KR101544084B1 - Mdh1의 아세틸화 억제제를 이용한 항비만용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말산탈수소효소(malate dehydrogenase 1; MDH1)의 아세틸화 억제제를 이용한 항비만용 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로, MDH1이 지방세포 분화 동안 MDH1의 발현이 증가하고, 특히 지방세포 분화의 마지막 단계에서 MDH1 단백질의 라이신 아세틸화(lysine acetylation) 수준이 급증하여 이의 활성이 증가함을 확인함으로써, 상기 MDH1의 아세틸화 억제제는 항비만용 및 지방세포 분화 억제용 약학적 조성물에 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

MDH1의 아세틸화 억제제를 이용한 항비만용 조성물{COMPOSITION FOR ANTI-OBESITY USING MDH1 ACETYLATION INHIBITOR}

본 발명은 말산탈수소효소(malate dehydrogenase 1; MDH1)의 아세틸화(acetylation) 억제제를 이용한 항비만용 및 지방세포 분화 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

단백질 라이신 아세틸화(lysine acetylation)는 번역 후 변형의 일종으로 세포 내 여러 반응의 주요 조절 인자로서 알려져 있다. 히스톤 탈아세틸라아제(Histone deacetylase; HDAC) 및 히스톤 아세틸트렌스퍼라아제(acetyltransferase) 효소는 단백질의 라이신 잔기의 아미노 그룹(amino group)의 탈아세틸화/아세틸화 반응의 촉매이다. 상기 라이신 아세틸화는 히스톤 단백질에서 최초로 보고되었고, 이는 염색질(chromatin)의 구조와 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다(Gershey et al., 1968, J. Biol . Chem . 243: 5018-5022). 이 후, 전사 인자, 호르몬 수용체, 신호전달인자 및 샤페론과 같은 히스톤이 아닌 단백질에도 아세틸화 반응이 존재함이 보고되었다(Choudhary et al., 2009, Science 325: 834-840; Kim et al., 2006, Mol . Cell 23: 607-618; Wang et al., 2010, Science 327: 1004-1007; Zhao et al., 2010, Science 327: 1000-1004). 상기 히스톤이 아닌 단백질의 아세틸화의 가역 반응은 세포 사멸(apoptosis), 생존 및 증식과 같은 여러 세포 반응을 조절한다. 최근 여러 보고에 따르면(Choudhary et al., 2009, Science 325: 834-840; Kim et al., 2006, Mol . Cell 23: 607-618; Wang et al., 2010, Science 327: 1004-1007; Zhao et al., 2010, Science 327: 1000-1004), 해당과정(glycolysis), 지방산 대사, 당신생과정(gluconeogenesis), TCA 회로, 우레아(urea) 회로 등의 대사과정에 연관되어 있는 여러 대사효소(metabolic enzyme)들이 과아세틸화되어있다. 상기 대사효소들의 아세틸화 수준 변화에 의해 효소의 활성이 조절된다.

지방(adipose) 조직은 지방세포(adipocyte)로 이루어진 소성결합조직(loose connective tissue)으로 구성되어있으며, 에너지 항상성을 조절하는 중요한 대사 기관이다(Rosen et al., 2000, Genes Dev. 14: 1293-307). 구체적으로, 지방세포는 아디포킨(adipokine)을 분비하여 글루코스(glucose) 대사, 노화, 염증성(inflammatory) 반응 및 생식 기능 등과 같은 생리적 과정을 조절한다. 지방세포의 분화는 에너지 소비보다 섭취가 많은 에너지 취득(positive energy balance)을 통하여 비만으로 발전하도록 기여한다(Hausman et al., 2001, Obes . Rev . 2: 239-254). 비만은 전 세계적으로 심각한 건강 문제를 유발하는 원인으로 주목받고 있다.

비만은 유형 II 당뇨, 이상지질혈증(dyslipidemia), 고혈압과 같은 대사성 질환뿐 아니라 심혈관계 질환을 합병증으로 가져온다(Wilson et al., 2005, Circulation 112: 3066-3072). 지방세포에서 지방산(fatty acid)은 트리글리세라이드(triglyceride)로 저장되어 에너지 균형을 유지한다. 아세틸-CoA(Acetyl-CoA)는 지방산 전구체로서, 지방산의 모든 탄소는 아세틸-CoA의 아세틸 그룹으로부터 온다. 또한, 지방생성(adipogenic) 분화는 HDAC 억제제에 의하여 다르게 조절될 수 있는데(Xu et al., 2009, Tissue Eng . Part A 15: 3697-3707; Lagace and Nachtiqal, 2004, J. Biol . Chem . 279: 18851-18860; Yoo et al., 2006, J. Biol . Chem. 281: 6608-6615), 이는 지방생성(adipogenesis)을 조절하는데 단백질의 아세틸화가 중요한 역할을 할 것임을 가정할 수 있다.

한편, 말산 탈수소효소(malate dehydrogenase; MDH)는 미토콘드리아 막에서 조효소 NAD⁺/NADH를 이용하여 말산과 옥살로아세테이트(oxaloacetate)의 상호전환을 촉매한다(Webb et al., 1973, Biochemistry 12: 5101-5109). 진핵세포에서, 두 말산 탈수소효소(MDH) 단백질이 존재하는데, 이들의 세포이하 국소화(subcellular localization)에 따라서 MDH1 또는 MDH2로 구분된다(Minarik et al., 2002, Gen. Physiol. Biophys 21: 257-265). 미토콘드리아 기질에서 MDH2는 구연산회로(citric acid cycle)를 통해 말산을 옥살로아세테이트로 산화시킨다. 한편, 세포질 형태인 MDH1은 말산/아스파르트산 왕복수송(malate/aspartate shuttle)을 통해 작용하고, 상기 왕복수송은 질소, 옥살로아세테이트, 및 알파-케토글루타레이트 중간체의 세포질과 미토콘드리아 기질 사이 출입에 있어 전반적으로 균형을 유지하도록 한다(Musrati et al., 1998, Gen . Physiol . Biophys 17: 193-210). 역방향운반(antiport) 상호교환에 필요한 말산은 이소구연산염(isocitrate) 대신 다량으로 축적된 구연산염(citrate)에 의해서 분비될 수 있다. 상기 축적된 구연산염은 미토콘드리아에서 세포질로 운송된 후, 옥살로아세테이트 및 아세틸-CoA가 세포질에서 합성된다. 세포질의 옥살로아세테이트는 MDH1에 의하여 말산으로 합성되며, 아세틸-CoA는 지방산 합성에 이용된다. 포유동물에서, MDH1은 많은 조직에서 높게 발현되며, 이의 여러 가지 역할은 다양한 발현 수준에 따라 결정된다(Joh et al., 1987, J. Biol . Chem 262: 15127-15131; Lo wt al., 2005, J. Cell . Biochem 94: 763-773; Tanaka et al., 1996, Genomics 32:128-130).

이에, 본 발명자들은 지방세포의 분화를 조절할 수 있는 방법, 라이신 아세틸화 및 지방세포 분화의 연관성에 대하여 연구하던 중, 지방세포 분화 단계별 아세틸롬(acetylome) 및 LC-MS/MS 분석을 통하여 말산탈수소효소인 MDH1이 지방세포 분화 과정 중 발현 증가하고, 특히 지방세포 분화의 마지막 단계에서 MDH1의 라이신 아세틸화 정도가 급증하고 이에 따라 MDH1의 활성이 증가하여 지방세포 분화를 증진시키므로, 상기 MDH1의 아세틸화 억제제를 항비만 또는 지방세포 분화 억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성시켰다.

본 발명의 목적은 MDH1(malate dehydrogenase 1, 말산탈수소효소)의 아세틸화(acetylation) 억제제를 유효성분으로 함유하는 항비만용 및 지방세포 분화 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 지방형성(adioigenesis)이 진행되는 지방전구세포에 피검시료를 처리한 후, MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계를 포함하는 항비만제 및 지방형성 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 MDH1(malate dehydrogenase 1, 말산탈수소효소)의 아세틸화(acetylation) 억제제를 유효성분으로 함유하는 항비만용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 MDH1의 아세틸화 억제제를 유효성분으로 함유하는 지방세포 분화 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검시료를 지방형성(adioigenesis)이 진행되는 지방전구세포에 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 지방전구세포에서 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 항비만제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검시료를 지방형성이 진행되는 지방전구세포에 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 지방전구세포에서 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 지방형성 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검시료를 MDH1 단백질 및 MDH1의 아세틸화 효소에 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 항비만제의 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 피검시료를 MDH1 단백질 및 MDH1의 아세틸화 효소에 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 지방형성 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 말산탈수소효소인 MDH1(malate dehydrogenase 1)이 지방세포 분화 동안 MDH1의 발현이 증가하고, 특히 지방세포 분화의 마지막 단계에서 MDH1 단백질의 라이신 아세틸화(lysine acetylation) 수준이 급증하여 이의 활성이 증가함을 확인함으로써, 상기 MDH1 아세틸화 억제제는 항비만용 및 지방세포 분화 억제용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 3T3-L1세포에서 지방세포 분화 동안 단백질 발현 및 아세틸롬(acetylome) 변화에 관한 분석을 나타낸 도이다.
도 2는 3T3-L1 지방세포 분화 동안 MDH1(malate dehydrogenase 1)의 발현 및 아세틸화 수준의 변화를 나타낸 도이다.
도 3은 MDH1 과발현에 의한 3T3-L1 지방세포 분화 촉진을 확인한 도이다.
도 4는 MDH1 돌연변이의 발현 및 이의 3T3-L1 지방세포 분화에 대한 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 3T3-L1 지방세포 분화 동안 MDH1 돌연변이의 발현 변화 및 이의 아세틸화 수준에 대한 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 MDH1 아세틸화가 MDH1 단백질 활성 및 NADPH의 세포 내 수준에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 지방세포 분화 동안 미토콘드리아 및 세포질에서 MDH1 아세틸화가 작용하는 기전을 나타낸 도이다.
도 8은 MDH1 야생형 및 돌연변이형 단백질의 활성을 비교한 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 MDH1(malate dehydrogenase 1, 말산탈수소효소)의 아세틸화(acetylation) 억제제를 유효성분으로 함유하는 항비만용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 MDH1의 아세틸화 억제제를 유효성분으로 함유하는 지방세포 분화 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 MDH1은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 MDH1의 아세틸화 억제제는 MDH1 탈아세틸화(deacetylation) 효소, MDH1 아세틸화 효소에 대한 경쟁적 저해제 또는 비경쟁적 저해제, 및 MDH1의 아세틸화 부위 돌연변이 유도제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 MDH1 아세틸화 효소에 대한 경쟁적 저해제 또는 비경쟁적 저해제는 펩티드, 단백질, 또는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 효소에 대한 저해제로 항체인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 3T3-L1 지방전구세포를 사용하여, 지방세포 분화를 유도한 후, 지방세포 분화 동안 단백질 라이신 아세틸롬 변화를 확인하기 위하여, 1D SDS-PAGE, 2D SDS-PAGE, 면역 블럿팅(immunoblotting), 면역침강(immunoprecipitation), 웨스턴 블럿팅(western blotting), 및 LC-MS/MS를 수행한 결과, 다양한 대사성 단백질들의 아세틸화 수준이 변화하고 특히 MDH1 단백질의 아세틸화 수준이 지방세포 분화 마지막 단계에 증가하는 것을 확인하였다(도 1, 표 1 및 도 2 참조).

또한, MDH1 단백질과 지방형성의 상관성을 확인하기 위하여, 형질감염(transfection), GFP 형광 관찰, 웨스턴 블럿팅, Oil-Red-O 염색, 및 실시간 PCR(realtime PCR)을 수행한 결과, 인간 전장의 MDH1 야생형 단백질의 과발현에 의해 3T3-L1 지방전구세포의 분화가 촉진되는 경향이 있었고, 특히, MDH1의 발현이 증가하고 또한 세포감염된 세포에서 중성 지방 축적이 증가함을 확인함으로써, MDH1 단백질에 의해 지방세포 분화가 촉진됨을 확인하였다(도 3 참조).

또한, MDH1 단백질의 아세틸화 및 지방형성의 상관성을 확인하기 위하여, MDH1 단백질의 아세틸화 부위 특이적 돌연변이형 제작 및 이의 형질감염을 수행한 결과, 돌연변이형이 형질감염된 3T3-L1 세포에서 웨스턴 블럿팅을 통해 돌연변이형 단백질 과발현 및 아세틸화는 감소되었음을 확인하였고, GFP 형광 관찰, 웨스턴 블럿팅, Oil-Red-O 염색, 및 실시간 PCR을 수행한 결과, 야생형의 경우와 비교하여 돌연변이형이 과발현된 세포에서 지방세포 분화가 적은 경향이 있음을 확인함으로써, MDH1 아세틸화에 의한 지방형성 상관성을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조).

또한, MDH1 아세틸화 및 단백질 활성의 상관성을 확인하기 위하여, MDH1 야생형 및 돌연변이형을 대장균 내 발현 및 면역정제를 수행하여 이들의 활성을 측정한 결과, 면역침강하여 수득한 MDH1 야생형의 아세틸화 수준은 증가, MDH1 돌연변이형 수준은 감소하였고, 특히, 세포 내 NADP/NADPH 비율을 측정한 결과, MDH1 야생형에 의해 NADP/NADPH 비율이 감소함을 확인함으로써, 지방세포 분화 동안 MDH1의 아세틸화에 의해 MDH1의 활성이 증가함을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조).

따라서, 본 발명의 MDH1이 지방세포 분화 과정 중 발현이 증가하고, 특히 지방세포 분화의 마지막 단계에서 MDH1 단백질의 라이신 아세틸화 수준이 증가하여 이의 활성이 증가함을 확인함으로써, 상기 MDH1의 아세틸화 억제제가 항비만용 및 지방세포 분화 억제용 약학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 약학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들어 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약학적 첨가제를 함유할 수 있다. 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.

또한, 본 발명의 조성물은 기존의 치료제와 병합 투여될 수 있으며, 이 경우 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 표면에 전달하는 임의의 방식으로 개체에게 투여될 수 있다. 적합한 비경구 투여경로는 혈관 내 투여(예: 정맥 내 볼루스 주사, 정맥 내 주입, 동맥 내 볼루스 주사, 동맥 내 주입, 맥관 내로의 카테터 점적 주입), 피하 주입을 포함하는 피하 주사 또는 침착(deposition)(예: 삼투압 펌프 이용), 조직 주위 및 조직 내 투여 또는 침착 등을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성별, 연령, 건강상태, 체중, 투여 방법과 횟수, 표적 조직이나 세포 등 다양한 요인을 고려하여 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 각 치료에 요구되는 총 용량은 수회 용량 또는 일회량으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 피검시료를 지방형성(adioigenesis)이 진행되는 지방전구세포에 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 지방전구세포에서 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 항비만제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 피검시료를 지방형성이 진행되는 지방전구세포에 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 지방전구세포에서 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 지방형성 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 지방전구세포는 3T3-L1인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 MDH1 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 아세틸화를 측정하는 방법은 웨스턴 블럿팅(Western blotting), 면역 블럿팅(Immunoblotting), 면역침강(immunoprecipitation), 또는 LC-MS/MS(liquid chromatography-mass spectrometry)을 이용하여 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 MDH1이 지방세포 분화 과정 중 발현이 증가하고, 특히 지방세포 분화의 마지막 단계에서 MDH1 단백질의 라이신 아세틸화 수준이 증가하여 이의 활성이 증가함을 확인함으로써, 상기 MDH1의 아세틸화를 지방세포 분화 조절 마커로 이용하는 항비만제 및 지방형성 억제제 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 피검시료를 MDH1 단백질 및 MDH1의 아세틸화 효소에 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 항비만제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 피검시료를 MDH1 단백질 및 MDH1의 아세틸화 효소에 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 지방형성 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 지방전구세포는 3T3-L1인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 MDH1 단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 아세틸화를 측정하는 방법은 웨스턴 블럿팅(Western blotting), 면역 블럿팅(Immunoblotting), 면역침강(immunoprecipitation), 또는 LC-MS/MS(liquid chromatography-mass spectrometry)을 이용하여 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 MDH1이 지방세포 분화 과정 중 발현이 증가하고, 특히 지방세포 분화의 마지막 단계에서 MDH1 단백질의 라이신 아세틸화 수준이 증가하여 이의 활성이 증가함을 확인함으로써, 상기 MDH1 단백질을 지방세포 분화 조절 마커로 이용하는 항비만제 및 지방형성 억제제의 스크리닝 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 세포 배양 및 지방세포 분화 유도

마우스(mouse) 배아 줄기세포에서 유래한 지방전구세포(preadipocyte) 세포주인 3T3-L1은 ATCC로부터 구입하였다. 상기 세포는 1% 항생제-항사상균제(antibiotic-antimycotic) 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 10% 우아혈청(bovine calf serum)(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 구성된 많은 포도당(high glucose) DMEM을 포함하는 생장 배지, 5% 이산화탄소의 습한 대기 및 37℃ 온도 조건에서 배양하였다.

GP2-293 포장(packaging) 세포는 1% 항생제-항사상균제 용액 및 10% FBS를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. 선행문헌(Jung et al., 2009, Biochem . Biophys . Res. Commun . 383: 252-257; Kim et al., 2008, Endocr . J 55: 827-837; Kim et al., 2009, J. Cell Sci . 122: 4160-4167; Kim et al., 2011, Mol . Biol . Cell 22: 4883-4891)에서 설명한 방법에 따라, 3T3-L1 세포를 성숙한 지방세포로 분화를 유도하였다. 또한, 융합성(Confluent) 3T3-L1 세포는 DMEM, 10% FBS, 및 MDI(0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine), 1 M 덱사메타손(dexamethasone), 및 10 g/ml 인슐린(Sigma, US)으로 이루어진 분화 칵테일(cocktail))을 포함하는 분화용 배지에서 유도하였다. 그런 다음, 48 시간 후, 상기 분화용 배지는 DMEM, 10% FBS, 및 10 g/ml 인슐린을 포함하는 유지용 배지로 옮겼다. 상기 유지용 배지는 매일 새로운 배지로 교환하였다.

< 실시예 2> 지방세포 분화 동안 아세틸롬 ( acetylome ) 변화 분석 확인

<2-1> 1D SDS - PAGE 및 면역 블럿팅(immunoblotting)을 통한 지방세포 분화 동안 단백질 라이신 아세틸화 변화 확인

지방세포 분화는 HDAC 억제제의 종류에 의존하여 특이하게 조절이 된다고 알려져 있다. 따라서, 아세틸화가 직접적으로 지방세포 발달에 관여하는지 확인하기 위해, 1D SDS-PAGE 및 면역 블럿팅(immunoblotting, IB)을 수행하였다.

구체적으로, 3T3-L1 지방세포 분화를 유도한 다음, 0, 2, 및 12일째에 각각 세포를 수득한 후, 수득한 세포를 완충용액(30 mM Tris pH 8.5, 7 M 우레아(urea), 2 M 티오우레아(thiourea), 및 4% CHAPS(3-(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio propane sulfonate))에 용해하였다. 수득한 세포의 용해물(lysate)을 1D SDS-PAGE 젤에 로딩(loading)한 후, 쿠마시 블루(Coomassie blue) G-250 염색으로 단백질 양을 시각화하였다(1A 왼쪽). 또한, 상기와 같은 방법으로, 수득한 세포의 용해물을 로딩하여 분리한 1D SDS-PAGE 젤을 이용하여 면역블럿(Immunoblot) PVDF 멤브레인(Millipore)을 제작한 후, Super-Signal West Pico Chemiluminescent Substrate kit(Pierce, Rockford, IL) 및 항-아세틸-라이신 항체(ImmuneChem Pharmaceuticals Inc.)를 사용하여 시각화하였다.

그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이 3T3-L1 지방세포 분화 동안 단백질(1A 왼쪽) 및 단백질의 라이신 아세틸화(1A 오른쪽) 패턴의 변화를 확인하였다(도 1A).

<2-2> 웨스턴 블럿팅(western blotting)을 통한 지방세포 분화 자극 이후 aP2 단백질 발현량 확인

지방세포 분화 자극 이후 지방전구세포인 3T3-L1의 분화 여부를 분자수준에서 확인하기 위하여, 지방분화시 발현이 증가하는 aP2 단백질의 발현량을 웨스턴 블럿팅을 수행하여 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>에 기재된 방법과 같이, 3T3-L1 지방세포 분화를 유도한 다음, 0, 2, 및 12일째에 각각 세포 전체로부터 단백질 용해물을 수득한 후, 1D SDS-PAGE 젤 상에서 분리하였다(Kang et al., 2007, Proteomics 7: 2624-2635; Kim et al., 2009, Proteomics 9: 5056-5066). 웨스턴 블럿팅을 통해 aP2 단백질의 발현양을 확인하였고, 이때 Eno1 및 히스톤 H3를 대조군으로 사용하였다. 항 aP2 항체, 항 Eno1(Anti enolase1) 및 항 히스톤 H3 항체는 Cell Signaling(Beverley, MA)으로부터 구입하였으며, 2차 항체는 Abcam으로부터 구입하였다. 세포 전체 단백질이 분리된 SDS-PAGE 젤에서 트렌스퍼(transfer)하여 준비된 멤브레인은 Super-Signal West Pico Chemiluminescent Substrate kit(Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 시각화하였다.

그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 3T3-L1 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 동안, 특히 지방세포 분화 자극 이후 12일째 aP2 단백질의 발현이 유의적으로 변화하는 것을 확인하였다(도 1B).

<2-3> 2D 웨스턴 블럿팅을 통한 지방세포 분화 동안 아세틸화된 단백질 스크리닝

등전점(isoelectric points)의 단백질의 발현 패턴을 pH 3 내지 11 범위에서 분석하기 위해 2D(2-dimensional) 젤 전기영동을 실시하였다. 또한, 아세틸화 패턴(아세틸롬)의 변화도 함께 관찰하기 위해 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.

구체적으로, 3T3-L1 세포로부터 실시예 <2-1>의 방법으로 세포 용해물을 수득하였다. 총 단백질 60 ㎍을 각각의 시료로 이용하였다. 2배 부피의 차가운 아세톤을 준비한 단백질 시료에 추가한 다음, 원심분리 후, 침전물을 재수화(rehydration) 완충용액(7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS, 2% 양성체(ampholyte), 및 20 mM DTT)을 이용하여 재수화하였다. 그런 다음, Multiphor II 기계(GE HealthCare)를 이용하여 등전점 전기영동(isoelectric focusing)을 실시하였다. 전기영동 후, 각 스트립(7 cm immobilized pH nonlinear strip, pH 3-11)은 평형 완충용액(equilibrium buffer) 2.5 ml에 15 분씩 두 번 평형화시켰다. 상기 평형 완충용액은 50 mM Tris (pH 8.8), 6 M 우레아, 및 30% 글리세롤을 포함한다. 두 번째 평형 단계에는 260 mM 아이오도아세트아마이드(iodoacetamide)를 추가하였다. 그리고 나서, IPG 스트립은 Mini-Protean system(Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 10% 아크릴아마이드(acrylamide) SDS-PAGE 젤에 로딩하여 분리시켰다.

또한, 2D 웨스턴 블럿팅을 수행하기 위해, 상기와 같은 방법으로 분리된 2D SDS-PAGE 젤(12.5%)로부터 실시예 <2-1>과 같은 방법으로 멤브레인을 준비하였다. 멤브레인은 한 시간 동안 5% skim milk로 블락킹(blocking)한 후, 1:2,000으로 희석된 토끼 항-아세틸-라이신 항체(ICP0380 Immunechem)를 프로브(probe)로 사용하고 5% skim milk를 함유하는 TBS를 이용하여 4 시간 동안 4℃ 조건에서 혼성화(hybridization)하였다(Kim et al., 2011, Mol . Biol . Cell 22: 4883-4891).

그 결과, 도 1C에 나타낸 바와 같이 지방세포 분화가 시작된 이후, 단백질의 라이신-아세틸화 비율이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 1C). 또한, 69개 스팟(spot)에서 지방세포 분화 동안 아세틸화 변화를 나타내는 것을 확인하였다(도 1C).

<2-4> LC - MS / MS 를 통한 지방세포 분화 동안 라이신 아세틸화된 단백질 수준의 증가 확인

실시예 <2-3>에서 아세틸화 변화가 나타난 69개 스팟에 해당하는 단백질을 동정하기 위하여, LC-MS/MS를 수행하였다.

구체적으로, 실시예 <2-3>에서 SDS-PAGE 젤에서 분리된 단백질을 쿠마시 블루 G-250 염색을 통해 시각화하였고, 관심 있는 69개의 스팟을 조각으로 만들었다. 젤 조각을 100 mM pH 8.2 탄화수소 암모늄(ammonium bicarbonate) 150 μl 및 70% v/v 아세토니트릴(acetonitrile)로 두 번 세척하고, 37℃에서 20 분 동안 건조시켰다. 50 mM 탄화수소 암모늄의 트립신(Trypsin)(20 μg/ μl)을 각각 젤 조각에 추가하였고, 상기 젤 조각은 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션(incubation)하였다. 0.1% v/v 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 20 μl 및 70% 아세토니트릴을 포함하는 혼합물을 이용하여 펩티드를 추출하였다. 추출한 펩티드는 LC-MS/MS 질량 분석하기 전, 제조사의 제조 방법에 따라 ZipTips TM (Millipore)를 사용하여 정제하였다. 그리고 나서, 정제한 상기 펩티드를 Synapt High Definition mass spectrometer (Waters, Manchester, UK)를 사용하여 분석하였다(Jang et al., 2009, Oncogene 28: 1529-1536; Kim et al., 2012, Stem Cells Dev . 10.1089/scd.2011.0243).

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 지방세포가 분화되는 동안 해당과정, 지방산 대사, 및 TCA 회로에 관여하는 다양한 대사성 단백질들이 아세틸화됨을 확인하였다(표 1).

<2-5> 지방세포 분화 동안 MDH1 및 MDH2 의 발현 및 아세틸화 수준 확인

실시예 <2-4>의 아세틸롬 분석 결과를 입증하고자, 여러 후보 단백질 중 MDH1 및 MDH2의 발현 및 아세틸화 수준을 확인하기 위한 면역 블럿팅 및 면역침강(immunoprecipitation)을 수행하였다.

구체적으로, 실시예 <2-1>에서 수득한 3T3-L1 세포를 차가운 PBS로 세 번 세척한 후, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail, Roche)을 포함하는 7 M 우레아 용해 완충용액을 이용하여 용해물을 제작하였다. 상기 용해물에 대하여, 브래드퍼드(Bradford) 검사(Bio-rad)를 수행하여 단백질 농도를 측정하였다. 실시예 <2-1> 방법을 참고하여 면역 블럿팅 및 면역침강을 수행하였고, 이때 항-MDH1 항체는 SantaCruz로부터, 항-Eno1 항체는 Cell Signaling(Beverley, MA)로부터, 및 항-아세틸-라이신 항체는 ImmuneChem Pharmaceuticals Inc.로부터 구입하였다. 또한, 면역침강을 위하여, 항-아세틸-라이신 항체 아가로즈비즈(agarosebeads) (ImmuneChem Pharmaceuticals Inc.)를 200 g의 상기 용해물에 추가하였다. 혼합물은 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 2,500 g로 원심분리하여 면역침강물을 수득한 후, NP-40 용해 완충용액으로 5 번 세척하고, 상기 실시예 <2-2>의 웨스턴 블럿팅 방법으로 분석하였다.

그 결과, 도 2A 및 도 2B에 나타낸 바와 같이, 지방세포 분화 동안, 여러 후보 단백질 중 하나인 MDH1의 발현 수준은 2배 증가하였고, 이의 아세틸화 수준은 6배 증가하는 것을 확인하였다. 한편, MDH2 및 대조군인 에노레이즈1(enolase1, Eno1)는 지방세포 분화 동안 단백질 발현 또는 아세틸화에 있어 유의적인 변화가 존재하지 않는 것을 확인하였다(도 2A 및 도 2B).

< 실시예 3> MDH1 과발현에 의한 3 T3 - L1 지방세포 분화 촉진 확인

<3-1> MDH1 과발현 지방전구세포에서 MDH1 발현 여부 확인

지방세포 분화 동안 MDH1 아세틸화의 역할을 확인하기 위해, MDH1이 과발현된 3T3-L1 지방전구세포를 제작하기 위하고자, 레트로비랄(retroviral) 벡터를 클로닝하여 세포감염(transfection) 및 전달(transduction)을 수행하였다.

구체적으로, FLAG로 태그된 전장(full-length)의 인간 MDH1을 암호화하는 DNA 서열(서열번호 1) 및 pRetroX-IRES-ZsGreen1 벡터(Clontech)를 이용하여 형질감염용 벡터를 제작(IRES-GFP 시스템)하였다. 바이러스 제작을 위하여, 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Gibco-Invitrogen)를 사용하여 GP2-293 세포주에 형질감염하였다(Jung et al., 2009, Biochem. Biophys . Res . Commun . 383: 252-257; Kim et al., 2008, Endocr . J 55: 827-837; Kim et al., 2009, J. Cell Sci . 122: 4160-4167; Kim et al., 2011, Mol. Biol . Cell 22: 4883-4891; Jeon et al., 2010, Cell. Mol. Life Sci. 67: 2271-2281). 바이러스를 이용하여 세포감염된 3T3-L1 세포를 FACSAria cell sorter(BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 선별하고, 생장용 배지에서 더 유지 배양하였다. MDH1의 엑토픽(ectopic) 발현을 형광 현미경(Digital Bio/JuLi^TM smart fluorescent cell analyzer)을 이용한 GFP 신호를 감지 및 실시예 <2-3>에 기재된 방법으로 웨스턴 블럿팅을 통해 확인하였다. 항-FLAG 항체는 Sigma로부터 구입하였다.

그 결과, 도 3A 및 도 3B에 나타낸 바와 같이, 세포감염된 3T3-L1 지방세포 내에서 FLAG 및 GFP로 태그된 MDH1이 발현을 형광 현미경으로 시각화하였고(도 3A), 웨스턴 블럿팅 결과 MDH1 단백질이 과발현되었음을 확인하였다(도 3B).

<3-2> MDH1 형질감염 세포에서 지방세포 분화 확인

상기 실시예 <3-1>의 세포감염된 3T3-L1 세포에서 MDH1의 과발현에 의해 지방세포가 분화되었는지 확인하기 위해, 세포 내 중성 지방 특이적 염색법인 Oil-Red-O 염색을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1>에 따라 세포감염된지 8 일째 되는 3T3-L1 세포를 PBS로 두 번 세척하고 상온에서 10% 포르말린(formalin)으로 고정시켰다. 60% 이소프로판올의 필터링한 0.3% Oil-Red-O 용액으로 상온에서 30 분 동안 염색하였다. 포함된 Oil-Red-O 염료를 추출하기 위해, 이소프로판올 원액을 염색한 세포-배양 접시에 추가한 후, 상온에서 30 분 동안 접시를 흔들어주었다. 3 반복(Triplicate) 시료를 GeneQuant 1300 spectrophotometer(GE HealthCare, Uppsala, Sweden)를 이용하여 510 nm에서 측정하였다(Kim et al., 2009, J. Cell Sci. 122: 4160-4167; Kim et al., 2011, Mol . Biol . Cell 22: 4883-4891).

그 결과, 도 3C에 나타낸 바와 같이, 공벡터를 세포감염한 세포와 달리, MDH1을 과발현시킨 세포에서 중성 지방의 축적이 많음을 시각화하여 확인하였고(도 3C), 이를 정량화한 결과, 도 3D에 나타낸 바와 같이 표현되었다(3 반복, error bar= ± SD, *** P < 0.001)(도 3D).

<3-3> 지방세포에서 aP2 단백질 발현량 확인

상기 실시예 <3-2>에서 중성 지방 축적을 확인한 세포에서 분자 수준으로 지방세포 분화를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.

구체적으로, 세포감염 즉시(0 일) 및 세포감염 8일 후의 세포를 상기 실시예 <2-1>과 같은 방법으로 수득한 후, 상기 실시예 <3-1>과 같은 방법으로 웨스턴 블럿팅을 실시하였다.

그 결과, 도 3E에 나타낸 바와 같이, MDH1을 세포감염시킨 세포에서 aP2의 수준은 공벡터를 세포감염시킨 세포에 비하여 높게 나타남으로써, 지방세포 분화 동안 MDH1의 과발현에 의해 aP2 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다(도 3E).

<3-4> 지방세포에서 지방세포 분화 마커의 전사량 확인

지방세포 분화 마커를 이용하여 지방세포 분화 여부를 확인하였다.

구체적으로, 실시예 <3-1> 방법에 따라 공벡터 또는 MDH1을 세포감염한 즉시(0 일 후) 및 세포감염한 8일 후의 세포로부터 각각 mRNA를 추출하였다. 지방세포 분화 마커로서 C/EBPα 및 PPARγ의 발현 수준을 측정하기 위하여 C/EBPα 및 PPARγ 각각의 하기 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다:

C/EBPα 정방향 프라이머(서열번호 3): 5'-AGGTGCTGGAGTTGACCAGT-3';

C/EBPα 역방향 프라이머(서열번호 4): 5'-CAGCCTAGAGATCCAGCGAC-3';

PPARγ 정방향 프라이머(서열번호 5): 5'-GAGCACTTCACAAGAAATTACC-3' 및;

PPARγ 역방향 프라이머(서열번호 6): 5'-GAACTCCAT AGTGGAAGCCT-3'.

그 결과, 도 3F에 나타낸 바와 같이, MDH1의 엑토픽(ectopic) 발현에 의하여 지방세포 분화 마커인 C/EBPα 및 PPARγ의 발현 또한 유도되어 증가함을 확인하였다(도 3F).

< 실시예 4> 예상 아세틸화 부위 특이적 MDH1 돌연변이의 3 T3 - L1 지방세포 분화에 대한 영향 확인

<4-1> 예상 아세틸화 부위 특이적 MDH1 돌연변이형 제작

지방세포 분화 동안 MDH1 아세틸화될 가능성이 있는 라이신을 돌연변이화시켜 그 영향을 알아보고자 예상 아세틸화 부위 특이적 MDH1 돌연변이형을 제작하였다.

구체적으로, 아세틸화를 막기 위해 라이신을 아르기닌으로 치환하거나, 또는 아세틸화된 라이신과 비슷하여 아세틸화되지 않는 글루타민으로 치환하여 MDH1 돌연변이형을 클로닝하여 제작하였다(EZchange TM Site-Directed Mutagenesis kit 이용(Enzynomics, KR)). 이때, Zhao 등에 의해 보고된 결과를 참조하여(Zhao et al., 2010, Science 327: 1000-1004), K118, K121, 및 K298이 예상되는 아세틸화 부위로서 선택되었다(표 2). 대장균 Rosetta DE3 세포(Novagen)에서 pET28a 플라스미드(Novagen, Madison, WI) 및 프라이머(정방향(Nde I); 5'-gggaattccatatgatgtctgaaccaatcagagtc-3' (서열번호 7), 역방향(Xho I); 5'-ccgctcgagttaggcagaggaaagaaattcaaa-3' (서열번호 8))를 이용하여 클로닝을 실시하였다. 그런 다음, 상시 실시예 <3-1>과 같은 방법으로, 3T3-L1 세포에 각 돌연변이형을 세포감염시켰다.

1 msepirvlvt gaagqiaysl lysigngsvf gkdqpiilvl lditpmmgvl dgvlmelqdc 61 alpllkdvia tdkedvafkd ldvailvgsm prregmerkd llkanvkifk sqgaald k ya 121 k ksvkvivvg npantnclta sksapsipke nfscltrldh nrakaqialk lgvtandvkn 181 viiwgnhsst qypdvnhakv klqgkevgvy ealkddswlk gefvttvqqr gaavikarkl 241 ssamsaakai cdhvrdiwfg tpegefvsmg visdgnsygv pddllysfpv viknktw k fv 301 eglpindfsr ekmdltakel teekesafef lssa

_:는 서열번호 2로 기재되는 MDH1의 아미노산 서열에서 돌연변이 시킨 부분.

<4-2> MDH1 돌연변이 형질감염 세포에서 MDH1 발현 여부 확인

지방세포 분화 동안 MDH1 아세틸화의 역할을 명확히 하기 위해 상기 <4-1>에서 제작한 MDH1 돌연변이형 과발현 세포에서 MDH1의 발현량을 확인하기 위해, GFP 형광을 이용한 세포 관찰 및 웨스턴 블럿팅 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1>과 같은 방법으로 형질감염된 MDH1 돌연변이형의 발현을 GFP 형광을 이용하여 시각화하였고, 웨스턴 블럿팅을 통해 단백질 수준의 발현 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 4A 및 도 4B에 나타낸 바와 같이, 세포감염된 3T3-L1 지방세포 내에서 FLAG 및 GFP로 태그된 MDH1의 돌연변이형의 발현을 형광 현미경으로 시각화하였고(도 4A), 웨스턴 블럿팅 결과 MDH1 돌연변이형 단백질이 과발현되었음을 확인하였다(도 4B).

<4-3> MDH1 돌연변이형 형질감염 세포에서 지방세포 분화 확인

상기 실시예 <4-2>의 세포감염된 3T3-L1 세포에서 MDH1 돌연변이형의 과발현에 의해 지방세포가 얼마나 분화되었는지 확인하기 위해 세포 내 중성 지방 특이적 염색법인 Oil-Red-O 염색을 수행하였다.

구체적으로, MDH1 야생형, MDH1의 세 가지 예상 아세틸화 부위 모두 아르기닌으로 치환된 돌연변이형인 3KR, 및 K118R을 세포감염된지 8 일째 되는 3T3-L1 세포를 상기 실시예 <3-2>에 따라 Oil-Red-O 염색을 실시하여 시각화하였다.

그 결과, 도 4C에 나타낸 바와 같이, MDH1의 돌연변이형인 3KR 및 K118R을 과발현시킨 세포 각각에서 중성 지방의 축적이 야생형의 결과와 비교하여 유의미하게 적음을 시각화하여 확인하였고(도 4C), 이를 정량화한 결과, 도 4D에 나타낸 바와 같이 표현되었다(3 반복, error bar= ± SD, * P < 0.05, ** P < 0.01, 및 *** P < 0.001)(도 4D).

<4-4> 지방세포 분화 동안 aP2 단백질 발현량 확인

상기 실시예 <4-1>에서 MDH1 돌연변이형이 형질감염된 3T3-L1 세포에서 분자 수준으로 지방세포 분화를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.

구체적으로, 세포감염 즉시(0 일) 및 세포감염 8일 후의 세포를 상기 실시예 <2-1>과 같은 방법으로 수득한 후, 상기 실시예 <3-1>과 같은 방법으로 항 Flag, 항 MDH1, 항 aP2, 및 항 Eno1 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 실시하였다.

그 결과, 도 5A 및 도5B에 나타낸 바와 같이, MDH1을 세포감염시킨 세포에서 aP2의 수준은 공벡터를 세포감염시킨 세포에 비하여 높게 나타남으로써, 지방세포 분화 동안 MDH1 야생형의 결과와 비교하여 MDH1 돌연변이형의 과발현에 의한 aP2 단백질의 발현이 적음을 확인하였다(도 5A 및 도 5B).

<4-5> 지방 분화 동안 MDH1 돌연변이형에 의한 아세틸화 수준 감소 확인

MDH1 돌연변이형에 의하여 아세틸화 수준 감소 여부를 입증하기 위해, 면역 블럿팅 및 면역침강을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-1>의 방법에 따라 수득한 상기 실시예 <4-2>의MDH1 돌연변이형, 즉, 세 부위의 라이신이 아르기닌으로 치환된 3KR 및 118번째 부위만 치환된 K118R이 과발현된 3T3-L1 세포를 상기 실시예 <2-5>와 같은 방법으로 분석하였다.

그 결과, 도 5C 및 도 5D에 나타낸 바와 같이, 지방세포 분화 동안, 상기 실시예 <2-5>에서 MDH1의 발현 및 아세틸화 수준이 증가한 것(도 2A 및 도 2B)과 달리, MDH1 돌연변이형 3KR 및 K118R의 아세틸화 수준은 상당히 감소한 것을 확인하였다(도 5C 및 도 5D).

<4-6> 지방세포에서 실시간 PCR 을 통한 지방 분화 마커의 mRNA 발현량 확인

지방세포 분화 마커를 이용하여 지방세포 분화 여부를 확인하였다.

구체적으로, 실시예 <3-4> 방법에 따라 MDH1 돌연변이형을 세포감염한 즉시(0 일 후) 및 세포감염한 8일 후의 세포로부터 각각 mRNA를 추출하고, 실시간 PCR을 실시하여 지방세포 분화 마커의 실시간 발현량을 확인하였다. 상기 지방세포 분화 마커로서 adiponectin, resistin, C/EBPα 및 PPARγ를 이용하였다:

adiponectin 정방향 프라이머(서열번호 9): 5'-ACTCCTGGAGAGAAGGGAGAGAAA-3';

adiponectin 역방향 프라이머(서열번호 10): 5'-GCTCCTGTCATTCCAACATCTCCT-3';

resistin 정방향 프라이머(서열번호 11):5'-CCCTTCTCATCTGCATCTCC-3'; 및

resistin 역방향 프라이머(서열번호 12): 5'-CAGTAGCAGTCATCCCAGCA-3'.

그 결과, 도 5E에 나타낸 바와 같이, MDH1 야생형의 엑토픽 발현에 의해 지방세포 분화 마커인 adiponectin, resistin, C/EBPα 및 PPARγ의 발현이 증가한 반면, 돌연변이형 3KR 및 K118R은 대조군과 유사한 수준으로 발현하여 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 5E).

< 실시예 5> MDH1 아세틸화의 효소 활성에 대한 영향 확인

<5-1> MDH1 야생형 및 돌연변이형 단백질의 면역정제 및 이들의 활성 확인

도 5E의 결과를 근거로 하여, MDH1 돌연변이형이 이의 효소 활성에 영향을 줄 가능성에 대하여 확인해보기 위하여, MDH1 야생형 및 돌연변이형(3KR 및 K118R) 단백질을 대장균 시스템을 이용하여 발현시켜 면역정제한 후, MDH1 효소 활성을 측정하였다.

구체적으로, MDH1 야생형 및 MDH1 돌연변이형 단백질을 발현시키기 위하여, 세포는 37℃ LB 배지에서 A₆₀₀이 0.6 내지 0.8에 도달하도록 배양하였다. 1 mM IPTG로 단백질 발현을 유도시켜 18℃에서 18 시간 동안 배양하였다. 수득한 세포는 용해 완충용액(50 mM Tris pH 7.5, 250 mM NaCl, 5% 글리세롤, and 1 mM β-mercaptoethanol)으로 세척하고, 이를 초음파처리(ultrasonication)하여 용해시켰다. 30 분동안 29,820 g로 원심분리한 후, 상층액을 코발트 친화성 레진(cobalt affinity resin)(TALON , Clontech)과 함께 4℃ 라커(rocker)에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 10 mM 이미다졸(imidazole)을 용해 완충용액에 첨가하였다. 100 mM 이미다졸을 포함한 용애 완충용액으로 금속 친화성 레진으로부터 단백질을 분리시켜 수득하였다. 상기 단백질을 5 mg/ml으로 농축한 후 -80℃에 저장하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, MDH1 야생형 및 MDH1 돌연변이형 단백질의 발현 후 면역정제한 즉시 활성에는 유의적인 차이를 발견하지 못하였다(도 8). 즉, 아미노산 치환의 도입에 의한 효소 활성 변화는 존재하지 않는 것을 확인하였다.

<5-2> 형질감염된 3 T3 - L1 세포로부터 면역침강하여 수득한 MDH1 야생형 및 돌연변이형 단백질의 활성 확인

일반적으로 단백질의 아세틸화는 효소 활성, 촉매 활성, 또는 단백질 사이의 상호작용을 변화시킴으로서 단백질의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서, MDH1 야생형 및 돌연변이형 단백질이 형질감염된 3T3-L1 세포에서 단백질의 아세틸화 수준에 변화가 생긴 MDH1 야생형 및 돌연변이형 단백질을 면역침강법을 통해 수득한 후, 이들 단백질의 활성을 확인하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <3-1> 및 실시예 <4-1>에서 제작한 MDH1 야생형 및 돌연변이형 단백질이 각각 형질감염된 3T3-L1 세포의 펠렛(pellet)을 각각 원심분리하여 준비하였다. 그런 다음, 상기 펠렛을 프로테아제 억제제(Roche, Indianapolis, IN) 및 KDAC 억제제(10 μM 트리코스타틴(trichostatin) A, 10 mM 니코틴아미드(nicotinamide), 및 50 mM 부티르산(butyric acid); Sigma, US)를 첨가한 NP-40 완충용액으로 용해하였다(Zhao et al., 2010, Science 327: 1000-1004). 용해물 내의 아세틸화 수준에 변화가 생긴 MDH1 야생형 또는 돌연변이형 단백질을 선별하여 수득하기 위한 면역침강을 수행하고자, 상기 용해물과 항 FLAG M2 아가로즈 비즈(Sigma)를 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 면역침강된 비즈를 NP-40 완충용액으로 10 번 세척한 다음, FLAG로 태그된 단백질을 3×FLAG 펩티드(Sigma)를 이용하여 녹여서 분리하였다. 녹여서 분리된 단백질의 농도를 측정하기 위해, 브래드퍼드 검사 및 쿠마시 블루 G-250 염색을 실시하였다. 3T3-L1 세포에서 과발현된 정제된 인간 MDH1 단백질은 0.2 mM 옥살로아세테이트(oxaloacetate) 및 1 mM NADH를 함유한 PBS (pH 7.5)로 인큐베이션 하였다. NADH의 형광(Ex. 350 nm; Em. 470 nm)의 감소 수준을 측정함으로써 MDH1 활성을 결정하였다. 이를 위해, Victor TM X3 Multilabel plate reader(PerkinElmer, Waltham, MA)에서 1 분 간격으로 15 분동안 관찰하였다.

그 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, 지방형성(adipogenesis) 동안 MDH1의 아세틸화 수준이 증가하였다(도 6A). 또한, 도 6B에 나타낸 바와 같이, 아세틸화 수준에 의한 MDH1 활성을 확인한 결과, 0 일째 활성과 비교하여 지방세포 분화 후 8 일째에 약 50% 정도 활성이 증가하였다. 또한, 도 6C 및 6D에 나타낸 바와 같이, 면역 침강 후 엑토픽하게(ectopically) 발현된 야생형 및 돌연변이형 MDH1 단백질의 활성을 측정한 결과, 야생형과 비교하여 3KR 및 K118R 돌연변이형 단백질 활성이 상당히 유의적으로 감소함을 확인하였다.

<5-3> 웨스턴 블럿팅을 통한 면역침강된 MDH1 단백질 및 이의 아세틸화 수준 확인

상기 실시예 <5-2>에서 면역침강하여 수득한 Flag로 태그된 MDH1 야생형 및 돌연변이형 단백질의 아세틸화 수준을 확인하고자, 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <2-5>의 웨스턴 블럿팅 방법을 따라 상기 실시예 <5-2>의 면역침강된 MDH1 야생형 및 돌연변이형 단백질 각각의 아세틸화 수준을 측정하고, 또한, 쿠마시 블루 G-250 염색을 통해 웨스턴 블럿팅에 이용한 단백질 양을 비교하였다.

그 결과, 6E에 나타낸 바와 같이, 야생형과 비교하여 KR 돌연변이형의 아세틸화 수준이 감소하였다. 따라서, 도 6A 내지 6E에 나타낸 결과를 종합함으로써, 지방형성 동안 MDH1의 증가한 아세틸화 수준이 MDH1의 활성을 증가함을 입증하였다.

< 실시예 6> MDH1 아세틸화의 MDH1 세포 내 NADPH 비율에 대한 영향 확인

세포 내 NADPH는 지방산 합성 과정의 주요 원료 에너지 형태이고, MDH1은 지방산 합성을 위한 아세틸-CoA 및 NADPH의 공급을 담당하는 말산/아스파르트산 왕복수송(malate/aspartate shuttle)에 참여한다. 지방세포 분화 동안 아세틸화된 MDH1의 활성 기전을 명확히 알아보고자, NADP/NADPH 비율 측정을 수행하였다.

구체적으로, 상업용 NADP/NADPH 검사 키트(Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여, NADPH 및 총 NADP를 측정하였다. 지방분화가 시작 된지 8 일째의 세포를 준비하고, 차가운 PBS로 3 번 세척한 후 NADP/NADPH 추출용 완충용액을 준비하였다. 세척한 세포를 두 번 냉동(드라이아이스에서 20 분)/해동(상온에서 10 분) 사이클을 반복하였다. 그런 다음, 조심스럽게 초음파 분해(sonication)을 하여 세포 용해물을 수득하였다. 녹여서 분리한 단백질의 농도를 브래드퍼드 검사(Bio-Rad)로 측정하였다. NADP/NADPH 비율을 산정하기 위하여, 총 NADP(NADPt) 및 단독 NADPH(NADPH-only)을 준비하고, NADPH의 순차적인 희석을 통해 표준 NADPH 값을 획득하였다. NADPH 반응을 1 내지 4 시간 동안 450 nm에서 microplate reader(Bio-Rad)로 관찰하였다.

그 결과, 도 6F 및 도 6G에 나타낸 바와 같이, 야생형 MDH1이 과발현된 세포에서 NADP/NADPH 비율이 상당히 감소한 반면, 돌연변이형 MDH1 3KR 및 K118R이 과발현된 세포의 경우 공벡터와 유사한 결과를 초래하였다(도 6F 및 도 6G). 따라서, 지방형성 과정 동안 MDH1의 아세틸화에 의한 효소 활성과 NADP/NADPH 비율 사이에 유의적인 상관관계가 존재하며, 도 7에 나타나낸 바와 같이, 아세틸화된 MDH1의 역할을 정리하였다(도 7).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> COMPOSITION FOR ANTI-OBESITY USING MDH1 ACETYLATION INHIBITOR <130> 13P-05-08 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1006 <212> DNA <213> malate dehydrogenase 1 sequence <400> 1 atgtctgaac caatcagagt ccttgtgact ggagcagctg gtcaaattgc atattcactg 60 ctgtacagta ttggaaatgg atctgtcttt ggtaaagatc agcctataat tcttgtgctg 120 ttggatatca cccccatgat gggtgtcctg gacggtgtcc taatggaact gcaagactgt 180 gcccttcccc tcctgaaaga tgtcatcgca acagataaag aagacgttgc cttcaaagac 240 ctggatgtgg ccattcttgt gggctccatg ccaagaaggg aaggcatgga gagaaaagat 300 ttactgaaag caaatgtgaa aatcttcaaa tcccagggtg cagccttaga taaatacgcc 360 aagaagtcag ttaaggttat tgttgtgggt aatccagcca ataccaactg cctgactgct 420 tccaagtcag ctccatccat ccccaaggag aacttcagtt gcttgactcg tttggatcac 480 aaccgagcta aagctcaaat tgctcttaaa cttggtgtga ctgctaatga tgtaaagaat 540 gtcattatct ggggaaacca ttcctcgact cagtatccag atgtcaacca tgccaaggtg 600 aaattgcaag gaaaggaagt tggtgtttat gaagctctga aagatgacag ctggctcaag 660 ggagaatttg tcacgactgt gcagcagcgt ggcgctgctg tcatcaaggc tcgaaaacta 720 tccagtgcca tgtctgctgc aaaagccatc tgtgaccacg tcagggacat ctggtttgga 780 accccagagg gagagtttgt gtccatgggt gttatctctg atggcaactc ctatggtgtt 840 cctgatgatc tgctctactc attccctgtt gtaatcaaga ataagacctg gaagtttgtt 900 gaaggtctcc ctattaatga tttctcacgt gagaagatgg atcttactgc aaaggaactg 960 acagaagaaa aagaaagtgc ttttgaattt ctttcctctg cctgac 1006 <210> 2 <211> 334 <212> PRT <213> malate dehydrogenase 1 amino acid sequences <400> 2 Met Ser Glu Pro Ile Arg Val Leu Val Thr Gly Ala Ala Gly Gln Ile 1 5 10 15 Ala Tyr Ser Leu Leu Tyr Ser Ile Gly Asn Gly Ser Val Phe Gly Lys 20 25 30 Asp Gln Pro Ile Ile Leu Val Leu Leu Asp Ile Thr Pro Met Met Gly 35 40 45 Val Leu Asp Gly Val Leu Met Glu Leu Gln Asp Cys Ala Leu Pro Leu 50 55 60 Leu Lys Asp Val Ile Ala Thr Asp Lys Glu Asp Val Ala Phe Lys Asp 65 70 75 80 Leu Asp Val Ala Ile Leu Val Gly Ser Met Pro Arg Arg Glu Gly Met 85 90 95 Glu Arg Lys Asp Leu Leu Lys Ala Asn Val Lys Ile Phe Lys Ser Gln 100 105 110 Gly Ala Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Lys Lys Ser Val Lys Val Ile Val 115 120 125 Val Gly Asn Pro Ala Asn Thr Asn Cys Leu Thr Ala Ser Lys Ser Ala 130 135 140 Pro Ser Ile Pro Lys Glu Asn Phe Ser Cys Leu Thr Arg Leu Asp His 145 150 155 160 Asn Arg Ala Lys Ala Gln Ile Ala Leu Lys Leu Gly Val Thr Ala Asn 165 170 175 Asp Val Lys Asn Val Ile Ile Trp Gly Asn His Ser Ser Thr Gln Tyr 180 185 190 Pro Asp Val Asn His Ala Lys Val Lys Leu Gln Gly Lys Glu Val Gly 195 200 205 Val Tyr Glu Ala Leu Lys Asp Asp Ser Trp Leu Lys Gly Glu Phe Val 210 215 220 Thr Thr Val Gln Gln Arg Gly Ala Ala Val Ile Lys Ala Arg Lys Leu 225 230 235 240 Ser Ser Ala Met Ser Ala Ala Lys Ala Ile Cys Asp His Val Arg Asp 245 250 255 Ile Trp Phe Gly Thr Pro Glu Gly Glu Phe Val Ser Met Gly Val Ile 260 265 270 Ser Asp Gly Asn Ser Tyr Gly Val Pro Asp Asp Leu Leu Tyr Ser Phe 275 280 285 Pro Val Val Ile Lys Asn Lys Thr Trp Lys Phe Val Glu Gly Leu Pro 290 295 300 Ile Asn Asp Phe Ser Arg Glu Lys Met Asp Leu Thr Ala Lys Glu Leu 305 310 315 320 Thr Glu Glu Lys Glu Ser Ala Phe Glu Phe Leu Ser Ser Ala 325 330 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> C/EBP alpha forward primer <400> 3 aggtgctgga gttgaccagt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> C/EBP alpha reverse primer <400> 4 cagcctagag atccagcgac 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> PPAR gamma forward primer <400> 5 gagcacttca caagaaatta cc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> PPAR gamma reverse primer <400> 6 aggtgctgga gttgaccagt 20 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Nde I primer <400> 7 gggaattcca tatgatgtct gaaccaatca gagtc 35 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Xho I primer <400> 8 ccgctcgagt taggcagagg aaagaaattc aaa 33 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> adiponectin forward primer <400> 9 actcctggag agaagggaga gaaa 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> adiponectin reverse primer <400> 10 gctcctgtca ttccaacatc tcct 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> resistin forward primer <400> 11 cccttctcat ctgcatctcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> resistin reverse primer <400> 12 cagtagcagt catcccagca 20

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 1) 피검시료를 지방형성(adioigenesis)이 진행되는 시험관 내(in vitro) 지방전구세포에 처리하는 단계;
   2) 상기 단계 1)의 지방전구세포에서 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및
   3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 항비만제의 스크리닝 방법.
   
6. 1) 피검시료를 지방형성이 진행되는 시험관 내 지방전구세포에 처리하는 단계;
   2) 상기 단계 1)의 지방전구세포에서 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및
   3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 지방형성 억제제의 스크리닝 방법.
   
7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 시험관 내 지방전구세포는 3T3-L1인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
8. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 아세틸화를 측정하는 방법은 웨스턴 블럿팅(Western blotting), 면역 블럿팅(Immunoblotting), 면역침강(immunoprecipitation), 또는 LC-MS/MS(liquid chromatography-mass spectrometry)을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
   
9. 1) 피검시료를 MDH1 단백질 및 아세틸 코엔자임 A(acetyl-coenzyme A)에 처리하는 단계;
   2) 상기 단계 1)의 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및
   3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 항비만제의 스크리닝 방법.
   
10. 1) 피검시료를 MDH1 단백질 및 아세틸 코엔자임 A에 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 MDH1 단백질의 아세틸화를 측정하는 단계; 및
    3) 상기 단계 2)의 MDH1 단백질의 아세틸화가 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검시료를 선별하는 단계를 포함하는 지방형성 억제제의 스크리닝 방법.
    

Images