KR101535531B1 - Simultaneous determination method of C1-C6 alcohols - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 탄소수 6이하의 알코올류 다성분을 분석하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 헤드스페이스샘플러(headspace autosampler)에서 염석(salting-out) 및 알코올류 다성분 추출 단계, 급속냉각장치(cryogenic trap)에 의한 응축 단계; 및 기체크로마토그래프(gas chromatograph) 분석법으로 분리하는 단계를 포함하는 탄소수 1-6개의 알코올류를 다성분 동시 분석하는 방법에 관한 것이다. TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for analyzing an alcohol multivalent component having 6 or less carbon atoms. More particularly, the present invention relates to a process for the extraction of alcohols from a salting-out and alcohol multi-component step in a headspace autosampler, a condensation step by means of a cryogenic trap; And a gas chromatograph analysis. The present invention also relates to a method for simultaneous multi-component analysis of alcohols having 1 to 6 carbon atoms.
알코올의 유해성에 의한 사회적 문제를 줄이기 위해 국가차원의 정책 수립 및 위해성에 대한 연구를 강화하고 정확한 정보를 알기 위한 노력을 기울이고 있다. 이에 따라 주류의 주정으로 사용되는 에탄올의 소비량뿐만 아니라 주류에 포함되어 있는 휘발성 유해화합물에 대한 관심이 높아지고 있다. 주류에 포함된 휘발성 유해화합물로는 메탄올, 고급 알코올류(탄소수 3-5개, C3-C5)인 퓨젤유(fusel oil) 등이 알려져 있다. In order to reduce the social problems caused by the harmfulness of alcohol, efforts are being made to strengthen the national policy formulation and risk studies and to obtain accurate information. As a result, there has been a growing interest in volatile harmful compounds contained in alcoholic beverages as well as consumption of ethanol used in alcoholic beverages. As volatile harmful compounds contained in the mainstream, methanol, fusel oil such as higher alcohol (C3 to C5, C3 to C5) are known.
메탄올은 유기용매로 널리 쓰여 페인트, 광택제 등에 사용되며 15 mL 이상 섭취하면 사람의 시력을 잃을 수 있고 30 mL 이상이면 사망에 이를 만큼 위험하다. 따라서 국립농산물품질관리원에서는 전통주 품질인증기준(탁주, 약주, 청주, 0.3 mg/mL 이하; 과실주 0.5 mg/mL 이하)을 정하여 메탄올의 함량을 엄격히 관리하고 있다. Methanol is widely used as an organic solvent for paints and brighteners. If you take more than 15 mL of methanol, you may lose sight. If you take more than 30 mL, it is dangerous to die. Therefore, the National Agricultural Products Quality Management Service strictly controls the methanol content by determining the quality standards of traditional wines (Takju, Yakju, Cheongju, less than 0.3 mg / mL, less than 0.5 mg / mL of fruit wine).
에탄올은 무색이고 독특한 향기가 나는 액체로 전통주, 증류주 등 주류의 주성분이다. 대부분의 전통주는 자연발효과정을 거치며 이 과정에서 온습도 등 주위환경여건이 적합하지 못하면 곰팡이, 효모, 유산균 등의 미생물이 정상적으로 에탄올을 만들어내지 못하고 3-메틸-1-부탄올(isoamyl alcohol), 1-펜타놀(amyl alcohol), 2-메틸-1-프로판올(isobutyl alcohol) 등 탄수화물이 에탄올로 이르는 반응 경로에서 퓨젤유가 생성된다 (Whiting, J I Brewing 82(2):84-82 1976). Ethanol is a colorless liquid with a unique aroma and is the main component of alcoholic beverages such as traditional alcohol and spirits. Most of traditional stocks undergo natural fermentation process. Microorganisms such as fungi, yeast, and lactic acid bacteria do not normally produce ethanol unless proper environmental conditions such as temperature and humidity are in the process. 3-Methyl-1-butanol (isoamyl alcohol) Fuel oil is produced in the reaction pathway where carbohydrates such as amyl alcohol and 2-methyl-1-propanol lead to ethanol (Whiting, JI Brewing 82 (2): 84-82 1976).
이러한 퓨젤유는 함량이 많으면 술의 향기가 나빠지고 과음 시 숙취의 주요 원인이 되지만 소량인 경우 술의 맛과 향을 좋게 하는 역할도 한다. 국내 식품공전 및 유럽연합(EU) 규격에서는 퓨젤유의 함량을 주류의 종류에 따라 규정하여 관리하고 있다. 따라서 주류에 포함되어 있는 메탄올, 에탄올, 퓨젤유 등 각각의 알코올 성분을 확인하고 함량을 측정함으로써 술의 종류를 예측할 수 있을 뿐 아니라 정품 주류와 가짜 주류 판별에 활용이 가능하다.When the content of fungus oil is high, the aroma of alcohol is deteriorated and it becomes a main cause of hangover in the case of overdrinking, but in the case of a small amount of fungus oil, it also serves to improve the taste and aroma of alcohol. In Korea Food Standards and the European Union (EU) standards, the content of fugel oil is regulated according to the type of alcoholic beverages. Therefore, alcohol content such as methanol, ethanol, fugel oil, etc. contained in the alcoholic beverages can be identified and measured to determine the type of alcohol, as well as to identify genuine alcohol and fake alcohol.
최근 신종마약인 알킬니트리트(alkyl nitrite; 일명, 파퍼스, 러시)의 국내 유입이 증가함에 따라 식약처는 2013년 12월 알킬니트리트 7종을‘임시마약’으로 지정하였다. 알킬니트리트는 휘발성이 있고 투명한 갈색의 액체로 동성사이의 최음제, 클럽 약물(단일 또는 다른 약물과 혼용)로 사용되는 것으로 알려져 있다. As the recent influx of alkyl nitrite (aka, papyrus, rush) in the domestic market has increased, the pharmacy has designated 7 kinds of alkylnitrite as 'temporary drug' in December 2013. Alkylnitrite is a volatile, clear, brown liquid that is known to be used as an aphrodisiac, a club drug (mixed with single or other drugs).
임시마약의 지정은 오용 또는 남용으로 인한 보건상의 위해가 우려되어 긴급히 마약류에 준하여 취급·관리할 필요가 있다고 인정하는 물질에 대해 한정되며, 현재 임시마약으로 지정된 알킬니트리트는 이소부틸니트리트(isobutyl nitrite), 이소프로필니트리트(isopropyl nitrite), 펜틸니트리트(pentyl nitrite), 이소펜틸니트리트(isopentyl nitrite), 터셔리부틸니트리트(tertiarybutyl nitrite), 사이클로헥실니트리트(cyclohexyl nitrite), 부틸니트리트(butyl nitrite)이다. 알킬니트리트는 환각효과(psychoactive effect)를 갖고 있고 주로 흡입에 의해 남용되며 과량을 흡입할 경우 사망에 이를 수 있다 (NIDA Research Monograph 83, NIDA, Rockville, MD, 1988; McFadden et al., Fundam Appl Toxicol 1:448-451 1981). 최근 해외인터넷 사이트에서 구매해 국제우편이나 특송화물로 쉽게 들여오다 적발되는 알킬니트리트 밀반입 사례가 증가하고 있어 이들 신종마약의 복용여부를 신속하고 정확하게 성분을 확인하고 함량을 측정할 수 있는 검출법의 필요성이 크게 증가하였다.The designation of a temporary drug is limited to substances that are considered to be in need of urgent treatment and management of drugs due to health hazards caused by misuse or abuse and alkylnitrates designated as temporary drugs are currently classified as isobutyl nitrate nitrite, isopropyl nitrite, pentyl nitrite, isopentyl nitrite, tertiarybutyl nitrite, cyclohexyl nitrite, It is a butyl nitrite. Alkynitrite has a psychoactive effect and is primarily abused by inhalation and can lead to death when inhaled excess (NIDA Research Monograph 83, NIDA, Rockville, MD, 1988; McFadden et al., Fundam Appl Toxicol 1: 448-451 1981). Recently, there has been an increase in the number of cases of alkylnitol smuggled from overseas websites, which are easily caught by international mail or special express cargoes. Therefore, there is a need for a detection method capable of quickly and accurately detecting components and measuring the content of these new drugs Respectively.
종래의 생체시료에서 알킬니트리트의 분석방법은 헤드스페이스샘플러가 장착된 기체크로마토그래프-불꽃이온화검출기(headspace-gas chromatograph-flame ionization detection, HS-GC-FID)를 이용하여 알킬니트리트의 분해 산물인 알코올류 검출을 통해 이루어진다(Watanabe-Suzuki et al., J Chromatogr Sci 41:63-66 2003). A method for analyzing alkylnitrite in a conventional biological sample uses a headspace-gas chromatograph-flame ionization detector (HS-GC-FID) equipped with a headspace sampler, (Watanabe-Suzuki et al., J Chromatogr Sci 41: 63-66 2003).
종래에 발표된 이외의 분석방법으로 오염된 커피음료에서 이소부틸니트리트의 분해산물인 이소부틸알코올(2-메틸-1-프로판올)의 정성분석방법(Seto et al., Anal Chem 72:5187-5192 2000), 비디오헤드 클리너 안에 포함된 사이클로헥실니트리트의 산물인 사이클로헥사놀의 정성분석방법(Dearmore et al., J Forensic Sci 44:197-204 1999) 및 소변과 혈액에서 부틸알코올, 이소부틸알코올, 이소아밀알코올(3-메틸-1-부탄올) 3개 성분에 대한 정량분석방법(Watanabe-Suzuki et al., J Chromatogr Sci 41:63-66 2003) 등이 보고되어있다.(Seto et al., Anal Chem 72: 5187-A) for the analysis of isobutyl alcohol (2-methyl-1-propanol), which is a decomposition product of isobutyryl nitrite in contaminated coffee beverages, (Dearmore et al., J Forensic Sci 44: 197-204 1999), and a method for qualitative analysis of cyclohexanol, which is a product of cyclohexynitrile contained in a video head cleaner, such as butyl alcohol, isobutyl (Watanabe-Suzuki et al., J Chromatogr Sci 41: 63-66 2003) on three components of alcohol and isoamyl alcohol (3-methyl-1-butanol) have been reported.
반면 주류에서 휘발성 알코올류 성분 분석은 다양한 방법이 사용되어 왔다. 국내 식품공전(2011)에 따르면 주류에서 메탄올의 정량방법은 시료 전처리 없이 직접 주입법(direct injection)이나 증류법으로 추출 후 기체크로마토그래프-불꽃이온화검출기(GC-FID)를 이용한 분석방법을 제시하고 있으나 퓨젤유의 정량방법은 따로 제시하고 있지 않다. On the other hand, various methods have been used to analyze volatile alcohol components in alcoholic beverages. According to the Korean Food Code (2011), the method for quantitative determination of methanol in the mainstream is a direct injection method without sample pretreatment or a method using gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID) after extraction by distillation method, The method of quantification of
한편 유럽연합의 Commission Regulation(EC, 2010)에 따르면 정량방법으로 시료 전처리 없이 직접 주입법과 모세분리관(capillary column)으로 정지상이 폴리에틸렌글리콜인 WAX 컬럼을 사용한 GC-FID 분석방법을 제시하고 있다 (Chung et al., J Appl Biol Chem 55(3):141-148 2012).According to Commission Regulation (EC, 2010) of European Union, GC-FID analysis method using direct injection method and capillary column with WAX column, which is a polyethylene glycol, is proposed as a quantitative method (Chung et al., J Appl Biol Chem 55 (3): 141-148 2012).
종래의 알코올류 검출에 사용된 분석 장비로는 시료 전처리를 위해 헤드스페이스샘플러 또는 고체상미세추출(solid-phase microextraction, SPME) 장치가 장착된 헤드스페이스샘플러를 이용하였으며, 개별 성분의 분리 및 검출에 사용된 장비는 GC-FID가 사용되었다. GC-FID 분석방법이 유용한 방법이기는 하지만, FID를 검출기로 사용하여 구조이성질체를 분석하는 경우 정성 및 정량 과정상의 문제점이 발생된다. Conventional analytical instruments used for alcohol detection include a headspace sampler equipped with a headspace sampler or a solid-phase microextraction (SPME) device for sample preparation and used for the separation and detection of individual components The equipment used was GC-FID. While GC-FID analysis is a useful method, there are problems in qualitative and quantitative processes when analyzing structural isomers using FID as a detector.
특히 탄소수 4-5개(C4-C5)의 알코올류의 경우 1차, 2차, 3차 알코올 등의 구조이성질체가 존재하고 일예로 2-펜탄올과 3-펜탄올의 경우 모세분리관에서 분리가 되지 않고 겹쳐서 두 물질이 함께 검출되므로 GC-FID로는 개별 성분의 확인(qualification) 및 함량 측정(quantification)을 할 수 없다. 또한 기체크로마토그래프를 이용한 알코올류 분석에 정지상으로 극성물질인 모세분리관을 사용할 경우 알코올류 성분의 머무름 시간(retention time)이 너무 길어져 신속한 분석 수행에 어려운 단점이 있다.Particularly in the case of alcohols having 4 to 5 carbon atoms (C4-C5), structural isomers such as primary, secondary and tertiary alcohols exist. For example, in the case of 2-pentanol and 3-pentanol, And the two substances are detected together. Therefore, it is not possible to qualify and quantify the individual components with GC-FID. Also, when a capillary separation tube, which is a polar substance, is used as a stationary phase in the analysis of alcohols using a gas chromatograph, the retention time of the alcohol component becomes too long, which makes it difficult to perform rapid analysis.
본 발명의 일 구체예에서는 탄소수 6 이하의 알코올류 다성분을 동시에 분석하면서도 신속, 정확한 고감도 분석이 가능한 분석방법을 제공하고자 한다. In one embodiment of the present invention, an analytical method capable of rapidly and accurately performing high-sensitivity analysis while simultaneously analyzing alcohol components having a carbon number of 6 or less is provided.
다만, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 평균적 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.It is to be understood, however, that the technical scope of the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other technical problems can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 탄소수 6 이하의 알코올류 다성분 동시분석방법에 관한 것으로, 헤드스페이스샘플러에서, 알코올류 다성분이 포함된 액상 시료를 염석(salting out) 및 알코올류 다성분을 기체 혼합물로 추출하는 단계; 상기 추출된 시료를 기체크로마토그래프(gas chromatograph)에 장착된 급속냉각장치를 이용하여 모세분리관 앞단에서 시료를 응축시키는 단계; 상기 응축된 시료를 기체크로마토그래프에 장착된 모세분리관을 이용하여 분리하는 단계; 및 상기 분리된 알코올류 다성분을 이온화한 후 질량분석기로 분석하는 단계를 포함하며, According to one embodiment of the present invention, there is provided a simultaneous analysis method of alcohol multi-component having a carbon number of 6 or less, wherein in a headspace sampler, a liquid sample containing an alcohol multi component is salted out and an alcohol multi component Extracting with a gas mixture; Condensing the extracted sample in the front end of the capillary separation tube using a rapid cooling device mounted on a gas chromatograph; Separating the condensed sample using a capillary separation tube mounted on a gas chromatograph; And ionizing the separated alcohol component and analyzing it by a mass spectrometer,
상기에서 탄소수 6 이하의 알코올류 다성분은 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 1-프로판올, 2-메틸-2-프로판올, 2-부탄올, 2-메틸-1-프로판올, 1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-펜탄올, 및 사이클로헥산올로 이들 성분에 대한 분석방법이 제공된다. The alcohols having a carbon number of 6 or less may be selected from the group consisting of methanol, ethanol, 2-propanol, 1-propanol, 2-methyl-2-propanol, 2- Analytical methods for these components are provided with 2-butanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 3-methyl-1-butanol, 1-pentanol and cyclohexanol.
예시적 구체예에서, 상기 염석단계에서 염석제는 탄산칼륨(K2CO3)일 수 있다. In an exemplary embodiment, the salting agent in the salting step may be potassium carbonate (K 2 CO 3 ).
예시적 구체예에서, 상기 헤드스페이스샘플러를 이용하여 알코올류 다성분을 기체 혼합물로 추출하는 단계에서, 헤드스페이스샘플러 내 시료는 80 ~ 110 ℃로 8 ~ 10분 가열, 헤드스페이스 샘플러내 루프(loop)는 100 ~ 110℃, 헤드스페이스샘플러와 기체크로마토그래프와의 연결관(transfer line)은 110 ~ 130 ℃로, 시료가 담긴 바이얼에 130 ~ 140 kPa 압력으로 10 ~ 30초간 헬륨가스를 주입하였고 기체크로마토그래프 내로 시료 주입시간은 0.1 min이내 일 수 있다. In an exemplary embodiment, in the step of extracting the alcohol multi-component into the gas mixture using the headspace sampler, the sample in the headspace sampler is heated at 80 to 110 DEG C for 8 to 10 minutes, ) Was 100 to 110 ° C, and the transfer line between the headspace sampler and the gas chromatograph was injected with helium gas at 110 to 130 ° C. for 10 to 30 seconds at 130 to 140 kPa pressure in the vial containing the sample Sample injection time into the gas chromatograph can be within 0.1 min.
예시적 구체예에서, 상기 응축단계에서 급속냉각장치는 초기 온도를 5 ℃ 이하로 설정하여 1 ~ 2분간 유지시킨 후 60 ~ 70 ℃/min 으로 200 ~ 300 ℃까지 승온할 수 있다. In an exemplary embodiment, the rapid cooling apparatus in the condensing step may raise the temperature to 200 to 300 ° C at 60 to 70 ° C / min after maintaining the initial temperature at 5 ° C or lower for 1 to 2 minutes.
예시적 구체예에서, 상기 모세분리관을 이용하여 분리하는 단계에서, 모세분리관은 1 ~ 5% phenyl과 95 ~ 99% dimethyl의 polysiloxane으로 비극성 정지상이 구성되어 있고, 모세관의 길이가 27 ~ 33 m, 직경이 0.23 ~ 0.27 mm, 정지상의 두께가 0.9 ~ 1.1 μm 일 수 있다. In an exemplary embodiment, in the step of separating using the capillary separation tube, the capillary separation tube comprises a nonpolar stationary phase composed of 1-5% phenyl and 95-99% dimethyl polysiloxane, and capillary length is 27 to 33 m, a diameter of 0.23 to 0.27 mm, and a thickness of the stationary phase of 0.9 to 1.1 m.
예시적 구체예에서, 상기 기체크로마토그래프를 이용하여 분리하는 단계에서, 기체크로마토그래프의 오븐 온도를 40 ~ 60 ℃로 설정하여 1 ~ 3분간 유지시킨 후, 30 ~ 50 ℃/min으로, 160 ~ 180 ℃까지 승온한 후, 50 ~ 70 ℃/min으로 240 ~ 260 ℃까지 승온하여 3 ~ 5분간 유지하며, 모세분리관의 유량을 1 ~ 2 mL/min로 설정할 수 있다. In an exemplary embodiment, in the step of separating using the gas chromatograph, the oven temperature of the gas chromatograph is set to 40 to 60 ° C, held for 1 to 3 minutes, and then cooled at a rate of 30 to 50 ° C / After raising the temperature to 180 DEG C, the temperature is raised to 240 to 260 DEG C at 50 to 70 DEG C / min and maintained for 3 to 5 minutes, and the flow rate of the capillary separation tube can be set to 1 to 2 mL / min.
예시적 구체예에서, 상기 모세분리관을 이용하여 분리하는 단계에서 알코올류 다성분의 머무름 시간(retention time)은 10분 이내일 수 있다. In an exemplary embodiment, the retention time of the alcohol multi component in the separation step using the capillary separation tube may be within 10 minutes.
예시적 구체예에서, 상기 탄소수 6이하의 알코올류 다성분 동시분석방법은 일내(n=6) 정밀도는 8.18% 이내이며, 정확도는 -12.9 ~ 10.0% 이며, 일간 4세트(n=24) 정밀도는 12.3% 이내이며, 정확도는-0.1 ~ 0.1%일 수 있다. In the exemplary embodiment, the simultaneous analysis method of the alcohol and the multi-component of the alcohol having less than 6 carbon atoms has an intra-day (n = 6) precision of less than 8.18%, an accuracy of -12.9 to 10.0% Is within 12.3% and the accuracy can be -0.1-0.1%.
본 발명의 구체예에 따르면, 한 번의 분석으로 탄소수 6 이하의 알코올류 성분 14종을 동시에 분석할 수 있으며, 신속한 분석이 가능하고 보다 높은 정밀도와 정확도의 측정이 가능하다. According to the embodiment of the present invention, it is possible to simultaneously analyze 14 kinds of alcohol components having 6 or less carbon atoms in one analysis, and it is possible to perform quick analysis and to measure higher precision and accuracy.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 헤드스페이스샘플러, 급속냉각장치, 기체크로마토그래프의 모세분리관이 포함된 분리부 및 알코올류 성분 확인과 함량 측정을 위한 질량분석기를 나타낸 구성도이다.
도 2는 실시예 1에 따라 실시한 14종의 알코올류 다성분의 전체 이온크로마토그램(total ion chromatogram)이다.
도 3은 본 발명의 질량 분석기를 사용하여, 완전히 분리된 구조이성질체 2-펜타놀과 3-펜타놀의 SIM(selected ion monitoring) 크로마토그램이다.
도 4는 염석제(salting-out reagent)로 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 탄산나트륨(Na2CO3), 황산나트륨(Na2SO4), 및 탄산칼륨(K2CO3)을 염석제로 사용하였을 때, 알코올류 성분 추출 효율을 비교한 전체 이온크로마토그램이다.
도 5 ~ 도 6은 본 발명의 분석방법에 따른 맥주 복용자의 소변 분석결과를 나타낸 전체 이온크로마토그램이다.
도 7 ~ 도 8은 본 발명의 분석방법에 따른 막걸리 복용자의 소변 분석결과를 나타낸 전체 이온크로마토그램이다.
도 9 ~ 도 10은 본 발명의 분석방법에 따른 양주 복용자의 소변 분석결과를 나타낸 전체 이온크로마토그램이다.
도 11은 본 발명의 분석방법에 따른 시중 탄산음료에서 측정된 알코올 성분 분석결과를 나타낸 전체 이온크로마토그램이다.
도 12는 본 발명의 분석방법에 따른 시중 보리음료에서 측정된 알코올 성분 분석결과를 나타낸 전체 이온크로마토그램이다.
도 13은 본 발명의 분석방법에 따른 시중 맥주에서 측정된 알코올 성분 분석결과를 나타낸 전체 이온크로마토그램이다.
도 14는 본 발명의 분석방법에 따른 시중 막걸리에서 측정된 알코올 성분 분석결과를 나타낸 전체 이온크로마토그램이다.
도 15는 본 발명의 분석방법에 따른 시중 양주에서 측정된 알코올 성분 분석결과를 나타낸 전체 이온크로마토그램이다. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a block diagram illustrating a headspace sampler, a rapid cooling apparatus, a separation unit including a capillary separation tube of a gas chromatograph, and a mass spectrometer for determining an alcohol component and measuring the content thereof according to an embodiment of the present invention.
Fig. 2 is a total ion chromatogram of 14 kinds of alcohol multi-components made according to Example 1. Fig.
Figure 3 is a selected ion monitoring (SIM) chromatogram of fully separated structural isomers of 2-pentanol and 3-pentanol using the mass spectrometer of the present invention.
Figure 4 is a salting out the (salting-out reagent) with potassium chloride (KCl), sodium chloride (NaCl), sodium carbonate (Na 2 CO 3), sodium sulfate (Na 2 SO 4), and potassium carbonate (K 2 CO 3) was salted out zero It is a total ion chromatogram comparing the extraction efficiency of alcohol components when used.
5 to 6 are total ion chromatograms showing the result of urine analysis of a beer user according to the analysis method of the present invention.
FIGS. 7 to 8 are total ion chromatograms showing the results of urine analysis of makgeolli users according to the analysis method of the present invention.
FIGS. 9 to 10 are total ion chromatograms showing the urine analysis results of a dietary recipient according to the analysis method of the present invention.
FIG. 11 is a total ion chromatogram showing the results of analysis of alcohol components measured in a commercially available carbonated beverage according to the analysis method of the present invention.
FIG. 12 is a total ion chromatogram showing the alcohol component analysis results measured in a barley beverage according to the analysis method of the present invention.
13 is a total ion chromatogram showing the result of analyzing alcohol components measured in a commercial beer according to the analysis method of the present invention.
FIG. 14 is a total ion chromatogram showing the results of analysis of alcohol components measured on a rice wine according to the analysis method of the present invention.
FIG. 15 is a total ion chromatogram showing the result of analyzing alcohol components measured in a commercial batch according to the analysis method of the present invention.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
The present invention can be all accomplished by the following description. The following description should be understood to describe preferred embodiments of the present invention, but the present invention is not necessarily limited thereto.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 탄소수 6 이하의 알코올류 다성분 동시분석법에 관한 것으로, 헤드스페이스샘플러에서, 알코올류 다성분이 포함된 액상 시료를 염석(salting out) 및 알코올류 다성분을 기체혼합물로 추출하는 단계; 상기 추출된 시료를 기체크로마토그래프(gas chromatograph)에 장착된 급속냉각장치(cryogenic trap)를 이용하여 모세분리관 앞단에서 시료를 응축시키는 단계; 상기 응축된 시료를 기체크로마토그래프(gas chromatograph)에 장착된 모세분리관을 이용하여 분리하는 단계; 및 상기 분리된 알코올류 다성분을 이온화한 후 질량분석기로 분석하는 단계를 포함하며, 상기에서 탄소수 6 이하의 알코올류 다성분은 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 1-프로판올, 2-메틸-2-프로판올, 2-부탄올, 2-메틸-1-프로판올, 1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-펜탄올, 및 사이클로헥산올이다. According to one embodiment of the present invention, there is provided a simultaneous analysis method for alcohol multi-component having 6 or less carbon atoms, wherein in a headspace sampler, a liquid sample containing an alcohol multi component is salted out and a multi- Extracting with a mixture; Condensing the extracted sample at the front end of the capillary separation tube using a cryogenic trap mounted on a gas chromatograph; Separating the condensed sample using a capillary separation tube mounted on a gas chromatograph; And analyzing the separated alcohol component with a mass analyzer after ionizing the alcohol component, wherein the alcohol component having 6 or less carbon atoms is selected from the group consisting of methanol, ethanol, 2-propanol, 1-propanol, Propanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 1-butanol, And cyclohexanol.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따른 헤드스페이스샘플러, 급속냉각장치, 응축된 알코올류 성분을 분리하는 기체크로마토그래프의 분리부 및 알코올류 성분 확인과 함량 측정을 위한 검출기를 포함한 구성도를 보여준다. 1 shows a headspace sampler, a rapid cooling device, a gas chromatograph separator for separating condensed alcohol components, and a detector including an alcohol component and a detector for measuring the content, according to an embodiment of the present invention .
본 발명자는 염석기법 및 특정 조건에서 헤드스페이스샘플러를 이용하여 액상시료에서 알코올류 14종에 대해 효과적인 추출이 가능하며, 급속냉각장치를 기체크로마토그래프 모세분리관 앞단에 장착하여 알코올류 성분을 응축시킨(focusing) 후 분리·분석을 수행함으로써 확산을 방지하고 분리능을 개선할 수 있었다. The present inventors have found that it is possible to effectively extract 14 kinds of alcohols from a liquid sample by using a salting-out method and a head space sampler under specific conditions, and by applying a rapid cooling device to the front end of a gas chromatograph capillary separator to condense the alcohol component separation and analysis are performed after focusing to prevent diffusion and improve resolution.
또한, 기체크로마토그래프에 장착한 모세분리관을 종래의 극성 분리관에서 특정 비극성 분리관으로 대체함으로써 분석물질과 정지상과의 상호작용을 줄여 머무름 시간을 단축함으로써 탄소수 6 이하의 알코올류 성분 14종에 대한 신속한 분석이 가능하였다. In addition, by replacing the capillary separation tube mounted on the gas chromatograph with a specific nonpolar separation tube in the conventional polarity separation tube, the retention time is shortened by reducing the interaction between the analyte and the stationary phase, and thus 14 kinds of the alcohol components having 6 or less carbon atoms It was possible to analyze quickly.
또한, 검출기로 질량분석기를 사용하여 얻은 개별 알코올 성분의 질량스펙트럼으로부터 특징적인 이온을 선정하여 정량이온 및 정성이온으로 사용하고 정량이온의 질량값(m/z)에 의해, 분리가 까다로운 이성질체간 분리가 가능하도록 설정함으로써 질량분석기 없이 기체크로마토그래프만으로는 분리되지 않는 구조이성질체 성분까지 분석 가능하였다. 결과적으로 단 시간 내에 탄소수 14종의 알코올류를 동시에 분석 가능하였다. In addition, characteristic ions are selected from the mass spectra of individual alcohol components obtained by using a mass spectrometer as a detector, and are used as quantitative and qualitative ions, and quantitative ion masses (m / z) It is possible to analyze structural isomeric components which can not be separated only by gas chromatograph without mass spectrometer. As a result, it was possible to simultaneously analyze 14 kinds of alcohols in a short time.
도 2는 본 발명에 따른 14종의 알코올류 다성분 동시 분석결과를 보여준다. 머무름시간(Retention time) 4.5분에 No. 10 2-펜탄올 및 No. 11 3-펜탄올은 동일하나, 질량분석기를 통해 도 3에서와 같이 2개의 구조 이성질체를 m/z 에 의해 분리할 수 있었다. FIG. 2 shows the result of simultaneous analysis of 14 kinds of alcohols in accordance with the present invention. Retention time At 4.5 minutes no. 10 < / RTI > 11 3-pentanol was the same, but two structural isomers were separated by m / z through mass spectrometry as in FIG.
도 3에서는 종래의 불꽃이온화검출기만으로는 성분 확인 및 함량측정이 어려운 2-펜타놀과 3-펜타놀의 구조이성질체 분석을 위해 검출기로 질량분석기를 사용함으로써, 물질의 질량스펙트럼으로부터 고유한 특징을 갖는 정량이온 및 정성이온을 선정할 수 있고 그 질량값(m/z)에 의해 두 이성질체를 완벽하게 분리할 수 있었다. In FIG. 3, by using a mass spectrometer as a detector for the structural isomer analysis of 2-pentanol and 3-pentanol, which is difficult to determine the content and content of a conventional flame ionization detector, Ion and qualitative ion can be selected and the two isomers can be completely separated by their mass value (m / z).
본 발명의 알코올류 다성분 동시분석법은 우선, 헤드스페이스샘플러에서, 14종의 알코올류 다성분이 포함된 액상 시료를 염석(salting out) 및 알코올류 다성분을 기체 혼합물로 추출한다. In the simultaneous alcohol-based multi-component analysis method of the present invention, first, in a headspace sampler, a liquid sample containing 14 kinds of alcohol multivalent components is salted out and alcohol components are extracted with a gas mixture.
14종의 알코올류는 탄소수 6 이하의 알코올류 다성분은 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 1-프로판올, 2-메틸-2-프로판올, 2-부탄올, 2-메틸-1-프로판올, 1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-펜탄올, 및 사이클로헥산올을 포함한다. The 14 kinds of alcohols are alcohols having 6 or less carbon atoms and the multi component is methanol, ethanol, 2-propanol, 1-propanol, 2-methyl-2-propanol, 2- Methyl-1-butanol, 1-pentanol, and cyclohexanol.
염석(salting out)은 염석제를 첨가함으로써 이미 녹아있는 알코올과 같은 용질을 석출 또는 휘발시키는 작용을 한다. 전해질 물질인 염석제를 첨가하면, 염석제가 물속에서 모두 해리되므로, 상대적으로 극성이 작은 알코올 분자의 용해도가 낮아져 알코올 분자가 헤드스페이스 상층부에 더 많이 휘발하게 되도록 할 수 있다. Salting out acts to precipitate or volatilize solutes, such as already dissolved alcohols, by adding a salting agent. When the salting agent is added as an electrolytic material, the salting out agent is dissociated in water, so that the solubility of the alcohol molecules having a relatively low polarity is lowered, so that the alcohol molecules are more volatilized in the upper part of the headspace.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 추출단계에서 사용된 염석방법은 액상시료에서 염석제를 넣고 바이얼을 밀봉한 후 헤드스페이스샘플러에서 일정 시간 동안 일정 온도에서 가열과정을 거친다. In one embodiment of the present invention, the salting method used in the extraction step is such that a salting agent is added to a liquid sample, the vial is sealed, and the sample is heated at a predetermined temperature for a certain period of time in a headspace sampler.
상기 단계에서 알코올류 다성분은 기체상 혼합물로 추출되어, 이후 기체크로마토그래프에 장착된 급속냉각장치로 이동된다. In this step, the alcohol multi component is extracted as a gaseous mixture and then transferred to the rapid cooling device mounted on the gas chromatograph.
상기 염석하는 단계에서 사용되는 염석제는 특별히 한정되지는 않으나, 상기 알코올류 성분의 간편하면서도 높은 추출 효율을 얻기 위해 액상시료에 첨가하는 염석제(salting-out reagent)의 선택이 중요하다. 본 발명에서는 구체적으로 염화칼륨(KCl), 염화나트륨(NaCl), 탄산나트륨(Na2CO3), 황산나트륨(Na2SO4), 또는 탄산칼륨(K2CO3)을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 탄산칼륨이다. 도 4에서는 염화칼륨, 염화나트륨, 탄산나트륨, 황산나트륨, 및 탄산칼륨을 염석제로 사용하여 14종의 알코올류 성분의 추출 효율을 비교한 결과로서, 5종의 염석제 중 탄산칼륨을 추출에 사용했을 때 알코올류 성분에 대한 가장 높은 효율을 나타내었다.The salting-out agent used in the salting-out step is not particularly limited, but it is important to select a salting-out reagent added to the liquid sample in order to obtain a simple but high extraction efficiency of the alcohol component. May in the present invention, specifically, use of potassium chloride (KCl), sodium chloride (NaCl), sodium carbonate (Na 2 CO 3), sodium sulfate (Na 2 SO 4), or potassium carbonate (K 2 CO 3), more specifically, acid It is potassium. FIG. 4 shows the extraction efficiencies of 14 kinds of alcohol components using potassium chloride, sodium chloride, sodium carbonate, sodium sulfate, and potassium carbonate as salting agents. As a result, when potassium carbonate in 5 kinds of salting out agents was used for extraction, And showed the highest efficiency for the components.
상기 단계에서, 알코올류 다성분을 효과적으로 분리하기 위해서는 헤드스페이스샘플러의 기기조건 중 시료의 온도 및 가열 시간과 헤드스페이스샘플러의 기기 작동 조건의 설정이 중요하다. In order to effectively separate the alcohol multi-components in the above step, it is important to set the temperature and the heating time of the sample among the instrument conditions of the headspace sampler and the operating conditions of the machine of the headspace sampler.
본 발명의 예시적에 구체예에 따르면, 시료 가열 온도는 80 ~ 110 ℃, 8 ~ 10분 가열, 헤드스페이스 샘플러내 루프(loop)는 100 ~ 110℃, 헤드스페이스샘플러와 기체크로마토그래프와의 연결관(transfer line)은 110 ~ 130 ℃로, 시료가 담긴 바이얼에 130 ~ 140 kPa 압력으로 10 ~ 30초간 헬륨가스를 주입하였고 기체크로마토그래프에 시료 주입시간은 0.1 min이내로 설정하는 것이 바람직하다. According to an exemplary embodiment of the present invention, the heating temperature of the sample is 80 to 110 ° C for 8 to 10 minutes, the loop in the headspace sampler is 100 to 110 ° C, the connection between the headspace sampler and the gas chromatograph (transfer line) is 110 ~ 130 ℃, and helium gas is injected into the vial containing the sample at 130 ~ 140 kPa pressure for 10 ~ 30 seconds. It is preferable to set the sample injection time to less than 0.1 min on the gas chromatograph.
본 발명은 다음 단계로서, 상기 추출단계에서 얻은 기체상 혼합물 상태의 추출된 시료를 기체크로마토그래프에 장착된 급속냉각장치를 이용하여 모세분리관 앞단에서 응축시킨다. In the next step, the extracted sample in the gaseous mixture state obtained in the extraction step is condensed at the front end of the capillary separation tube using a rapid cooling device mounted on a gas chromatograph.
본 발명의 응축 과정을 통해, 상기 헤드스페이스샘플러 추출단계에서 얻은 기체상 혼합물이 기체크로마토그래프의 모세분리관 내에서 확산되지 않게 함으로써 분리능이 향상된다. 즉, 모세분리관 내에 14종 알코올류 분석물질의 확산이 증가할수록 크로마토그램 상의 피크(peak)가 넓어지게 되어 분리능의 저하와 정량한계가 나빠지므로 함량 측정의 정확성 및 정밀성이 낮아지게 된다. Through the condensation process of the present invention, the gas phase mixture obtained in the headspace sampler extraction step is prevented from diffusing in the capillary separation tube of the gas chromatograph, thereby improving the resolution. That is, as the diffusion of the analyte of 14 kinds of alcohol in the capillary separation tube increases, the peak on the chromatogram becomes wider, so that the resolution and the limit of quantification become worse, and the accuracy and precision of the content measurement are lowered.
본 발명의 예시적 구체예에 따르면, 상기 응축단계에서 급속냉각장치는 온도 프로그램은 초기 온도를 5 ℃ 이하로 설정하여 1 ~ 2분간 유지시킨 후 60 ~ 70 ℃/min 으로 200 ~ 300 ℃까지 승온하는 것이 바람직하다. According to an exemplary embodiment of the present invention, in the rapid cooling device in the condensing step, the temperature program is maintained for 1 to 2 minutes with the initial temperature set at 5 DEG C or less, and then the temperature is raised to 200 to 300 DEG C at 60 to 70 DEG C / .
본 발명은 다음 단계로서, 상기 응축된 시료를 기체크로마토그래프에 장착된 모세분리관을 이용하여 분리한다. In the next step of the present invention, the condensed sample is separated using a capillary separation tube mounted on a gas chromatograph.
기체크로마토그래프를 이용하여 알코올류 성분을 분석하는 경우, 먼저 기체크로마토그래프에 장착된 모세분리관의 고정상과 이동상 사이에서 흡착성 또는 분배계수의 차를 이용하여 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 1-프로판올, 2-메틸-2-프로판올, 2-부탄올, 2-메틸-1-프로판올, 1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-펜탄올, 및 사이클로헥산올이 분리된다.When alcohol components are analyzed using a gas chromatograph, the difference in adsorptivity or partition coefficient between the stationary phase and the mobile phase of the capillary separator attached to the gas chromatograph is used to determine the amount of alcohol, such as methanol, ethanol, 2-propanol, , 2-methyl-2-propanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, , 1-pentanol, and cyclohexanol are separated.
본 발명에서는 상기 기체크로마토그래프 분석법에 비극성 모세분리관을 장착하여 사용함으로써, 알코올류 성분을 바람직하게 분리할 수 있다. In the present invention, by using a nonpolar capillary separation tube in the gas chromatograph analysis method, the alcohol component can be preferably separated.
이때 모세분리관은 모세관의 길이가 27 ~ 33 m, 직경이 0.23 ~ 0.27 mm, 정지상의 두께가 0.9 ~ 1.1 μm인 모세분리관이 바람직하다. The capillary separation tube is preferably a capillary tube having a capillary length of 27 to 33 m, a diameter of 0.23 to 0.27 mm and a stationary phase thickness of 0.9 to 1.1 μm.
기체상 크로마토그래프의 이동상 기체로는 질소, 수소, 헬륨 기체를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 고순도 헬륨 기체를 사용한다.As the mobile phase gas of the gas phase chromatograph, nitrogen, hydrogen, and helium gas may be used, and a high purity helium gas is preferably used.
기체상 크로마토그래프의 분리조건 설정 단계에서는 모세분리관이 장착된 오븐의 온도를 단계별 조절하여 알코올류 성분의 머무름 시간과 분리 조건을 조정할 수 있다. 이때 적용되는 온도 조건은 기질로부터 유래한 방해물질의 영향을 최소화하고 빠른 시간 내에 모든 성분이 분석될 수 있도록 설정한다. In the step of setting the separation condition of the gas phase chromatograph, the retention time and the separation condition of the alcohol component can be adjusted by adjusting the temperature of the oven equipped with the capillary separation tube stepwise. At this time, the applied temperature condition is set so that the influence of the interfering substances derived from the substrate can be minimized and all components can be analyzed within a short time.
기체크로마토그래프 분석법의 오븐 온도 조절 단계에서 등온과 가온을 가함으로써 알코올류 성분과 방해물질을 구분하고 각 성분에 해당되는 크로마토그램의 분리능(resolution)을 향상시키기 위해 50 ~ 325 ℃의 범위로 오븐 온도를 선정할 수 있다, 바람직하게는 오븐 초기 온도를 40 ~ 60 ℃로 설정하여 1-3분간 유지시킨 후, 30 ~ 50 ℃/min으로, 160 ~ 180 ℃까지 승온한 후, 50 ~ 70 ℃/min으로 240 ~ 260 ℃까지 승온하여 3 ~ 5분간 유지시키는 것이다. 이때 모세분리관의 유량은 1 ~ 2 mL/min이 바람직하다. In order to improve the resolution of the chromatogram corresponding to each component by separating the alcohol component and the obstructing substance by isothermal and warming in the oven temperature control step of the gas chromatography method, the oven temperature Preferably, the oven initial temperature is set at 40 to 60 ° C and maintained for 1 to 3 minutes. After the temperature is raised to 160 to 180 ° C at 30 to 50 ° C / min, the temperature is raised to 50 to 70 ° C / min to 240 to 260 占 폚 and maintained for 3 to 5 minutes. At this time, the flow rate of the capillary separation tube is preferably 1 to 2 mL / min.
본 발명에 따르면, 14종의 알코올류 성분을 모세분리관을 이용하여 분리하는 데 머무름 시간은 10분이내이며, 일 구체예에 따르면 6.1분 이내에 모두 분리되었다. According to the present invention, 14 kinds of alcohol components were separated using a capillary separation tube, and the retention time was 10 minutes or less, and all of them were separated within 6.1 minutes according to one specific example.
본 발명은 다음 단계로서, 상기 분리된 알코올류 성분을 이온화한 후 질량분석기로 분석하는 단계를 포함한다. The present invention comprises, as a next step, a step of ionizing the separated alcohol component and then analyzing it by a mass spectrometer.
상기 질량분석기로 14종의 알코올류 성분을 확인하는 단계에서 이온화장치에서 발생된 물질의 특징적인 이온들을 확인하기 위해 m/z 20 ~ 120 범위의 스캔 방식으로 분석을 수행한다. In the step of identifying the 14 kinds of alcohol components by the mass spectrometer, the analysis is performed by a scanning method in the range of m / z 20-120 to identify characteristic ions of the material generated in the ionization apparatus.
상기 질량분석기로 성분의 함량을 측정하는 단계에서 질량분석기의 SIM(selected ion monitoring) 방식으로 분석을 수행한다. SIM 방식으로 분석을 수행함으로써 신호대잡음비(signal to noise ratio)를 개선하고 검출감도를 개선이 가능하며 중수소가 치환된 내부표준물질의 특성 이온을 함께 검출하는 경우 선택성(selectivity)이 높아지고 함량 측정시 개선된 정확도와 정밀도로 분석 대상물질(analyte)을 분석할 수 있다.In the step of measuring the content of components in the mass spectrometer, analysis is performed by a SIM (selected ion monitoring) method of a mass spectrometer. Simulation analysis can improve the signal-to-noise ratio and improve the detection sensitivity. In the case of detecting the characteristic ions of the internal standard substance substituted with deuterium, selectivity is increased and improvement is made in the content measurement The analyte can be analyzed with accuracy and accuracy.
종래의 기체크로마토그래프를 이용한 알코올류 성분을 검출하는 대표적인 방법으로 와타나베-스즈키 발명 (Watanabe-Suzuki et al., J Chromatogr Sci 41:63-66 2003)에 따르면 극성 정지상이 포함된 미디움보어(medium-bore) 모세분리관으로 분리하여 검출하는 방법이다. 구체적으로는 극성 정지상이 포함된 미디움보어(medium-bore) 모세분리관(길이 30 m, 직경 0.32 mm, 정지상 두께 0.25 μm, 상표명 Rtx-BAC2)을 사용하여 알코올 성분을 분리하였고 검출기로는 불꽃이온화검출기를 사용하였다. 분석결과 2-메틸-1-프로판올, 1-부탄올, 3-메틸-1-부탄올의 알코올류 3종을 모두 분석하는 하는 데는 10분 이상이 소요되었다. 또한, 기체크로마토그래프의 온도 조절 단계에서 등온과 가온을 가함으로써 알코올 성분을 분리하기 위하여 오븐의 초기 온도를 0 ℃로 설정하여 1.0 분간 유지시킨 후 10 ℃/min으로 120 ℃까지 승온한 후 20 ℃/min으로 240 ℃까지 승온하였다. 이때 미디움보어 모세분리관의 헬륨의 유량을 3 mL/min으로 설정하였다. According to Watanabe-Suzuki (Watanabe-Suzuki et al., J Chromatogr Sci 41: 63-66 2003), as a typical method for detecting an alcohol component using a conventional gas chromatograph, a medium- bore) capillary separation tube. Specifically, the alcohol component was separated using a medium-bore capillary separation tube (length 30 m, diameter 0.32 mm, stationary phase thickness 0.25 μm, trade name Rtx-BAC2) containing a polar stationary phase, Detector was used. Analysis showed that it took more than 10 minutes to analyze all three alcohols of 2-methyl-1-propanol, 1-butanol and 3-methyl-1-butanol. In order to separate the alcohol component by isothermal and warming in the temperature control step of the gas chromatograph, the initial temperature of the oven was set at 0 ° C., and the temperature was maintained at 1.0 ° C. for 10 minutes. After the temperature was raised to 120 ° C. at 10 ° C./minute, / min to 240 < 0 > C. At this time, the flow rate of helium in the medium bore membrane was set at 3 mL / min.
그러나, 와타나베-스즈키 발명에서 사용한 미디움보어 모세분리관은 내경이 0.32 mm이며 길이 30 m이며 이때 사용된 유량이 3 mL/min으로 통상적인 분석에 사용되는 이동상 헬륨기체의 유량이 1 ~ 2 mL/min를 넘고 최대 유량 2.4 mL/min을 넘어 안정적 분석 수행이 쉽지 않음을 확인할 수 있다 (Agilent 5975 Series MSD Operation Manual 2012 p 14).
However, the medium bore capillary separation tube used in the Watanabe-Suzuki invention has an inner diameter of 0.32 mm and a length of 30 m. At this time, the flow rate used is 3 mL / min, and the flow rate of the mobile phase helium gas used for usual analysis is 1 to 2 mL / min and the maximum flow rate exceeded 2.4 mL / min, which makes it difficult to perform stable analysis (Agilent 5975 Series MSD Operation Manual 2012 p 14).
실시예Example
실시예Example
1: 소변 중 알코올류 성분 14종 동시분석법 개발 및 유효화 1: Development and validation of simultaneous analysis method for 14 kinds of alcoholic components in urine
소변시료 2 mL가 담겨 있는 20 mL 바이얼에 염석제로 탄산칼륨(K2CO3) 1 g을 넣은 후 뚜껑을 닫고 헤드스페이스샘플러에서 90 ℃로 9분간 가열한 후, 바이얼에 138 kPa의 압력으로 헬륨기체를 30초간 주입하여 상층의 기체상 추출물을 헤드스페이스샘플러와 연결된 기체크로마토그래프에 0.01분 동안 주입하였다.1 g of potassium carbonate (K 2 CO 3 ) as a salting agent was added to a 20 mL vial containing 2 mL of urine sample, and the cap was closed. After heating for 9 minutes at 90 ° C in a headspace sampler, Was injected with helium gas for 30 seconds, and the gas phase extract of the upper layer was injected into the gas chromatograph connected to the headspace sampler for 0.01 minute.
상기 추출단계에서 얻은 기체상 혼합물을 기체크로마토그래프에 주입 후 오븐 안에 장착된 급속냉각장치를 이용하여 모세분리관 앞단에 응축시키는 단계는 급속냉각장치 온도 프로그램 초기 온도를 0 ℃로 설정하여 1.5분간 유지시킨 후 65 ℃/min으로 250 ℃까지 승온하였다.The gas phase mixture obtained in the extraction step is introduced into a gas chromatograph and then condensed in the front end of the capillary separation tube by using a rapid cooling device installed in the oven. The initial temperature of the rapid cooling device temperature program is set to 0 ° C and maintained for 1.5 minutes And the temperature was raised to 250 DEG C at 65 DEG C / min.
상기 응축된 혼합물을 모세분리관이 구비된 기체크로마토그래프를 이용하여 분리하는 단계는 모세분리관의 길이가 30 m, 직경이 0.25 mm, 정지상의 두께가 1.0 μm이고, 정지상의 조성이 5% phenyl 과 95% methyl-polysiloxane인 분리관을 사용하였다. 이때 기체크로마토그래프의 오븐의 초기 온도를 50 ℃로 설정하여 2.5분간 유지시킨 후 40 ℃/min으로 170 ℃까지 승온한 후 60 ℃/min으로 250 ℃까지 승온하여 4.2분간 유지시킨다. 기체상 크로마토그래프의 이동상 기체로는 고순도 헬륨 기체를 사용하였으며 유량은 1.2 mL/min로 설정하였으며 상기 14종의 알코올류 성분을 분석하는데 소요된 시간은 6.1분 이내였다.The separation of the condensed mixture using a gas chromatograph equipped with a capillary separation tube comprises: a capillary tube having a length of 30 m, a diameter of 0.25 mm, a stationary phase of 1.0 μm, a stationary phase of 5% phenyl And 95% methyl-polysiloxane. At this time, the initial temperature of the oven of the gas chromatograph is set at 50 ° C., and the temperature is maintained at 2.5 ° C. for 2.5 minutes. The temperature is then increased to 170 ° C. at 40 ° C./min. High purity helium gas was used as the mobile phase gas of the gas phase chromatograph. The flow rate was set at 1.2 mL / min. The time required for analyzing the 14 kinds of alcohol components was within 6.1 minutes.
탄소수 6개 이내의 알코올류 성분으로 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 1-프로판올, 2-메틸-2-프로판올, 2-부탄올, 2-메틸-1-프로판올, 1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-펜탄올, 사이클로헥산올 14종 및 동소체로 치환된 내부표준물질(internal standard) 에탄올-d6, 2-메틸-2-프로판올-d10, 3-메틸-1-부탄올-d7 3종의 표준물질을 이용하여 개별 시료를 제조하였다.2-propanol, 2-methyl-2-propanol, 2-methyl-1-propanol, 1-butanol and 2-methyl- -butanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 3-methyl-1-butanol, 1-pentanol, cyclohexanol, and 14 kinds of the internal standard is substituted by allotrope (internal standard) ethanol -
개별 시료에 대한 특징적인 이온을 확인하기 위해 검출기로 질량분석기를 사용하여 m/z 20-120 범위의 스캔 방식으로 분석을 수행하였고, 14종의 알코올류 성분의 함량 측정을 위한 정량 이온과 성분 확인을 위한 정성 이온을 표 1에 나타내었다. 14종의 알코올류 성분을 분석하는데 소요된 시간은 6.05분 이내였으며, 이때 크로마토그램을 도 2에 표시하였다.In order to identify characteristic ions for individual samples, a mass spectrometer was used as a detector to perform an analysis using a scanning method in the range of m / z 20-120. In order to measure the contents of 14 kinds of alcohol components, Are shown in Table 1. < tb > < TABLE > The time required for analyzing 14 kinds of alcohol components was within 6.05 minutes, and the chromatogram was shown in FIG.
[표 1][Table 1]
도 2에 나타난 바와 같이 No. 10의 2-펜타놀과 No. 11의 3-펜타놀의 피크가 겹쳐 검출됨을 알 수 있다. 2-펜타놀과 3-펜타놀은 구조이성질체로, 본 발명에서는 도 3에서 나타난 바와 같이, 이러한 구조이성질체 분석이 수월하도록 검출기로 질량분석기를 사용함으로써 물질의 질량스펙트럼으로부터 고유한 특징을 갖는 정량이온 및 정성이온을 선정함으로써 그 질량값(m/z)에 의해 두 이성질체의 분리가 가능하도록 하였다.As shown in Fig. 10 < / RTI > 11 peak of 3-pentanol is detected in a superimposed manner. 2-pentanol and 3-pentanol are structurally isomers. In the present invention, as shown in Fig. 3, quantitative ions having unique characteristics from the mass spectrum of a substance are obtained by using a mass spectrometer as a detector to facilitate such structural isomer analysis And mass ion (m / z) were selected for the separation of the two isomers.
본 발명을 이용하여 소변 내에 포함된 알코올류 성분의 개별 성분의 함량을 측정하기 위해 표준물질 (standard material)의 측정값 변화를 그래프상의 선으로 나타내어 소변 시료의 측정값과 비교함으로써 함량을 측정하였다. 알코올류 성분의 함량 측정은 크로마토그램에서 나타난 피크의 면적을 합한 후, 내부표준법을 적용하여 검량곡선을 작성하여 측정하였다. 알코올류 개별 성분 14종에 대한 검량곡선 작성과 관련된 결과 값을 아래 표 2에 나타내었다.In order to measure the content of the individual components of the alcohol component contained in the urine using the present invention, the content of the reference material was measured by comparing the measured value of the standard material with the measured value of the urine sample. The content of alcohol components was measured by adding the area of the peak shown in the chromatogram and then creating the calibration curve by applying the internal standard method. The results related to the preparation of the calibration curve for the 14 kinds of the individual components of the alcohol are shown in Table 2 below.
[표 2][Table 2]
분석법의 유효화(validation)는 소변 또는 혈액과 같은 생체시료중의 분석물질의 함량을 측정하는 데에 사용되는 특정 방법이 믿을만하고 재현성이 있다는 것을 증명하는 일련의 과정으로, 본 발명을 이용하여 개발된 소변 중 알코올류 성분의 동시분석법의 유효화 요소로 정확성과 정밀성을 측정하였다. Validation of an assay is a series of procedures that demonstrate that the particular method used to measure the content of analyte in a biological sample such as urine or blood is reliable and reproducible. Accuracy and precision were measured as validation factors for simultaneous analysis of urine alcohol components.
측정은 일내, 일간, 시험자간 정확성과 정밀성을 측정하여 나타내었으며, 아래 표 3에 알코올류 성분별 정밀도 및 정확도 측정 결과를 나타내었다.The measurements were made by measuring the accuracy and precision between daily, daily, and tester, and Table 3 below shows the accuracy and accuracy measurement results for each alcohol component.
[표 3] [Table 3]
표 3의 결과, 분석방법의 정밀도와 정확도는 저, 중, 고 3개 농도의 QC 시료(n=6)로 측정하였고 알코올류 성분 14종 모두에 대해 일내(n=6) 정밀도는 8.18% 이내이며 정확도는 -12.9 ~ 10%의 결과를 얻었고, 일간 4세트(n=24) 분석한 결과 정밀도는 12.33% 이내이며 정확도는 -0.1 ~ 0.1%로 양호한 정밀도와 정확도를 보였다. 시험자간 정밀도와 정확도는 3명(n=3)의 시험자가 측정에 참여하여 저, 중, 고 3개 농도의 QC 시료(n=6)로 측정하였으며 정밀도는 14.97% 이내, 정확도는 -0.13 ~ 0.04% 사이의 결과를 나타내었다. Table 3 shows that the accuracy and accuracy of the analytical method were measured with QC samples (n = 6) at low, medium, and high concentrations, and intra-day (n = 6) precision within 8.18% And the accuracy was -12.9 ~ 10%, and the accuracy was within -12.13% and the accuracy was -0.1 ~ 0.1% with good accuracy and accuracy. The precision and accuracy of the test were measured by three (n = 3) testers and the QC samples (n = 6) of low, medium and high concentrations were measured. The accuracy was within 14.97% 0.04%, respectively.
본 발명의 분석법의 일내, 일간, 시험자간 정확도 및 정밀도 값은 미국 식품의약품안전청 가이드라인(US FDA guidance on bioanalytical methods validation 2001) 기준인 정밀도 (% RSD, 15% 이내)와 정확도 (% bias, -15 ~ 15%)에 부합하는 양호한 값을 확인할 수 있었다.
The accuracy and precision of the method according to the present invention are within the range of accuracy (% RSD, within 15%) and accuracy (% bias, based on US FDA guidance on bioanalytical methods validation 2001) 15 to 15%).
실시예Example
2 : 주류 복용자의 소변 중 알코올류 성분 14종 분석 2: Analysis of 14 Alcoholic Components in Urine of Mainstream Users
본 발명의 분석법을 이용하여 주류 복용자의 소변에서 알코올류 성분 분석을 수행하였다. 시중에 판매되는 맥주(O사, 에탄올 함량 4.5%), 막걸리(H사, 에탄올 함량 6%), 양주(B사, 에탄올 함량 43%)를 구입하여 피실험자 6명 중 2명에게는 맥주 1캔(330 mL), 다른 2명에게는 막걸리 2잔(600 mL에 해당), 나머지 2명에게는 양주 2잔(80 mL에 해당)을 복용하게 한 후 1시간 이내에 소변 시료를 채취하였다.Alcohol component analysis was performed in the urine of the mainstream drinker using the assay of the present invention. Purchase of commercially available beer (O company, ethanol content 4.5%), makgeolli (H company, ethanol content 6%) and Yangju (B company, ethanol content 43%) were purchased. 330 mL), two cups of makkolli (equivalent to 600 mL) and two cups of two cups (equivalent to 80 mL). One hour later, urine samples were collected.
실시예 1의 소변 시료 2 mL 대신, 상기 주류 복용자의 소변시료 2 mL를 채취한 것을 제외하고는 전술한 실시예 1과 동일한 처리 방법으로 주류 복용자의 소변 중 알코올류 성분 14종을 분석하였다. 14 kinds of alcoholic components in the urine of the mainstream drinker were analyzed by the same method as in Example 1 except that 2 mL of the urine sample of the mainstream drinker was taken instead of 2 mL of the urine sample of Example 1.
본 발명의 분석법을 이용하여 맥주 복용자 2명(도 5 및 도 6), 막걸리 복용자 2명(도 7 및 도 8), 양주 복용자 2명(도 9 및 도 10)의 소변 시료를 분석한 결과를 도 5-도 10에 도시한 바, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올 성분만 검출되었고, 이외의 나머지 11종의 알코올류 성분은 검출되지 않았다. 검출된 메탄올, 에탄올, 2-프로판올 측정결과는 아래 표 4에 기재하였다. 아래 표4에서 보듯이, 메탄올(0.33 ~ 2.72 μg/mL), 에탄올(0.33 ~ 2.72 μg/mL), 및 2-프로판올(0.33 ~ 2.72 μg/mL)이 검출되었다. Using the assay method of the present invention, the results of analyzing urine samples from two beer drinkers (FIGS. 5 and 6), two makgeolli drinkers (FIGS. 7 and 8), and two drinkers (FIG. 9 and FIG. 10) As shown in FIGS. 5 to 10, only methanol, ethanol and 2-propanol components were detected, and the remaining 11 alcohol components were not detected. The measured methanol, ethanol and 2-propanol measurement results are shown in Table 4 below. Methanol (0.33 to 2.72 μg / mL), ethanol (0.33 to 2.72 μg / mL), and 2-propanol (0.33 to 2.72 μg / mL) were detected as shown in Table 4 below.
[표 4] [Table 4]
실시예Example
3 : 음료수 중 알코올류 성분 14종 분석 3: Analysis of 14 Alcoholic Components in Drinking Water
본 발명의 분석법을 이용하여 시중 음료수 중 알코올류 성분 분석을 수행하였다. 시중에 판매되는 탄산음료(L사) 1종, 보리음료(I사) 1종을 구입하여 분석대상 시료로 사용하였다.Analysis of alcohol components in commercial beverages was performed using the assay of the present invention. One commercially available carbonated beverage (L company) and one barley beverage (I company) were purchased and used as a sample for analysis.
실시예 1의 소변 시료 2mL 대신, 상기 음료 1ml에 증류수 1ml를 넣어 희석한 혼합시료 2ml를 채취한 것을 제외하고는, 전술한 실시예 1과 동일한 처리 방법으로 알코올류 14종 성분을 분석하였다. Instead of 2 mL of the urine sample of Example 1, 14 kinds of alcohols were analyzed by the same treatment method as in Example 1 except that 1 mL of distilled water was added to 1 mL of the beverage to collect 2 mL of the diluted mixed sample.
본 발명의 분석법을 이용하여 시중에 판매되는 2종의 음료 시료를 분석한 결과를 도 11(탄산음료) 및 도 12(보리음료)에 도시한 바, 에탄올 성분만 검출되었고, 이외의 나머지 13종의 알코올 성분은 검출되지 않았다. 검출된 에탄올 성분 양은 아래 표 5에 기재하였다. 아래 표5에서 보듯이, 탄산음료에는 에탄올이 불검출되었으나, 보리 음료에서는 에탄올이 354.3 μg/mL 검출되었다. 이는 보리음료의 제조 또는 유통과정에서 보리음료 원료인 보리가 발효과정을 거치면서 부산물로 에탄올이 생성된 것으로 추정된다.As shown in FIG. 11 (carbonated beverage) and FIG. 12 (barley drink), only the ethanol component was detected, and the remaining 13 kinds of beverage samples were analyzed by the analysis method of the present invention. Was not detected. The amounts of detected ethanol components are listed in Table 5 below. As shown in Table 5 below, ethanol was not detected in carbonated beverages, but 354.3 μg / mL of ethanol was detected in barley beverages. It is presumed that the fermentation process of barley, which is a raw material of barley beverage, produced ethanol as a by - product in the process of manufacturing or distributing barley beverages.
[표 5][Table 5]
실시예Example
4 : 주류 중 알코올류 성분 14종 분석 4: Analysis of 14 kinds of alcohols in alcohol
본 발명의 분석법을 이용하여 시중 주류 중 알코올류 성분 분석을 수행하였다. 시중에 판매되는 맥주(O사, 에탄올 함량 4.5%), 막걸리(H사, 에탄올 함량 6%), 양주(B사, 에탄올 함량 43%)를 구입하여 분석대상 시료로 사용하였다.Analysis of alcohol components in the alcoholic beverage was performed using the assay of the present invention. (O company, ethanol content 4.5%), makgeolli (H company, ethanol content 6%) and Yangju (B company, ethanol content 43%) were purchased and used as sample for analysis.
실시예 1의 소변 시료 2mL 대신, 맥주 0.2 mL에 증류수 1.8 mL, 막걸리 0.05 mL에 증류수 1.98 mL, 양주 0.05 mL에 증류수 1.98 mL를 넣어 희석한 혼합시료 2 mL를 채취한 것을 제외하고는, 전술한 실시예 1과 동일하게 알코올류 14종 성분을 분석하였다. Instead of 2 mL of the urine sample of Example 1, 1. mL of distilled water, 0.05 mL of distilled water, and 1.98 mL of distilled water were added to 0.2 mL of beer, and 1.98 mL of distilled water was added to 0.05 mL of distilled water to obtain 2 mL of the diluted mixed sample. 14 kinds of alcohols were analyzed in the same manner as in Example 1.
본 발명의 분석법을 이용하여 시중에 판매되는 맥주 1종(도 13), 막걸리 1종(도 14) 및 양주 1종(도 15)의 주류 시료를 분석한 결과를 도 13 - 도 15에 도시한 바, 맥주와 막걸리에서는 에탄올, 1-프로판올, 2-메틸-1-프로판올, 3-메틸-1-부탄올의 4종이 검출되었고 다른 10종의 알코올은 검출되지 않았다. 양주는 맥주와 막걸리와 달리 2-부탄올이 추가되어 5종이 검출되었고, 다른 9종의 알코올은 검출되지 않았다. 검출된 알코올 성분 양은 아래 표 6에 기재하였다. 아래 표 6에서 보듯이, 발효과정을 거치는 주류의 경우 제조, 유통, 보관 방법 등 여러 조건의 영향을 받아 알코올류 성분이 달리 생성됨을 알 수 있었다.
The results of analyzing the mainstream samples of one kind of beer (Fig. 13), one type of makkolli (Fig. 14) and one kind of wine (Fig. 15) sold on the market using the analysis method of the present invention are shown in Figs. Four kinds of ethanol, 1-propanol, 2-methyl-1-propanol and 3-methyl-1-butanol were detected in bar, beer and rice wine. No other 10 kinds of alcohol were detected. Unlike beer and makgeolli, 5 kinds of 2 - butanol were added to the bean sprouts and 9 kinds of alcohol were not detected. The detected amounts of alcohol components are listed in Table 6 below. As shown in Table 6 below, the fermentation of alcoholic beverages was affected by various conditions such as manufacturing, distribution and storage, and thus, alcohol components were produced differently.
[표 6][Table 6]
Claims (9)
헤드 스페이스 샘플러에서, 알코올류 다성분이 포함된 소변 시료를 염석(salting out) 및 알코올류 다성분을 기체 혼합물로 추출하는 단계;
상기 추출된 시료를 기체크로마토그래프(gas chromatograph)에 장착된 급속냉각장치(cryogenic trap)를 이용하여 모세분리관 앞단에서 시료를 응축시키는 단계, 여기에서, 상기 응축단계에서 급속냉각장치는 초기 온도를 5 ℃ 이하로 설정하여 1 ~ 2분간 유지시킨 후 60 ~ 70 ℃/min 으로 200 ~ 300 ℃까지 승온하며;
상기 응축된 시료를 기체크로마토그래프(gas chromatograph)에 장착된 모세분리관을 이용하여 분리하는 단계; 및
상기 분리된 알코올류 다성분을 이온화한 후 질량분석기로 분석하는 단계를 포함하며,
상기에서 탄소수 6 이하의 알코올류 다성분은 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 1-프로판올, 2-메틸-2-프로판올, 2-부탄올, 2-메틸-1-프로판올, 1-부탄올, 2-메틸-2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 3-메틸-1-부탄올, 1-펜탄올, 및 사이클로헥산올인 것을 특징으로 하는 알코올류 다성분 동시분석법. The present invention relates to a method for simultaneous analysis of multi-component alcohols having 6 or less carbon atoms,
In a headspace sampler, a step of extracting a urine sample containing an alcohol multi component by salting out and an alcohol multi component into a gas mixture;
Condensing the extracted sample at the front end of the capillary separation tube using a cryogenic trap mounted on a gas chromatograph, wherein the rapid cooling device in the condensing step is operated at an initial temperature The temperature is set to 5 ° C or less, and the temperature is maintained for 1 to 2 minutes, and then the temperature is raised to 200 to 300 ° C at 60 to 70 ° C / min;
Separating the condensed sample using a capillary separation tube mounted on a gas chromatograph; And
Ionizing the separated alcohol component, and analyzing the separated alcohol component by a mass spectrometer,
The alcohols having a carbon number of 6 or less may be selected from the group consisting of methanol, ethanol, 2-propanol, 1-propanol, 2-methyl-2-propanol, 2- 2-butanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 3-methyl-1-butanol, 1-pentanol and cyclohexanol.
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