KR101540517B1 - 액티노바실러스 숙시노게네스 균체 재순환 연속배양 방식에 의한 숙신산 연속생산 공정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 이용한 균체재순환 연속식 발효공정에 대한 것으로써, 균체재순환 시 숙신산의 생산량은 약 60 g/L로 나타났고 생산성은 시간당 3.873 g/L의 숙신산 생산량을 갖는 것을 확인하였다. 균체의 재순환 발효공정은 일반적인 연속배양에 비하여 균체는 2배이상, 숙신산 생산량은 5배가량 높았으며 숙신산의 생산성에 있어서는 8배 이상 증가하는 것을 확인 하였다. 이러한 고 생산성, 고수율의 숙신산 생산 공정은 기존의 회분식 배양에 비하여 생산단가를 절감 할 수 있을 뿐 아니라 배양 단위의 대규모화를 하지 않고도 파일럿 규모에서도 산업화 단계 수준으로 생산을 가능하게 해준다. 따라서 본 발명의 공정을 도입 했을 경우 산업화로의 적용이 더욱 유리할 것으로 전망된다.

Description

액티노바실러스 숙시노게네스 균체 재순환 연속배양 방식에 의한 숙신산 연속생산 공정 {A method for the mass production of succinic acid by use of Actinobacillus succinogenes through the application of cell-recycled continuous fermentation process}

본 발명은 고분자 원료 등 화학제품, 청량음료, 조미료, 염료, 향료 등에 사용되는 숙신산을 고효율로 생산할 수 있는 발효공정에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명의 발효공정은 다양한 조건의 연속식 배양 발효 공정으로써 기존의 회분식 배양보다 숙신산의 생산량이 증가하는 숙신산의 대량 생산방법에 관한 것이다.

숙신산(succinic acid)은 곧은 사슬 디카르복시산 나트륨염(HOOC-CH₂CH₂-COOH)은 조개류의 맛성분으로 조미료로 사용된다. 1550년 R. 아그리콜라가 화석(化石)이 된 수지인 호박(琥珀)을 건류하여 얻었다는 기록이 있는 데서 호박산이라고도 한다. 무색의 주상 또는 판상 결정으로 분자량 118.09, 녹는점 185℃, 끓는점 235℃, 비중 1.564이다. 또한 TCA회로의 일원인 주요 유기산으로 카르복시산의 일종이다. TCA회로에서 숙신산이 생성되는 단계는 알파케토글루타르산이 탈수소화, 탈카르복시화되어 숙시닐조효소A(succinyl Co-A)를 형성한 후 다시 숙신산으로 전환되여 생성되며, 숙신산은 숙신산탈수소효소에 의해 푸마르산으로 산화된다.

화학적 합성법과 미생물 발효에 의하여 생산이 가능한 숙신산 중에서 의약품, 식품의 첨가제 및 보존제 등 특수한 용도로 사용되는 소량의 숙신산만이 미생물 발효법에 의하여 생산되고 있다. 반면에 산업적으로 사용되는 대부분의 숙신산은 미국, 유럽, 일본 및 중국의 거대 화학회사들에 의하여 원유나 액화천연가스에서 유래한 n-부탄(butane)과 아세틸렌(acetylene)으로부터 합성되고 있다. 일반적으로 화학적 숙신산 합성공정은 제조과정에서 유해성 고형폐기물, 폐용액 및 폐가스(일산화탄소 포함) 등을 다량 배출한다는 문제점을 가지고 있을 뿐 아니라 자원의 고갈 가능성이 높은 화석원료를 기초물질로서 사용함으로 이를 대체할 미생물을 이용한 숙신산 생산방법에 대한 연구개발이 시급한 실정이다. 또한 유가상승으로 인해 생산원가가 지속적으로 증가하고 있으므로 생산 공정의 대체가 시급하여 곡물로부터 생산될 수 있는 생물학적 숙신산 생산이 관심의 대상이 되고 있다.

숙신산은 의약, 식료품, 석유화학공정에서의 여러 분야에 걸쳐 적용될 수 있는 C4계열의 유기산으로써, 미 에너지성에서 미래 10대 중요한 물질로 선정한 바 있다. 최근 발효기술의 발전으로 수소치환을 통하여 생산하던 기존의 프로세스를 대체할 수 있는 수준에 이르렀으므로 세계적으로 많은 연구가 진행되고 있다. 또한 연간 20조원 규모 이상의 국제적 시장이 형성되어 있어 그 가치가 매우 높다 할 수 있다.

배양의 형식으로서는 미생물의 성질에 따라 일반적인 호기성 발효과 알콜발효로 대표되는 혐기성 발효로 나눌 수 있으나, 배지의 상태에 따라서는 액체배양과 고체배양으로 조작상으로 회분배양과 연속배양으로 각각 분류할 수 있다.

회분배양(回分培養, Batch culture)이란 발효조를 사용하여 배양의 경과에 따라 배지성분이 감소되어 주요 기질이 완전히 소비될 때까지 배양을 계속하고 미생물의 증식과 목적생산물을 축적하는 폐쇄반응의 일종이며 발효공업에서 가장 일반적으로 이용되고 있는 방법이다. 접종 후 유도기, 대수생장기, 정상기, 생장감속기 및 정지기의 5단계로 나뉜다. 세포배양시 정상기의 세포를 새로운 배지에 종균후 다시 생장주기를 반복한다. 배양과정에서 배지성분이나 세포밀도가 변화해서 세포 환경이 일정하지 않으며 생산성이 낮은 결점이 있지만 연속배양에 비하여 장치나 방법이 간편하기 때문에 자주 사용된다.

유가배양(流加培養, Fed-batch culture)이란 증식에 대햐여 제한인자로 되어 있는 기질을 소량씩 계속 공급하면서 일정하게 저농도로 유지하는 배양법이며, 배양에 적합한 환경을 계속 조절할 수 있는 장점이 있다. 일반적으로 유가배양은 증식을 저해하는 기질을 원료로하는 경우 Feeding 속도를 조절하거나, 기질농도가 높아지면 catabolite 억제 등 조절기구에 의해 생산성이 저하되는 경우 또는 영양요구성 변이주를 이용하는 경우 요구성 영양물질의 공급을 조절하여 Feedback 조절을 방지하는 경우에 사용된다. 다만 유가배양은 최적조건을 조절하거나 적절한 Feed rate을 유지하기 곤란하여 Dilution rate이 급격히 감소할 수 있어 배양의 조절이 힘들다는 단점이 있다.

연속배양(連續培養 , continuous culture)이란 연속적으로 배양액을 발효조 안에 공급하고 동시에 같은 양의 배양액을 유출시킴으로써 정상상태를 유지하면서 미생물을 배양하는 방법으로서, 케모스탯(chemostat)은 영양액의 탄소원이나 질소원 등을 증식 제한 기질로 하여 미생물의 증식을 제어하는 방법이며, 타비드스탯(turbidostat)은 미생물 농도를 일정하게 유지하도록 배치를 계속적으로 공급·유출시키는 방법이다.

연속배양은 일단 배양의 정상상태가 확립되면 정상상태에서 반응이 이루어지며, 정상상태에 도달 한 후에는 세포, 산물, 기질의 농도가 일정하게 유지되고, 자동제어, 운전조작의 표준화와 자동화가 가능하며 노동력이 절감되는 효과가 있고 가장 큰 장점으로는 정상기의 시간을 연장하고 유도기, 정지기 등의 시간을 최소화할 수 있어 생산성이 매우 크다는 매력이 있다.

그러나 현재의 연속배양 공정은 공급되는 액량의 속도를 펌프로 조절함으로써 세포 비 성장속도를 인위적으로 고정시킬 수 있다는 것에 큰 장점이 있다. 본 발명은 여기에 더하여, 생산균주의 생리학적 특성을 이용하여 소량의 탄산이온 농축액을 유가식으로 첨가해주는 공정을 추가함으로써, 한계희석속도의 극복, 숙신산 생산량의 증가 등을 시도하고자 하였다. 또한 연속식 배양을 통한 발효 공정은 회분식 배양에 비해 작은 규모의 공정으로 회분배양만큼 생산할 수 있어, 발효조의 규모를 효율적으로 낮추고 따라서 생산단가의 절감을 가져옴으로써 산업화에서의 시장 내 경쟁력을 갖추게 해준다.

그러나 연속배양은 한가지 생성물만을 위한 공정체계이며, 잡균의 비증식속도가 생산균주의 비증식속도보다 큰 것이 일반적이므로 잡균에 오염되면 생산균주가 잡균으로 대체될 위험이 있으며, 개량균주의 경우 유전형질이 변형되어 복귀변이주가 발생할 수 있으며 복귀변이주의 비증식속도가 크다면 생산량이 매우 감소하는 결과가 발생한다. 또한 공정비용 면에서 Product농도가 낮아 분리 회수비용이 증가하는 문제가 있다.

또한 회분식 또는 유가배양식은 규정된 크기의 반응조에서 생산성이 낮다. 즉 회분식 또는 유가식 배양은 전술한 바와 같은 여러 단계의 공정을 거치기 때문에, 비효율적이므로 문제점을 극복하고자 연속배양을 선택하여 고생산성을 달성할 수 있으나, 미생물을 고정화시키는 방식을 사용할 경우에는 미생물의 과다발현으로 인하여 막힘 현상일 발생할 수 있다.

따라서 대부분의 발효공정은 고정화보다는 부유배양(suspension)으로 생산물을 제조하는 방법을 이용한다. 그러나 이러한 부유배양법으로 연속발효를 수행할 경우는 균체의 washout 때문에 생산성을 높이는데 한계가 있다.

한편, 반응기의 단위부피에서 균체의 증식률(dX/dt)은 다음 수식으로 표현할 수 있다.

dX/dt = D(X1-X0) + (μ-kd)X

이때, D는 희석율(dilution rate)이며, X는 균체농도이고, X0는 반응기로 유입되는 균체농도이며, X1은 반응기로부터 유출되는 균체농도이고, μ는 균체의 생성속도이며, kd는 사멸속도이다. 여기서, 균체의 washout을 방지하기 위해서는 (μ-kd)X가 D(X1-X0)보다 커야한다. 그러나 생산성은 DX에 비례하는 바, 균체의 washout을 방지하기 위하여, D를 작게 운전할 경우에 생산성이 저하되게 된다. 따라서, 생산성 향상을 위하여, 반응기에서 유출되는 흐름에서 균체를 회수하는 다양한 방법이 고안되었다.

균체를 회수하는 방법으로는 침전법 또는 다공성 미세섬유(hollow fiber)를 이용하는 여과법 등이 있다. 현재 두 방법 모두 도시하수의 처리에는 사용되고 있으나, 생물공정에서는 각각 느린 침전속도와 막 표면에 미생물이 붙는 현상 때문에 사용되지 못하고 있다. 이때, 생산성을 높이기 위해서는 위의 수식에서 "DX"를 증가시키면서 연속운전을 하여야 하는데, 상기와 같은 이유로 아직까지 고농도 연속배양이 실현되지 못하고 있다.

한국등록특허 10-0301960호

이에 본 발명에서는 미생물을 이용하여 숙신산을 대량생산하기위한 연속배양의 조건을 확립하기 위해 본 발명자들은 포도당(glucose), 효모 추출물(yeast extract) 및 옥수수 침지액(corn steep liquor)을 혼합하여 배지를 제조하는 단계;

악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 배양액에 접종하는 단계;

상기 배양액에 상기 배지를 1~100 ml/hr 속도로 공급하며 악티노바실러스 숙시노게네스를 접종한 배양액을 제거하는 연속배양단계;

상기 배양액에 탄산마그네슘(MgCO3)을 2~4 ml/hr로 공급하는 단계; 및

상기 제거된 배양액에서 악티노바실러스 숙시노게네스를 회수한 후 배양액에 재순환하는 단계를 포함하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 포도당(glucose), 효모 추출물(yeast extract) 및 옥수수 침지액(corn steep liquor)을 혼합하여 배지를 제조하는 단계; 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 배양액에 접종하는 단계; 상기 배양액에 상기 배지를 1~100 ml/hr 속도로 공급하며 악티노바실러스 숙시노게네스를 접종한 배양액을 제거하는 연속배양단계; 상기 배양액에 탄산마그네슘(MgCO3)을 2~4 ml/hr로 공급하는 단계; 및 상기 제거된 배양액에서 악티노바실러스 숙시노게네스를 회수한 후 배양액에 재순환하는 단계를 포함하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 연속생산 방법에 균체 재순환 시스템(cell recycle system)을 이용하여 회수한 악티노바실러스 숙시노게네스를 발효조에 연속적으로 공급하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 연속생산 방법에 10~50 g/L으로 농축한 탄산수소나트륨(NaHCO3)을 2~4 ml/hr의 속도로 공급하는 단계를 더욱 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법에 이산화탄소를 0.4~0.8 vvm의 속도로 폭기(aeration , 曝氣)하는 단계를 더욱 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 포도당은 45~65 g/ℓ; 효모 추출물은 5~8 g/ℓ; 옥수수 침지액은 1~14 g/ℓ인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)는 UK13균주(KCTC 12233BP)인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 포도당은 45~65 g/ℓ; 효모 추출물은 5~8 g/ℓ; 옥수수 침지액은 1~14 g/ℓ; 탄산마그네슘은 1~50 g/ℓ인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 악티노바실러스 숙시노게네스를 회수하는 단계는 배양액을 원심분리, 여과, 침전, 부유, 흡착 또는 막분리하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재순환하는 단계는 배지의 공급속도와 재순환 하는 속도가 1 : 0.5~1 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 탄산마그네슘은 배양개시 후 10~24 g/ℓ 농도이며 배양개시 후 250시간 경과하면 25~35 g/ℓ 농도일 수 있다.

본 발명에 따른 연속배양으로 숙신산을 생산하면 회분식 배양보다 높은 숙신산 생산성을 갖게 되므로 기존의 생산단가에 비해 저렴하게 생산 공정이 진행될 수 있고 또한 본 발명에 따른 숙신산 생산 균주 액상배양용 배지 및 연속배양 공정을 이용한 산업적 규모의 액상 배양을 통하여 석유화학 유도체 및 의약, 식품산업 등에 다양하게 이용되는 숙신산을 저렴한 원가를 통하여 경쟁력 있는 대량 공급이 가능하다.

도 1은 균체 재순환 발효공정과 연속배양을 수행하였을 때 균체량을 비교한 그래프이다.
도 2는 균체 재순환 발효공정과 연속배양을 수행하였을 때 포도당 잔량을 비교한 그래프이다.
도 3은 균체 재순환 발효공정과 연속배양을 수행하였을 때 숙신산 생산량을 비교한 그래프이다.
도 4는 균체 재순환 발효공정과 연속배양을 수행하였을 때 포도당에 대한 균체량의 수율을 비교한 그래프이다.
도 5는 균체 재순환 발효공정과 연속배양을 수행하였을 때 포도당에 대한 숙신산의 수율을 비교한 그래프이다.
도 6은 실제 균체 재순환 발효공정을 수행할 때의 배양을 도시한 것이다.
도 7은 균체 재순환 발효공정을 모식한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 물질을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 물질이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

여기서 사용된 바와 같은 용어 '연속배양'은 바이오리액터에서 연속적인 영양분 공급, 기질 공급, 세포 제조를 포함하는 발효 방법을 말한다. 이 연속 공급, 제거 또는 세포 제조는 동일한 또는 다른 스트림에서 발생할 수 있다. 연속 공정은 바이오리액터 내에서 정상 상태의 달성을 초래한다. '정상상태'란 이들 측정가능한 변수들 모두(즉, 공급 속도, 바이오리액터에서 유지되는 기질 및 영양분 농도, 바이오리액터에서 세포 농도 및 바이오리액터로부터 세포 제거, 바이오리액터로부터 생산물 제거는 물론이고, 온도와 압력과 같은 조건 변수들)가 시간에 걸쳐 일정하다는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

숙신산을 생산하는 데 있어 강력한 발효공정은 연속배양 공정으로 알려져 있는데, 연속배양 공정은 회분식 발효와는 달리 연속적으로 살균된 발효배지를 발효조에 공급하고 미생물과 목적물 등이 혼합된 발효 배양액을 공급되는 액량만큼 발효조 외부로 유출시켜 발효조내의 액량을 일정하게 유지시키면서 미생물을 발효하는 발효방법이다. 다른 이름으로는 키모스탯(chemostat)이라고도 부르는 데, 정상상태 하에서 배양액 내의 화학 양론적 특성이 일정한 공정이기 때문이다.

악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)은 통성혐기성 균주로서 혹위 박테리아(rumen bacteria)의 일종으로 높은 농도의 숙신산(succinic acid)을 생산하는 것으로 가장 주목받고 있는 박테리아 중 하나이다.

본 발명은 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 생산균주로 하여 연속배양을 통해 숙신산을 대량생산하기 위한 시스템인 균체 재순환을 이용한 연속배양 시스템(cell recycling continuous system)에 최적화된 배지 조성물 및 균체 재순환 방법에 관한 것으로서 특히 탄산마그네슘(MgCO₃) 및/또는 탄산수소나트륨(NaHCO₃)를 유가식으로 공급하여 숙신산 대량생산에 관한 조건을 확립하여 숙신산의 연속생산을 가능하게 하는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 재료 및 기구 >

본 발명에 사용한 포도당은 대정, 탄산수소나트륨은 덕산에서 구입하였으며, 효모 추출물, 옥수수 침지액 고형분 및 탄산마그네슘(MgCO₃)은 sigma aldrich에서 구입하여 사용하였다.

< 실시예 >

1. 생산균주( producing strain )

본 발명에 따른 숙신산 생산균주는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입한 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)(ATCC 55618)를 유전자 변형시킨 돌연변이주, UK13균주(KCTC 12233BP)를 사용하였다.

2. 균주의 보존

본 발명자들은 상기 생산균주를 보존한 후 일정량을 분주하여 사용하였으며, 본 발명에 따른 생산균주를 보관하는 배지는 고체배지로서 TSA(tryptic soy agar) 배지(pancreatic digest of casein 15 g, papaic digest of soybean 5 g, NaCl 5 g, 한천(agar) 15 g, 증류수 1ℓ)를 이용하였다.

균주보관은 액상배양을 통해 얻은 균체를 4℃에 보관하거나 20% 글리세롤 stock을 만들어 -80℃에 보관하였고, 필요시 마다 보관된 stock을 꺼내어 고체 계대배양 배지에 접종 후 배양하여 사용하였다.

3. 성장배양 (또는 종균배양) 및 접종

본 발명자들은 숙신산의 생산배양에 앞서 균체의 양을 늘리기 위하여 성장배양을 실시하였으며, 성장배양(종균배양)은 TSB(tryptic soy broth) 배지(pancreatic digest of casein 17 g, papaic digest of soybean 3 g, 덱스트로오스 2.5 g, NaCl 5 g, K₂HPO₄(potassium phosphate dibasic) 2.5 g, 증류수 1ℓ)를 사용하여 활성이 높은 균체를 얻었다.

고체 배지에서 성장한 단일 콜로니를 무균적으로 수거한 후, 이를 액체배지에 1%(v/v)가 되도록 접종하였다. 배양은 2.5L 크기의 교반반응기(stirred tank reactor)에서 1.2 L의 배양부피로 진행되었다. 최초 균체의 성장 배양은 진탕 배양기에서 38, 200 rpm으로 1 내지 2일간 배양하였고, 액상 성장 배양은 50 ml 부피의 유리튜브에 5 ml 조업부피로 수행되었으며 원활한 배양을 위하여 기울여 배양하였다. 1차 성장 배양은 12 내지 15 시간 배양하였으며 그 후 2차 성장 배양은 250 ml 플라스크에서 조업부피 30 ml 농도로 6 내지 12 시간 배양한 후 목적물의 생산을 위해 발효조에 접종하였다.

4. 연속배양방법

본 발명에 따른 액티노바실러스 숙시노게네스 균주를 이용한 숙신산 대량생산을 위한 연속배양은 도7의 모식도에 나타내었다.

본 발명에 따른 미생물배양의 실시는 배양방법에 따라 연속배양, 유가식 배양 또는 연속배양과 유가식 배양의 결합으로 실시할 수 있으며, 세포재순환 시스템(cell recycle system)을 이용하여 세포농도를 높은 수준으로 유지하였다.

본 발명에 따른 일 실시예로서 구체적으로는 먼저 발효조(Bioreactor)에 액체배지를 배양조에 생산균주를 1%의 접종량으로 종균한 후 연속배양을 실시하였으며, 탄산마그네슘 및/또는 탄산수소나트륨은 생산배지에 유가식으로 추가적으로 공급하였다. 또한 제거되는 배양액 중에 존재하는 액티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 여과 및 세척한 후 회수하여 다시 배양조에 공급하며 연속배양을 잰행하였다.

5. 배지( culture medium , 培地 ) 및 배양 조건

본 발명에 따른 성장배양과 생산배양 모두 1%의 접종량으로 접종하였으며 생산배지는 포도당(Glucose) 45 또는 50 g/ℓ, 효모 추출물(Yeast extract) 10 또는 15 g/ℓ, 옥수수 침지액(corn steep liquor) 10 또는 15g/ℓ, 탄산수소나트륨 (sodium hydrogen carbonate : NaHCO₃) 5 g/ℓ 및 탄산마그네슘 (magnesium carbonate : MgCO₃) 20 g/ℓ이 포함 된 생산배지를 사용하여 최초 발효조 내에 공급하는 배지와 연속공급용 배지를 동일하게 하여 배양하였다.

연속공급용 배지와는 별개로 탄산 마그네슘을 10~24 g/L의 농도로 제조하여 3ml/hr의 속도로 유가식으로 공급하며, 탄산수소나트륨은 3~15 g/L의 농도로 제조하여 3ml/hr의 속도로 유가식으로 공급하였다. 또한 배양개시 후 300시간 경과 후부터는 탄산마그네슘의 농도를 25~35 g/L로 증가시켜 3ml/hr의 속도로 유가식으로 공급하였다.

본발명의 배양 조건은 배양액의 pH는 6~7 범위에서 배양하였으며, 온도는 35~40℃사이에서 안정시킨 후 Foam Breaker 및 실리콘소포제로 거품을 제거하면서 배양을 진행하였다.

6. 연속배양의 배양 조건과 조업

본 발명에 따른 연속배양은 상기 서술된 배지를 사용하였고 펌프를 통하여 보내는 배지의 유속은 0~100 ml/hr 사이에서 다양하게 변화시켜 주면서 배양을 진행시켰다. 이때 유속이 0 ml/hr인 경우는 배지의 출입이 없는 회분식 배양이다.

또한 일 실시예로서 균체를 재순환 하는 cell recycle system의 경우에는 재순환되는 펌프의 유속은 배지에서 발효조로 유입되는 살균 배지 유속의 1/2로 조정하여 배양을 진행하였다.

이산화탄소의 폭기는 0.6 vvm(aeration volume/medium volume/minute)의 속도로 폭기 시켜 주었고 수산화나트륨을 이용하여 일정한 수소이온을 유지시키며 배양하였다.

탄산마그네슘 및/또는 탄산수소나트륨 같은 탄산이온을 제공하기 위하여 탄산마그네슘을 10 내지 40 g/L, 탄산수소나트륨을 5 내지 40 g/L의 농도로 농축한 용액을 사용하였으며 연동펌프를 이용하여 3 ml/hr의 속도로 발효조 내로 투입시켰다.

탄산마그네슘이나 탄산수소나트륨과 같은 물에 녹아서 탄산이온을 형성하는 물질을 농축액으로 첨가하는 것은, 생산 균주인 악티노바실러스 숙시노게네스가 숙신산을 생합성에 있어, 이산화탄소의 풍부한 공급이 필수적이기 때문이다. 또한 박테리아는 이산화탄소를 이용하기 위하여 물에 녹아진 탄산이온을 세포막에 존재하는 펌프단백질을 이용하여 손쉽게 능동수송 시키므로, 이러한 논리에 따라 숙신산의 생산성을 늘리기 위하여 탄산이온을 직접 발효조에 첨가시키는 공정을 추가하였다.

7. 균체 재순환( cell recycling system )

본 발명의 연속배양은 상기 실시예에서 제조한 연속배양용 액체배지를 12~24 ml/hr 속도로 공급하면서 동시에 악티노바실러스 숙시노게네스를 배양하는 배양액을 12~24 ml/hr 속도로 제거하였다. 또한 탄산마그네슘과 탄산수소나트륨을 2~4 ml/hr로 유가식 공급하여 배양을 최적화 하면서 연속배양을 실시하였다.

본 발명자들은 높은 균체농도를 유지하기 위해 세포재순환 공정을 부가하여 제거되는 배양에서 생산균주인 악티노바실러스 숙시노게네스를 여과를 통해 회수한 후 세척하여 회수하였다.

회수한 악티노바실러스 숙시노게네스가 포함된 배양액을 6~8 ml/hr 속도로 공급하여 숙신산 생산을 위한 균체의 농도를 높인 상태에서 연속배양을 실시하였다.

< 실험예 1>

1. 숙신산의 정량분석

본 발명자들은 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 배양한 배양액에서 본 발명의 목적 생산물인 숙신산의 정량분석을 위해 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 시료를 채취하고 연속 희석(serial dilution)을 통하여 희석한 다음 0.45 ㎛ 여과지를 이용하여 2번의 여과 과정을 수행한 후, HPLC를 이용하여 다음의 조건으로 분석하였다.

분석 온도: 25℃

유속: 0.8 ㎖/min

이동상: 0.01N H₂SO₄

분석시간: 20분

시료 주입양: 10 ㎕

칼럼: Organic acid column (Bio-Rad, Aminex HPX 87H, 125-0140 )

검출기: UV detector

검출파장 : 210 nm

2. 당분석

배양액 중의 당분석은 배양액을 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하여 12,000 rpm에서 10분간 3회 원심분리를 반복 수행하여 상등액만을 취한 다음 0.45 ㎛ HPLC용 여과지를 이용하여 여과하였다. HPLC를 이용한 당분석 조건은 다음과 같았다:

분석 온도: 40℃

유속: 1.2 ㎖/min

이동상(mobile phase): 아세토니트릴 : 물 = 75 : 25 (v/v)

분석 시간 : 15분

시료 주입양 : 20 ㎕

칼럼 : Amine column (250 ㎜ × 46 ㎜, RS tech)

검출기: RI detector

3. 악티노바실러스 숙시노게네스의 균체량확인

발효조에서 배양되는 배양액을 회수하여 12000 rpm의 속도로 10분간 원심분리를 수행하고 증류수나 saline water로 3번 이상 세척하였다. 후에 100 ℃에서 10~12시간 건조하여 준 후 중량을 측정한다. 또는 회수된 배양액을 균일하게 섞어 준 후 660 nm에서 분광흡도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 균체량은 탁도로 측정할 수 있는데 생산배지 중, 탄산마그네슘이 포함된 배양일 경우 1N 염산을 이용하여 원액을 50배 희석하는 과정을 통하여 탄산마그네슘을 완전히 녹인 후 흡광도를 측정하였다.

4. 균체량 , 숙신산의 생산량, 사용된 포도당에 대한 배양변수의 계산식

연속배양과 균체재순환 발효공정에 적용되는 수식은 아래에 도시되어 있고, 아래의 수식에 사용되는 단어는 다음과 같다.

V :　발효조 부피, F : 유속, D : 희석속도, X : 발효조 내의 균체량, P : 발효조내의 숙신산 생산량, S0 : 최초 포도당 농도, S : 발효조 내의 포도당 농도, α : 재순환 되는 속도의 비, C : 재순환되는 농도의 비율, γX : 시간당 부피당 균체가 자라는 속도 , γS : 시간당 부피당 포도당을 이용하는 속도, γP : 시간당 부피당 숙신산을 생산하는 속도

가. 연속배양의 경우

균체수지는,

기질수지는,

나. 균체재순환 연속배양공정의 경우

균체수지,

기질수지,

위 식을 만족하고, 각각 포도당에 대한 균체, 포도당에 대한 숙신산 생산량, 균체에 대한 숙신산 생산량은 위에 도시해 놓은 것들을 이용하여 아래와 같이 정의할 수 있다.

< 실험예 2 >

균체 재순환공정 유무에 따른 연속배양 공정의 생산성( productivity ) 비교

본 발명자들은 상기 실시예에 따른 균체 재순환 연속배양 공정이 숙신산 생산성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 균체재순환 시스템이 없는 연속배양과 균체재순환 시스템을 부가한 연속배양을 각각 수행한 후 균체량, 포도당 사용량, 숙신산의 생산성을 비교하였다.

1.2 L의 발효조 부피에 배지의 유입속도는 각각 33.7ml/hr, 40.44 ml/hr, 53.88 ml/hr의 속도로 점차 증가시켜 주었으며 재순환 속도는 각각 살균배지 유입속도의 1/2의 속도로 수행되었다.

1. 균체량의 비교

균체재순환 시스템 유무에 따른 연속배양 공정에서 균체량을 분석한 결과 도 1과 표 1에 도시된 것과 같이 펌프를 흘려준 후 30시간째까지는 연속배양과 균체재순환 공정 모두 비슷한 균체량을 보이지만 이후 확연하게 차이가 나면서 재순환 공정의 균체량이 월등히 증가하는 것을 알 수 있다.

연속배양의 경우 균체량이 희석속도 0.0281 /hr의 속도에서 19.078 g/L, 희석속도 0.0337 /hr에서 19.885 g/L, 희석속도 0.0449 /hr에서 21.632로 큰 증가는 없었다

균체 재순환 공정은 희석속도 0.0281 /hr에서 39.325g/L, 0.0337 /hr에서 43.328 g/L, 0.0449 /hr에서 53.806로 증가하는 양상을 나타내었다.

따라서 실험결과 전체적으로 균체 재순환 공정이 연속배양 공정보다 균체량이 약 두배 가량 증가한 것을 알 수 있고 그래프 최종 배출 라인으로 나간 균체량을 확인해 보면 약 65 % 이상의 균체가 다시 발효조로 회수되었음을 알 수 있다.

2. 포도당 사용량의 비교

균체재순환 시스템 유무에 따른 연속배양 공정에서 포도당의 사용정도를 분석한 결과 연속배양과 재순환공정 모두 포도당을 전부 사용하고 있음을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 두 공정 모두 희석속도를 좀 더 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있고, 균체 재순환 공정은 더욱 큰 폭으로 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다(도 2 참조).

3. 숙신산 생산량의 비교

균체재순환 시스템 유무에 따른 연속배양 공정에서 숙신산 생산량을 분석한 결과 숙신산의 생산량은 연속배양공정에서는 정상상태에서 0.281 /hr의 희석속도를 가질 때 12 내지 18 g/L 사이에서 생산량이 분포하고 있는 것을 관찰할 수 있고 평균적으로는 약 14.65 g/L를 생산한 것을 관찰할 수 있었다. 희석속도를 0.0337 /hr 및 0.0449 /hr로 증가시켰을 때에도 숙신산의 생산량의 큰 변화는 없었으며 평균적으로 약 14.7 g/L의 생산량을 나타내었다(도 3, 표 1).

균체 재순환 공정을 부가한 연속배양의 경우 희석속도 0.0281 /hr일 때, 60.173 g/L, 희석속도 0.0337 /hr일 때, 60.580 g/L, 0.0449 /hr에선 57.459인 것으로 나타났고 균체량이 희석속도가 증가함에 따라 증가하였는데 숙신산의 생산량은 소폭 증가하다가 약간 감소한 것으로, 별반 큰 차이가 없는 것으로 보아 희석속도를 좀 더 높여주거나 배지의 농도수준을 좀 더 높일 필요가 있는 것을 알 수 있다.

3. 수율( yield rate , 收率)의 비교

균체 재순환 공정의 유무에 따른 연속배양 공정의 효율성을 확인하기 위해서 수율을 계산하였으며, 각각의 수율을 분석한 결과를 표 1과 함께 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5는 각각 앞서 기술한 균체량, 포도당의 잔량, 숙신산 생산량의 정보를 이용하여 포도당에 대한 균체의 수율, 포도당에 대한 숙신산의 수율을 나타낸 그래프이다.

본 분석은 앞서 도시한 그래프들의 샘플마다 각각 계산하여 나타내었으며, 균체재순환 발효 공정이 연속배양 보다 포도당에 대한 균체의 수율도 전체적으로 약 2배가량 높은 것을 확인하였다(도 4 참조).

포도당에 대한 숙신산의 수율의 그래프에서도 역시 균체재순환 발효공정이 4 내지 5배가량 높은 것을 확인할 수 있었으며 포도당에 대한 숙신산의 수율에서는 희석속도가 증가할 때 수율은 거의 같은 것을 확인하였다(도 5).

전체적인 배양 변수에 관한 결과의 도시는 표 1에 나타내었으며, 분석결과 포도당에 대한 균체의 수율( ; g 균체/ g 포도당)은 균체 재순환 공정에서 희석율이 가장 높은 0.0449/hr 일때 1.196 으로 가장 높았으며, 균체 재순환 공정이 있는 경우 약 3배정도 높은 수율을 나타내는 것을 알 수 있었다.

또한 포도당에 대한 숙신산의 수율 ( ; g 숙신산/ g 포도당)은 균체 재순환 공정간에는 유의미한 차이가 없으나 균체 재순환 공정이 없는 연속배양에 비하면 2.5배 이상 높았다.

또한 균체량에 대한 숙신산의 수율( ; g 숙신산/ g 균체)은 균체 재순환 공정에서 희석율이 가장 낮은 0.0281/hr 에서 1.950 으로 가장 높았으며, 균체 재순환 공정이 있는 경우 약 2배정도 높은 수율을 나타내는 것을 알 수 있었다.

이때 표의 약자는 하기와 같다.

Batch culture : 회분식 배양

Continuous culture : 연속식 배양

Recycled continuous : 균체 재순환 연속식 배양

Steady X : 정상상태에서의 발효조 내 균체량 (g/L)

Steady S : 정상상태에서의 발효조 내 포도당 잔량 (g/L)

Steady P : 정상상태에서의 발효조 내 숙신산 생산량 (g/L)

따라서 수율을 계산한 결과 전체적으로 균체 재순환 공정이 있는 연속배양이 균체 재순환 공정이 있는 연속배양보다 매우 높은 수율을 나타냄으로써 공급한 배지를 효율적으로 사용하면서도 정량적으로도 숙신산을 대량생산하는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

1. 포도당(glucose), 효모 추출물(yeast extract) 및 옥수수 침지액(corn steep liquor)을 혼합하여 배지를 제조하는 단계;
   악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)를 배양액에 접종하는 단계;
   상기 배양액에 상기 배지를 1~100 ml/hr 속도로 공급하며 악티노바실러스 숙시노게네스를 연속배양하는 단계;
   상기 배양액에 탄산마그네슘(MgCO₃) 또는 탄산수소나트륨(NaHCO₃)을 2~4 ml/hr속도로 유가식 공급하는 단계; 및
   상기 배양액에서 악티노바실러스 숙시노게네스를 회수한 후 배양액에 재순환하는 단계를 포함하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법으로,
   상기 연속배양단계는 이산화탄소를 0.4~0.8 vvm의 속도로 폭기(aeration , 曝氣)하며,
   상기 재순환단계는 균체 재순환 시스템(cell recycle system)을 이용하여 회수한 악티노바실러스 숙시노게네스를 발효조에 연속적으로 공급하는 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 탄산수소나트륨(NaHCO₃)은 5~40 g/L 농도인 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법.
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 포도당은 45~65 g/ℓ 농도; 효모 추출물은 5~8 g/ℓ 농도; 옥수수 침지액은 1~14 g/ℓ 농도인 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법.
6. 제1항에 있어서,
   상기 악티노바실러스 숙시노게네스(Actinobacillus succinogenes)는 UK13균주(KCTC 12233BP)인 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 탄산마그네슘은 10~40 g/ℓ 농도인 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법.
8. 제1항에 있어서,
   상기 악티노바실러스 숙시노게네스를 회수하는 단계는 배양액을 원심분리, 여과, 침전, 부유, 흡착 또는 막분리하는 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법.
9. 제1항에 있어서,
   상기 연속배양하는 단계는 악티노바실러스 숙시노게네스를 접종한 배양액을 1~100 ml/hr 속도로 제거하는 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법.
10. 제1항에 있어서,
    상기 재순환하는 단계는 배지의 공급속도와 배양액을 재순환 하는 속도가 1 : 0.5~1 인 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법.
11. 제7항에 있어서,
    상기 탄산마그네슘은 배양개시 후 10~24 g/ℓ 농도이며 배양개시 후 250시간 경과하면 25~35 g/ℓ 농도인 것을 특징으로 하는 악티노바실러스 숙시노게네스를 이용한 숙신산 생산방법.
    

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