KR101541969B1 - 단백질 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목표지점까지 단백질을 효율적으로 전달할 수 있으며, 전달하는 단백질의 생리활성을 변성시키지 않는 단백질 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

단백질 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법{Nanocomposite for protein delivery and manufacturing method thereof}
본 발명은 단백질 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목표지점까지 단백질을 효율적으로 전달할 수 있으며, 전달하는 단백질의 생리활성을 변성시키지 않는 단백질 전달용 나노 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
약물전달체계(이하, "DDS"라 한다) 기술이란 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 하는 의약 기술을 말한다.
최근에는 나노기술과 결합하면서 의약계에서 새로운 부가가치를 창출하는 첨단기술의 한 분야로 자리 잡고 있으며, 미국과 일본 등 기술선진국은 지난 80년대 후반부터 약물전달체계기술 개발에 전력을 쏟아 왔다.
특히, 작용부위에 도달한 약물은 약효가 발휘되지만, 질병부위가 아닌 다른 부위로 운반된 약물은 주로 부작용의 원인이 되기 때문에 목표 지점에 선택적으로 약물을 전달할 수 있는 표적지향적 약물 전달체의 개발이 요구되고 있다.
한편, 그래핀은 흑연의 한 층, 즉 흑연의 면 단층을 말하는데, 흑연에 있어서 그래핀과 그래핀 간의 결합이 미약하므로 두께가 약 4 옹스트롱(Å)으로 매우 얇은 이차원 구조를 가지는 그래핀이 존재할 수 있다. 그래핀은 2차원 구조의 탄소 나노물질로서 많은 흥미로운 물리적, 화학적 성질을 가지고 있어서 그래핀에 관한 연구는 급격히 증가하는 추세이다. 그래핀의 특이한 복합 구조, 넓은 표면적과 생체안정성, 낮은 가격의 장점에 의해 생물학과 생체의학 적용에서도 주목받고 있으며, 약물 로딩과 전달과 같은 약의학 부분에 대한 적용점도 생겨났다.
이 중 공개특허 10-2013-0024551(공개일자: 2013년03월08일)에는 타겟 비고정화 방식의 그래핀을 이용한 앱타머 선별방법 및 이로부터 선별된 Nampt 특이 앱타머에 관한 것으로 신속하고 정확하게 2형 당뇨, 암 등 Nampt 관련 질환을 진단할 수 있는 Nampt 단백질 특이적인 앱타머를 기재하고 있다.
약학의 눈부신 발달로 여러 가지 고성능의 신약들이 개발되고 있으나 개발되는 많은 약물들은 낮은 용해도로 인하여 임상에서의 사용에 극히 제한을 받고 있다. 이에 그래핀의 표면에 폴리머를 그래프트시켜 효과적으로 용해도의 증가와 목표 물질과의 상호작용을 하도록 하는 연구가 있어왔다.
구체적으로 종래에는 설폰산과 엽산에 의한 기능성 그래핀옥사이드(GO)에 항암제 성분을 섞어 약물 로딩이 되도록 하였으며, 이는 생리적인 안정과 특별한 세포지향 능력을 지녔다. 또한, 그래핀옥사이드(GO)에 PEG 작용기를 결합하고 항암제 약물을 로드시킨 전달체가 개시되었고, 그래핀옥사이드(GO)표면에 키토산과 poly (N-isopropylacrylamide)에 결합시켜 약물의 로딩과 방출을 시험하기도 했다.
그러나 종래의 그래핀을 이용한 단백질 전달체는 로딩되는 단백질의 양이 적은 문제를 해결하는 데 한계가 있었으며, 또한 목표지점에서의 선택적 단백질 방출이 어려워 부작용의 원인이 될 수 있는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 단백질 전달체로서 단백질을 잘 보호하며, 운반 단백질을 목표지점에서 선택적으로 방출할 수 있는 단백질 전달용 나노 복합체를 제공하려는 목적이 있다.
또한, 본 발명의 단백질 전달용 나노 복합체는 단백질을 효소로부터 잘 보호하며 결합한 단백질의 생물학적 활성도 저하하지 않아 단백질 전달체로서 높은 활용도를 갖는 나노 복합체를 제공하려는 목적이 있다.
나아가, 본 발명은 세포독성이 존재하지 않아 세포의 증식 및 생존에 영향을 끼치지 않으며, 이로 인해 생체에 사용하기 적합한 단백질 전달용 나노 복합체를 제공하려는 목적이 있다.
본 발명은 폴리아크릴산(polyacrylic acid; PAA)가 그래프팅(grafting)된 그래핀옥사이드(graphene oxide; GO)를 포함하는 단백질 전달용 나노 복합체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 그래핀옥사이드는 평균 직경 50 ~ 1,000 ㎚일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, XYZ 좌표 상에서, 상기 나노 복합체는 XY, YZ 및 XZ면에 의하여 잘린 단면 중 가장 큰 면적인 단면의 장축의 평균이 50 ~ 200 ㎚일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, XYZ 좌표 상에서, 상기 나노 복합체는 XY, YZ 및 XZ면에 의하여 잘린 단면 중 가장 작은 면적인 단면의 단축의 평균이 1 ~ 10 ㎚일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 단백질 전달용 나노 복합체는 그래핀옥사이드와 폴리아크릴산의 혼합비가 1: 1 ~ 10 중량비로 혼합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 단백질 전달용 나노 복합체는 pH 3 ~ 4일 때 평균 유체역학 사이즈(hydrobynamic size)가 190 ~ 220 ㎚이고, pH 7 ~ 8일 때 평균 유체역학 사이즈가 120 ~ 170 ㎚일 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 바와 같은 단백질 전달용 나노 복합체에 친수성 약리활성 단백질을 로딩한 약리활성 단백질 전달체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 약리활성 단백질 전달체는 pH 3에서 로딩된 친수성 약리활성 단백질의 방출되지 않고, pH 7 이상에서 로딩된 친수성 약리활성 단백질이 방출될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 약리활성 단백질 전달체는 pH 7.3 ~ 7.5에서 1 ~ 3일 동안 로딩된 친수성 약리활성 단백질의 10 ~ 25 중량%가 방출되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 약리활성 단백질 전달체는 pH 7.9 ~ 8에서 1 ~ 3일 동안 로딩된 친수성 약리활성 단백질의 50 ~ 85 중량%가 방출되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 친수성 약리활성 단백질은 창자(intestine)에서 약리활성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약리활성 단백질 전달체는 단백질 전달용 나노 복합체 100 중량부에 대하여 1 ~ 250 중량부의 친수성 약리활성 단백질이 로딩되는 것일 수 있다.
나아가, 본 발명은 그래핀옥사이드 및 극성 유기용매를 혼합하여 혼합물을 제조하고, 초음파 처리하는 단계; 상기 초음파 처리된 혼합물, 활성화제 및 비극성 용매를 혼합하고, 계면활성제를 첨가하여 계면활성된 그래핀옥사이드를 수득하는 단계; 상기 계면활성된 그래핀옥사이드 및 촉매를 혼합 및 교반하여 촉매가 그래프팅된 그래핀옥사이드를 수득하는 단계; 상기 촉매가 그래프팅된 그래핀옥사이드를 무극성 용매에 용해하고 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계; 및 상기 침전물을 가수분해하고 용매를 제거하여 폴리아크릴산이 그래프팅된 그래핀옥사이드를 수득하는 단계; 를 포함하는 단백질 전달용 나노 복합체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 극성 유기용매는 디메틸포름아미드(DMF; dimethylformamide) 및 테트라하이드로피란(THF; tetrahydropyran)로 이루어진 군 중 1종 이상이고, 상기 계면활성제는 2-브로모-2-메틸프로피오닐 브로마이드(2-bromo-2-methylpropionyl bromide)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 비극성 용매는 톨루엔(toluene) 및 트리에틸아민(triethylamine)으로 이루어진 군 중 1종 이상이고, 상기 활성화제는 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide), N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-(dimethylamino) propyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 및 1,3-디아미노피로판(1,3-Diaminopropane)로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 촉매는 CuBr, N,N,N',N',N''-펜타메틸디에틸렌트리아민(N,N,N',N',N''-pentamethyldiethylenetriamine) 및 터트-부틸 아크릴레이트(Tert-butyl acrylate)으로 이루어진 군 중 1종 이상이고, 상기 무극성 용매는 테트라하이드로피란(THF; tetrahydropyran)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 가수분해는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 및 다이클로로메테인(DCM; dichloromethane)의 혼합물을 첨가하여 20 ~ 27 ℃에서 20 ~ 30 시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명은 단백질 전달체로서 단백질을 잘 보호하며, 운반 단백질을 목표지점에서 선택적으로 방출할 수 있는 단백질 전달용 나노 복합체를 제공하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 단백질을 효소로부터 잘 보호하며 결합한 단백질의 생물학적 활성도 저하하지 않아 단백질 전달체로서 높은 활용도를 갖는 나노 복합체를 제공하는 효과가 있다.
나아가, 본 발명은 세포독성이 존재하지 않아 세포의 증식 및 생존에 영향을 끼치지 않으며, 이로 인해 생체에 사용하기 적합한 단백질 전달용 나노 복합체를 제공하는 효과가 있다.
도 1은 실험예 1에서 측정한 1H NMR 결과이다.
도 2는 실험예 1에서 측정한 FT-IR 결과이다.
도 3은 실험예 1에서 측정한 TGA 결과이다.
도 4는 실험예 1에서 측정한 DLS 및 제타포텐셜 결과이다.
도 5는 실험예 1에서 측정한 AFM 결과이다.
도 6은 실험예 1에서 측정한 GO와 GO-PAA의 높이 프로파일이다.
도 7은 실험예 2에서 측정한 BSAFITC 로딩 전 후의 UV-vis 스펙트라이다.
도 8은 실험예 2에서 측정한 BSAFITC 농도 변화에 따른 GO-PAA에 결합되는 BSAFITC 변화를 측정한 그래프이다.
도 9는 실험예 3에서 측정한 pH 변화에 따른 단백질 방출 효과를 측정한 결과이다.
도 10은 실험예 4-1에서 측정한 GO-PAA에 결합된 단백질 안정성 평가 중 SDS-PAGE 결과이다.
도 11은 실험예 5-1에서 측정한 GO-PAA의 세포독성 측정 결과이다.
도 12는 실험예 5-2에서 측정한 배양 온도 변화에 따른 세포의 GO-PAA의 흡수능 측정 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 종래의 그래핀을 이용한 단백질 전달체는 로딩되는 단백질의 양이 적은 문제를 해결하는 데 한계가 있었으며, 또한 목표지점에서의 선택적 단백질 방출이 어려워 부작용의 원인이 될 수 있는 문제점이 있었다. 더구나 우수한 수용성을 만족하면서도 동시에 pH에 따라 선택적으로 단백질을 방출할 수 있는 효과를 달성하기 어려운 문제점이 있었다.
이에 본 발명은 폴리아크릴산(polyacrylic acid; PAA)가 그래프팅(grafting)된 그래핀옥사이드(graphene oxide; GO)를 포함하는 단백질 전달용 나노 복합체를 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 종래의 그래핀을 이용한 단백질 전달체보다 다량의 단백질을 로딩할 수 있으며, 목표지점에서 선택적으로 단백질을 방출할 수 있는 단백질 전달용 나노 복합체를 제공하는 효과가 있다. 또한, 단백질을 효소로부터 잘 보호하며 결합한 단백질의 생물학적 활성도 저하하지 않아 단백질 전달체로서 높은 활용도를 갖는 나노 복합체를 제공하는 효과가 있다. 나아가, 세포독성이 존재하지 않아 세포의 증식 및 생존에 영향을 끼치지 않으며, 이로 인해 생체에 사용하기 적합한 단백질 전달용 나노 복합체를 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 폴리아크릴산(polyacrylic acid; PAA)가 그래프팅(grafting)된 그래핀옥사이드(graphene oxide; GO)를 포함하는 단백질 전달용 나노 복합체를 제공한다.
상기 그래핀옥사이드는 통상적으로 합성 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 평균 직경 50 ~ 1,000 ㎚의 그래핀옥사이드를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 평균 직경 100 ~ 400 ㎚의 그래핀옥사이드를 사용할 수 있다.
만약, 평균 직경이 1,000 ㎚를 초과하는 그래핀옥사이드를 사용할 경우, 생체적합성이 감소하는 문제가 발생할 수 있다.
상기 폴리아크릴산은 통상적으로 합성 및/또는 구매할 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않는다.
그래핀옥사이드에 폴리아크릴산을 그래프팅하는 방법은 통상적으로 알려진 그래프팅 방법이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이, ATRP(atom transfer radical polymerization)방법 및 가수분해를 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 상기 단백질 전달용 나노 복합체는 폴리아크릴산(PAA)이 그래프팅된 그래핀옥사이드(GO)를 포함하는 것이라면 그 크기를 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 XYZ 좌표 상에서, 상기 나노 복합체는 XY, YZ 및 XZ면에 의하여 잘린 단면 중 가장 큰 면적인 단면의 장축의 평균이 50 ~ 200 ㎚일 수 있으며, XYZ 좌표 상에서, 상기 나노 복합체는 XY, YZ 및 XZ면에 의하여 잘린 단면 중 가장 작은 면적인 단면의 단축의 평균이 1 ~ 10 ㎚일 수 있다.
구체적으로, 실험예 1에서 측정한 AFM 결과 및 GO와 GO-PAA의 높이 프로파일과 도면 5 내지 6에서 확인되는 바와 같이, GO 보다 GO-PAA의 두께는 약 5.7 ㎚로 증가하였고 측면 길이는 약 100 ㎚로 감소하였다. 상기 GO-PAA의 두께 증가로 인해 GO 표면에 PAA가 잘 그래프팅된 것을 확인할 수 있었다.
나아가, 상기 단백질 전달용 나노 복합체는 폴리아크릴산(PAA)이 그래프팅된 그래핀옥사이드(GO)를 포함하는 것이라면 그 함량비를 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 그래핀옥사이드와 폴리아크릴산의 혼합비가 1: 1 ~ 10 중량비일 수 있다.
만약, 그래핀옥사이드와 폴리아크릴산의 혼합비가 1:1 미만일 경우, 목표 지점까지 단백질을 보호할 수 없는 문제가 발생할 수 있으며, 그래핀옥사이드와 폴리아크릴산의 혼합비가 1:10을 초과할 경우, 폴리아크릴산에 의한 단백질 흡착이 어려운 문제가 발생할 수 있다.
더불어, 상기 단백질 전달용 나노 복합체는 pH 3 ~ 4일 때 평균 유체역학 사이즈(hydrobynamic size)가 190 ~ 220 ㎚이고, pH 7 ~ 8일 때 평균 유체역학 사이즈가 120 ~ 170 ㎚일 수 있으며, 이는 실험예 1 및 도면 4에서 확인할 수 있다.
게다가, 본 발명은 상술한 바와 같은 단백질 전달용 나노 복합체에 친수성 약리활성 단백질을 로딩한 약리활성 단백질 전달체를 제공한다.
상기 약리활성 단백질 전달체는 pH 3에서 로딩된 친수성 약리활성 단백질의 방출되지 않고, pH 7 이상에서 로딩된 친수성 약리활성 단백질을 방출할 수 있다.
구체적으로, 실험예 3 및 도 9에서 확인되는 바와 같이, 상기 약리활성 단백질 전달체는 pH 7.3 ~ 7.5에서 1 ~ 3일 동안 로딩된 친수성 약리활성 단백질의 10 ~ 25 중량%가 방출할 수 있으며, pH 7.9 ~ 8에서 1 ~ 3일 동안 로딩된 친수성 약리활성 단백질의 50 ~ 85 중량%가 방출될 수 있다.
이를 통해, 본 발명의 약리활성 단백질 전달체는 체내 중 pH가 상대적으로 낮은 위장에서는 로딩된 단백질을 방출하지 않으며, 체내 중 pH가 상대적으로 높은 창자에서는 로딩된 단백질을 방출하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 친수성 약리활성 단백질은 통상적으로 친수성 및 약리활성을 가지는 단백질로 알려진 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 pH 7.8 ~ 8.2인 창자(intestine)에서 약리활성을 나타내는 것일 수 있다.
상기 약리활성 단백질 전달체는 단백질 전달용 나노 복합체에 친수성 약리활성 단백질을 로딩된 것이라면 그 혼합비를 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 단백질 전달용 나노 복합체 100 중량부에 대하여 1 ~ 250 중량부의 친수성 약리활성 단백질이 로딩된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 단백질 전달용 나노 복합체 100 중량부에 대하여 100 ~ 250 중량부의 친수성 약리활성 단백질이 로딩된 것일 수 있다.
만약, 단백질 전달용 나노 복합체 100 중량부에 대하여 1 중량부 미만의 친수성 약리활성 단백질이 로딩된 것은 약리적 효과가 적은 문제가 발생할 수 있으다.
본 발명의 약리활성 단백질 전달체는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으나, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
또한, 상기 약리활성 단백질 전달체는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 메이신에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
게다가, 본 발명은 그래핀옥사이드 및 극성 유기용매를 혼합하여 혼합물을 제조하고, 초음파 처리하는 단계; 상기 초음파 처리된 혼합물, 활성화제 및 비극성 용매를 혼합하고, 계면활성제를 첨가하여 계면활성된 그래핀옥사이드를 수득하는 단계; 상기 계면활성된 그래핀옥사이드 및 촉매를 혼합 및 교반하여 촉매가 그래프팅된 그래핀옥사이드를 수득하는 단계; 상기 촉매가 그래프팅된 그래핀옥사이드를 무극성 용매에 용해하고 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계; 및 상기 침전물을 가수분해하고 용매를 제거하여 폴리아크릴산이 그래프팅된 그래핀옥사이드를 수득하는 단계; 를 포함하는 단백질 전달용 나노 복합체 제조방법을 제공한다.
우선, 그래핀옥사이드 및 극성 유기용매를 혼합하여 혼합물을 제조하고, 초음파 처리한다.
상기 극성 유기용매는 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 디메틸포름아미드(DMF; dimethylformamide) 및 테트라하이드로피란(THF; tetrahydropyran)로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 DMF일 수 있다.
상기 그래핀옥사이드와 극성 유기용매의 혼합비는 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용하는 비율이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직한 그래핀옥사이드와 극성 유기용매의 혼합비는 1: 100 ~ 1,000 중량비일 수 있다.
만약, 그래핀옥사이드와 극성 유기용매의 혼합비가 1: 100 중량비 미만일 경우, 극성 유기용매의 양이 적어 그래핀옥사이드의 분산이 힘든 문제가 발생할 수 있으며, 그래핀옥사이드와 극성 유기용매의 혼합비가 1: 1,000 중량비를 초과할 경우, 그래핀옥사이드의 농도가 너무 낮아져 합성시 문제가 발생할 수 있다.
상기 초음파 처리는 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용하는 조건이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 100 ~ 300 와트(W) 초음파로 20 ~ 30 시간 동안 처리하는 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 120 ~ 150 와트(W)로 21 ~ 25 시간 동안 처리하는 것일 수 있다.
만약, 100 와트 미만의 초음파로 처리할 경우, 그래핀옥사이드의 평균 직경이 너무 커지는 문제가 발생할 수 있으며, 300 와트를 초과하는 초음파로 처리할 경우, 그래핀옥사이드의 평균 직경이 너무 작아서 파괴되는 문제가 발생할 수 있다.
다음, 상기 초음파 처리된 혼합물, 활성화제 및 비극성 용매를 혼합하고, 계면활성제를 첨가하여 계면활성된 그래핀옥사이드를 수득한다.
상기 활성화제는 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide), N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-(dimethylamino) propyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 및 1,3-디아미노피로판(1,3-Diaminopropane)로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide), N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-(dimethylamino) propyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 및 1,3-디아미노피로판(1,3-Diaminopropane)의 혼합물일 수 있다.
상기 비극성 용매는 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 톨루엔(toluene) 및 트리에틸아민(triethylamine)으로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 톨루엔(toluene) 및 트리에틸아민의 혼합물일 수 있다.
상기 초음파 처리된 혼합물, 활성화제 및 비극성 용매의 혼합비는 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용하는 비율이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 초음파 처리된 혼합물 100 중량부에 대하여 0.1 ~ 2 중량부의 활성화제 및 200 ~ 300 중량부의 비극성 용매를 포함하는 것일 수 있다.
상기 계면활성제는 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 2-브로모-2-메틸프로피오닐 브로마이드(2-bromo-2-methylpropionyl bromide)일 수 있다.
상기 초음파 처리된 혼합물, 활성화제 및 비극성 용매를 포함하는 혼합물에 첨가하는 계면활성제 함량은 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용할 수 있는 첨가량이라면 특별히 제한하지 않는다.
다음으로, 상기 계면활성된 그래핀옥사이드 및 촉매를 혼합 및 교반하여 촉매가 그래프팅된 그래핀옥사이드를 수득한다.
상기 촉매는 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 CuBr, N,N,N',N',N''-펜타메틸디에틸렌트리아민(N,N,N',N',N''-pentamethyldiethylenetriamine) 및 터트-부틸 아크릴레이트(Tert-butyl acrylate)으로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 CuBr, N,N,N',N',N''-펜타메틸디에틸렌트리아민(N,N,N',N',N''-pentamethyldiethylenetriamine; PMDETA) 및 터트-부틸 아크릴레이트(Tert-butyl acrylate; tBA) 혼합물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PMDETA 100 중량부에 대하여 0.5 ~ 10 중량부의 tBA 및 10 ~ 20 중량부의 CuBr을 포함하는 혼합 촉매일 수 있다.
다음, 상기 촉매가 그래프팅된 그래핀옥사이드를 무극성 용매에 용해하고 원심분리하여 침전물을 수득한다.
상기 무극성 용매는 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 테트라하이드로피란(THF; tetrahydropyran)일 수 있다.
상기 원심분리는 통상적으로 용액에서 침전물을 수득하기 위해 수행하는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 회전농축기(rotavapor)를 사용할 수 있다.
다음으로, 상기 침전물을 가수분해하고 용매를 제거하여 폴리아크릴산이 그래프팅된 그래핀옥사이드를 수득한다.
상기 가수분해는 통상적으로 그래핀옥사이드에 단백질 또는 약물을 그래프팅할 때 사용하는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 및 다이클로로메테인(DCM; dichloromethane)의 혼합물을 첨가하여 20 ~ 27 ℃에서 20 ~ 30 시간 동안 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 트리플루오로아세트산과 DCM의 혼합비가 1: 3 ~ 7 중량비로 혼합된 혼합물을 첨가하여 20 ~ 27 ℃에서 21 ~ 27 시간 동안 수행할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
[ 실시예 ]
준비예 1.
평균 입경 25 ㎛의 그래피이트(graphite)를 삼양 C&G로부터 구매하여 사용하였다. 또한, 터트-부틸 아크릴레이트(Tert-butyl acrylate; tBA, Aldrich, 98%)는 산화알루미늄에 통과시켜 정제하고 4 ℃에서 저장하였다. 브롬화 구리(Copper (I) bromide; CuBr, Sigma Aldrich, 98%)는 빙초산(glacial acetic acid)과 혼합하여 정제하였고 이후 메탄올로 세척한 뒤 진공오븐에서 건조하여 사용하였다. N,N,N',N',N''-펜타메틸디에틸렌트리아민(N,N,N',N',N''-pentamethyldiethylenetriamine; PMDETA, Sigma Aldrich, 99%)은 4Å의 분자체(molecular sieve)를 이용하여 건조하여 사용하였다.
트리플루오로아세트산(Trifluoro acetic acid), 1,3-디아미노프로판(1, 3-diaminopropane), N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-(dimethylamino) propyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride; EDC.HCl), 2-브로모-2-메틸프로피오닐 브로마이드(2-bromo-2-methylpropionyl bromide, 98%), 플루오레세인 이소티오시아네이트-레벨드 소 혈청 알부민(fluorescein isothiocyanate-labeled bovine serum albumin; BSAFITC), DMEM(high glucose Dulbecco’s modified eagle’s medium), 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS), MTT(3-(4,5-dmethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, 98%) 및 트립신(trypsin)을 포함하는 본 발명의 실시예에서 사용한 물질들은 Sigma Aldrich에서 구매하여 사용하였다.
준비예 2. 그래핀옥사이드(GO)의 합성
그래핀옥사이드(GO)는 허머(Hummer) 방법으로 합성하였다.
구체적으로, 그래파이트(graphite) 가루 4g을 3 ℃에서 NaNO3 2g 및 H2SO4 92 ㎖와 혼합한 후 KMnO4 12g을 1시간 동안 천천히 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물은 냉각통(ice-bath)를 이용하여 25 ℃에서 30분 동안 교반한 후 3시간 동안 반응을 진행하고 200 ㎖의 증류수를 첨가하여 반응을 중지하였다. 이후 30% 과산화수소 50 ㎖를 첨가하여 반응하지 않은 KMnO4를 제거하여 노란 황금색의 반응물을 수득하였다. 상기 반응물은 pH가 7이 될 때까지 증류수와 염화수소(HCl)로 세척하고, 막 필터(직경 50 ㎜, 공경 크기 0.2 ㎛)로 필터링 후 60 ℃ 진공상태에서 건조하여 그래핀옥사이드를 수득하였다.
준비예 2. 분석 장비
푸리에 변환 적외분광법(Fourier transform infrared spectroscopy; FT-IR Jasco, FT/IR-620, Japan)은 진공상태에서 수행했고, 1H 핵자기공명 스펙트라(1H nuclear magnetic resonance, NMR, Bruker, 400 MHz, AVANCE digital 400, Germany)는 25 ℃에서 용매로 D2O을 이용하여 수행하였다. 열 중량 분석(thermogravimetric analysis, TGA Setaram, TGA-DSC EVO, France)은 N2 분위기 하 승온 속도 10 ℃/분으로 20 ~ 80 ℃에서 수행하였다. 원자력현미경(Atomic force microscopy; AFM, NanoScope, III,England)은 티핑모드(tapping mode)로 수행하였고, AFM의 샘플은 0.005 mg/ml의 용액을 운모(mica)에 떨어뜨리며 24시간 동안 25 ℃의 건조한 환경에서 수행하였다. 동적 광산란(Dynamic light scattering; DLS) 및 제타 포텐셜(zeta potential)은 Malvern Zetasizer Nano instrument(Nano-ZS90, England)을 이용하여 633 ㎚의 레이저 파장으로 측정하였고, 모든 결과는 3번 측정한 값의 평균을 사용하였다. UV-vis 스펙트라는 V-650(Jasco, Japan)을 이용하고, 실온 광루미네선스(room temperature photoluminescence; PL) 스펙트라는 FP-6500(Jasco, Japan)을 이용하여 측정하였다.
실시예 1. 폴리아크릴산을 그래프팅한 그래핀옥사이드 합성
1-1: 그래핀옥사이드가 부착된 원자 전달 라디칼 중합 개시제( GO -I)의 합성
준비예 1에서 수득한 1g의 그래핀옥사이드를 250 ㎖의 디메틸포름아미드(DMF; dimethylformamide)에 넣고 24 시간 동안 40 ㎑ 및 135 와트(W)의 초음파로 처리했다. 이후 0 ℃에서 NHS 3.42 g과 EDC.HCL 5.75 g을 첨가하고 2시간 동안 교반하고, 1,3-디아미노피로판(1,3-Diaminopropane) 3.8 ㎖를 첨가하고 24 시간 동안 25 ℃에서 교반하여 GO-NH2 가루를 수득하였다.
상기 GO-NH2 가루는 물과 에탄올로 세척하고, 40 ℃ 진공상태에서 건조하였다. 이후 250 ㎖ 톨루엔(toluene)과 10.5 ㎖ 트리에틸아민(triethylamine)을 첨가하고, 2-브로모-2-메틸프로피오닐 브로마이드(2-bromo-2-methylpropionyl bromide)를 천천히 첨가하고 0 ℃에서 2 시간 동안 교반한 후 90 ℃에서 24 시간 동안 정치하여 브롬으로 기능화한 그래핀옥사이드(Br-functionalized GO; GO-I)를 수득하였다. 이후 상기 GO-I는 톨루엔으로 세척하고 40 ℃ 진공상태에서 건조하였다.
1-2: 폴리아크릴산을 그래프팅한 그래핀옥사이드 나노입자 합성
쉬링크 플라스크(Schlenk flask)에 PMDETA 0.345 mmol, 1.3 ㎖ tBA(미리 N2와 함께 60분 동안 끓여서 가스를 제거하여 준비하였다.) 및 진공 건조한 0.115 mmol의 CuBr을 첨가하였다. 이후 CuBr를 완전히 용해시켜 용액으로 제조하고, 상기 용액은 새로운 쉬링크 플라스크로 옮기고, 상기 실시예 1-1에서 제조한 GO-I 0.2 g을 첨가하였다. 이후 쉬링크 플라스크는 60 ℃ 오일 배스(oil bath)로 옮겨 질소(N2) 하에서 48 시간 동안 교반하여 PtBA-그래프티드 GO(PtBA-grafted GO; GO-PtBA)를 수득하였다.
상기 GO-PtBA는 에틸렌디아민 테트라 아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid) 수용액으로 세척하고, 테트라하이드로피란(THF; tetrahydropyran)에 용해시키고 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 상기 침전물은 60 ℃에서 24 시간 동안 진공 건조하고, 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid) 및 다이클로로메테인(DCM; dichloromethane)의 혼합물(1:5, v/v)에 첨가하고 25 ℃에서 24 시간 동안 가수분해하여 가수분해 용액을 수득하였다. 상기 가수분해 용액은 회전농축기(Rotavapor)를 이용하여 용매를 제거하여 폴리아크릴산으로 기능화된 그래핀옥사이드(graphene oxide functionalized with polyacrylic acid; GO-PAA) 나노입자를 수득하였다.
실시예 2. GO - PAA 나노입자에 단백질 부착
실시예 1에서 수득한 GO-PAA를 0.5 ㎎/㎖ 농도로 PBS(pH7.4)에 용해한 GO-PAA 용액을 제조하였다. 이후 상기 GO-PAA 용액 5 ㎖를 2 ㎖의 BSAFITC 용액(1 ㎎/㎖)과 혼합하고 25 ℃의 암실에서 24 시간 동안 교반하였다. 이후 GO-PAA에 부착되지 않은 BSAFITC은 0.2 ㎛의 나일론 필터(nylon filter)를 이용한 여과를 통해 제거하였고, BSAFITC가 부착된 GO-PAA(GO-PAA-BSAFITC)는 물에 분산시키고 암실에서 3일 동안 물로 투석(dialyze)하였다. 이후 GO-PAA-BSAFITC는 4 ℃ 암실에 정치하였다.
실험예 1. 제조한 나노입자의 분석
준비예 2에서 제조한 GO, 실시예 1-1에서 제조한 GO-I 및 실시예 1-2에서 제조한 GO-PAA는 FT-IR, 1H NMR, TGA, AFM, DLS 및 제타포텐셜을 측정하였다(사용한 장비 또는 방법은 준비예 2 참조). 측정한 1H NMR 결과는 도면 1에, FT-IR은 도면 2에, TGA는 도면 3에, DLS 및 제타포텐셜는 도면 4에, AFM 결과는 도면 5에, 및 GO와 GO-PAA의 높이 프로파일은 도면 6에 나타냈다.
도 1에서 확인되는 바와 같이, GO-PAA 스펙트럼에서 PAA 피크는 작은 ppm으로 이동했고, 디아미노프로판(diaminopropane; d) 및 원자 전달 라디칼 중합 개시제(atom transfer radical polymerization initiator; ATRP initiator; c) 양성자의 피크를 확인할 수 있었다. 또한, 폴리머 피크의 유의미한 이동은 그래핀에 존재하는 반자성체 고리(diamagnetic ring)의 영향에 의한 것으로 사료된다.
이를 통해, GO에 PAA가 효과적으로 그래프팅된 것을 알 수 있었다.
도 2에서 확인되는 바와 같이, PAA의 스펙트럼인 (a)는 3500 ㎝-1에서 O-H 스트레칭(stretching), 2925 ㎝-1에서 C-H 스트레칭, 1704 ㎝-1에서 C=O 스트레칭, 1418 ㎝-1에서 C-O-H 밴딩, 1240 ㎝-1에서C-O 기본 스트레칭 및 803 ㎝-1에서 O-H 밴딩 바이브라이션(bending vibrations)을 확인할 수 있었다.
또한, GO-I의 스펙트럼인 (b)에서는 3430㎝-1에서 -NH 스트레칭(non-hydrogen bonded), 2950㎝-1에서 메틸 및 메틸렌 그룹의 C-H의 대칭적이고(symmetric) 비대칭적인(asymmetric) 결합, 2740㎝-1에서 -N-(CH2)2 그룹의 -C-H 스트레칭, 1480㎝-1에서 메틸(methyl) 및 메틸렌(methylene) 그룹의 -C-H 밴딩(bending), 1180㎝-1에서 지방족(aliphatic) C-N 스트레칭(stretching), 1037 ㎝-1에서 C-O 스트레칭(stretching) 및 805 ㎝-1에서 N-H 심한 진동(rocking vibration)을 확인할 수 있었다. 나아가, 1640 ㎝-1에서 아미드(amide; -C(O)NH-) 스트레칭 바이브레이션(stretching vibration)은 GO의 작용기와 ATRP 개시제 사이의 반응에 의해 형성된 2º 아미드 I 본드의 존재를 확인할 수 있었다.
더불어, GO에 PAA를 그래프팅한 후, GO-I와 PAA 사이의 피크 특징은 파장길이가 긴 곳에서 많은 이동이 있었으며, 이를 통해 GO에 PAA가 잘 그래프팅된 것을 확인할 수 있었다. 예를 들면, GO-I의 스펙트럼의 1640 ㎝-1에서 확인할 수 있었던 아미노 I C=O의 결합은 GO-PAA의 스펙트럼(c)에서 1661 ㎝- 1으로 이동하였다.
도 3는 GO, GO-I, GO-PAA의 열적 안정성을 TGA를 통해 확인한 결과이다. 이의 결과인 도 3 에서 확인되는 바와 같이, GO의 열기록도(thermogram)(a)에서 100 ℃ 이하에서 질량 손실은 GO의 파이(pie)-결합된 구조에서 물의 기화에 의한 것으로 예상된다. 또한, 200 ℃부터 시작되는 급격한 질량 손실(약 60 질량%)은 불안정한 산소를 포함하는 그룹의 열분해에 의한 것으로 판단된다.
나아가, 300 ℃에서 GO-I(b)의 질량 손실이 GO(a)보다 큰 것은 ATRP 개시제의 손실 때문으로 판단된다.
게다가, GO-PAA의 열기록도(c)는 150 ℃, 225 ℃ 및 350 ℃에서 3단계의 열화(degradation)를 보이며, 이는 흡수된 수분의 손실 및 사이드 체인 및 그래프트된 PAA의 고분자 기본 구조의 열 열화에 기인한 것으로 판단된다.
더불어, 400 ℃ 이상에서의 GO-PAA 및 GO-I의 질량 손실 차이는 GO에 그래프팅된 PAA의 양이 GO-PAA의 약 35 질량%에 해당하는 것을 확인할 수 있는 자료이다.
도 4는 pH 민감형 GO-PAA의 유체역학 사이즈(hydrodynamic size)와 표면 변화는 DLS 및 제타포텐셜 측정으로 특정하였다. 이의 결과인 도 4에서 확인되는 바와 같이, GO-PAA의 유체역학 사이즈는 pH의 증가와 함께 계속 증가하는데, 이는 운반되는 PAA의 증가에 기인한 것으로 판단된다. 또한, GO-PAA의 제타포텐셜은 pH가 증가하면서 계속 감소하고, PAA의 pKa 값보다 pH가 높아지는 pH 4.7부터 GO-PAA의 제타포텐셜은 음수로 변한다.
이 결과는 낮은 pH에서 PAA의 카르복실(carboxyl) 그룹의 프로톤 부가(protonation)는 체인 수축 및 입자 크기의 감소를 유발하고, 높은 pH에서 탈양성자화 작용(deprotonation, 이온화(ionization))은 원자들 결합 사이의 정전기의 반발 상호작용(electrostatic repulsive interaction)을 통해 결합 스트레칭을 유발한다.
도 5에서 확인되는 바와 같이, GO-PAA의 뭉툭한 끝은 GO의 날카로운 끝과 비교하면, GO 표면을 고분자인 PAA가 잘 감싸고 잡고 있는 것을 확인할 수 있다.
도 5 내지 6에서 확인되는 바와 같이, GO는 플레이틀럿(platelet)로 측면 길이는 약 1 ㎛이고, 두께는 약 1 ~ 2 ㎚인 것을 확인할 수 있었다.
도 6에서 확인되는 바와 같이, GO 보다 GO-PAA의 두께는 약 5.7 ㎚로 증가하였고 측면 길이는 약 100 ㎚로 감소하였다. GO-PAA의 두께 증가는 GO 표면에 PAA가 잘 그래프팅된 것을 보여주는 수치이며, GO-PAA의 측면 길이 감소는 ATRP 상태 또는 GO-PAA의 합성 반응 동안의 초음파 처리에 기인한 것으로 판단된다.
실험예 2. 단백질 결합 전 후의 GO - PAA 변화 측정
검량선(calibration curve)을 이용하여 GO-PAA에 부착된 단백질(BSAFITC)을 측정하기 위해, BSAFITC는 250 ~ 2500 ㎍/㎖의 농도로 물에 용해시킨 후 각 농도별 BSAFITC 용액의 UV-Vis 흡광도(absorbance)를 277 ㎚에서 측정하였다. 이후 상기 각 농도별 BSAFITC 용액의 UV-Vis 흡광도는 검량선(calibration curve)으로 이용하였다.
GO-PAA에 부착된 단백질(BSAFITC) 측정을 위해, 상기 각 농도별 BSAFITC 용액 2 ㎖을 0.5 ㎖의 GO-PAA 용액(실시예 1에서 수득한 GO-PAA을 1 ㎎/㎖ 농도로 물에 용해시킨 용액)으로 옮긴 후 25 ℃에서 24 시간 동안 교반하고 필터링하여 여과물을 수득하였다. 상기 여과물의 BSAFITC 농도는 상기 검량선을 이용하여 측정하였다. GO-PAA 부착된 BSAFITC의 양은 각기 다른 농도의 BSAFITC 용액을 이용 전 및 후의 차이에 의해 측정하였다. 측정한 UV-vis는 도면 7에, BSAFITC 농도 변화에 따른 GO-PAA에 결합되는 BSAFITC 변화를 측정한 그래프는 도면 8에 나타냈다.
도 7에서 확인되는 바와 같이, BSAFITC의 UV-vis 스펙트럼은 GO-PAA에 결합되기 전의 276 ㎚에서 BSA 및 490 ㎚에서 FITC의 흡광도 피크를 확인할 수 있다.
또한, GO-PAA의 UV-vis 스펙트럼은 특정 피크 없이 파장의 길이 증가에 따른 흡광도 감도를 확인할 수 있다.
나아가, GO-PAA-BSAFITC의 UV-vis 스펙트럼은 BSAFITC와 같은 피크를 보였으며, GO-PAA 스펙트럼과 겹쳤을 때 흡광도 강도는 감소하였다. 게다가, BSAFITC의 486.5 ㎚에서 FITC 피크는 GO-PAA-BSAFITC에서 491.2 ㎚로 이동하였으며, 이는 GO-PAA에 형광염색 단백질인 BSAFITC가 잘 결합하였음을 나타내는 것이다.
도 8에서 확인되는 바와 같이, BSAFITC 농도의 증가로 인해 GO-PAA에 결합되는 BSAFITC의 양은 BSAFITC 농도가 1500 ㎍/㎖ 이상에서 포화상태인 95%에 도달하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 포화상태는 통상적으로 사용되는 나노 전달체(예를 들면 리포좀)의 포화상태인 64 ~ 75 %보다 높은 수치로, 상기 결과는 본 발명의 GO-PAA가 종래 나노 전달체들보다 많은 양의 단백질을 결합할 수 있어 단백질 전달체로서 보다 향상된 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 3. pH 변화에 따른 단백질 방출 효과 측정
실시예 1에서 제조한 GO-PAA-BSAFITC로부터 BSAFITC가 방출되는 것을 측정하기 위해, 실험예 2에서 수득한 여과물을 투석 튜브(dialysis tube)에 넣고 pH 3, pH 7.4 또는 pH 8의 2 ㎖ GO-PAA-BSAFITC 용액(BSAFITC 1.4 ㎍/㎖을 포함하는 용액)에 담궈두고 37 ℃에서 3일 동안 봉인해두었다. 상기 투석 튜브를 통해 방출된 투석물(Dialyzate) 2 ㎖는 일정한 시간 간격을 두고 채취한 후 각각 2 ㎖의 물을 첨가하였다. 투석물에 포함된 BSAFITC양은 상기 검량선을 이용한 UV-vis 스펙트라 분석법을 이용하여 측정하였다. 측정한 UV-vis 스펙트럼은 도면 9에 나타냈으며, 이는 친수성 약제 전달체로서 GO-PAA의 가능성을 평가한 실험으로 pH 3, pH 7.4 또는 pH 8에서 GO-PAA에 결합된 단백질을 보여준다.
도 9에서 확인되는 바와 같이, 위(stomach)의 pH와 유사한 pH 3에서는 3일 동안 GO-PAA에 결합된 단백질의 양이 거의 변하지 않는 것을 확인할 수 있으며, 세포 사이의 공간에서 몸 속 pH와 유사한 pH 7.4에서는 3일 동안 약 20 %의 단백질이 손실되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 창자(intestine)의 pH와 유사한 pH 8에서는 3일 동안 약 80 %의 단백질일 손실되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 친수성 약제에 대한 나노 전달체로서 GO-PAA는 위장에서는 결합된 단백질을 배출하지 않아 친수성 약제의 위장 통과를 용이하게 하는 나노 전달체인 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4. GO - PAA 에 결합된 단백질 안정성 평가
4-1: SDS - PAGE 측정
0.125% 트립신 수용액에 1.4 ㎍/㎖ 농도의 BSAFITC 용액 0.5 ㎖ 또는 GO-PAA-BSAFITC 용액(1.4 ㎍/㎖의 BSAFITC를 포함하는 용액) 0.5 ㎖을 첨가하고, 37 ℃에서 1시간, 3 시간 또는 6 시간 동안 반응을 진행하였다. 상기 반응 이후 수득한 반응물은 10 분 동안 100 ℃로 가열하여 반응을 멈춰 트립신으로 소화시킨 GO-PAA-BSAFITC을 수득하였다. 상기 트립신으로 소화시킨 GO-PAA-BSAFITC은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 소화되지 않은 BSAFITC의 양을 측정하였다. 측정한 SDS-PAGE 결과는 도면 10에 나타냈다.
도 10은 GO-PAA에 결합한 BSA의 안정성은 같은 농도의 BSA의 안정성과 SDS-PAGE를 통해 측정한 결과이며, 상기 SDS-PAGE는 소화되지 않은 BSA의 밴드 및 이의 양을 밴드의 강도로 확인할 수 있다. 이를 통해 확인되는 바와 같이, GO-PAA-BSAFITC에 대한 BSA 밴드는 뚜렷하게 나타나는데, 이는 대조군(트립신을 첨가하지 않은 순수 BSA를 측정한 결과)과 유사한 결과이다.
반면, BSAFITC에서는 트립신 첨가 1시간 이후 트립신에 의해 BSA가 완전히 소화되어 이후 6 시간까지 밴드가 확인되지 않는 것을 알 수 있었다.
4-2: pH 변화에 따른 결합 단백질의 변성 측정
상기 실험예 4-1에서 트립신으로 소화시킨 GO-PAA-BSAFITC 또는 순수 BSAFITC을 pH 3, pH 7.4 또는 pH 8에서 제타 포텐셜을 측정하였으며, 결과는 하기 표 1에 나타냈다.
Figure 112013114502854-pat00001
상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, pH 3, pH 7.4 및 pH 8 모두에서 GO-PAA-BSAFITC의 제타포텐셜이 순수 BSAFITC와 유사한 값으로 측정되었으며, 이는 GO-PAA에 결합된 단백질이 변성되지 않은 것을 나타내는 결과이다. 또한, 상기 결과는 GO-PAA에 결합된 단백질을 GO-PAA가 효소로부터 잘 보호하는 것을 나타내는 것이며, 본 발명의 GO-PAA가 전달한 단백질의 생물학적 활성이 유지되는 것을 확인할 수 있는 결과이다.
따라서, 본 발명의 GO-PAA는 효소로부터 결합된 단백질을 잘 보호하며 결합된 단백질의 생물학적 활성을 변성시키지 않아 단백질 전달체로서 뛰어난 역할을 수행할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 5. 세포독성 측정 및 세포의 흡수 측정
5-1: 세포독성 측정
본 발명의 GO-PAA의 생체적합성(biocompatibility)을 평가하기 위해, 정상 세포 주인 섬유아세포 세포 주(fibroblast cell line)를 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection)로부터 구매하고, 10% FBS 및 DMEM를 포함하는 배지에서 37 ℃, 5% CO2, 95% 상대습도 조건에서 배양하였다. 이후 배양한 세포는 MTT 어세이를 수행하였다. 상기 MTT 어세이는 포르마잔(formazan)을 이용한 세포의 미토콘드리아 의존적인 환원반응(mitochondrial-dependent reduction)에 바탕을 둔 MTT 어세이(assay)를 이용하였으며, 이를 통해 세포 생존력을 측정하였다.
구체적으로, 배양한 세포는 24-웰 플레이트에 3 × 104 unit/well로 분주하고, 24 시간 동안 배양하고, GO-PAA를 10 ㎎/L의 농도로 PBS에 분산시킨 용액 100 ㎕를 포함하는 새 배지에 1일, 3일 또는 5일 동안 접종했다. 각 웰 당 100 ㎕의 MTT를 첨가하고 물에 용해되지 않는 포르마잔이 형성을 위해, 37 ℃에서 4시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 웰들의 상청액(supernatant)을 흡인(aspiration)으로 제거하고, 침전된 세포들은 PBS로 3번 세척하였다. 세척한 세포들 중 보라색 포르마잔 결정들은 0.04 N HCl-이소프로판올(isopropanol) 500 ㎕에 용해하여 포르마잔 용액을 수득하였다.
상기 포르마잔 용액 중 상청액 100 ㎕를 제거하고 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 이후 키네틱 마이크로플레이트 리더(kinetic microplate reader; EL 9800, Bio-Tek, Instruments, Inc, and Highland Park, USA)를 이용하여 570 ㎚에서 광학밀도(optical density)를 측정하였다. 또한, 세포 생존력(%)은 하기 수학식 1로 계산했다. 하기 수학식 1에서 Atest는 GO-PAA를 포함하는 웰의 흡광도이고, Acontrol는 GO-PAA를 포함하지 않는 웰의 흡광도이며, 각 웰의 흡광도는 8개 웰의 흡광도의 평균을 사용하였다. 측정 및 계산한 세포생존력 결과는 도면 11에 나타냈다.
Figure 112013114502854-pat00002
도 11에서 확인되는 바와 같이, GO-PAA를 첨가한 실험군과 GO-PAA를 첨가하지 않은 대조군의 세포생존력은 배양 5일까지 유사하게 나타냈다. 이 결과는 섬유아세포의 증식 및 생존력에 GO-PAA가 영향을 미치지 않는 것을 확인한 것이며, 이를 통해 본 발명의 GO-PAA는 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인한 결과이다.
5-2: 세포의 흡수 측정
세포의 흡수 측정을 위해, 암세포주인 KB 셀은 100 ㎕ BSAFITC(1.4 ㎍/㎖) 또는 100 ㎕ of GO-PAA-BSAFITC(0.5 ㎎/㎖의 GO-PAA-BSAFITC 및 1.4 ㎍/㎖의 BSAFITC을 포함)에서 37 ℃ 또는 4 ℃에서 24시간 동안 배양하고, PBS 버퍼로 세척하였다. 이후 콘포칼 현광현미경(Confocal fluorescence microscopy; CFM; Carl Zeiss, LSM700, Germany)을 이용하여 세포 이미지를 관찰하여 도면 12에 나타냈다.
도 12a는 37 ℃ 27 시간 동안 GO-PAA-BSAFITC을 포함하여 배양한 것이고, 도 12b는 37 ℃ 27 시간 동안 BSAFITC을 포함하여 배양한 것이고, 도 12c는 4 ℃ 27 시간 동안 GO-PAA-BSAFITC을 포함하여 배양한 것이다.
도 12a 내지 12b에서 확인되는 바와 같이, 작은 형광을 보이는 BSAFITC(도 12b)와는 대조적으로 GO-PAA-BSAFITC은 보다 명확한 형광 녹색을 확인할 수 있었다.
또한, GO-PAA에 의해 BSA는 엔도좀(endosome) 및 세포질(Cytoplasm)로 운반되며, 운반된 BSA는 세포에 분산되는데, 이때의 작용기작을 명확히 하기 위해 낮은 온도(4 ℃)에서의 배양을 수행하였다.
도 12c에서 확인되는 바와 같이, 4 ℃에서의 배양한 세포의 활성이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이를 도 12a와 비교하여 보면, 4 ℃에서의 배양한 세포가 37 ℃에서 배양한 세포보다 GO-PAA-BSAFITC의 흡수가 감소한 것은 엔도시토시스 (endocytosis)가 주요 흡수 메커니즘임을 보인 결과이다.
상기 실시예 및 실험예를 통해 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 GO-PAA는 단백질 전달체로서 위장에서는 운반하는 단백질을 잘 보호하며, 창자에서 운반 단백질을 방출하여 단백질 전달체로서 유용하게 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 GO-PAA는 결합한 단백질을 효소로부터도 잘 보호하며, 결합한 단백질의 생물학적 활성도 저하하지 않아 탁월한 단백질 전달체인 것을 알 수 있었다. 나아가, 본 발명의 GO-PAA는 세포독성이 존재하지 않아 세포의 증식 및 생존에 영향을 끼치지 않으며, 이로 인해 생체에 사용하기 적합한 것을 확인할 수 있었다.

Claims (15)

  1. 폴리아크릴산(polyacrylic acid; PAA)가 그래프팅(grafting)된 그래핀옥사이드(graphene oxide; GO)를 포함하는 단백질 전달용 나노 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 그래핀옥사이드는 평균 직경 50 ~ 1,000 ㎚인 것을 특징으로 하는 단백질 전달용 나노 복합체.
  3. 제1항에 있어서, XYZ 좌표 상에서, 상기 나노 복합체는 XY, YZ 및 XZ면에 의하여 잘린 단면 중 가장 큰 면적인 단면의 장축의 평균이 50 ~ 200 ㎚인 것을 특징으로 하는 단백질 전달용 나노 복합체.
  4. 제1항에 있어서, XYZ 좌표 상에서, 상기 나노 복합체는 XY, YZ 및 XZ면에 의하여 잘린 단면 중 가장 작은 면적인 단면의 단축의 평균이 1 ~ 10 ㎚인 것을 특징으로 하는 단백질 전달용 나노 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단백질 전달용 나노 복합체는 그래핀옥사이드와 폴리아크릴산의 혼합비가 1: 1 ~ 10 중량비인 것을 특징으로 하는 단백질 전달용 나노 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단백질 전달용 나노 복합체는 pH 3 ~ 4일 때 평균 유체역학 사이즈(hydrobynamic size)가 190 ~ 220 ㎚이고, pH 7 ~ 8일 때 평균 유체역학 사이즈가 120 ~ 170 ㎚인 것을 특징으로 하는 단백질 전달용 나노 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 단백질 전달용 나노 복합체에 친수성 약리활성 단백질인 BSAFITC(fluorescein isothiocyanate-labeled bovine serum albumin)를 로딩(loading)한 약리활성 단백질 전달체.
  8. 제7항에 있어서, 체내의 창자(intestine)에서 약리활성 단백질 전달체로부터 상기 친수성 약리활성 단백질을 방출시켜서, 상기 친수성 약리활성 단백질이 약리활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약리활성 단백질 전달체.
  9. 제7항에 있어서, 상기 약리활성 단백질 전달체는 단백질 전달용 나노 복합체 100 중량부에 대하여 1 ~ 250 중량부의 친수성 약리활성 단백질이 로딩되는 것을 특징으로 하는 약리활성 단백질 전달체.
  10. 제7항에 있어서, 상기 약리활성 단백질 전달체는 pH 3에서 로딩된 친수성 약리활성 단백질의 방출되지 않고, pH 7 이상에서 로딩된 친수성 약리활성 단백질이 방출되는 것을 특징으로 하는 약리활성 단백질 전달체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 약리활성 단백질 전달체는 pH 7.3 ~ 7.5에서 1 ~ 3일 동안 로딩된 친수성 약리활성 단백질의 10 ~ 25 중량%가 방출되는 것을 특징으로 하는 약리활성 단백질 전달체.
  12. 그래핀옥사이드 및 극성 유기용매를 혼합하여 혼합물을 제조하고, 초음파 처리하는 단계;
    상기 초음파 처리된 혼합물, 활성화제 및 비극성 용매를 혼합하고, 계면활성제를 첨가하여 계면활성된 그래핀옥사이드를 수득하는 단계;
    상기 계면활성된 그래핀옥사이드 및 촉매를 혼합 및 교반하여 촉매가 그래프팅된 그래핀옥사이드를 수득하는 단계;
    상기 촉매가 그래프팅된 그래핀옥사이드를 무극성 용매에 용해하고 원심분리하여 침전물을 수득하는 단계; 및
    상기 침전물을 가수분해하고 용매를 제거하여 폴리아크릴산이 그래프팅된 그래핀옥사이드를 수득하는 단계;를 포함하며,
    상기 비극성 용매는 톨루엔(toluene) 및 트리에틸아민(triethylamine)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고,
    상기 활성화제는 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide), N-(3-(디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-(dimethylamino) propyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 및 1,3-디아미노피로판(1,3-Diaminopropane)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하며,
    상기 촉매는 CuBr, N,N,N',N',N''-펜타메틸디에틸렌트리아민(N,N,N',N',N''-pentamethyldiethylenetriamine) 및 터트-부틸 아크릴레이트(Tert-butyl acrylate)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고,
    상기 무극성 용매는 테트라하이드로피란(THF; tetrahydropyran)을 포함하며,
    상기 극성 유기용매는 디메틸포름아미드(DMF; dimethylformamide) 및 테트라하이드로피란(THF; tetrahydropyran)로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하고,
    상기 계면활성제는 2-브로모-2-메틸프로피오닐 브로마이드(2-bromo-2-methylpropionyl bromide)을 포함하며,
    상기 용매는 트리플루오로아세트산 및 다이클로로메테인의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 전달용 나노 복합체 제조방법.
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