured using FACS.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 성숙지방세포에 대한 각 회의 피크 변화(peak shift)가 라이브러리 피크보다 뒤로 이동하는 경향을 보이는 것을 확인하였다. 일반적으로, SELEX 회의 수가 증가하면 성숙지방세포에 대한 형광 강도가 증가하고, 성숙지방세포에 결합 친화도를 가진 특이적 앱타머들이 각 회 풀에서 증가한다. 그러나, 성숙지방세포에 대한 앱타머 풀의 피크 변화에 있어서, 11 회 풀의 피크보다 9 회 풀의 피크가 뒤에 있음을 확인하였다(도 1a, 아래). 반면, 지방전구세포에서 피크 변화는 나타나지 않았다(도 1a, 위). 따라서, 상기 결과를 통해 9 회 앱타머 풀의 형광 강도가 높고, 성숙지방세포에 대한 결합 친화도가 좋음을 확인하였다(도 1a).As a result, as shown in FIG. 2, it was confirmed that each peak shift for mature adipocytes showed a tendency to move backwards than the library peak. In general, as the number of SELEX cycles increases, the fluorescence intensity for mature adipocytes increases, and specific aptamers with binding affinity to mature adipocytes increase in each pool. However, in the peak change of the aptamer pool for mature adipocytes, it was confirmed that the peak of
<2-4> 성숙지방세포에 특이적인 <2-4> Specific to mature adipocytes 앱타머Aptamer 풀 선별 Grass screening
성숙지방세포와 결합 친화도가 높은 앱타머 풀을 선별하기 위하여, 상기 실시예 <2-3>의 결과를 통해 선별한 결합 친화도가 좋은 9 회 앱타머 풀을 이용하여 추가적인 FACS-CELL SELEX 방법을 수행하였다.In order to select the aptamer pool with high binding affinity to mature adipocytes, an additional FACS-CELL SELEX method using the 9-time aptamer pool with good binding affinity selected through the results of Example <2-3> Was performed.
구체적으로, 도 3과 같이 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 획득한 분화된 3T3-L1 세포와 앱타머 라이브러리 또는 9 회 앱타머 풀(MA-9 round)를 상기 실시예 <2-3>과 같이 배양하고 FACS를 수행하여 FITC(x 축)에 대한 SSC(side scattering, y 축) 값을 측정하였다. FACS의 SSC-A 값은 지방형성분화의 정도와 관련이 있다고 알려져 있다. 따라서, 상기 세포는 dot plot에 있는 SSC 값(P1<P2<P3; 분화 정도)에 따라 세 부분으로 나누었다. 그 다음, 분화 정도가 높은 P3 부위의 세포를 FACS를 이용해 분류하고, 결합된 앱타머 풀을 상기 실시예 <2-2>와 같이 추출 및 정제한 후, PCR로 증폭하였다. 상기 증폭된 앱타머 풀을 이용하여 추가적으로 3 회 FACS-CELL SELEX을 수행하여, 총 12 회의 SELEX 방법으로 성숙지방세포에 현저하게 특이적인 앱타머 풀(MA-12 round)을 선별하였다.Specifically, as shown in FIG. 3, differentiated 3T3-L1 cells obtained by the method described in Example <2-2> and an aptamer library or 9 aptamer pools (MA-9 round) were used in Example <2- Incubation as in 3> and FACS was performed to measure SSC (side scattering, y-axis) values for FITC (x-axis). It is known that the SSC-A value of FACS is related to the degree of lipotyping. Therefore, the cells were divided into three parts according to the SSC value (P1<P2<P3; degree of differentiation) in the dot plot. Then, the cells of the P3 site having a high degree of differentiation were sorted using FACS, and the bound aptamer pool was extracted and purified as in Example <2-2>, and then amplified by PCR. FACS-CELL SELEX was additionally performed 3 times using the amplified aptamer pool, and a remarkably specific aptamer pool (MA-12 round) for mature adipocytes was selected by a total of 12 SELEX methods.
<2-5> 다양한 세포와 최종 선별된 <2-5> Various cells and finally selected 앱타머Aptamer 풀의 결합 확인 Check for pool binding
상기 실시예 <2-4>과 같이 12 회 SELEX 수행하여 선별한 성숙지방세포에 특이적인 앱타머 풀과 다른 세포와의 결합 친화도를 확인하기 위하여, FACS 및 공초점 현미경 이미징(confocal micorscopic imaging)을 수행하였다.In order to confirm the binding affinity between the aptamer pool and other cells specific to mature adipocytes selected by performing
구체적으로, 상기 실시예 <2-3>과 같이 상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 획득한 12 회의 10 pmol 앱타머 풀(MA-12 round) 및 앱타머 라이브러리를 1×106 3T3-L1 지방전구세포 및 성숙지방세포, HEK-293 세포, C2C12 세포 또는 HeLa 세포와 함께 배양하여 원심분리 후, 펠렛을 20 ㎕ 결합 완충용액으로 현탁하고, 10 ㎕ 세포의 형광을 FACS caliber flow cytometer(BD Bioscience)를 이용하여 측정하였다(도 4a, 왼쪽). 또한, 나머지 10 ㎕ 세포는 유리 슬라이드 위에 떨어뜨린 후, 앱타머의 FITC 신호를 LSM 510 META 공초점 현미경(Zeiss, Thornwood, NY, USA)으로 시각화였다(도 4a, 오른쪽).Specifically, as in Example <2-3>, 12 10 pmol aptamer pools (MA-12 rounds) and aptamer libraries obtained by the method described in Example <2-4> were 1×10 6 3T3 After incubation with L1 adipocytes and mature adipocytes, HEK-293 cells, C2C12 cells or HeLa cells and centrifugation, the pellet was suspended in 20 µl binding buffer, and the fluorescence of 10 µl cells was measured on a FACS caliber flow cytometer ( BD Bioscience) (Fig. 4a, left). In addition, the remaining 10 μl cells were dropped on a glass slide, and the FITC signal of aptamer was visualized with an LSM 510 META confocal microscope (Zeiss, Thornwood, NY, USA) (Fig. 4A, right).
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 라이브러리의 피크 변화와 비교하여 12 회 앱타머 풀의 피크 변화는 성숙한 3T3-L1 지방세포에서만 나타나고(도 4a, 왼쪽), 공초점 분석에서도 성숙한 3T3-L1 세포에서만 형광이 나타나는 것을 확인함으로써, 상기 12 회 SELEX 후 앱타머 풀은 성숙지방세포에 현저하게 특이적임을 확인하였다(도 4a).As a result, as shown in Fig. 4a, the peak change of the
<2-6> 성숙지방세포의 <2-6> of mature adipocytes 막단백질과Membrane Protein Department 최종 선별된 Final screened 앱타머Aptamer 풀의 결합 확인 Check for pool binding
상기 실시예 <2-3>과 같이 12 회 SELEX 수행하여 선별한 성숙지방세포에 특이적인 앱타머 풀의 표적이 성숙지방세포의 막 단백질인지 확인하기 위하여, 트립신을 처리한 세포를 이용하여 FACS를 수행하였다.In order to confirm whether the target of the aptamer pool specific to mature adipocytes selected by performing
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 획득한 3T3-L1 성숙지방세포에 막 단백질을 분리하기 위한 트립신 또는 대조군으로 2% EDTA를 처리하여 5 분 동안 배양한 후, 결합 완충용액으로 2 번 세척하였다. 그 다음, 상기 실시예 <2-3>과 같이 상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 획득한 12 회 앱타머 풀 및 앱타머 라이브러리와 상기 세포 1×106를 함께 배양한 후, FACS를 수행하였다.Specifically, 3T3-L1 mature adipocytes obtained by the method described in Example <2-2> were treated with trypsin for separating membrane proteins or 2% EDTA as a control and incubated for 5 minutes, followed by binding buffer solution Washed twice. Then, as in Example <2-3>, 12 times the aptamer pool and aptamer library obtained by the method described in Example <2-4> and the cells 1×10 6 were cultivated together, and then FACS Was performed.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 트립신 처리한 3T3-L1 세포에 12 회 앱타머 풀을 결합한 경우 피크 변화가 나타나지 않지만, 막 단백질이 보존된 성숙한 3T3-L1 지방세포에 2% EDTA를 처리한 경우 피크 변화가 뒤로 이동하는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 결과들을 통해 12 회 앱타머 풀의 주요한 결합 파트너가 성숙지방세포의 막 단백질임을 확인하였다(도 4b).As a result, as shown in FIG. 4B, when the aptamer pool was bound 12 times to trypsin-treated 3T3-L1 cells, the peak change did not appear, but the membrane protein-preserved mature 3T3-L1 adipocytes were treated with 2% EDTA. In case it was confirmed that the peak change moved backward. Therefore, through the above results, it was confirmed that the major binding partner of the 12-time aptamer pool was the membrane protein of mature adipocytes (Fig. 4b).
< 실시예 3> 최종 선별된 앱타머 풀로부터 성숙지방세포에 특이적인 앱타머 선별 및 성숙지방세포와의 결합 친화도 확인 <Example 3> determine the binding affinity and specificity of aptamer selection and mature adipocytes from the final screening aptamer pool in mature adipocytes.
<3-1> 최종 선별된 앱타머 풀로부터 성숙지방세포에 특이적인 앱타머 선별 <3-1> specific aptamer in mature fat cells from the final screening aptamer pools Selection
최종 선별된 12 회 앱타머 풀의 데이터를 기반으로, 12 회 앱타머 풀 내에서 성숙지방세포에 대해 높은 친화도를 보이는 앱타머 후보를 선별하였다.Based on the data of the final selected 12 aptamer pool, aptamer candidates showing high affinity for mature adipocytes in the 12 aptamer pool were selected.
구체적으로, 상기 실시예 <2-4>에 기재된 방법으로 획득한 12 회 앱타머 풀로부터 91 개의 앱타머를 pTOP TA V2 벡터(TOPclonerTM TA kit, Enzynmics, 한국)에 클로닝한 후, 상기 벡터를 DH5α 세포에 형질전환하였다. 상기 91개의 앱타머가 삽입된 클론을 miniprep 키트를 이용하여 정제한 후, 솔젠트(주)에 의뢰하여 염기서열을 분석하여 가장 열역학적으로 안정한 예측된 구조의 앱타머를 선별하였다. 또한, mfold 프로그램(http://mfold.rna.lbany.edu)을 이용하여 91 개의 앱타머의 이차구조를 조사하였다. 그 다음, 상기 실시예 <2-3>과 같이 상기 91 개의 앱터머와 3T3-L1 지방전구세포(음성 세포) 또는 3T3-L1 성숙지방세포(양성 세포)와 배양한 후, FACS를 수행하여 앱타머 코팅된 세포의 평균 형광 강도를 측정하고, 하기 [수학식 1]을 적용하여 SigmaPlot(Jandel, San Rafael, CA, USA)으로 평균값을 계산하고, 해리 평형상수(equilibrium dissociation constant, Kd)를 구하였다.Specifically, 91 aptamers from the 12-time aptamer pool obtained by the method described in Example <2-4> were cloned into a pTOP TA V2 vector (TOPcloner TM TA kit, Enzynmics, Korea), and then the vector was DH5α cells were transformed. The 91 clones into which the aptamers were inserted were purified using a miniprep kit, and then subjected to Solgent Co., Ltd. to analyze the nucleotide sequence to select the aptamer with the most thermodynamically stable predicted structure. In addition, the secondary structure of 91 aptamers was investigated using the mfold program (http://mfold.rna.lbany.edu). Then, as in Example <2-3>, after culturing with the 91 aptamers and 3T3-L1 adipocytes (negative cells) or 3T3-L1 mature adipocytes (positive cells), FACS was performed to The average fluorescence intensity of the tarmer-coated cells was measured, and the average value was calculated with SigmaPlot (Jandel, San Rafael, CA, USA) by applying the following [Equation 1], and the equilibrium dissociation constant ( K d) was calculated. Obtained.
상기 서열분석 및 해리 평형상수 계산 결과, 하기 [표 3]에 나타낸 바와 같이 성숙지방세포에 높은 친화도를 가지는 5 개의 앱타머 중, MA-33, MA-64 및 MA-91이 나노몰(nanomolar) 범위에서 성숙지방세포와 친화도를 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 해리 평균상수값을 바탕으로 성숙지방세포와 친화도가 제일 높은 MA-33 및 MA-91을 선별하고 이차구조를 확인하였다(도 5).As a result of the sequencing analysis and calculation of the dissociation equilibrium constant, among the five aptamers having high affinity for mature adipocytes, as shown in the following [Table 3], MA-33, MA-64 and MA-91 are nanomolar (nanomolar ), it was confirmed that the affinity with mature adipocytes was shown. Therefore, MA-33 and MA-91 having the highest affinity with mature adipocytes were selected based on the average dissociation constant value, and the secondary structure was confirmed (FIG. 5).
<3-2> 성숙지방세포에 대한 선별된 <3-2> Selected for mature adipocytes 앱타머의Aptamer 결합 친화도 확인 Check binding affinity
상기 실시예 <3-1>과 같이 선별된 두 개의 앱타머, MA-33 및 MA-91과 성숙지방세포와의 결합 친화도를 확인하기 위하여, FACS를 수행하였다.In order to confirm the binding affinity between the two aptamers, MA-33 and MA-91, selected as in Example <3-1> and mature adipocytes, FACS was performed.
구체적으로, 상기 실시예 <2-3>과 같이 400 nM 앱타머 라이브러리, MA-33 및 12 회 앱타머 풀(MA-12 round)를 1×106 3T3-L1 지방전구세포 또는 성숙지방세포를 함께 배양한 후, FACS를 수행하고(도 6a), 형광 강도를 그래프화하였다(도 6c, 위).Specifically, as in Example <2-3>, a 400 nM aptamer library, MA-33 and 12 aptamer pools (MA-12 round) were used to prepare 1×10 6 3T3-L1 adipocytes or mature adipocytes. After culturing together, FACS was performed (FIG. 6A), and fluorescence intensity was graphed (FIG. 6C, above).
또한, 상기 실시예 <2-3>과 같이 400 nM 앱타머 라이브러리, MA-91 및 12 회 앱타머 풀(MA-12 round)를 1×106 3T3-L1 지방전구세포 또는 성숙지방세포를 함께 배양한 후, FACS를 수행하고(도 6b), 형광 강도를 그래프화하였다(도 6c, 아래).In addition, as in Example <2-3>, a 400 nM aptamer library, MA-91, and 12 rounds of aptamers (MA-12 round) were mixed with 1×10 6 3T3-L1 adipocytes or mature adipocytes. After incubation, FACS was performed (FIG. 6B), and fluorescence intensity was graphed (FIG. 6C, bottom).
그 결과, 도 6a 내지 도 6c에 나타낸 바와 같이, MA-33 및 MA-91 모두 지방전구세포에 대한 피크 변화가 나타나지 않지만, 성숙지방세포에 대한 피크 변화가 뒤로 이동하며, 또한, 형광 강도도 성숙지방세포에서 현저하게 증가하는 것을 함으로써, 상기 MA-33 및 MA-91 앱타머는 분화하지 않은 지방전구세포에는 결합하지 못하고 성숙지방세포에만 특이적으로 결합하며, 따라서, 상기 두 개의 앱타머가 지방전구세포 및 성숙지방세포를 효율적으로 구별할 수 있음을 확인하였다(도 6a 내지 도 6c). As a result, as shown in Figs. 6A to 6C, neither MA-33 nor MA-91 shows a peak change for adipocytes, but the peak change for mature adipocytes moves backward, and the fluorescence intensity is also mature. By doing a marked increase in adipocytes, the MA-33 and MA-91 aptamers do not bind to undifferentiated adipocytes and specifically bind only to mature adipocytes, and thus, the two aptamers are adipocytes. And it was confirmed that it is possible to efficiently distinguish mature adipocytes (FIGS. 6A to 6C ).
<3-3> 다양한 세포에 대한 선별된 <3-3> Selected for various cells 앱타머의Aptamer 결합 친화도 확인 Check binding affinity
선별된 두 개의 앱타머, MA-33 및 MA-91가 다른 세포에 대한 특이성이 있는지 확인하기 위하여, HEK-293 세포, C2C12 세포 및 HeLa 세포를 이용하여 공초점 현미경 이미징을 수행하였다.Confocal microscopy imaging was performed using HEK-293 cells, C2C12 cells and HeLa cells in order to confirm whether the two selected aptamers, MA-33 and MA-91 have specificity for other cells.
구체적으로, 상기 실시예 <2-5>와 같이 400 nM MA-33 및 MA-91를 1×106 3T3-L1 성숙지방세포 또는 지방전구세포, C2C12 세포, HeLa 세포 또는 HEK-293 세포와 함께 배양한 후, 공초점 현미경을 이용하여 시각화하였다.Specifically, as in Example <2-5>, 400 nM MA-33 and MA-91 were mixed with 1×10 6 3T3-L1 mature adipocytes or adipocytes, C2C12 cells, HeLa cells, or HEK-293 cells. After incubation, it was visualized using a confocal microscope.
그 결과, 도 6d에 나타낸 바와 같이, MA-33 및 MA-91 앱타머가 유의적으로 성숙지방세포에만 결합하는 것을 확인하였다(도 6d). As a result, as shown in Fig. 6d, it was confirmed that MA-33 and MA-91 aptamers significantly bind only to mature adipocytes (Fig. 6d).
<3-4> 성숙지방세포의 <3-4> of mature adipocytes 막단백질과Membrane Protein Department 선별된 Selected 앱타머의Aptamer 결합 확인 Bonding check
상기 실시예 <3-1>과 같이 선별된 두 개의 앱타머, MA-33 및 MA-91의 결합 파트너가 성숙지방세포의 막 단백질인지 확인하기 위하여, FACS를 수행하였다.In order to confirm whether the binding partners of the two aptamers, MA-33 and MA-91 selected as in Example <3-1>, were membrane proteins of mature adipocytes, FACS was performed.
구체적으로, 상기 실시예 <2-3>과 같이 400 nM 앱타머 라이브러리, MA-33 및 MA-91을 1×106 트립신을 처리한 3T3-L1 성숙지방세포 또는 2% EDTA를 처리한 성숙지방세포를 함께 배양한 후, FACS를 수행하였다(도 6e).Specifically, as in Example <2-3>, 400 nM aptamer library, MA-33 and MA-91 treated with 1×10 6 trypsin 3T3-L1 mature adipocytes or 2% EDTA-treated mature fat After culturing the cells together, FACS was performed (Fig. 6e).
그 결과, 도 6e에 나타낸 바와 같이, MA-33 및 MA-91은 대조군 및 트립신 처리 성숙지방세포와 비교하여 2% EDTA 처리한 성숙지방세포와 혼합한 경우, 피크가 오른쪽으로 이동하는 것을 확인함으로써, 상기 두 개의 선별된 앱타머의 표적이 성숙지방세포의 표면에서 발현되는 단백질임을 확인하였다(도 6e). As a result, as shown in Figure 6e, when compared with the control and trypsin-treated mature adipocytes, MA-33 and MA-91 confirmed that the peak shifted to the right when mixed with 2% EDTA-treated mature adipocytes. , It was confirmed that the targets of the two selected aptamers were proteins expressed on the surface of mature adipocytes (FIG. 6E).
< 실시예 4> 지방형성분화( adipogenic differentiation) 동안 선별된 앱타머의 결합 확인 <Example 4> binding of the aptamer selection for lipogenesis differentiation (adipogenic differentiation) OK
지방전구세포의 지방형성분화 동안 선별된 앱타머와 세포의 결합 변화를 확인하기 위하여, FACS를 수행하였다.FACS was performed to confirm the change in binding between the selected aptamer and cells during adipogenesis of adipocytes.
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 3T3-L1 세포를 지방형성분화 동안 400 nM 앱타머 라이브러리, 성숙지방세포에 특이적인 앱자머로 잘 알려진 아디포-8(adipo-8), MA-33 및 MA-91을 0, 2, 4, 6, 8, 10 또는 12일 동안 함께 배양한 후, 상기 실시예 <2-3>과 같이 FACS를 수행하였다(도 7a).Specifically, in the method described in Example <2-2>, the 400 nM aptamer library, Adipo-8, which is well known as an Abjamer specific for mature adipocytes, was used to convert 3T3-L1 cells during adipogenesis. After culturing MA-33 and MA-91 together for 0, 2, 4, 6, 8, 10 or 12 days, FACS was performed as in Example <2-3> (FIG. 7A).
또한, 상기 실시예 <2-3>과 같이3T3-L1 세포를 앱타머 라이브러리, 아디포-8, MA-33 또는 Ma-91과 배양한 후, FACS를 수행하였다(도 7b).In addition, as in Example <2-3>, 3T3-L1 cells were cultured with an aptamer library, Adipo-8, MA-33, or Ma-91, and then FACS was performed (FIG. 7B).
그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, MA-33 및 MA-91은 지방형성 분화 후 4 일째까지는 세포와 결합하지 않지만, 6 일째에 갑작스럽게 세포와 결합하고, 지방형성 분화의 마지막 단계까지 결합이 유지됨을 확인하였다(도 7a). 또한, MA-33 및 MA-91의 피크 변화가 유사하나, 아디포-8의 피크 변화 양상과 다르다는 것을 확인함으로써, 상기 두 개의 앱타머의 결합 파트너는 서로 유사하지만, 아디포-8의 결합 파트너와 상당히 다르다는 것을 확인하였다(도 7b). 따라서, 상기 결과들을 통해 MA-33 및 MA-91은 지방형성분화된 성숙지방세포와 결합하고, 아디포-8와 다른 표적에 결합함을 확인하였다.As a result, as shown in Figs. 7A and 7B, MA-33 and MA-91 do not bind to cells until the 4th day after adipogenic differentiation, but abruptly bind to the cells on the 6th day, and the final stage of adipogenic differentiation. It was confirmed that the binding was maintained until (Fig. 7a). In addition, by confirming that the peak change of MA-33 and MA-91 is similar, but different from the peak change pattern of Adipo-8, the binding partners of the two aptamers are similar to each other, but the binding partner of Adipo-8. It was confirmed that it was significantly different from (Fig. 7b). Therefore, through the above results, it was confirmed that MA-33 and MA-91 bind to adipogenic mature adipocytes and bind to Adipo-8 and other targets.
< 실시예 5> 선별된 앱타머에 의한 초기백색지방세포(primary white adipocytes) 및 초기갈색지방세포(primary brown adipocyte) 구별 확인 < Example 5> Identification of primary white adipocytes and primary brown adipocytes by the selected aptamer
<5-1> 선별된 앱타머와 초기백색지방세포의 결합 확인<5-1> Confirmation of binding of the selected aptamer and early white adipocytes
초기 지방세포에 특이적으로 앱타머가 결합하는지 확인하기 위하여, 초기 지방세포인 초기백색지방세포를 성숙백색지방세포로 분화를 유도한 후, FACS 및 공초점 현미경 이미징을 수행하였다.In order to confirm whether aptamer specifically binds to the initial adipocytes, the early adipocytes, which are early white adipocytes, were induced to differentiate into mature white adipocytes, and then FACS and confocal microscopic imaging were performed.
구체적으로, 백색지방전구세포는 피하지방 부위(subcutaneous areas)(사타구니 및 부고환 지방(inguinal and epididymal fat)) 및 8 주된 수컷 ICR 마우스(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)의 내장지방(visceral adipose) 조직(상방 장간막 지방(mesenteric fat))으로부터 분리하였다. 적출된 조직은 분리 완충용액(pH 7.4, 123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2, 5 mM 글루코오스, 100 mM HEPES, 4% 여과된 BSA, 및 1 mg/㎖ II 형 콜라게나제(collagenase type II))으로 37℃에서 45 분 동안 분해하였다. 비분해된 조직은 100-㎛ 세포 여과기(strainer)로 제거하고, 남은 세포는 1300 rpm으로 3 분 동안 원심분리하여 백색 지방전구세포를 침전시켰다. 상기 침전된 백색지방전구세포는 1% 항균-항진균 용액 및 10% BCS가 포함된 DMEM/F12[1:1; Gibco-Invitrogen]로 재현탁하였다. 융합된 세포는 1 μM 로시글리타존(rosiglitazone)를 함유한 DMEM/F12를 포함한 MDI을 처리하고 2일 후, 10 ㎍/㎖ 인슐린 및 1 μM 로시글리타존을 함유한 DMEM/F12 배지로 이틀에 한 번씩 배지를 교체하여 20일 동안 유지하였다. 상기 분리된 백색지방전구세포는 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 지방형성분화를 유도한 후, PBS로 2 번 세척하고 10% 포르말린(formalin)으로 30 분 동안 상온에서 고정하였다. 그 다음, 멸균수로 세척한 후, 60% 이소프로페놀(isopropanol)(Sigma)로 용해한 0.3% 여과된 Oil-Red-O 용액으로 30 분 동안 상온에서 염색하고, 멸균수로 5 번 반복 세척하여 건조하였다. 그 다음, 이소프로페놀을 첨가하여 결합된 Oil-Red-O 염료를 추출하고, GeneQuant 1300 분광광도계(spectrophotometer, GE HealthCare, Sweden)를 이용하여 510 nm 흠광도를 측정하였다. 상기 실험은 세 번 반복 수행하여 평균을 구하였다(도 8a).Specifically, white adipose progenitor cells are subcutaneous areas (inguinal and epididymal fat) and visceral adipose of 8-week-old male ICR mice (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA). ) Isolated from tissue (upper mesenteric fat). The extracted tissue was a separation buffer solution (pH 7.4, 123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.3 mM CaCl2, 5 mM glucose, 100 mM HEPES, 4% filtered BSA, and 1 mg/ml type II collagenase). II)) at 37° C. for 45 minutes. The undigested tissue was removed with a 100-µm cell strainer, and the remaining cells were centrifuged at 1300 rpm for 3 minutes to precipitate white adipocytes. The precipitated white adipose progenitor cells were DMEM/F12[1:1] containing 1% antibacterial-antifungal solution and 10% BCS; Gibco-Invitrogen]. The fused cells were treated with MDI containing DMEM/F12 containing 1 μM rosiglitazone, and after 2 days, the medium was changed every two days with DMEM/F12 medium containing 10 μM/ml insulin and 1 μM rosiglitazone. And maintained for 20 days. The isolated white adipose progenitor cells were subjected to lipotyping by the method described in Example <2-2>, washed twice with PBS, and fixed at room temperature for 30 minutes with 10% formalin. Then, after washing with sterile water, dyed with a 0.3% filtered Oil-Red-O solution dissolved in 60% isopropanol (Sigma) at room temperature for 30 minutes, and washed 5 times with sterile water. It was dry. Then, isopropphenol was added to extract the bound Oil-Red-O dye, and the 510 nm flaw intensity was measured using a GeneQuant 1300 spectrophotometer (GE HealthCare, Sweden). The experiment was repeated three times to obtain an average (FIG. 8A).
또한, 상기 실시예 <2-5>와 같이 400 nM 앱타머 라이브러리, MA-33 또는 MA-91과 상기 백색지방전구세포(도 8b) 또는 성숙백색지방세포(도 8c)를 배양한 후, FACS 분석 및 공초점 현미경 이미징을 수행하였다.In addition, as in Example <2-5>, after culturing the 400 nM aptamer library, MA-33 or MA-91 and the white adipocytes (Fig. 8b) or mature white adipocytes (Fig. 8c), FACS Analysis and confocal microscopy imaging were performed.
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 성숙백색지방세포의 지방 축적을 확인함으로써, 백색지방세포의 분화 유도가 잘 되었음을 확인하였다(도 8a).As a result, as shown in FIG. 8A, by confirming the accumulation of fat in mature white adipocytes, it was confirmed that the differentiation of white adipocytes was well induced (FIG. 8A ).
또한, 도 8b 및 도 8c에 나타낸 바와 같이, 백색지방전구세포 경우 MA-31 및MA-91의 피크 변화는 나타나지 않지만, 성숙백색지방세포의 경우 피크 변화가 오른쪽으로 이동하고, 세포와 결합하는 것을 확인함으로써, 상기 MA-33 및 MA-91 앱타머가 초기성숙백색지방세포에는 결합하지만 초기백색지방전구세포는 인식하지 못함을 확인하였다(도 8b 및 도 8c).In addition, as shown in Figs. 8b and 8c, in the case of white adipocytes, the peak changes of MA-31 and MA-91 do not appear, but in the case of mature white adipocytes, the peak change shifts to the right, and binding with the cells. By confirming, it was confirmed that the MA-33 and MA-91 aptamers bind to early mature white adipocytes, but do not recognize early white adipocytes (FIGS. 8B and 8C).
<5-2> 선별된 앱타머와 초기갈색지방세포의 결합 확인<5-2> Confirmation of binding of the selected aptamer and early brown fat cells
초기 지방세포에 특이적으로 앱타머가 결합하는지 확인하기 위하여, 초기 지방세포인 초기갈색지방세포를 성숙갈색지방세포로 분화를 유도한 후, FACS 및 공초점 현미경 이미징을 수행하였다.In order to confirm whether aptamer specifically binds to the initial adipocytes, the early adipocytes, which are early brown adipocytes, were induced to differentiate into mature brown adipocytes, and then FACS and confocal microscopic imaging were performed.
구체적으로, 갈색지방전구세포는 출생 후 하루된 마우스의 견갑골 사이 갈색지방 패드(interscapular brown fat pad)를 적출하여 상기 실시예 <5-2>와 같이 갈색 지방전구세포를 침전시켜 분리하였다. 분리된 갈색 지방전구세포의 분화를 위하여, 융합된 갈색지방전구세포를 고농도-글루코오스 DMEM, 20% FBS, 및 분화 칵테일(0.5 mM 3-아이소부틸-1-메틸잔틴, 125 μM 인도메타신(indomethacin), 0.5 μM 덱사메타손, 20 nM 인슐린 및 1 nM T3(3,3',5-triiodo-L-thyronine))로 2 일 동안 배양한 후, DMEM, 20% FBS, 1 nM T3 및 20 nM 인슐린을 포함한 유지 배지로 배양하였다. 상기 분화된 성숙갈색지방세포는 상기 실시예 <5-1>에 기재된 방법으로 Oil-Red-O 염색법을 수행하여 지방 축적을 확인하였다(도 9a).Specifically, brown adipose progenitor cells were separated by extracting an interscapular brown fat pad between the scapula of a mouse one day after birth, and precipitating brown adipocytes as in Example <5-2>. For the differentiation of the isolated brown adipocytes, the fused brown adipocytes were mixed with high concentration-glucose DMEM, 20% FBS, and a differentiation cocktail (0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 125 μM indomethacin). ), 0.5 μM dexamethasone, 20 nM insulin and 1 nM T3 (3,3',5-triiodo-L-thyronine)) for 2 days, followed by DMEM, 20% FBS, 1 nM T3 and 20 nM insulin. It was cultured with a maintenance medium containing. The differentiated mature brown adipocytes were subjected to Oil-Red-O staining by the method described in Example <5-1> to confirm fat accumulation (FIG. 9A).
또한, 상기 실시예 <2-5>와 같이 400 nM 앱타머 라이브러리, MA-33 또는 MA-91과 상기 갈색지방전구세포(도 9b) 또는 성숙갈색지방세포(도 9c)를 배양한 후, FACS 분석 및 공초점 현미경 이미징을 수행하였다.In addition, as in Example <2-5>, after culturing the 400 nM aptamer library, MA-33 or MA-91 and the brown adipose progenitor cells (Fig. 9b) or mature brown adipocytes (Fig. 9c), FACS Analysis and confocal microscopy imaging were performed.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 성숙갈색지방세포의 지방 축적을 확인함으로써, 백색지방세포의 분화 유도가 잘 되었음을 확인하였다(도 8a).As a result, as shown in Fig. 9A, by confirming the accumulation of fat in mature brown adipocytes, it was confirmed that the differentiation of white adipocytes was well induced (FIG. 8A).
또한, 도 9b 및 도 9c에 나타낸 바와 같이, MA-33 및 MA-91 모두 갈색지방전구세포 및 성숙갈색지방세포에서 피크 변화가 없음을 확인함으로써, 상기 앱타머는 갈색지방세포와는 결합하지 않음을 확인하였다(도 9b 및 9c). 따라서, 상기 <실시예 5>의 결과를 통해 두 개의 선별된 앱타머가 백색지방세포 및 갈색지방세포를 구별할 수 있으며, 실질적으로, 상기 두 개의 선별된 앱타머는 성숙백색지방세포에 특이적으로 결합함을 확인하였다.In addition, as shown in FIGS. 9B and 9C, it was confirmed that both MA-33 and MA-91 had no peak changes in brown adipocytes and mature brown adipocytes, indicating that the aptamer did not bind to brown adipocytes. It was confirmed (Figs. 9b and 9c). Therefore, through the results of <Example 5>, the two selected aptamers can distinguish white adipocytes and brown adipocytes, and substantially, the two selected aptamers specifically bind to mature white adipocytes. Confirmed that.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Aptamers for mature white adipocytes and uses thereof <130> 13p-10-42 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MA-33 <400> 1 gttaccgcgg tgaagggtgg atgtgtctgg acgctatatc 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MA-64 <400> 2 aagatgacaa attgctggag tgtcgtggcg aggatgtcgg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MA-91 <400> 3 caccggcagg ccaaataaca ggcatcacac acactgcagg 40 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer library <400> 4 cgcggaagcg tgctgggcc 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer library <400> 5 cataacccag aggtcgat 18 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplifing forward primer <400> 6 ggggaattcg cggaagcgtg ctgggcc 27 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplifing reverse primar <400> 7 ggggggatcc atcgacctct gggttatg 28 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA cloning forward primer <400> 8 ggggaattcg cggaagcgtg ctgggcc 27 <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Aptamers for mature white adipocytes and uses thereof <130> 13p-10-42 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MA-33 <400> 1 gttaccgcgg tgaagggtgg atgtgtctgg acgctatatc 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MA-64 <400> 2 aagatgacaa attgctggag tgtcgtggcg aggatgtcgg 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MA-91 <400> 3 caccggcagg ccaaataaca ggcatcacac acactgcagg 40 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer library <400> 4 cgcggaagcg tgctgggcc 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer library <400> 5 cataacccag aggtcgat 18 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplifing forward primer <400> 6 ggggaattcg cggaagcgtg ctgggcc 27 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR amplifing reverse primar <400> 7 ggggggatcc atcgacctct gggttatg 28 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA cloning forward primer <400> 8 ggggaattcg cggaagcgtg ctgggcc 27
Claims (10)
A nucleic acid aptamer that specifically binds to mature white adipocytes consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
2. The nucleic acid aptamer of claim 1, wherein the aptamer specifically binds to mature white adipocytes.
1. A composition for detecting or quantifying mature white adipocytes comprising a nucleic acid aptamer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
A kit for detecting or quantifying mature white adipocytes comprising a nucleic acid aptamer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
A kit for monitoring adipogenesis, comprising a nucleic acid aptamer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
2) 상기 핵산 앱타머와 검체 시료 내 성숙백색지방세포 복합체를 검출 또는 정량하는 단계를 포함하는 성숙백색지방세포 검출 또는 정량 방법.
1) contacting a test sample with a nucleic acid aptamer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; And
2) detecting or quantifying the nucleic acid aptamer and a mature white adipocyte complex in a sample of mature white adipocytes.
The method according to claim 6, wherein the detection or quantification of the step 2) is performed using an enzyme immunoassay (EIA), a radioimmunoassay (RIA), a fluorescence immunoassay (FIA), Western blotting, immunohistochemical staining, ), An enzyme-substrate coloring method, a chemiluminescent substance-binding method, and a gold particle complex method. The method for detecting or quantifying mature white adipose cells according to any one of claims 1 to 5,
1) 지방전구세포와 성숙지방세포에서 성숙지방세포의 검출 또는 정량; 및
2)성숙백색지방세포와 성숙갈색지방세포에서 성숙백색지방세포의 검출 또는 정량.
The method for detecting or quantifying mature white adipocytes according to claim 6, which is used for any one selected from the group consisting of:
1) detection or quantification of mature adipocytes in adipose precursor cells and mature adipocytes; And
2) Detection or quantification of mature white adipocytes in mature white adipocytes and mature brown adipocytes.
1. A composition for screening for the prevention and treatment of obesity comprising a nucleic acid aptamer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
A kit for screening for the prevention and treatment of obesity comprising a nucleic acid aptamer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
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