KR101535319B1 - 후생적 조절의 소형 분자 조절물질, 그리고 이들의 치료적 적용 - Google Patents

후생적 조절의 소형 분자 조절물질, 그리고 이들의 치료적 적용 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 전사 인자, 특히 후생적 조절인자 (히스톤 제한 효소)를 특정한 DNA 프로모터로 동원하는 전사 인자의 기능을 조절하기 위한 방법과 조성물이 개시된다. 표적화된 전사 인자에는 근육세포 강화 인자 (MEF2), 포크헤드 (forkhead)/날개 나선 (winged helical) 전사 인자 FOXP3 및 전사 인자 GATA3이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명에서는 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC), p300/CBP와 Cabin1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 MEF2 및 이의 연관된 인자의 소형 분자 조절물질, 그리고 이들의 치료적 적용이 개시된다.

Description

후생적 조절의 소형 분자 조절물질, 그리고 이들의 치료적 적용{SMALL MOLECULE MODULATORS OF EPIGENETIC REGULATION AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATIONS}
관련된 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2008년 11월 5일 제출된 U.S. 가출원 번호 61/111,689, 그리고 2009년 9월 29일 제출된 U.S. 가출원 번호 61/246,934에 우선권을 주장하고, 이들 가출원은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
연방 정부의 지원을 받은 연구와 개발에 관한 진술
본 발명은 부분적으로, N1H R21AI49905, RO1HL076334, 그리고 RC1DA028790로부터 보조금 지원을 받아 완성되었다. 이런 이유로, U.S. 정부는 일정한 권리를 갖는다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 전반적으로, 특정 의약 분야에 관계한다. 특히, 본 발명은 전사 인자, 특히 후생적 조절인자 (히스톤 제한 효소)를 특정한 DNA 프로모터로 동원하는 전사 인자의 기능을 조절하기 위한 방법과 조성물에 관계한다. 표적화된 전사 인자에는 근육세포 강화 인자 (MEF2), 포크헤드 (forkhead)/날개 나선 (winged helical) 전사 인자 FOXP3 및 전사 인자 GATA3이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC), p300/CBP와 Cabin1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 MEF2 및 이의 연관된 인자의 소형 분자 조절물질, 그리고 이들의 치료적 적용에 관계한다.
본 발명의 배경기술
본 발명은 특정 질환과 연관된 전사 인자의 기능을 조절하기 위한 소형 분자의 용도에 관계한다. 전사 인자는 특정한 DNA 서열에 결합하고, 그리고 직접적으로 또는 연관된 단백질, 예를 들면, 보조-활성물질과 보조-억제물질을 통하여, 또는 히스톤 제한 효소, 예를 들면, 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제 (HAT)와 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC)를 동원함으로써 유전자 발현을 조절하는 단백질이다. 전사 인자는 유전자 발현의 적절한 수준을 담보함으로써 많은 생물학적 과정에서 핵심적인 역할을 한다. 이들은 또한, 전사를 조절하는 그들의 능력이 비정상적으로 변경되면, 일정한 질병 상태 (disease state)와 연관될 수 있다. 이런 이유로, 일정한 전사 인자의 기능을 선별적으로 조정할 수 있는 소형 분자의 확인과 개발은 잠재적으로 새로운 치료적 적용을 결과할 수 있다. 본 발명은 2가지 기본적인 아이디어에 기초된다. 한 가지는 특정한 전사 인자, 예를 들면, MEF2, FOXP3과 GATA3에 결합하고, 그리고 전사 보조-활성물질과 보조-억제물질과 이의 상호작용을 조정하는 소형 분자를 개발하는 것이다. 다른 한 가지는 크로마틴의 특정한 영역으로 HAT (가령, p300과 CBP)와 HDAC 및 다른 히스톤 제한 효소 (가령, 히스톤 메틸트랜스퍼라아제와 디메틸라아제, DNA 메틸트랜스퍼라아제), 그리고 크로마틴 재형성 기구의 동원을 차단하는 소형 분자를 개발하는 것이다.
특히, 본 발명은 근육계, 면역계와 신경계의 발달과 적응 반응에서 결정적인 역할을 하는 근육세포 인핸서 인자-2 (MEF2)에 관계한다 (Flavell et al., 2006; Kim et al., 2008; Mao et al., 1999; McKinsey et al., 2002; Pan et al., 2004; Potthoff and Olson, 2007; Youn and Liu, 2000; Youn et al., 1999). MEF2는 심장 근육 세포 내에서 비대성 (hypertrophic) 반응의 핵심적인 조절물질로서 관련된다. 병리학저 자극에 의해 유발된 심장 비대 (heart hypertrophy)는 많은 형태의 심혈관 질환에서 심부전 (heart failure )을 유발할 수 있다.
MEF2는 일반적으로, 4개의 구성원: MEF2A, MEF2B, MEF2C와 MEF2D를 보유하는 전사 인자 집단을 정의한다. 이들의 기능의 중요성은 뮤린과 초파리 유전적 특질의 이용을 통하여 상세하게 입증되었다 (Potthoff and Olson, 2007). MEF2는 최초에 확인된 골격근 내에서 근육형성 염기성 나선-루프-나선 전사 인자, 예를 들면, MyoD와 함께, 근육발생 (myogenesis)을 촉진하고 유지시킨다 (Molkentin and Olson, 1996). MEF2 집단의 구성원인 MEF2A는 최근에, "심장 마비 유전자 (heart attack gene)"로 낙인되었는데, 그 이유는 상기 단백질에서 돌연변이가 관상 동맥 질환 (coronary artery disease, CAD) 및 심근 경색 (myocardial infarction, MI)에 관련되기 때문이다 (Wang et al., 2003). 이들 발견은 인간 심장 질환에서 MEF2의 결정적인 역할을 뒷받침한다 (Kim et al., 2008; Wei et al., 2008; Zhang et al., 2002).
MEF2는 현재, 많은 다른 세포 유형에서 보편적 전사 인자인 것으로 알려져 있다. 가령, MEF2는 림프계 발달에서 칼슘 신호전달을 매개하기 위한 중요한 전사 인자 중의 하나이다 (Pan et al., 2004; Youn and Liu, 2000; Youn et al., 1999). MEF2는 사이토킨 발현과 면역 반응을 조절한다. MEF2는 또한, 뉴런 생존과 시냅스 재형성의 기초가 되는 전사 프로그램을 조절한다 (Chen and Cepko, 2009; Flavell et al., 2006; Flavell and Greenberg, 2008; Flavell et al., 2008; Mao et al., 1999; Morrow et al., 2008; Shalizi et al., 2006; Shalizi and Bonni, 2005; Yang et al., 2009). 이들 관찰 결과는 MEF2 기능을 조절하는 소형 분자가 심장 비대와 심부전, 자가면역 질환과 이식 거부반응, 신경변성 질환, 그리고 학습과 기억의 병리학적 손상에서 치료 효과를 나타낼 수 있음을 암시한다 (Fischer et al., 2007; Stefanko et al., 2009).
세포 내에서, MEF2의 작용은 3가지 상이한 단계를 포함한다: (i) 전사 억제; (ii) 칼슘-의존성 탈-억제; 그리고 (iii) 전사 활성화. MEF2에 의한 전사 억제는 내재성 또는 연관된 히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) 활성을 갖는 다양한 전사 보조-억제물질과의 결합에 의존한다. T 세포 내에서, MEF2는 Cabin1에 결합하고, 이는 차례로, 클래스 I HDAC, 예를 들면, HDAC1, HADC2와 HDAC3과 결합한다 (Youn and Liu, 2000). 근육 세포내에서, MEF2는 클래스 II HDAC, 예를 들면, HDAC4, HDAC5, 그리고 HDAC9에 직접적으로 결합하고, 그리고 근육의 발달과 적응 반응에 관여하는 특정한 유전자의 발현을 저해한다 (Chan et al., 2003; Gregoire et al., 2006; Gregoire and Yang, 2005; McKinsey et al., 2001, 2002; Miska et al., 1999; Sparrow et al., 1999). HDAC5 또는 HDAC9가 녹아웃 (knock out)된 생쥐는 비대성 자극에 증가된 민감성을 보였는데, 이는 심장 비대에서 클래스 II HDAC의 중요한 역할을 암시하였다 (Potthoff and Olson, 2007). 이들 데이터는 MEF2와 클래스 II 히스톤 디아세틸라아제 (HDACs), 그리고 특히 HDAC5와 HDAC9는 심장근육세포에서 비대성 신호의 핵심적인 매개물질임을 지시한다. 충분한 데이터는 MEF2/클래스 II HDAC 경로가 심장 비대에 대한 잠재적인 치료 표적임을 암시하였다.
특정한 칼슘 신호에 응하여, Cabin1과 HDAC가 MEF2로부터 제거되었다 (Potthoff and Olson, 2007). MEF2는 이후, 보조-활성물질, 예를 들면, p300과 CBP를 동원하여, 다양한 전사 활성물질과 보조-활성물질과의 결합에 의한 상이한 프로그램을 가동시킨다 (McKinsey et al., 2001; Sartorelli et al., 1997; Slepak et al., 2001; Wei et al., 2008). p300의 작은 증가가 MEF2-의존성 심장 비대를 유발하는데 필수적이고 충분한 것으로 밝혀졌다. MEF2는 충분히 특성화된 MADS-상자와 MEF2-특정한 도메인으로 구성되는, 고도로 보존된 N-말단 영역 (잔기 2-93)을 보유한다 (Shore and Sharrocks, 1995). MADS-box/MEF2 도메인은 기능이 눈에 띄게 풍부하고, DNA 결합, 이합체화, 그리고 Cabin1, 클래스 IIa HDAC와 p300/CBP를 비롯한 무수한 MEF2 전사 상대와의 단백질-단백질 상호작용을 매개한다 (McKinsey et al., 2001, 2002). MEF2 내에서 MADS-box/MEF2 도메인이 클래스 II HDAC와 Cabin1에서 보존된 소형 모티프와 결합하는데 필수적이고 충분한 것으로 밝혀졌다. 또한, p300과 CBP의 CH3 도메인이 MADS-box/MEF2 도메인에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
당분야에서 가용한 다양한 세포 과정에서 MEF2의 관련에 관한 광범위한 지식에도 불구하고, 적절한 분자 도구의 부재로 인하여 이러한 지식을 활용하는 것이 불가능하였다. 특히, 소형 분자로 MEF2의 활성을 어떻게 조절할 것인 가는 오랫동안 해결되지 못한 과제이었다. 이는 MEF2가 임의의 명백한 효소 활성이 없는 상대적으로 작은 전사 인자이기 때문이다; 이의 주요 기능은 특정한 DNA에 결합하고, 그리고 전사 보조-조절물질, 예를 들면, Cabin1, 클래스 II HDAC와 p300/CBP를 특정한 프로모터에 동원하는 것이다. 이러한 양식의 기능은 일반적으로, 약제가능한 것으로 간주되지 않거나, 또는 소형 분자에 의한 표적화가 적어도 매우 어렵다. 이런 분자의 발견 또는 산출은 이러한 분야에서 진전을 더욱 촉진하고, 그리고 염증, 자가면역 질환, 신경변성 질환, 암, 그리고 심혈관 질환을 비롯한 MEF2-연관된 질환에 대한 새로운 기전-기초된 및 구조-기초된 치료 적용을 결과할 수 있다.
본 출원에서 기술된 발명은 다른 전사 인자, 예를 들면, 포크헤드/날개 나선 전사 인자 FOXP3의 활성 조절에도 적용될 수 있다 (Bennett et al., 2001; Fontenot et al., 2003; Hori et al., 2003; Wu et al., 2006; Zheng and Rudensky, 2007). FOXP3은 조절물질 T 세포 (Treg)의 발달과 기능에 결정적인 핵심 전사 인자이다. Treg는 면역계의 과도한 활성화를 억제하는데 필요한 T 세포의 특수한 개체군이다. 돌연변이 및 다른 기전에 의한 FOXP3의 기능 상실은 치명적인 자가면역 질환, 예를 들면, IPEX를 유발하는 반면, FOXP3 또는 이의 활성의 강화된 발현은 억제 기능을 공여할 수 있다. 상승된 FOXP3 기능은 자가면역 질환과 이식 거부반응을 치료하는데 유익할 수 있고, 반면 FOXP3 활성의 전략적인 하향 조절은 면역-기초된 항-종양 요법을 개발하는데 이용될 수 있다 (Zuo et al,, 2007a; Zuo et al., 2007b). 따라서 FOXP3에 결합하고 보조-억제물질과 보조-활성물질과 이의 상호작용을 조절하는 소형 분자는 자가면역 질환, 이식 거부반응과 암 요법에서 치료적으로 적용될 수 있다.
MEF2에 유사하게, FOXP3의 기능은 HAT (가령, TIP60) 및 HDAC (클래스 I과 클래스 II HDAC 포함)를 비롯한 전사 보조-조절물질에 의해 강하게 조절된다 (Li et al., 2007). 따라서 FOXP3에 결합하고, 그리고 후생적 조절인자, 예를 들면, 히스톤 제한 효소와 크로마틴 재형성 기구를 비롯한 보조-조절물질과 이의 상호작용을 차단하는 소형 분자가 본 발명에서 기술된 방법에 의해 개발될 수 있다.
유사하게, 표적화 전사 보조-조절물질 역시 이러한 과제의 일부를 충족시킨다.
전사 인자, 예를 들면, MEF2의 전사 보조-조절물질 중에서, 클래스 II HDAC는 가장 많이 연구된 군이다.
히스톤 디아세틸라아제 (HDAC) (EC 번호 3.5.1)는 히스톤 상에서 ε-N-아세틸 리신 아미노산으로부터 아세틸 기를 제거하는 일군의 효소이다. 이의 작용은 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제 (HAT)의 작용과 정반대이다 .
HDAC 단백질은 현재, 다수의 비-히스톤 단백질 역시 포함하는 그들의 표적보다는 그들의 활성을 더욱 정확하게 기술하기 위하여 리신 디아세틸라아제 (KDAC)로 지칭된다.
그들의 이름이 암시하는 바와 같이, HDAC 주요 기능 중의 한 가지는 히스톤 단백질로부터 아세틸 기를 제거하는 것이다. 히스톤 단백질은 크로마틴의 주요한 단백질 성분이다. 이들은 주변에 DNA가 감겨지는 스풀 (spool)로서 기능하고, 그리고 유전자 조절과 DNA 패키징 (packaging)에서 중요한 역할을 수행하다. 히스톤 단백질은 꼬리를 보유하고, 이들 꼬리는 그들의 리신과 아르기닌 아미노산 상에 존재하는 아민 기로 인하여 정상적으로 양으로 하전된다. 이들 양성 전하는 히스톤 꼬리가 DNA 골격 상에 음으로 하전된 인산염 기와 상호작용하고 이들에 결합하는데 도움을 준다.
DNA와 히스톤 사이에 결합은 DNA에 접근하는 전사 인자의 능력을 조절함에 있어 결정적인 제어 기전으로서 기능하다. DNA와 히스톤 간에 강한 결합은 전사 인자에 의한 접근을 제한하고, 따라서 유전자 전사를 억제한다 (Morrison et al, 2007). 히스톤 또는 DNA의 변형은 그들의 결합 강도를 변화시키고, 따라서 전사 활성을 조절할 수 있다 (Morrison et al., 2007). 메틸, 인산염, 또는 아세틸 모이어티의 공유 부가는 뉴클레오솜 상태를 변화시키고 결과적으로, 전사에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 아세틸화는 히스톤 상에 보존된 N-말단 리신 잔기의 ε-아미노 기에 아세틸 기의 부가에 기인한다. 히스톤에 아세틸 기의 부가는 양으로 하전된 히스톤 단백질과 음으로 하전된 DNA 인산염 골격 사이에 인력 (attractive force)을 감소시키고 더욱 이완되고 접근가능한 크로마틴 구조를 발생시킨다. HAT는 히스톤 아세틸화를 촉진하고, 따라서 전사 활성물질인 것으로 생각된다. 반대로, HDAC는 히스톤로부터 아세틸 기를 제거하고, 따라서 전사를 억제하는 역할을 한다. 따라서 국소 크로마틴 구조와 유전자 발현을 일차적으로 지배하는 것은 HAT와 HDAC 활성 간에 상호작용이다. HDAC는 크로마틴의 디아세틸화를 통하여 전반적인 유전자 전사를 변화시킨다. 흥미롭게도, HDAC는 DNA 서열에 직접적으로 결합하지 않고 표적 유전자 인식을 위한 추가적인 인자를 필요로 한다 (Morrison et al., 2007).
기능과 DNA 서열 유사성에 기초하여 4가지 인정된 HDAC 단백질의 아류형 (클래스 I - IV)이 존재한다. 첫 번째 2개의 아류형은 "고전적" HDAC인 것으로 간주되고, 이의 활성은 트리코스타틴 A (TSA)에 의해 저해된다. 클래스 I HDAC에는 HDAC 1, 2, 3과 8이 포함되고, 이들은 편재적으로 발현된다 (Zhang and Olsen, 2000). 클래스 II HDAC는 2가지 하위군, IIa (4, 5, 7과 9 포함), 그리고 IIb (HDAC6과 HDAC1O 포함)을 보유한다. 클래스 IIa는 카르복실-말단 촉매 도메인 및 전사 인자의 근육세포 인핸서 인자 2 (MEF2) 집단의 구성원과의 상호작용을 매개하는 아미노-말단 신장으로, 공통의 구조 조직을 공유한다. HDAC는 또한, 일반적으로 핵 내에서 관찰되는 클래스 I과 세포하 국지화 (sub세포 localization)의 측면에서 상이한데, 클래스 IIb는 주로 세포질 내에 위치하고, 반면 클래스 IIa는 핵과 세포질 사이를 왕복한다. 클래스 I HDAC와 달리, 클래스 IIa HDAC는 조직-제한되고, 특히 심장, 골격근, 그리고 뇌에서 발현 수준이 높다 (Zhang et al., 2002). 클래스 III는 TSA에 의해 영향을 받지 않는 NAD+-의존성 단백질 집단이고, 그리고 클래스 IV는 비정형 범주인 것으로 간주된다. HDAC11은 클래스 V로 분류된다.
HDAC가 세포 과정에서 수행하는 중요한 역할을 고려할 때, HDAC 저해물질 (HDACi)의 의학적 적용은 집중적인 연구 분야이다. 하지만, 의약에서 HDACi의 대부분의 용도는 기초 기전에 관한 지식 없이 발견되었다. 가령, 정신병학과 신경학에서, 밸프로산은 역사적으로 오랫동안 기분 안정제 (mood stabilizer)와 항-간질약 (anti-epileptics)으로 이용되어 왔다.
밸프로산의 항경련 특성 (anticonvulsant property)은 항경련약으로서 조사되던 다수의 다른 화합물에 대한 운반제로서 이용될 때, 우연하게 발견되었다. 시간이 지난 이후에, 밸프로산은 HDACi로서 확인되었다. 최근 몇년간, HDACi는 신경변성 질환의 완화제 또는 치료제로서 활발하게 연구되고 있다. 또한, 암 요법을 위한 HDACi를 개발하려는 집중적인 노력이 경주되고 있다. 가령, Vorinostat (SAHA)가 최근에, 피하 T-세포 림프종 (CTCL)의 치료용으로 승인되었다. CTCL에 대하여 임상 평가 중에 있는 대안적 약제는 환형 데시펩티드 (cyclic depsipeptide) 자연 산물 FK228 (Romidepsin)인데, 이는 클래스 I HDAC의 강력한 저해물질이다. 이에 더하여, 감염된 인간에서 HIV의 잠복 풀 (latent pool)에 대한 밸프로산의 효과를 조사하는 임상 연구가 진행되고 있다. HDACi의 의학적 적용에서 증가하는 관심에도 불구하고, 이들 화합물이 작용하는 정확한 기전은 여전히 충분히 이해되지 못하고 있다. 따라서 이들 노력은 대부분, 억측 및 시행착오 실험에 의해 인도된다.
HDACi의 이용에서 한 가지 특정 문제점은 HDAC 활성을 저해하는 것으로 알려져 있는 대부분의 소형 분자가 HDAC의 촉매 활성을 표적함으로써 기능하도록 설계되어 있다는 점이다. 하지만 활성 부위가 다수의 상이한 HDAC 동종형에 의해 공유되는 보존된 특징이기 때문에, 동종형-선별적 HDACi를 확인하는 것이 본질적으로 어렵다. 이런 이유로, 대부분의 HDACi는 낮은 특이성 (specificity)을 갖고, 그리고 HDAC의 임의의 특정한 종류의 특정한 표적화가 불가능하다. 가령, 트리코스타틴 A (TSA)는 낮은 나노몰 범위에서 IC50으로, 현재 알려진 가장 강력한 가역성 HDACi 중의 하나이다. 히드록사민산 기 및 페닐 기에 5개-탄소 원자 링커를 보유하는 TSA는 HDAC의 활성 부위 내로 적합되는 최적 형태를 갖는다 (de Ruijter et al., 2003; Somoza et al., 2004). 모든 HDAC는 TSA에 의한 저해에 대략 동등하게 민감한 것으로 생각된다 (de Ruijter et al., 2003).
이런 이유로, HDAC의 기능을 저해하고, 따라서 관련된 전사 인자의 활성을 조절하는 소형 분자의 발견에서 주요한 장애물은 현재의 최신 기술이 이들 HDAC 효소의 활성 부위에 결합하는 능력을 통하여 확인되고 평가되는 HDACi의 발견과 최적화에 집중된다는 점이다. 전형적으로, 이들 HDACi는 일반식 R-L-Z를 갖는데, 여기서 R은 활성 부위 아연 원자에 결합하는 Zn2+ -킬레이트화 기 Z에 짧은 지방 링커 L을 통하여 연결된 단백질 표면 인식 기이다. 공지된 HDACi에서 특징되는 가장 일반적인 킬레이트화 기 (Z)는 히드록사민산 (TSA, vorinostat, LAQ824, belinostat), 티올 유도체 (FK228, largazole) 또는 친전자성 케톤이다 (trapoxin A). Zn2+과 같은 금속 양이온에 강하게 결합하는 이런 기의 잠재적인 단점은 이들이 특정 단백질에 대한 충분한 선택성이 부재하고 다양한 부작용을 유발할 수 있다는 점이다.
다른 종류의 공지된 HDACi는 MS-725, MGCD0103, 피멜로일아닐리드 오르토-아미노아닐리드 (PAOA), 그리고 프리드라이히 실조증과 헌틴텅병을 비롯한 신경변성 질환에 대한 잠재적인 치료제로서 조사되고 있는 화합물 106 (N'-(2- 아미노페닐)-N7-p-톨릴헵탄디아미드)을 비롯하여, 오르토-아미노아닐리드 (2-아미노아닐리드) 모이어티를 특징으로 하는 벤자미드이다 (Chou et al., 2008; Herman et al., 2006; Paris et al., 2008; Rai et al., 2008; Thomas et al., 2008; Wong et al., 2003).
이러한 종류의 HDACi의 작용의 상세한 분자 기전이 알려져 있진 않지만, 이들 분자는 결합 모티프에 관한 직접적인 증거가 부족하긴 하지만, HDAC 활성 부위의 아연 원자에 o-아미노아닐리드 기의 결합에 관여하는 것으로 가정되었다. 게다가, 이런 분자는 비록 다른 비-선별적 HDACi가 유사한 활성을 보이진 않았지만, HDAC 기능의 저해를 함축하는 생물학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 가령, 화합물 106은 약한 HDAC 저해에도 불구하고 프라탁신 (frataxin)의 유도에 매우 능동적인 것으로 밝혀진 반면, 밀접하게 관련된 HDACi, 예를 들면, SAHA는 이러한 유형의 활성을 갖지 못하였다. 결과적으로, 이러한 종류의 화합물의 작용을 위한 분자 기전의 부재에 비추어, 이들의 치료 잠재력의 최적화가 방해되었다.
다양한 HDAC 동종형의 충분히 조절된 생물학적 역할에 기인하는 여러 추가적인 인자는 HDACi의 설계에 전통적인 접근에 대한 추가의 과제를 부과한다. 아세틸화된 히스톤의 양은 HDACi의 존재에서 증가하는 것으로 실험적으로 밝혀졌다. 하지만, DNA-결합된 전사 인자에 의한 HAT와 HDAC의 동원은 배열된 하위 유전자에 세포 유형 특이성과 신호 의존성 조절을 공여하는 다중-단백질 전사 조절 복합체의 형성을 결과한다. HDAC를 무차별적으로 저해하는 HDACi를 이용하는 것은 복잡하고 정교하게 균형된 기계 내로 몽키 랜치 (monkey ranch)를 던져 넣는 것과 유사하다. 이는 HDACi를 수반하는 다수의 시험에서 관찰되는 다수의 바람직하지 않은 부작용을 설명한다.
HDACi의 임상적 용도를 조사할 때 마주치는 문제점은 또한, 후생적 조절을 조사하는 연구자에 의해 공유된다. 후생적 조절은 DNA 서열을 영구적으로 변화시키지 않으면서 유전하는 유전자 발현 패턴의 확립이다. 이는 세포 기능을 조절하기 위한 핵심 기전으로서 부상하고 있다.
후생적 조절의 변경은 많은 질환, 특히 암의 징표이다. 전형적으로, 표현형 스크리닝 (phenotypic screening)을 통해 발견되는, 이들 질환의 치료에서 약물로서 개발되는 소형 분자는 세포 과정의 후생적 조절을 조정함으로써 기능한다. 이와 같이, 후생적 조절의 근본적인 기전은 집중적인 관심 분야이다. 이와 동시에, 소형 분자 후생적 조절인자에 대한 탐색은 약물 발견을 위한 매우 유망한 분야가 되고 있다.
후생적 조절이 거의, DNA (가령, DNA 시토신 메틸트랜스퍼라아제) 또는 단백질에 작용하는 효소 (가령, HAT, HDAC, 히스톤 메틸라아제, 그리고 히스톤 디메틸라아제)에 의한 크로마틴 구조의 화학적 변형을 통하여 달성되기 때문에, 이러한 배경에서 DNA 전사의 조절에서 HDAC의 역할은 후생적 조절의 한 성분으로 간주될 수 있다. HDACi와 유사하게, 후생적 조절인자의 대부분의 현재의 화학적 조절물질은 종종, 상이한 세포 역할을 갖는 복수 효소에 의해 공유되는 그들의 촉매 부위에 결합함으로써 이들 효소를 저해한다.
전사 인자, 예를 들면, MEF2의 역할, 그리고 여러 주요 질환에서 이의 연루에 관한 최근의 진전에도 불구하고, MEF2의 기능을 조정할 수 있는 소형 분자를 확인하는 것이 불가능하다. 이런 분자는 상기 분야에서 진전을 더욱 조장할 것이고, 그리고 염증, 자가면역 질환, 신경변성 질환, 암, 그리고 심혈관 질환을 비롯한 MEF2-연관된 질환에 대한 새로운 기전-기초된 및 구조-기초된 치료적 적용을 결과할 수 있다.
이런 이유로, 이러한 연구 분야에서 보편적인 문제점은 특정한 후생적 조절인자 효소 또는 단백질을 표적할 수 있는 소형 분자의 부재이다. 다른 문제점은 전체 효소 또는 단백질 종류에서 넓은 스펙트럼 활성으로 인하여, 연관된 단점 없이 필요한 선택성을 제공하는 방식으로 이런 소형 분자의 설계, 평가와 최적화를 위한 방법의 부재이다. 이런 분자는 후생적 조절의 기본 기전, 그리고 표적화된 치료 개입 (therapeutic intervention)을 위한 치료제를 연구하는 분자 도구로서 중요한 적용을 가질 것이다.
본 발명의 요약
광범위한 화학적 및 구조적 연구 (Guo et al., 2007; Han et al., 2005; Han et al., 2003)를 통하여, 본 발명자들은 예상치 않게, 소형 분자를 이용한 MEF2 활성의 조절을 가능하게 만드는 MEF2의 독특한 구조적 특징을 발견하였다. 이러한 발견은 통상적인 지식에 반하고 새로운 가능성의 문을 열어놓았다는 점에서 본 발명의 핵심이다. 이러한 예상치 못한 발견에 기초하여, 본 발명자들은 계면 저해물질을 통해 전사 인자 및 그들의 보조-인자 사이에 상호작용을 차단함으로써 세포 과정을 조절하기 위한 포괄적인 전략을 창안하였다. 따라서 본 발명에서는 인자-보조인자 복합체의 계면 표면에 있는 부위에 결합하여 상기 복합체의 형성을 파괴할 수 있는 소형 분자 조절물질을 확인하고, 스크리닝하고, 분석하고, 그리고 합성하기 위한 방법을 제시한다.
따라서 본 발명에서는 이전에 "약제불가능" 전사 인자, 예를 들면, MEF2를 표적으로 하는 오랫동안 해결되지 못한 문제점을 해결하였다.
HDACi에서 직면하는 특이성 문제점과 관련하여, 본 발명에서는 HDAC 기능의 소형 분자 조절물질의 개발을 위한 대안적 접근법을 제공한다. 본 발명은 특정 HDAC의 활성 부위를 표적으로 하지 않고, 전사를 조절하는데 요구되는 연관된 전사 인자와 HDAC의 결합 부위를 표적으로 한다. 상이한 HDAC 아류형이 이들 단백질-단백질 상호작용의 계면을 표적으로 함으로써 상이한 전사 인자에 상이한 결합 표면을 갖기 때문에, 보존성 활성 부위에 의해 유발된 특이성 문제가 해결된다.
특히, 본 발명에서는 전사 인자 MEF2와 클래스 IIa HDAC 사이에 상호작용을 표적으로 한다. MEF2의 활성은 특정한 프로모터 상에 MEF2에 결합하여 표적 유전자 발현을 억제하는 클래스 IIa HDAC에 의해 조절된다 (Potthoff and Olson, 2007). 다양한 암의 치료를 위하여 개발되고 있는 HDAC의 일부 소형 분자 저해물질 (HDACi)은 또한, 심장 비대, 신경변성 질환, 그리고 면역 기능장애를 비롯하여 MEF2와 HDAC 활성의 탈조절이 관련되는 질환에서 치료 잠재력을 보인다 (Morrison et al., 2007; Paris et al., 2008). 이들 관찰 결과는 클래스 IIa HDAC:MEF2 상호작용을 차단하는 소형 분자가 구성원-특정한 HDACi와 유사한 임상적 혜택을 제공할 수도 있다는 것을 암시한다 (Guo et al., 2007; Han et al., 2005; Han et al., 2003).
클래스 IIa HDAC는 근육, 뉴런과 T 세포 내에서 MEF2와 긴밀하게 작용한다. 클래스 IIa HDAC는 DNA에 결합하지 않지만 프로모터 표적화를 위하여 DNA-결합된 MEF2와의 상호작용에 의존한다. 이러한 상호작용은 클래스 IIa HDAC 내에 보존된 짧은 친양쪽성 나선에 의해 매개되지만 MEF2의 MADS-box/MEF2 도메인 상에 소수성 그루브 (groove)에 결합하는 다른 HDAC에 의해 매개되지 않는다 (Guo et al., 2007; Han et al., 2005; Han et al, 2003). 이런 리간드/수용체 유사 결합 기전은 소형 분자를 이용하여 MEF2-특정한 프로모터로 클래스 IIa HDAC의 동원을 차단하는 것이 가능할 수도 있음을 암시한다 (Guo et al., 2007; Han et al., 2005; Han et al., 2003).
본 발명은 MEF2에 결합하는 소형 분자가 전사 보조-조절물질, 예를 들면, Cabin1, 클래스 IIa HADC와 p300/CBP의 동원에서 이의 활성을 조절할 수 있다는 것을 암시하는 체계적인 구조와 생화학적 연구에 기초된다 (Guo et al., 2007; Han et al., 2005; Han et al., 2003). 이들 보조-조절물질의 대부분은 크로마틴 (가령, HDAC, p300과 CBP)을 변경하는 내재성 기능, 또는 크로마틴 제한 효소와 기구 (가령, 클래스 IIa HDAC에 결합하는 Cabin1, HPl, CtBP, 14-3-3에 결합하는 mSin3A)를 동원하는 능력을 갖는다. 따라서 MEF2에 결합하고 다른 전사 보조-조절물질과 이의 상호작용을 조절하는 소형 분자는 MEF2가 핵심적인 조절 역할을 수행하는 조직 내에서 후생적 조절인자로서 기능할 수 있다. 이런 이유로, 이들 소형 분자는 MEF2-의존성 유전자 발현의 활성이 정상적으로 조절되지 않는 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 이러한 조절장애는 MEF2 및 이의 연관된 인자의 유전자 돌연변이, 감소된 또는 과도하게 활성화된 MEF2 기능을 유발하는 감소된 또는 과도한 신호, MEF2에 결합하고 이와 상호작용하는 보조-인자의 비정상적인 과소- 또는 과다-발현에 기인할 수 있다. MEF2-결합 소형 분자의 잠재적인 임상적 적용에는 근육계, 면역계와 신경계의 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 근육계에서 질환은 심장 비대, 근육 섬유 종류 재형성, 그리고 불균형한 MEF2 기능에 기인하는 다른 근육 관련된 질환이다. 면역계에서 질환은 과도한 또는 너무 적은 MEF2-의존성 유전자 발현에 기인하는 다양한 자가면역 질환 또는 면역 결핍이다. MEF2-결합 소형 분자는 또한, 이식 거부반응을 예방하기 위하여 조절 T 세포의 기능 및 전반적인 면역 반응을 조작하는데 이용될 수 있다. MEF2-의존성 유전자 발현은 시냅스 재형성과 뉴런 생존에 밀접하게 연관되기 때문에, MEF2-결합 소형 분자는 또한, 다양한 신경변성 질환 (가령, 알츠하이머병과 헌팅턴병 등), 자폐증, 정신병적 질환, 그리고 탈조절된 MEF2 기능에 기인하는 손상된 학습과 기억을 치료하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 소형 분자 조절물질이 전사 인자와 그들의 보조-인자의 단백질-단백질 상호작용 계면에 위치하는 결합 부위를 표적으로 함으로써 기능하기 때문에, 이들은 본 명세서에서, 계면 저해물질로서 지칭된다.
본 발명의 기본 원리를 설명했기 때문에, 하기에서는 본 발명의 다양한 측면과 구체예를 요약한다:
첫 번째 측면에서, 본 발명에서는 후보 계면 저해물질을 스크리닝하거나, 확인하거나, 또는 최적화하는 분석법을 제시한다. 본 발명의 이러한 측면에 따른 분석법은 일반적으로, 후보 계면 저해물질을 평가 요소에 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 요소는 단백질-단백질 계면에 의해 정의된 분자 표면을 포함하고, 상기 계면은 각 MEF2 단량체의 베타 가닥 S1, S2와 S3 및 나선 H2, 그리고 Cabin1과 HDAC4와 FIDAC9로부터 짧은 나선 모티프를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 평가 요소는 후보 저해물질에 관한 정보를 제공하는 보고 요소와 작동가능하게 결합된다. 바람직한 구체예에서, 상기 분석법은 MEF2에 결합하고 전사 보조-조절물질에 대한 이의 결합을 조절하는 소형 분자의 신속하고 높은 처리량 스크린과 최적화를 가능하게 하는 세포-기초된 루시페라제 분석법이다. 이러한 분석법은 본 발명자들의 실험실에 의한 MEF2 복합체에 관한 10년 이상의 구조적 및 생화학적 연구에 기초하여 개발된다. 본 발명에서는 본 발명에서 먼저, 결정학 연구에 의해 확인되고, 그리고 구조-인도된 돌연변이 연구에 의해 더욱 증명되는 단백질-단백질 계면이 MEF2-결합 소형 분자에 대한 고도로 특정하고 민감한 스크린을 위한 분자 기초로서 기능할 수 있음을 청구한다. 다른 구체예에서, 이러한 분석법의 평가 요소는 풀다운 (pulldown), 공동-면역침전 (coimmunoprecipitation) 또는 형광 소광 (fluorescence quenching)과 비등방성 (anisotropy)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 물리적 분석법, 또는 본 발명에 의해 확인된 단백질-단백질 계면에 기초된 임의의 시험관내 결합 분석법, 세포-기초된 루시페라제 리포터 분석법, 또는 외래유전자 리포터 분석법으로 수행될 수 있다.
두 번째 측면에서, 본 발명에서는 또한, 근육계, 면역계와 신경계가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 포유동물 조직 내에서 MEF2-의존성 전사의 후생적 조절인자로서 유용한 화합물을 제시한다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명의 이러한 측면에 따른 화합물에는 이전에 공개된 화합물 (Chou et al., 2008; Herman et al., 2006; Paris et al., 2008; Rai et al., 2008; Thomas et al., 2008; Wong et al., 2003), 피멜로일아닐리드 오르토아미노아닐리드 PAOA, 그리고 상업적으로 가용한 동족체 수베로일아닐리드 오르토아미노아닐리드, 또는 BML-210, 그리고 이들의 구조적으로 관련된 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
세 번째 측면에서, 본 발명에서는 또한, 표 1에서 결정 구조 동격자에서 열거된 바와 같이, MEF2에 결합된 BML-210의 결정 구조에 의해 확립된 구조 뼈대로부터 유래되는 MEF2 상에서 BML-210 결합 부위에 의해 정의되는 분자 뼈대를 제시한다. BML-210은 DNA에 결합된 MEF2A (1-78) 이합체와 공동-결정화되었다. 이들 결정은 2.4Å로 회절되고, 그리고 상기 구조는 MEF2A (1-78):DNA 복합체를 탐색 모형 (search model)으로 이용하는 분자 대체에 의해 해석되었다 (Santelli and Richmond, 2000). BML-210은 MEF2의 소수성 포켓 내로 결합되는 확대된 형태를 채용한다 (도 1d). 상기 분자의 한쪽 단부, 페닐아미드 기는 Leu66, Leu67, Thr70, Leu66' (프라임 기호는 다른 단량체로부터 잔기를 표시한다)과 Thr70'을 비롯한 다수의 소수성 잔기에 의해 둘러싸인다. 이러한 단부에서 아미드 기 역시 각각, Thr70과 Thr70'과의 수소 결합 상호작용에 참여하는 위치에 존재한다. BML-210의 다른 단부에서, 고리-링크 전자 밀도 (ring-link electron density)는 Asn73, Gln56', Asp61'과 Asp63'에 의해 둘러싸인 더욱 친수성 환경에 존재한다. 이러한 영역은 오르토-아미노아닐리드 기에 부합한다. 여기서, 아미드 기를 보유하는 오르토-아미노아닐리드 모이어티는 MEF2의 잔기와의 광범위한 판 데르 발스 (van der waals) 접촉 및 잠재적인 수소 결합 상호작용을 만든다 (도 Id). 옥탄디아미드의 메틸렌 기는 2개의 MEF2 분자의 나선 H2 사이에 편하게 맞춰지고, 대부분 소수성 성질의 MEF2 잔기의 주요 사슬과 측면 사슬에 다수의 접촉을 만든다 (도 Id). MEF2에 결합된 BML-210의 결정 구조에 기초하여, 본 발명은 BML-210과 PAOA에 접촉하거나, 또는 접촉할 만큼 근접하는 표면 잔기가 실험과 연산 기초된 접근법에 의해 MEF2에 소형 분자의 설계와 스크린을 인도하는데 이용될 수 있음을 청구한다. 이들 잔기에는 노출되는 MEF2의 가닥 S1, S2와 S3 및 나선 H2 상에 모든 잔기가 포함된다. 이러한 구조적 프레임은 본 발명에서 기술된 높은 처리량의 특정한 민감성 분석법과 결합될 때, 신규한 분자 뼈대에 기초된 BML210과 PAOA 유도체와 분자를 포함하는 MEF2-결합 소형 분자의 신속한 설계와 최적화를 가능하게 할 것이다. 본 발명에 기술된 MEF2에 결합된 BML-210의 결정 구조는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 소형 분자 MEF2-결합 부위를 정의할 뿐만 아니라, 이는 또한, BML-210 및 다른 벤자미드-포함 HDAC 저해물질 내에 존재하는 오르토-아미노아닐리드 모이어티에 대한 가능 결합 부위를 최초로 노출한다. 흥미롭게도, 이러한 결합 부위는 이러한 종류의 HDAC 저해물질에 대하여 이전에 추정된 바와 같이, HDAC 효소의 활성 부위와 상이하다.
네 번째 측면에서, 본 발명에서는 상기 세 번째 측면에서 분자 뼈대에 의해 정의되는 계면 결합 부위에 결합에 유용한 MEF2-결합 소형 분자를 제시한다. 한 구체예에서, 제시된 분자는 MEF2에 결합된 BML-210의 결정 구조로부터 유래된 확인된 결합 부위로부터 유래된 일반 구조식을 갖는 MEF2-결합 소형 분자이다. 제시된 소형 분자는 기술된 구조 폴드에 결합하도록 설계되고 높은 친화성과 선택성으로 MEF2에 잠재적으로 결합할 것이다. 본 발명의 이러한 구체예 하에 제공된 화합물은 MEF2 결합 부위에 결합하는 일반식 Ra-L-Rb의 화합물을 포함하고, 여기서:
Ra는 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 아릴옥시; 알킬티오, 아릴티오, 또는 RcRdNC(=O)-, RcRdC(=O)N-, RcRdN(SO2)-를 포함하는 기에서 선택되는 MEF2 결합 부위의 소수성 영역에 결합하는 인식 기이고, 여기서:
Rc와 Rd는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노 또는 헤테로아릴아미노로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
L은 최대 20개 탄소 원자의 사슬로 구성되는 링커이고, 단서로써 최대 3개의 탄소 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 대체될 수 있고, 그리고 다른 단서로써 상기 링커가 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 벤조, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 옥사, 케토, 아미도, 설폰아미도, 또는 플루오르로 구성된 군에서 선택되는 치환기를 포함할 수 있고:
Rb는 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 아릴옥시, 알킬티오, 아릴티오, 또는 RcRdNC(=O)-, RcRdC(=O)N-, RcRdN(SO2)-을 포함하는 군에서 선택되는 MEF2 결합 부위의 친수성 영역에 결합하는 인식 기이고, 여기서:
Rc와 Rd는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노 또는 헤테로아릴아미노로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
바람직한 구체예에서, 제시된 화합물은 일반식 Ar1-L1-L2-L3-Ar2를 보유하고, 여기서:
Ar1과 Ar2는 벤젠, 나프탈렌, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 티아졸, 이속사졸, 인돌, 벤즈이미다졸, 벤조티아졸, 벤족사졸로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 방향족 고리이고, 단서로써 상기 방향족 고리는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 히드록시, 또는 할로로 구성된 군에서 선택되는 최대 7개의 치환기를 보유할 수 있다. 이들 치환기는 또한, 서로 결합하여 최대 12개 원자의 고리를 형성할 수 있다.
L1과 L3은 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 옥사, 케토, NHC(=O), C(=O)NH, NR(C=O), S(=O) 또는 -S(=O)2-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 연결 기이고,
L2는 최대 10개의 탄소 원자의 사슬로 구성된 군에서 선택되는 연결 기이고, 단서로써 최대 3개의 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 대체될 수 있고, 그리고 다른 단서로써 이들 원자는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 벤조, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 옥사, 케토, 아미도, 설폰아미도, 또는 플루오르로 구성된 군에서 선택되는 치환기를 포함할 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 제시된 화합물은 하기 일반식을 갖는다:
Figure 112011042385727-pct00001
여기서:
R1 - R10은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 히드록시, 또는 할로로 구성된 군에서 선택되는 독립적으로 선택되고,
L1과 L3은 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 옥사, 케토, NHC(=O), C(=O)NH, NR(C=O), S(=O) 또는 -S(=O)2-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 연결 기이고,
L2는 최대 10개의 탄소 원자의 사슬로 구성된 군에서 선택되는 연결 기이고, 단서로써 최대 3개의 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 대체될 수 있고, 그리고 다른 단서로써 이들 원자는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 벤조, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 옥사, 케토, 아미도, 설폰아미도, 또는 플루오르로 구성된 군에서 선택되는 치환기를 포함할 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 제시된 화합물은 화합물의 하기 목록에서 선택된다 (도 2).
이들 화합물은 시험관내와 생체내에서 MEF2에 대한 결합에서 넓은 범위의 친화성을 보였고, 그리고 앞서 언급된 바와 같이 근육계, 면역계와 신경계에서 MEF2-기초된 치료제를 개발하기 위한 선도 물질로서 이용될 수 있다. 이들 화합물은 실제로, 시험관내와 생쥐 모형에서 조절 T 세포 기능을 촉진하는데 효과를 보였고, 이런 이유로 자가면역 질환을 치료하고 이식 거부반응을 예방하기 위한 잠재적인 선도 약물이다.
제시된 MEF2-결합 분자의 제조를 위한 방법 역시 본 발명에서 제시된다.
다섯 번째 측면에서, 본 발명에서는 또한, MEF2-의존성 전사의 탈조절에 기인하는 질환을 치료하는데 유용한 화합물과 조성물을 제시한다. 본 발명의 이러한 측면에 따른 조성물은 MEF2와 이의 보조-인자의 결합을 차단할 수 있는 한 가지 이상의 화합물을 포함할 것이다. 제시된 화합물과 조성물은 전사 인자 및 이들의 동원된 히스톤-제한 효소의 상호작용과 연관된 후생적 조절의 조정을 수반하는 치료적 적용에 이용될 수 있다. 특히, 제시된 MEF2-결합 소형 분자는 MEF2-의존성 전사의 탈조절에 기인하는 다양한 질환을 치료하는데 이용될 수 있고, 이런 질환에는 심장 비대, 근육 섬유 종류 재형성, 그리고 불균형한 MEF2 기능에 기인하는 다른 근육-관련된 질환; 과도한 또는 너무 적은 MEF2-의존성 유전자 발현에 기인하는 자가면역 질환 또는 면역 결핍, 그리고 이식 거부반응; 다양한 신경변성 질환 (가령, 알츠하이머병과 헌팅턴병 등), 자폐증, 정신병적 질환, 그리고 탈조절된 MEF2 기능에 기인하는 손상된 학습과 기억이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 이러한 구체예의 다른 적용은 FOXP3 -의존성 전사의 탈조절에 기인하는 다양한 질환을 치료하는데 이용될 수 있는 FOXP3 전사 인자의 기능을 조절하는 소형 분자를 필요로 한다. 이들 질환에는 자가면역 질환, 이식 거부반응과 암이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 발명의 여섯 번째 구체예는 약물:MEF2 복합체의 제조 및 구조 결정을 위한 이의 결정화에 관계한다. 이러한 프로토콜은 MEF2에 결합된 화합물의 높은 품질의 결정을 획득하기 위하여, MEF2A의 특정한 단백질 단편 (2-78) 및 완충액 조건 범위를 정의한다. 복합체 제조와 결정화의 이러한 방법은 MEF2에 결합되는 현재와 미래 소형 분자의 구조적 특성화에 필수적이고, 그리고 이러한 구조를 이용하여 선도 화합물의 최적화를 인도한다.
본 발명의 앞서 기술된 특징과 기타 특징, 그리고 이들을 획득하고 이용하는 방식은 더욱 명백해질 것이고, 그리고 첨부된 도면과 공동으로 아래의 상세한 설명을 참조하면 최상으로 이해될 것이다. 이들 도면은 본 발명의 단지 전형적인 구체예만을 묘사하고, 따라서 이의 범위를 한정하지 않는다.
본 발명의 다른 측면과 이점은 아래의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
상세한 설명
본 발명의 다양한 측면을 요약했기 때문에, 하기에서는 본 발명을 더욱 예시하는 다양한 전형적인 구체예를 상세하게 기술한다.
HDAC의 특정한 계면 저해물질 및 이의 용도
앞서 언급된 바와 같이, 후생적 조절인자 과제를 연구하게 만든 것은 상이한 기능을 갖는 다수의 효소 동종형이 존재한다는 사실이다. 가령, 4가지 HDAC 효소 대집단 중에서, 클래스 I (HDAC 1, 2, 3, 그리고 8) 및 클래스 II (HDAC 4, 5, 6, 7, 9, 그리고 10)는 암에 관련되는 2가지 주요 종류이다. 각 개별 구성원의 독특한 기능이 분자 생물학적 접근법, 예를 들면, 녹아웃 또는 녹다운에 의해 조사될 수 있긴 하지만, 약물-기초된 요법에서 이들의 역할은 평가될 수 없는데, 그 이유는 대부분의 현재 HDAC 저해물질이 대부분의 HDAC (클래스 I과 II)에 공통된 촉매 도메인을 표적으로 하기 때문이다. 실제로, 소정의 HDAC 저해물질이 아마도, 상이한 HDAC 동종형의 활성에 영향을 줌으로써 상이한 세포 조건에서 반대 효과인 것으로 생각되는 것을 유도하는 것은 종종 관찰된다. 따라서 현재 HDACi의 동종형 특이성의 부재는 특정한 HDAC의 약물 효과와 개별 기능에 관한 합리적인 기계적인 연구에 주요한 장벽을 발생시킨다. 또한, 다수의 HDAC 또는 작은 하위집합 또는 심지어 특정한 구성원을 저해하는 것이 약리학적으로 더욱 유익한 지가 명확하지 않다. 일정한 임상적 적용 (가령, 암 요법)은 전자를 필요로 하는 반면, 다른 임상적 적용 (가령, 신경변성과 염증)은 후자로부터 이익을 얻을 수 있다.
클래스 I과 클래스 II HDAC의 현재 가용한 저해물질은 그들의 화학 구조의 핵심적인 특징에 기초하여 6가지 범주로 분류될 수 있다: (1) 히드록사민산; (2) 티올-포함 분자; (3) 친전자성 케톤; (4) 짧은 사슬 지방산; (5) 벤자미드 (오르토- 아미노아닐리드); 그리고 (6) 환형 뎁시펩티드. 히드록사민산, 티올, 그리고 친전자성 케톤을 비롯한 이들 분자 중에서 일부가 HDAC 활성 부위의 아연 이온에 결합함으로써 기능한다는 것이 널리 확립되어 있긴 하지만, 다른 범주의 저해 기전은 충분히 정의되어 있지 않다. 상이한 HDAC 저해물질은 상이한 종류의 HDAC에서 상이한 활성을 나타낸다. 가령, 히드록사민산 범주의 구성원, 예를 들면, TSA와 SAHA가 전체 클래스 I과 클래스 II HDAC에서 강력한 저해물질이긴 하지만, 벤자미드 집단 (가령, 피멜로일아닐리드 오르토-아미노아닐리드 (PAOA), MS-275, CI-994, MGCD-0103), 그리고 환형 펩티드 집단 (가령, FK228)의 일부 구성원은 일정한 HDAC 구성원 또는 하위종류에 대하여 별로 크지 않은 선택성을 보였다. 하지만, HDAC 저해물질의 분자 기전에 관한 전반적인 이해 부족으로 인하여, 이러한 선택성이 어떻게 달성되는 지가 명확하지 않다. 결과적으로, 일부 HDAC 저해물질에서 선택성의 경험적 관찰이 아류형-특정한 HDAC 저해물질의 합리적인 설계를 인도할 수 없었다. 여러 클래스 I (HDAC8)와 클래스 II (HDAC4 and HDAC7) 구성원 및 상이한 저해물질과 이들의 복합체의 촉매 도메인의 결정 구조는 해석되었는데, 클래스 I과 클래스 II HDAC의 이들 구조 및 구조-기초된 서열-정렬은 활성 부위가 고도로 보존되고 주변 영역에서만 경미한 차이를 보인다는 것을 암시한다. 이런 이유로, 이들은 또한, 선택성의 잠재적인 기전에 관하여 통찰력을 제공하지 못한다. 이러한 배경을 고려할 때, 고도로 보존된 촉매 도메인에 대한 아류형-특정한 저해물질의 합리적인 설계는 매우 힘들 것으로 폭넓게 간주된다.
HDAC가 종종, 특정한 보조-조절물질과 다른 크로마틴 제한 효소와의 큰 다중-단백질 복합체로 존재한다는 것을 관찰한 이후, 본 발명의 발명자들은 기전-기초된 접근법이 신규한 HDAC-기초된 소형 분자 후생적 조절인자를 확인하고 최적화하는 더욱 우수한 경로를 제공할 수 있다고 추정하였다. 다시 말하면, 약물 설계의 전통적인 접근법에 의해 지시되는 바와 같이 효소의 활성 부위를 표적으로 하는 대신에, HDAC 및 그들의 관련된 기능적 상대 사이에 단백질-단백질 상호작용을 표적으로 하는 소형-분자가 개발될 것이다.
따라서 한 측면에서, 본 발명에서는 연관된 전사 인자에 HDAC의 결합을 차단함으로써 HDAC 기능을 조절하는 방법을 제시한다. 일반적으로, 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 전사 인자를 계면 저해물질과 접촉시키는 단계를 포함할 것이고, 여기서 계면 저해물질은 전사 인자와 HDAC 사이에 계면 표면 내에 부위에 선별적으로 결합하여 이러한 HDAC가 전사 인자의 DNA-결합 부위의 인근에 위치하는 단백질 부위에서 촉매 활성을 수행하는 것을 예방할 수 있다.
HDAC는 고전적인 HDAC 또는 이의 하위집합으로부터 임의의 HDAC 동종형일 수 있다. 전형적인 HDAC는 HDAC 4, 5, 6, 7, 9와 10, 또는 이들의 임의의 하위집합을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, HDAC는 클래스 IIa HDAC이고, 그리고 더욱 바람직한 구체예에서, HDAC는 HDAC4 또는 HDAC9이다.
전사 인자는 HDAC에 결합하는 것으로 알려져 있는 임의의 전사 인자일 수 있다. 전형적인 전사 인자에는 MEF2, FOXP3, GATA3, 그리고 Cabin1이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 바람직한 구체예에서, 전사 인자는 MEF2이다.
계면 저해물질은 소형 분자일 수 있다.
본 명세서에서 앞서 기술된 방법은 생체내에서와 시험관내에서 HDAC 및 상대 전사 인자의 기능과 기전에 관한 정보를 획득하기 위한 연구 환경에서 이용될 수 있다. 이들은 또한, 질환을 치료하기 위한 임상적 환경에서 이용될 수 있다.
본 발명의 방법으로 치료될 수 있는 질환은 일반적으로, 심장 비대, 근육 섬유 종류 재형성, 그리고 불균형한 MEF2 기능에 기인하는 다른 근육-관련된 질환; 과도한 또는 너무 적은 MEF2-의존성 유전자 발현에 기인하는 자가면역 질환 또는 면역 결핍, 그리고 이식 거부반응; 다양한 신경변성 질환 (가령, 프레드리히 운동실조증, 알츠하이머병과 헌팅턴병 등), 자폐증, 정신병적 질환, 그리고 탈조절된 MEF2 기능에 기인하는 손상된 학습과 기억이다. 전형적인 질환에는 신경변성 질환, 심장 질환, 자가면역 질환, 염증, 그리고 암이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
임상적 환경에서 이용될 때, 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 차단제의 치료 효과량을 환자에 투여하는 일반적인 단계를 포함할 것이고, 여기서 차단제는 전사 인자에 HDAC의 결합을 차단할 수 있다.
상이한 임상적 환경에서 이용될 때, 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 차단제의 치료 효과량을 환자에 투여하는 일반적인 단계를 포함할 것이고, 여기서 차단제는 MEF2에 Cabin1의 결합을 차단할 수 있다. Cabin1은 칼시뉴린-의존성 전사 프로그램의 전사 보조-억제물질이다. 이는 T 세포와 뉴런 세포에서 고도로 발현된다.
다른 상이한 임상적 환경에서 이용될 때, 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 차단제의 치료 효과량을 환자에 투여하는 일반적인 단계를 포함할 것이고, 여기서 차단제는 MEF2에 p300의 결합을 차단할 수 있다.
다른 상이한 임상적 환경에서 이용될 때, 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 차단제의 치료 효과량을 환자에 투여하는 일반적인 단계를 포함할 것이고, 여기서 차단제는 MEF2에 CBP의 결합을 차단할 수 있다.
더욱 일반적인 환경에서, 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 차단제의 치료 효과량을 환자에 투여하는 일반적인 단계를 포함할 것이고, 여기서 차단제는 MEF2에 결합하는 임의의 전사 보조-조절물질의 결합을 차단할 수 있다.
앞서 기술된 바와 같이, HDAC는 임의의 고전적 HDAC 또는 이의 하위집합일 수 있다. 차단제는 이러한 차단제가 HDAC와 전사 인자 사이에 계면 표면 상에 위치하는 부위에 선별적으로 결합할 수 있으면, 소형 분자, 나선형 펩티드모방체, 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 전사 인자는 MEF2이다.
계면 저해물질을 개발하는 방법과 도구
다른 측면에서, 본 발명에서는 HDAC와 전사 인자 사이에 계면 부위에 결합하여 이들의 상호작용을 차단할 수 있는 계면 저해물질을 확인하기 위한 분석법을 제시한다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 분석법은 일반적으로, 검사 화합물을 평가 요소에 도입하는 단계를 포함하고, 상기 평가 요소는 MEF2 이합체 상에 구조 요소의 첫 번째 군 및 구조 요소의 두 번째 군 사이에 계면에 의해 정의되는 MEF2 이합체 상에 계면 결합 부위를 포함한다. 구조 요소의 첫 번째 군은 각 MEF2 단량체의 베타 가닥 S1, S2와 S3 및 나선 H2를 포함한다 (두번째 구조 요소 및 상응하는 잔기 범위는 Han et al,, Nature 2003에서 기술된 바와 같다).
두 번째 군은 Cabin1, HDAC4, HDAC9, HDAC5, HDAC7, p300과 CBP로부터 짧은 나선 모티프를 포함한다. 평가 요소는 또한, 검사 화합물의 결합 또는 비-결합에 관련된 정보를 보고하기 위한 리포터 요소와 작동가능하게 결합될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 미끼 (bait)와 융합된 결합 도메인, 먹이 (prey)와 융합된 활성화 도메인, 그리고 리포터 유전자를 포함하고; 그리고 리포터 신호 수준을 결정하는 이중-하이브리드 기초된 분석법 (two-hybrid system based assay)이 개시된다. 결합 도메인은 GAL4 DNA와 융합된 MEF2D (GAL4-MEF2)를 포함한다; 활성화 도메인은 VP-16 (HDAC4-VP16)과 융합된 HDAC4의 MEF2 결합 모티프를 포함한다. 리포터 유전자는 GAL4-구동된 리포터 플라스미드 (GAL4Luc)이고, 모두 세포 숙주 내에 수용된다.
본 발명의 이러한 바람직한 구체예는 전사 인자, 예를 들면, MEF2에 결합하고 전사 보조-조절물질에 이의 결합을 조절하는 소형 분자의 신속하고 높은 처리량의 스크리닝과 최적화를 가능하게 하는 세포-기초된 루시페라제 분석법이다. 이러한 분석법은 본 발명자들의 실험실에 의한 MEF2 복합체의 10년 이상의 구조적 및 생화학적 연구에 기초하여 개발된다. 이러한 전형적인 구체예는 먼저 결정학 연구에 의해 확인되고, 그리고 본 발명에서 구조-인도된 돌연변이 연구에 의해 더욱 증명된 단백질-단백질 계면이 MEF2-결합 소형 분자에 대한 고도로 특정하고 민감한 스크린을 분자 기초로서 기능할 수 있다는 것을 기초로 하였다.
각 MEF2 단량체의 베타 가닥 S1, S2와 S3 및 나선 H2, 그리고 Cabin1과 HDAC4와 HDAC9로부터 짧은 나선 모티프를 포함하는 이러한 단백질-단백질 계면에 기초하는 임의의 분석법은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 다른 전형적인 분석법 구현은 풀다운 (pulldown), 공동-면역침전 (coimmunoprecipitation), 형광-기초된 결합 분석법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 임의의 물리적 분석법 기술, 그리고 본 발명에 의해 확인된 단백질-단백질 계면에 기초된 루시페라제 리포터 분석법과 외래유전자 리포터 분석법이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 기능적 분석법을 포함한다.
특히, 제시된 화합물이 실제로, 세포 내에서 클래스 IIa HDAC의 결합을 파괴하는 지를 확립하기 위하여, 크로마틴 면역침전 (ChIP) 분석법을 비롯한 여러 유형의 분석법이 이용될 수 있다. HDAC4 플라스미드 구조체는 HeIa 세포 내로 일시적으로 형질감염된다. MEF2 매개된 프로모터 상에 HDAC4 점유는 조사된 화합물 및 완충액 대조의 존재에서 적절한 특정 항체와 PCR 프라이머를 이용한 ChIP에 의해 검출된다. ChIP 분석법에 대안적 접근법으로서 형광 이미지화 기초된 방법 역시 이용될 수 있다. GFP-융합된 MEF2C와 HDAC4는 이들의 상호작용을 조사하기 위하여 HeLa 또는 C2C12 세포 내로 형질감염된다. 단독으로 발현될 때, GFP-HDAC4는 확산성 방식으로 세포질 내에 모이는 반면, GFP-MEF2는 확산성 패턴으로 핵 내에 모인다. 공동-발현될 때, HDAC4와 MEF2는 핵 내에서 반점 보디 (punctate body)를 형성한다. 비록 이들 반점 핵 보디의 성격이 알려져 있긴 하지만, 이들의 형성은 명백하게, MEF2:HDAC4 상호작용에 의존하는데, 그 이유는 기능성 MEF2-결합 모티프가 부재하는 HDAC4 돌연변이체가 MEF2를 핵 보디 (nuclear body)로 표적화시키지 못하기 때문이다. 최종적으로, mRNA 프로파일링 (마이크로어레이) 및 결합 위치선정 (ChIP-on-chip)에 의한 MEF2 표적 유전자의 게놈-범주 분석은 휴면 상태 또는 활성화된 (가령, 칼슘 신호가 가동된) 상태에서 MEF2-의존성 억제 또는 활성화에 큰 반응을 보이는 널리-공지된 MEF2 표적 유전자를 선택함으로써, 이러한 방법을 더욱 조장할 수 있다. 이러한 방법을 이용하여, ChIP로 클래스 IIa HDAC의 프로모터 존재를 검출하고, 그리고 약물 치료 시에 또는 HDAC4, 5, 7 또는 9의 siRNA 녹다운 이후 발현 변화 (siRNA에 기인한 발현 변화가 먼저 평가된다)를 모니터함으로써, 이들 유전자가 클래스 II HDAC 또는 다른 MEF2 보조-억제물질 (가령, Cabin1)에 의해 잠재적으로 조절되는 지가 확립될 수 있다 . 포괄적인 이러한 방법은 마이크로어레이를 이용한 유전자 발현을 분석하고, 그리고 다양한 농도의 제시된 화합물의 존재에서 클래스 IIa HDAC의 게놈-범주 결합을 검출함으로써 게놈-범주 수준에서 화합물을 평가하는데 이용될 수 있다.
이러한 분석법의 수행을 조장하기 위하여, 본 발명에서는 또한, MEF2-결합 소형 분자를 탐색하기 위한 높은 처리량의 고도로 민감하고 특정한 스크린 플랫폼을 제공한다. 이러한 플랫폼은 GAL4-구동된 리포터 플라스미드 (GAL4Luc), GAL4 DNA-결합 도메인과 융합된 MEF2D (GAL4-MEF2), VP-16과 융합된 HDAC4의 MEF2-결합 모티프 (HDAC4-VPI6), VP-16 (양성 대조)과 융합된 GAL4 DNA-결합 도메인, 그리고 음성과 양성 대조로서 다양한 화합물을 내포하는 안정적으로 형질전환된 세포주를 포함한다. 상기 안정한 세포주, 플라스미드, 그리고 대조 화합물로 구성되는 키트는 새로운 MEF2-결합 분자를 탐색하고 기존의 선도 화합물을 최적화하기 위하여 사용자에 의한 스크린을 위하여 만들어질 수 있다. MEF2D를 MEF2A, MEF2B와 MEF2C로 전환함으로써, 이러한 방법은 MEF2 집단의 동종형에 선별적으로 결합하는 화합물을 탐색하는 데에도 이용될 수 있다. 이런 화합물은 특정한 MEF2 집단 구성원의 기능과 질환에 관련을 조사하는데 이용될 수 있고, 그리고 진단제의 개발 및 MEF2-연관된 질환에 대한 더욱 특정한 치료제의 확인에 이용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명에서는 조절과 기능 복합체를 표적으로 함으로써 아류형-특정한 HDAC 저해물질/조절물질을 확인하는 방법을 제시한다. 본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 일반적으로, (1) 기능적으로 중요한 계면을 포함하는 구조 또는 하위구조를 해석하는 단계; (2) 기존의 또는 새로운 잠재적인 HDAC 저해물질에서 선택되는 검사 분자를 계산적으로 도킹함으로써, 해석된 구조에 도킹 분석 (docking analysis)을 적용하는 단계; (3) 목적 HDAC 복합체 사이에 단백질-단백질 상호작용을 파괴할 수 있는 화합물을 스크리닝하기 위한 분석법을 개발하는 단계; (4) 단계 (3)에서 확인된 화합물을 특성화하는 단계; (5) 상기 화합물을 계산적으로 최적화하는 단계; 그리고 (6) 최적화된 화합물을 합성하고 단계 (3)의 분석법을 이용하여 상기 화합물을 확인하는 단계를 포함한다.
단계 1에서, 구조는 기존 구조를 탐색 모형 (search model)으로서 이용한 분자 교체에 의해 해석될 수 있다. 필요한 경우에, 실험 단계는 획득된 MAD 또는 MIR일 수 있다. 단계 2에서, 도킹은 AutoDock과 같은 표준 패키지를 이용하여 수행될 수 있다. 단계 3은 앞서 기술된 바와 동일하고 포유동물 이중-하이브리드 분석법에 기초할 것이다. 나머지 단계는 당분야에 공지된 방법을 이용하여 화합물의 성격에 의존할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명에서는 HDAC와 전사 인자 사이에 결합을 차단하기 위한 차단제로서 유용한 화합물을 제시한다. HDAC는 임의의 고전적인 HDAC 또는 이의 하위집합일 수 있다. 전사 인자는 MEF2, FOXP3과 GATA3이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, HDAC에 결합하는 것으로 알려져 있는 임의의 전사 인자일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 전사 인자는 MEF2이다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 화합물에는 소형 유기 분자 및 나선 펩티드유사체가 포함된다.
MEF2-결합 소형 분자는 개시된 MEF2 결합 부위를 가이드로서 이용함으로써, 본 명세서에 제시된 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 제시된 소형 분자는 MEF2에 결합된 BML-210의 결정 구조로부터 노출된 확인된 결합 부위로부터 유래되는 일반 구조식을 갖는다. 제시된 소형 분자는 기술된 구조적 폴드에 결합하도록 설계되고, 그리고 높은 친화성과 선택성으로 MEF2에 잠재적으로 결합할 것이다. 이러한 접근법을 이용하여 더욱 강력한 선별성 화합물을 확인하기 위하여, 인-실리코 스크리닝 (in-silico screening)과 결합된 컴퓨터-보조된 구조-기초된 설계, 높은 처리량 스크리닝과 결합된 조합 라이브러리 설계, 그리고 선도 확인을 위한 단편-기초된 약물 발견과 그 이후, 선도 최적화 (lead optimization)가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당분야에 공지된 방법이 이용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에서 제시된 화합물은 MEF2 결합 부위에 결합하는 일반식 Ra-L-Rb의 화합물을 포함하고, 여기서:
Ra는 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 아릴옥시; 알킬티오, 아릴티오, 또는 RcRdNC(=O)-, RcRdC(=O)N-, RcRdN(SO2)-를 포함하는 기에서 선택되는 MEF2 결합 부위의 소수성 영역에 결합하는 인식 기이고, 여기서:
Rc와 Rd는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노 또는 헤테로아릴아미노로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
L은 최대 20개 탄소 원자의 사슬로 구성되는 링커이고, 단서로써 최대 3개의 탄소 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 대체될 수 있고, 그리고 다른 단서로써 상기 링커가 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 벤조, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 옥사, 케토, 아미도, 설폰아미도, 또는 플루오르로 구성된 군에서 선택되는 치환기를 포함할 수 있고:
Rb는 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 알콕시, 아릴옥시, 알킬티오, 아릴티오, 또는 RcRdNC(=O)-, RcRdC(=O)N-, RcRdN(SO2)-을 포함하는 군에서 선택되는 MEF2 결합 부위의 친수성 영역에 결합하는 인식 기이고, 여기서:
Rc와 Rd는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노 또는 헤테로아릴아미노로 구성된 군에서 독립적으로 선택된다.
바람직한 구체예에서, 제시된 화합물은 일반식 Ar1-L1-L2-L3-Ar2를 보유하고, 여기서:
Ar1과 Ar2는 벤젠, 나프탈렌, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 티아졸, 이속사졸, 인돌, 벤즈이미다졸, 벤조티아졸, 벤족사졸로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 방향족 고리이고, 단서로써 상기 방향족 고리는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 히드록시, 또는 할로로 구성된 군에서 선택되는 최대 7개의 치환기를 보유할 수 있다. 이들 치환기는 또한, 서로 결합하여 최대 12개 원자의 고리를 형성할 수 있다.
L1과 L3은 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 옥사, 케토, NHC(=O), C(=O)NH, NR(C=O), S(=O) 또는 -S(=O)2-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 연결 기이고,
L2는 최대 10개의 탄소 원자의 사슬로 구성된 군에서 선택되는 연결 기이고, 단서로써 최대 3개의 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 대체될 수 있고, 그리고 다른 단서로써 이들 원자는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 벤조, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 옥사, 케토, 아미도, 설폰아미도, 또는 플루오르로 구성된 군에서 선택되는 치환기를 포함할 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 제시된 화합물은 하기 일반식을 갖는다:
Figure 112011042385727-pct00002
여기서:
R1 - R10은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 히드록시, 또는 할로로 구성된 군에서 선택되는 독립적으로 선택되고,
L1과 L3은 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 옥사, 케토, NHC(=O), C(=O)NH, NR(C=O), S(=O) 또는 -S(=O)2-로 구성된 군에서 독립적으로 선택되는 연결 기이고,
L2는 최대 10개의 탄소 원자의 사슬로 구성된 군에서 선택되는 연결 기이고, 단서로써 최대 3개의 원자가 산소, 질소 또는 황 원자로 대체될 수 있고, 그리고 다른 단서로써 이들 원자는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 벤조, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 옥사, 케토, 아미도, 설폰아미도, 또는 플루오르로 구성된 군에서 선택되는 치환기를 포함할 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 제시된 화합물은 화합물의 하기 목록으로부터 선택된다 (도 2):
Figure 112011042385727-pct00003
본 발명의 다양한 측면과 효과의 완전한 이해를 더욱 조장하기 위하여, 아래의 예시적인 실시예가 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1에서는 MEF2 및 확인된 리간드 결합 부위의 결정 구조의 3가지 상이한 묘사 (a-c)를 도시한다; (d)에서는 BML-210과의 결합 상호작용에 관여하는 아미노산을 비롯하여, 2.4 Å 분해능에서 MEF2에 결합된 BML-210A (1-78)가 도시된다.
도 2에서는 BML-210, PAOA 및 관련된 예시적인 MEF2-결합 분자의 구조를 도시한다.
도 3에서는 HDACi에 대한 MEF2-HDAC 루시페라제 리포터 분석법의 개요 다이어그램을 도시한다.
도 4에서는 BML-210로 치료후 24시간 시점에, MEF2-HDAC 루시페라제 리포터 분석에서 루시페라제 활성에 대한 표준화된 반응을 도시한다. 루시페라제 활성은 용량 의존성 방식으로 감소하였다.
도 5 (a)에서는 Biacore 분석에서 BML-210과 함께 항온처리후, HDAC에 MEF2 결합의 경쟁적 저해를 보여준다; (b) BML-210과 HDAC9가 MEF2 상에서 중복 영역에 결합한다는 것을 증명하는 구조적 분석.
실시예
실시예 1. 아류형-특정한 HDAC 저해물질/조절물질을 확인하는 전략
본 발명에서는 아류형-특정한 HDAC 저해물질/조절물질로서 기능할 수 있는 선도 화합물을 확인하기 위한 신규한 전략을 제시한다. 이러한 전략은 여러 반복 단계로 구성된다:
단계 1: 목적되는 소정의 HDAC 복합체에 대하여, 연관된 조절 단백질에 결합된 HDAC의 구조 또는 하위구조가 해석되거나, 또는 기능적으로 중요한 계면을 내포하는 이의 구조 또는 하위구조가 획득된다.
단계 2: 상기 구조가 단백질-단백질 계면에 결합할 수 있는 기존 또는 새로운 잠재적인 HDAC 저해물질의 도킹 분석에 이용된다. 가상 스크린은 HDAC 저해물질이 표적 HDAC 복합체를 수반하는 세포 과정에서 효과를 보이는 지, 그리고 HDAC 저해물질이 활성 부위 저해 이외의 기전을 통하여 기능하는 것으로 보이는 지와 같은 기능성 데이터에 의해 인도될 것이다.
단계 3: 구조 및 관련된 생화학적 정보는 또한, 의도된 단백질-단백질 계면을 파괴할 수 있는 화합물을 스크리닝하는데 이용될 수 있는 분석법의 개발을 인도하는데 이용된다.
단계 4: 이와 같은 선도가 확인되면, 단백질 표적과 이들의 복합체는 단계 1에서 확립된 구조 연구 시스템을 이용하여 특성화된다.
단계 5: 관련된 화학 방법과 공동으로 이러한 구조 정보는 더욱 높은 친화성과 특이성으로 표적 단백질에 결합할 수 있는 유사체의 설계를 인도하는데 이용된다. 이용된 방법은 단계 2의 방법과 유사하다.
단계 6: 설계된 유사체는 단계 3에서 확립된 분석법에 의해 합성되고 분석된다. 최종적으로, 최적화된 화합물은 더욱 높은 효능 및 더욱 낮은 비-특이적 효과/부작용으로, 부모 화합물의 효과를 모방할 수 있는 지를 조사하기 위한 생체내 연구에 이용된다.
상기 기전-기초된 접근법을 이용하여, 본 발명자들은 이전의 공지된 HDAC 저해물질, PAOA이 MEF2 저해물질 (MEF2i)로서 기능함으로써 클래스 IIa HDAC의 기능을 특이적으로 파괴할 수 있는 선도 화합물로서 확인된다는 것을 증명하였다. 게다가, PAOA의 대표적인 구조 유사체 역시 본 명세서에 기술된 방법으로 설계되고, 합성되고, 평가되었으며, 그리고 더욱 강력한 여러 MEF2i가 확인되고 (도 2), 따라서 이러한 접근법의 추가 측면이 증명되었다.
실시예 2. 치료 적용에서 아류형-특정한 HDAC 저해물질의 용도
클래스 IIa HDAC는 뉴런 생존/시냅스 형성, T 세포 선별/활성화, 그리고 근육 재형성에서 결정적인 역할을 한다. 이들 활성의 조절장애는 신경변성, 염증과 심장 비대를 비롯한 다수의 질환에 관련된다. 암 요법을 위하여 개발된 일부 HDACi는 이들 질환에 대하여 유익한 효과를 보였다. 비록 이들 HDAC 저해물질의 비-특이적인 성질이 이들 질환에서 이들의 임상적 적용을 예방하긴 하지만, 이들 관찰 결과는 관찰된 치료 효과가 클래스 IIa HDAC에 관련되는 지, 그리고 클래스 IIa HDAC 기능의 선택된 파괴가 이들 질환을 치료하기 위한 실행가능 전략일 수 있는 지에 관한 흥미로운 의문점을 발생시킨다. 이들 의문점을 해결하기 위하여, 클래스 IIa HDAC의 기능을 특이적으로 파괴할 수 있는 소형 분자가 요구된다.
MEF2와 클래스 IIa HDAC의 공지된 세포 기능, 그리고 근육계, 면역계와 신경계에서 일부 HDAC 저해물질의 효과에 기초하여, 본 발명에서는 본 발명의 방법과 화합물이 심장 비대, 근육 섬유 종류 재형성, 그리고 불균형한 MEF2 기능에 기인하는 다른 근육-관련된 질환; 과도한 또는 너무 적은 MEF2-의존성 유전자 발현에 기인하는 자가면역 질환 또는 면역 결핍, 그리고 이식 거부반응; 다양한 신경변성 질환 (가령, 프레드리히 운동실조증, 알츠하이머병과 헌팅턴병 등), 자폐증, 정신병적 질환, 그리고 탈조절된 MEF2 기능에 기인하는 손상된 학습과 기억을 치료하는데 이용될 수 있음을 제안한다.
앞서 언급된 다양한 인간 질환을 치료하기 위하여 개발된 MEF2-결합 분자는 경구, 근육내, 복막내, 피하, 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 다른 전달 방법 역시 가능하고, 그리고 정확한 프로토콜은 치료되는 질환에 좌우될 것이다. 용량 역시 특정한 임상적 적용에 따라 변할 수 있다. 하지만, 화합물이 시험관내에서 효과를 보이는 표준 분석법은 동물 모형 연구에서 대략, 시험관내에서 0.1 - 10 μM, 그리고 체질량 (body mass) kg당 1-10 mg이다.
도 2에 도시된 본 발명에서 제시된 선호되는 화합물은 시험관내에서와 생체내에서 MEF2에 대한 결합에서 넓은 범위의 친화성을 보였고, 그리고 앞서 언급된 바와 같이 근육계, 면역계와 신경계에서 MEF2-기초된 치료제를 개발하기 위한 선도 화합물로서 기능할 수 있었다. 이들 화합물은 실제로, 시험관내에서 생쥐 모형에서 조절 T 세포 기능을 촉진하는데 효과를 보였고, 따라서 자가면역 질환을 치료하고 이식 거부반응을 예방하기 위한 잠재적인 약물이다. 가령, 0.15μM에서 MEF2-결합 분자 NKL30은 생체내에서 강화된 억제 활성에 의해 입증되는 바와 같이 조절 T 세포 기능을 매우 강화시켰다. 항상성 증식 분석의 생쥐 모형에서, 1 mg/체질량 kg으로 정맥내 주사로 투여된 상기 화합물은 또한, 생체내에서 Treg 기능을 매우 강화시켰다. 이들 데이터는 본 발명에 의해 제공된 MEF2-결합 분자가 자가면역 질환을 치료하고 이식 거부반응을 예방하는데 이용될 수 있음을 강하게 암시한다.
실시예 3. 기능적 조절을 위한 클래스 IIa HDAC 표적화
다른 HDAC에 비하여, 클래스 IIa 집단은 기능과 조절의 여러 측면에서 독특하였다. 먼저, 클래스 IIa HDAC는 근육, 뇌와 T 세포에서 선별적으로 발현되고 이들 조직 내에서 그들의 기능과 일치한다. 두 번째, 클래스 IIa HDAC의 활성은 클래스 IIa HDAC가 발현되는 조직 내에서 우세한 이차 메신저인 칼슘 신호에 의해 강하게 조절된다. 셋째, 클래스 II HDAC는 촉매 도메인의 N-말단에 큰 조절 도메인을 포함하고, 이는 HDAC의 이러한 하위종류에 독특한 특성을 공여한다. N-말단 조절 영역은 클래스 II HDAC의 칼슘 반응성을 조절하는 것들, 예를 들면, CaM, CaMK와 14-3-3, 그리고 클래스 II HDAC를 특정한 프로모터로 표적화시키는 것들, 예를 들면, MEF2와 BCL-6, 그리고 기타 후생적 조절인자와 작동체, 예를 들면, 클래스 IIa HDAC와 협력적으로 기능하는 클래스 I HDAC, CtBP와 HP-1을 비롯한 다양한 단백질과 상호작용하는 도메인과 모티프를 포함한다. 다수의 이들 복합체의 구조는 특정한 파괴를 위한 잠재적인 표적으로서 연구되고 있다.
클래스 IIa HDAC의 조절과 기능에 관여하는 많은 복합체 중에서, 가장 특성화된 것은 생화학과 구조의 관점에서 MEF2 복합체이다. MEF2는 클래스 IIa HDAC와 동일한 발현 패턴을 갖고, 또한 신경변성, 염증과 심장 질환에 관련되는 서열-특정한 전사 인자의 집단 (MEF2A-D)이다. 전사 인자의 MEF2 집단은 MADS-box/MEF2S 도메인으로 지칭되는 고도로 보존된 N-말단 영역을 공유하고, 이는 DNA 결합, 이합체화, 그리고 다양한 전사 인자와 보조-조절물질과의 단백질-단백질 상호작용을 매개한다. 클래스 IIa HDAC는 DNA에 결합하지 않지만 디아세틸화를 위한 특정한 크로마틴 영역을 표적으로 하기 위하여 MEF2와의 상호작용에 의존한다. 이러한 상호작용의 차단은 클래스 IIa HDAC의 기능을 파괴하는 잠재적인 방법으로 선택된다.
클래스 IIa HDAC와 MEF2 사이에 상호작용은 광범위한 기능적 및 생화학적 분석의 주제이며, 이들 분석에서 클래스 IIa HDAC에서 보존된 짧은 서열 모티프 (MEF2-결합 모티프) 및 MEF2의 MADS-box/MEF2S 도메인은 그들의 결합에 필수적이고 충분한 것으로 밝혀진다. MEF2와 클래스 IIa HDAC, 그리고 유사한 MEF2-결합 모티프를 포함하는 관련된 전사 억제 (Cabin1) 사이에 상호작용에 관한 체계적인 구조적 및 생물물리학적 연구가 수행되었다. 이들 결정 구조는 MEF2-결합 모티프가 MEF2의 MADS-box/MEF2 도메인 상에 소수성 그루브에 결합하는 짧은 친양쪽성 나선 구조를 채용한다는 드러낸다. 이런 리간드/수용체 유사 결합 기전은 소형 분자를 이용하여 MEF2-특이적 프로모터에 클래스 IIa HDAC의 동원을 차단하는 것이 가능할 수도 있음을 암시한다 (참조: Han Nature and 2005).
실시예 4. 하위종류 특정한 HDAC 저해 분석법의 개발
다양한 화합물을 스크리닝하기 위하여, 일시적으로 형질감염된 MEF2D, HDAC4와 보조-활성물질 p300으로 일련의 MEF2 -의존성 루시페라제 리포터 분석법이 초기에 이용되었다. 하지만 이들 분석법은 아마도 MEF2의 복합체 전사 활성화 기전 및 내인성 인자로부터 간섭으로 인하여, 약한 신호 및 가양성 (false positive)의 높은 빈도를 제공하였다. 이들 관찰 결과를 통하여, 세포 내에서 HDAC4와 MEF2 사이에 분자 상호작용을 재현할 수 있는 고도로 민감하고 특정한 분석법이 필수적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 내인성 인자로부터 간섭을 최소화하면서 HDAC4와 MEF2D 사이에 상호작용을 검출할 수 있는 포유동물 이중-하이브리드 시스템을 창안하였다 (도 3).
이러한 분석 시스템에서, MEF2D는 GAL4 DNA 결합 도메인과 융합되고 (GAL4-MEF2D), 그리고 HDAC4의 MEF2-결합 모티프 (aa 155-220)는 VP-16과 융합되었다 (HDAC4-VP16). 예비 분석은 양쪽 구조체 및 GAL4-구동된 리포터 플라스미드 (GAL4Luc)로 일시적으로 형질감염된 HeLa 세포가 GAL4-VP16의 양성 대조에 의해 산출된 것에 필적하는 강한 신호를 발생시키는 반면, HDAC4에 대한 결합에서 결함이 있는 것으로 이전에 확인된 MEF2D 돌연변이체 Leu67Asp (L67D)가 상기 리포터를 활성화시키지 못한다는 것을 증명하였다 (데이터 제시되지 않음). 모든 루시페라아제 리포터 분석법에서 단백질 발현 수준은 웨스턴 블롯에 의해 확증되었다.
구조적 통찰력을 이용하여, 앞서 언급된 MEF2D L67D 돌연변이체 이외에, 본 발명에서는 시험관내에서 HDAC4:MEF2 상호작용을 파괴하는 것으로 이전에 밝혀진 HDAC4에 다수의 돌연변이를 도입하였다. 이들 돌연변이 역시 세포-기초된 분석법에서 루시페라아제 신호를 감소시켰다 (도 3b). 가장 흥미롭게도, 시험관내에서 MEF2의 결합을 -60% 약화시킨 HDCA4 상에 Val180Lys의 돌연변이 (야생형과 돌연변이 HDAC4에 의한 MEF2 결합의 Kd는 각각 0.47 μM과 0.81 μM이다)는 세포-기초된 분석법에서 루시페라아제 신호를 부분적으로 감소시켰다 (도 3b). 이들 관찰 결과는 포유동물 이중-하이브리드 분석법으로부터 신호가 HDAC4와 MEF2 사이에 분자 상호작용과 매우 상관한다는 것을 증명한다. 이들 결과는 HDAC4:MEF2 상호작용의 구조 모형에 대한 진전된 뒷받침을 제공할 뿐만 아니라 세포 내에서 HADC4:MEF2 상호작용을 검출하기 위한 민감하고 특정한 방법을 확립한다.
실시예 5. MEF2/HDAC 상호작용의 선별적 저해물질 확인
스크리닝의 복합성을 감소시키기 위하여, 기존 HDAC 저해물질에 대한 광대한 양의 기능적 데이터가 활용되었다. 이들 저해물질 중에서 대부분이 촉매 도메인을 표적으로 하지만, 세포 기초된 히스톤 아세틸화 분석법을 통하여 발견된 화합물 중에서 일부는 MEF2에 클래스 TIa HDAC의 결합을 비롯한 HDAC 기능의 다른 측면에 영향을 줄 수 있다. 이를 염두에 두고, 본 발명에서는 HDAC9:MEF2 복합체의 결정 구조로부터 유래된 약물분자구조 (pharmacophore) 모형을 이용하여 소형 분자 데이터베이스에 대한 가상 스크린 (3D 도킹)을 수행하였다. 비록 이러한 탐색이 신규한 표적을 산출하진 못했지만, 이는 MEF2의 소수성 포켓이 일정한 길이의 링커에 의해 연결된 2개의 방향족 고리를 갖는 화합물을 선호한다는 것을 증명하였다. 이러한 결과는 MEF2 이합체가 HDAC9로부터 페닐알라닌에 결합할 수 있는 2개의 대칭-관련된 부위를 포함한다는 것을 증명하는 결정학적 분석과 일치한다 (참조: Han et Nature and JMB). 이런 이유로, 이런 구조적 특징을 갖는 공지된 HDAC 저해물질이 탐색되고 포유동물 이중-하이브리드 분석법을 이용하여 HDAC4:MEF2 상호작용에 대한 그들의 효과가 조사되었다.
포유동물 이중-하이브리드 분석법을 이용하여 선택된 HDAC 저해물질의 풀을 스크리닝하면, 기존에 조사된 화합물인 PAOA (도 2)가 용량 의존성 방식으로 리포터 신호를 저해하는 것으로 밝혀졌다 (도 4). PAOA는 HDAC4-VP16의 발현에 영향을 주지 않았지만 GAL4-VP16에 의해 구동된 리포터 신호를 1OμM에서 5.6배 감소시켰는데 (데이터 제시되지 않음), 이는 실험 조건 하에 루시페라제 활성의 발현에 대한 이러한 화합물의 비-특이적인 저해를 지시하였다. 하지만, 동일한 농도의 PAOA는 GAL4-MEF2D and HDAC4-VPl6에 의해 구동된 리포터 신호를 대략 26배 감소시켰는데, 이는 PAOA가 보편적 저해 효과를 뛰어넘어 HDAC4:MEF2 상호작용을 파괴하는데 대한 특정한 효과를 갖는다는 것을 암시하였다. 대조적으로, 아연 활성 부위를 표적으로 하는 강력한 HDAC 저해물질인 트리코스타틴 A (TSA)는 GAL4-VP16 및 GAL4-MEF2D/HDAC4-VP16에 의해 구동된 리포터 신호에 대한 유사한 저해 효과를 보였다 (데이터 제시되지 않음). 이들 결과는 PAOA는 HDAC4와 MEF2D 사이에 상호작용을 파괴할 수 있지만 TSA는 그렇지 못하다는 것을 암시한다.
HDAC4:MEF2 상호작용에 대한 PAOA의 IC50은 히스톤 아세틸화 저해 분석법을 이용하여 결정된 것과 유사한, 포유동물 이중-하이브리드 분석법에 기초하여 대략 5μM이었다. MEF2에 HDAC4 결합에 대한 Kd는 이전에, 0.47μM인 것으로 결정되었다. HDAC4의 평형 농도 (equilibrium concentration)를 본 발명의 분석 조건 하에 ~ 0.5μM이라고 가정하면, MEF2에 PAOA의 결합을 위한 Kd는 5μM인 것으로 추정된다. 하지만, 추정된 Kd는 유리 HDAC4 농도가 세포-기초된 분석법에서 더욱 낮으면 더욱 클 수 있다.
또한, PAOA가 HDAC4와 경쟁적으로 MEF2에 결합하는 지가 Biacore T-100에서 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 이용하여 시험관내에서 평가되었다. 여기서 HDAC4 (aa 155-220)가 CM5 센서 칩 상에 고정되고, 그리고 정제된 MEF2A (1-95)가 분석물로서 이용되었다. 다양한 농도에서 HDAC4에 MEF2A의 결합은 일련의 충분히 정의된 센소그램 (sensorgram)을 산출하였다 (데이터 제시되지 않음). 증가된 농도의 PAOA와 함께 항온처리된 MEF2A는 고정된 HDAC4에 대한 결합의 용량 의존성 감소를 보였다 (도 5). 이러한 Biacore 데이터의 분석은 경쟁적 결합 반응이 복합적인 반면, MEF2에 BML-2I0의 직접적인 결합이 상기 장치의 검출 한계 (detection limit)를 벗어난다는 것을 지시한다. 이들 기술적 한계는 정량적 결합 상수 (quantitative binding constant)의 획득을 어렵게 만들었다. 그럼에도 불구하고, 이러한 예비 데이터는 BML-210이 실제로, 시험관내에서 HDAC4와 경쟁적으로 MEF2에 결합한다는 것을 암시한다.
PAOA는 초기에, 아마도 튜불린-특정한 HDAC인 HDAC6이 아닌 HDAC의 저해를 통해, 튜불린이 아닌 히스톤의 아세틸화를 선별적으로 유도하는 일군의 화합물의 일부로서 발견되었다. PAOA는 시험관내에서 HDAC4와 경쟁적으로 MEF2에 결합한다. 오른쪽에 삽입물은 Biacore에 의한 분석법을 예시한다. HDAC4: 적색 나선; MEF2: 녹색 십자형. 디아세틸라아제. 비록 이러한 선택성의 분자 기초가 알려져 있진 않지만, 클래스 IIb 대집단에 속하는 HDAC6이 클래스 IIa에 보존된 MEF2-결합 모티프를 보유하지 않고 기능을 위하여 MEF2를 필요로 하는 것으로 생각된다는 것은 주목할 만하다. PAOA와 이의 유도체는 최근에, 프리드라이히 실조증에서 프라탁신의 발현을 강화시키는 것으로 밝혀졌다. 비록 이러한 기전이 유도된 히스톤 아세틸화를 수반하는 것으로 생각되긴 하지만, 더욱 강력하지만 덜 특정한 HDAC 저해물질, 예를 들면, TSA와 SAHA는 PAOA보다 세포 내에서 더욱 높은 수준 전체 히스톤 아세틸화를 유도할 수 있음에도 불구하고, 프라탁신 발현에 대한 어떤 효과도 나타내지 못하였다. 이들 관찰 결과는 PAOA와 이의 유도체가 프라탁신 침묵에 관여하는 특정한 HDAC 또는 HDAC 복합체를 저해하는 독특한 기능을 갖는다는 것을 암시한다. 게다가, PAOA의 작용에 대한 분자 기초는 본 발명에 기술된 MEF2에 결합된 BML-210의 결정 구조로 더욱 명백하게 설명될 수 있다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이 소형 분자 MEF2-결합 부위를 정의하는 것에 더하여, 이러한 구조는 또한, BML-210, PAOA 및 기타 벤자미드-포함 HDAC 저해물질에 존재하는 오르토-아미노아닐리드 모이어티에 대한 가능 결합 부위를 최초로 드러낸다. 흥미롭게도, 이러한 결합 부위는 이러한 종류의 HDAC 저해물질에 대하여 이전에 가정된 바와 같이 HDAC 효소의 활성 부위와 상이하다.
실시예 5. DNA 상에 MEF2에 결합된 BML-210의 복합체의 제조, 그리고 BML-210:MEF2:DNA 복합체의 결정, 그리고 이러한 복합체 구조의 원자 상세
MEF2에 결합된 BML-210의 상세한 상호작용을 특성화하고 더욱 강력한 MEF2 결합 분자의 설계를 인도하는 구조 정보를 이용하기 위하여, DNA 상에 MEF2에 결합된 BML-210의 결정 구조를 결정하였다. MEF2A1-78을 코딩하는 유전자는 MEF2AFL로부터 PCR 증폭 및 pET30b 발현 벡터 내로 클로닝에 의해 산출되었다. 단백질은 25℃에서 하룻밤동안, 대장균 (E. coli) 균주 BL21(DE3)pLysS에서 발현되고, 그리고 Sp-Sepharose에서 연속 크로마토그래피 단계에 의해 정제되고, 그리고 겔 여과가 4℃에서 25OmM NaCl, 1OmM Hepes(pH7.6), 1mM EDTA, 1mM DTT에서 수행되어 0.6 mg/ℓ의 최종 수율이 제공되었다. 올리고뉴클레오티드 (Santelli and Richmond, 2000)는 IDT DNA technologies로부터 구입되고, MonoQ FPLC 칼럼을 이용하여 정제되고, 그 이후에 투석, 동결건조 및 유전자 증폭 장치 (thermal cycler)를 이용한 어닐링이 수행되었다.
1/10th 단백질 시료 부피 (sample volume)의 1OmM BML 210이 0.5 mg/㎖로 상기 단백질 시료에 첨가되고 대략 17 mg/㎖(0.9 mM)로 농축되고, 그리고 DNA 이중나선이 트레이 (10%DMSO 종결 농도)를 셋팅하기에 앞서 1:1 비율로 첨가되었다. 판 유사한 결정이 24% PEG4000, 14OmM NaCI, 5mM MgCl2, 1OmM CaCI2, 0.004%NaN3, 3.3% 글리세롤, 5OmM TrisHCl (pH 5.8 - pH 8.18)을 이용하여 방울 증기 (drop vapor) 확산 조건을 18℃에서 묶어둠으로써 획득되었다. 약물 밀도를 갖는 결정은 pH 8.18에서 획득되었다. 결정은 2.4Å 분해능으로 회절되고 스페이스 기 (space group) P1 (a=41.567Å, b=61.622Å c=61.478Å α=114.12° β=89.99° γ-89.95°)에 속한다. 상기 구조는 1TQE.pdb를 탐색 모형으로서 이용한 분자 교체에 의해 해석된다 (참조: Richmond 2000). 최종 모형은 26%의 Rfree 및 23%의 Rw를 갖는다. 이들 동격자는 부착된다 (11.1_001_nr_nh_bml.pdb).
실시예 6. 구조-인도된 설계와 화학적 방법을 이용한 선도 최적화
기능적 스크린에 의해 발견된 대부분의 HDAC 저해물질은 마이크로몰 (micromolar) 또는 심지어 밀리몰 (millimolar) 범위에서 IC50으로 별로 크지 않은 효능을 갖는다. 선도 최적화는 전형적으로, 화학적 구조와 구조-활성 상관관계 (SAR) 연구의 체계적 변형에 의해 수행된다. 하지만, 표적, 그리고 화합물과 이의표적 사이에 상세한 결합 상호작용에 관한 지식 없이, 이런 경험적 접근법은 종종, 노동 집중적이고 효능이 제한된다. PAOA의 경우에 실제로 그러한데, 여기서 일련의 유사체가 프리드라이히 실조증을 치료하는데 이용될 수 있는 더욱 강력한 화합물을 탐색하기 위하여 합성되었다. 비록 일부 PAOA 유사체가 부모 화합물보다 더욱 높은 활성을 보이긴 했지만, 이러한 효과는 별로 크지 않고 향상의 기전이 분명하지 않았다.
흥미롭게도, 이들 PAOA 유도체가 프라탁신 발현을 활성화시키는 능력은 그들의 HDAC 저해 활성과 상관하지 않았다. 가령, 일부 유도체는 히스톤 디아세틸화 저해 분석에서 매우 약하지만 프라탁신 유도에서 매우 능동적이었다. PAOA가 MEF2에 결합하고 클래스 IIa HDAC의 동원을 차단한다는 예비 조사 결과는 이들 흥미로운 결과에 대한 잠재적인 분자 기전을 제공한다. 클래스 IIa HDAC는 디아세틸라아제 활성과 무관하게 전사를 억제할 수 있다. 가령, MITR로서 알려져 있는 전체 C-말단 촉매 도메인이 부재하는 HDAC9의 자연 발생 접합 변이체 (splicing variant)는 아마도 다른 후생적 효과물질, 예를 들면, HPI와 CtBP를 동원함으로써 MEF2-의존성 유전자 발현의 강력한 전사 억제물질이다. 이러한 의미에서, 클래스 IIa HDAC의 촉매 도메인을 표적으로 하는 소형 분자 저해물질은 이들 단백질의 완전한 후생적 침묵 잠재력을 소멸시킬 수 없고, 이는 프라탁신 발현의 재활성화에서 TSA와 SAHA의 무능을 설명할 수 있다. 다른 한편, PAOA는 HDAC 활성과 기타 전사 억제물질의 동원을 함께 차단할 수 있다. 비록 MEF2가 전사 활성물질, 예를 들면, CBP/p300을 동원함으로써 유전자 활성화에도 관여하긴 하지만, 현재의 데이터는 MEF2 의존성 유전자 발현에 대한 PAOA의 주요 효과가 클래스 IIa HDAC 및 기타 전사 억제물질의 침묵 효과를 완화시킨다는 것을 암시한다.
상기 분석 및 BML-210:MEF2:DNA의 개시된 구조에 의존하고, 그리고 MEF2A에 PAOA의 도킹 해법을 이용함으로써, 이러한 약물 분자는 실험적으로 관찰된 전자 밀도에 선호적으로 적합될 수 있는 것으로 확인되고, 이는 MEF2 결합을 위한 신규한 PAOA-유사 화합물의 설계에서 ICM-도킹 프로토콜의 상대적인 효능을 증명한다 (Molsoft L.L.C). 이러한 도킹 접근법은 잠재적으로 더욱 큰 친화성과 선택성을 갖는 새로운 PAOA 유사체를 설계하고 분석하는데 이용될 수 있다. 이러한 구조의 특징 중의 일부는 더욱 높은 친화성으로 MEF2에 결합할 수 있는 새로운 분자를 설계하는데 이용되는 원리를 예시하기 위하여 하기에 간단하게 기술된다.
BML-210은 MEF2의 소수성 포켓 내로 결합하기 위하여 확장된 형태를 취한다 (도 1). 이는 또한, 클래스 IIa HDAC와 Cabin1에서 보존된 MEF2-결합 모티프에 대한 결합 부위이다. 전자 밀도의 한쪽 단부가 간단한 방향족 고리와 유사하고 Leu66, Leu67, Thr70, Leu66', Leu67'과 Thr70' (프라임 기호는 다른 단량체로부터 잔기를 표시한다)을 비롯한 다수의 소수성 잔기에 의해 둘러싸여 있기 때문에, 상기 밀도는 페닐 기로 선정되었다. 이러한 단부에서 카르보닐 기 역시 Thr70'과의 수소 결합 상호작용에 참여하는 위치에 존재한다 (도 1).
최적화된 새로운 MEF2-결합 소형 분자의 구조-기초된 설계는 MEF2의 여러 공지된 구조를 이용하여 달성될 수 있다. 본 발명에서는 3가지 MEF2 복합체의 결정 구조를 해석하였다. 이들 중에서 2개는 각각, Cabin1과 HDAC9의 MEF2-결합 모티프 (Guo et al., 2007; Han et al., 2005; Han et al., 2003)로부터 유래된 펩티드를 포함하는 반면, 세 번째 것은 본 명세서에서 기술된 BML-210 복합체이고, 이는 소형 분자가 MEF2에 어떻게 결합할 수 있는 지를 보여주는 첫 번째 구조이다. 3가지 복합체 모두, 소형 분자 리간드가 자연 발생 펩티드 또는 합성 분자인 지에 상관없이, MEF2 이합체의 표면 상에 심부 그루브에 결합한다 (도 1). 이전의 연구에서, Cabin1과 HDAC9는 상이한 단백질-단백질 상호작용뿐만 아니라 유사한 단백질-단백질 상호작용을 통하여 MEF2에 결합하는 것으로 밝혀졌다 (도 1). 흥미롭게도, BML-210은 MEF2에 대한 결합에서 자연 리간드의 일부 측면을 모방하는 것으로 생각된다. 가령, Leu66, Leu67, Thr70, Leu66', Leu67'과 Thr70'에 의해 형성된 중심 소수성 포켓에 PAOA의 페닐 고리의 결합은 HDAC9 내에서 Leul47의 결합을 연상시킨다 (도 1). 이들 3가지 구조의 상세한 분석을 통하여, 다수의 구별된 소수성 포켓, 수소 결합 공여자와 수용자, 그리고 여러 하전된 잔기를 비롯하여 소형 분자 결합을 위하여 조사될 수 있는 MEF2 그루브 상에 다양한 구조 특징이 확인되었다. 이러한 구조 정보는 MEF2에 선별적으로 결합할 수 있는 일련의 소형 분자를 설계하고 최적화하는데 이용이 계획된다.
실시예 7. MEF2/HDAC 상호작용의 소형 분자 저해물질의 구조-인도된 설계
이들 결정 구조를 가이드로서 이용하여, 새로운 MEF2-활성 소형 분자를 확인하기 위한 기초를 제공할 수 있는 다수의 PAOA 유사체가 설계되었다. 첫 번째 유사체 군은 PAOA 구조의 2가지 일반적 요소를 조사하기 위하여 설계되었다. 첫 번째는 링커의 길이와 강성률이다. 두 번째는 기능 기 및 2개의 방향족 결합 단위 상에 이들의 방향이다. 링커의 전자 밀도는 상기 링커가 복수 형태를 취한다는 것을 지시하고 이러한 영역 내에서 PAOA와 MEF2 사이에 비-최적 결합을 암시한다. 다른 한편, HDAC9에서, Lysl44와 VaI143의 지방족 측쇄는 광범위한 판 데르 발스 (Van der Waals) 접촉과 수소 결합을 확립하기 위하여 MEF2의 그루브를 정밀하게 채운다. 이들 자연 상호작용을 모방/향상시키기 위하여 PAOA 링커에 도입된 기능 기는 결합 친화성을 강화시킨다. 이들 설계된 화합물은 정력적으로 불리한 것들을 걸러 내기 위하여 앞서 언급된 도킹 분석에 종속되었다. 나머지 분자는 표준 기술을 이용하여 합성되고 앞서 기술된 바와 같은 시험관내와 생체내 분석에 종속되었다.
첫 번째 일련의 잠재적인 저해물질 (도 2)이 합성되었고, 그리고 상이한 화합물은 포유동물 이중-하이브리드 분석법에서 리포터 신호를 저해하는 능력에서 현저하게 상이한 활성을 나타내는 것으로 이미 밝혀졌다. 가장 흥미롭게도, 이들 중에서 한 가지, 화합물 4는 PAOA와 유사한 활성을 나타내지만 GAL-VP-16에 의해 구동된 조절 신호에 어떤 영향도 주지 않았는데, 이는 상기 새로운 유도체가 PAOA모다 더욱 특이적이라는 것을 암시한다. PAOA 내에서 오르토-아미노아닐리드 모이어티는 이전에, 클래스 I과 클래스 II HDAC의 활성 부위에 결합할 수 있는 아연 킬레이트화 기인 것으로 가정되었지만, 이러한 작용 양식에 대한 직접적인 증거는 아직 획득되지 못하고 있다. 화합물 4에서, 이러한 아연 킬레이트화 기는 아미노 기를 메타 위치로 이전함으로써 제거된다. 하지만 이러한 유도체는 비-특이적 효과가 적으면서도 PAOA 만큼 능동적인데, 이는 본 발명의 분석 조건 하에 세포 내에서 PAOA의 관찰된 효과가 촉매 활성을 저해하기 보다는 MEF2:HDAC4 상호작용을 파괴하는 능력에 주로 기인한다는 것을 암시한다.
실시예 8. 화합물 10의 합성
제시된 화합물은 당분야에 공지된 방법의 개조에 의해 제조될 수 있다. 가령, 화합물 10:
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의 합성은 아래의 단계에 의해 제조되었다:
단계 1: 피멜산 (1 당량)과 3-브로모아닐린 (1 당량)이 플라스크에 첨가되고 130Å에서 하룻밤동안 교반되었다. 반응 혼합물은 EtOAc에서 희석되고 10% 수산화칼륨으로 추출되었다. 수성 층은 cone. HCl로 pH~2로 산성화되고 에틸 아세테이트로 추출되었다. 유기 층은 진공 하에 환원되고 아세토니트릴/물로 재결정화되었다.
단계 2. 디클로로메탄에서 페닐렌디아민의 용액에 실온에서 (Boc)2O (1 당량)이 첨가되고, 그리고 혼합물은 하룻밤동안 교반되었다. 반응물은 진공 하에 농축되고, 에틸 아세테이트로 희석되고, 그리고 물과 염수로 3회 추출되었다. 유기 층은 진공 하에 환원되고 클로로포름/헥산으로 재결정화되었다.
단계 3. 단계 1의 산물 (100 mg)은 DMSO (3 ㎖)에 용해되고, 그리고 생성된 용액에 Hunig 염기 (1 equiv), HBTU (1 equiv) 및 단계 2의 단일보호된 페닐렌디아민 산물이 첨가되었다. 생성된 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반되었다. 상기 용액은 에틸 아세테이트로 희석되고 염수로 3회 추출되었다. 유기 층은 진공 하에 환원되고 칼럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트 농도구배)에 의해 정제되었다. 분리된 산물은 디클로로메탄에 용해되고, 0℃로 냉각되고, 그리고 트리플루오르아세트산 (1 ㎖)으로 처리되었다. 생성된 용액은 실온으로 가온되고 하룻밤동안 교반되었다. 반응물은 중탄산나트륨으로 중화되고 진공 하에 농축되었다. 생성된 고체는 에틸 아세테이트에 용해되고 포화된 염화나트륨 용액으로 추출되었다. 유기 층은 황산마그네슘으로 건조되고, 여과되고, 진공 하에 농축되고, 그리고 칼럼 크로마토그래피 (헥산/에틸 아세테이트 및 디클로로메탄/메탄올 농도구배)에 의해 정제되었다. 진공 하에 이들 용매의 증발은 순수한 산물 10을 제공하고, 이의 구조와 순도는 NMR 분광학에 의해 확인되었다.
비록 본 발명이 특정한 예시적인 구체예와 실시예의 관점에서 기술되긴 했지만, 본 명세서에 개시된 구체예는 예시를 목적으로 하고 다양한 개변이 하기 특허청구범위에서 기술된 바와 같은 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서 당업자에 의해 만들어질 수 있을 것으로 인지될 것이다.
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참고문헌
본 명세서에 인용된 모든 간행물은 순전히 참조로서 편입된다.
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Claims (36)

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  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. MEF2 표면에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는, 다음의 군에서 선택된 화합물:
    Figure 112014126941912-pct00090
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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