KR101532999B1

KR101532999B1 - 수니티닙 내성을 가진 신장암 세포주

Info

Publication number: KR101532999B1
Application number: KR1020140019155A
Authority: KR
Inventors: 변석수; 이상철; 이은식; 호진녕; 진현진
Original assignee: 서울대학교병원 (분사무소)
Priority date: 2014-02-19
Filing date: 2014-02-19
Publication date: 2015-07-02

Abstract

본 발명은 신장암 세포주, 더욱 상세하게는 항암제인 수니티닙(sunitinib)에 대해 내성을 가진 신세포암 세포주에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 수니티닙에 내성을 갖는 신장암 세포주를 제공하여, 수니티닙의 약제내성 기전을 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 수니티닙에 내성을 갖는 암을 치료할 수 있는 새로운 항암제의 스크리닝을 위해서도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

수니티닙 내성을 가진 신장암 세포주 {Renal cell carcinoma cell line with Sunitinib resistant}

본 발명은 신장암 세포주, 더욱 상세하게는 항암제인 수니티닙(sunitinib)에 대해 내성을 가진 신세포암 세포주에 관한 것이다.

신장암은 발생하는 위치에 따라 신우암과 신세포암으로 구분할 수 있는데, 80~90%가 신세포암이다. 2007년 미국에서 약 51,200명 정도의 환자가 신세포암으로 진단을 받았으며, 약 12,900명의 환자가 사망한 것으로 추정되고 있고 전 세계적으로 매년 그 발생빈도가 증가하고 있다 (Jemal A et al. CA Cancer J Clin 57: 43-66, 2007).

우리나라에서는 2010년 보건복지부 중앙암등록본부의 자료에 따르면 3,598명의 환자가 등록되어 전체 암발생의 1.8%를 차지하고 있다. 신장암은 40대 이후의 남성에서 많이 발생하며 지속적인 증가 추세를 보이고 있으며, 남성이 여성보다 2배 정도 많아 우리나라 남성에서 발생하는 암중 2.4%로 9위를 차지하고 있다 (국립암센터. 국가암등록사업 연례보고서, 2010년 암등록통계).

신세포암의 치료는 암의 진행정도와 환자의 연령, 전신상태, 동반된 다른 질환의 유무 등에 따라 결정하게 되는데, 초기의 국소성 병변일 경우 근치적 신적출술과 같은 수술요법이 표준 치료가 된다 (Escudier B et al., Ann Oncol 21: 137-139, 2010). 하지만 신세포암 환자의 25~30%가 진단 당시 이미 전이성 질환을 나타내며, 국소성 신세포암으로 신적출술을 시행 받은 환자에서도 20~50%가 추적관찰 기간 중 재발, 진행 또는 전이성 질환을 나타내게 된다. 다른 장기에 전이가 있는 경우는 표적치료나 면역요법, 면역화학요법 등을 시행하게 되는데, 신세포암은 방사선 치료나 항암화학요법에 잘 반응하지 않는 대표적인 암으로 그 동안 면역치료가 주로 시행되어 왔으나 반응률이 10~15%로 낮고 평균 생존 기간이 겨우 1년 정도로 치료 효과가 좋지 않아서 새로운 약제의 개발이 절실히 필요한 질환으로 인식되어 왔다 (Board RE et al., Cancer Ther Rev 33: 1-8, 2007).

최근 신세포암의 신호전달체계와 관련한 생물학적 기전 및 분자유전학적인 연구 결과, VHL(Von Hippel-Lindau) 유전자가 비활성화되면서 종양의 신생혈관생성을 유발한다는 사실이 밝혀지면서 이를 억제하기 위한 표적치료제가 개발되었다. 이러한 표적치료제에는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 항체, 광범위(broad spectrum) 또는 다중표적 (multi-targeted) 티로신 키나아제 저해제(tyrosine kinase inhibitors, TKIs), mTOR(mammalian target of rapamycin) 저해제 등이 있는데, 종래의 면역치료요법에 비해 항암효과가 우월할 뿐만 아니라 환자의 생존율을 향상시키고, 부작용면에서도 유리하여 내약성이 좋으며 대부분의 약제들이 경구로 투여할 수 있다는 이점을 가지고 있다 (Kroog GS et al., Urol Clin North Am 35: 687-701, 2008). 현재 표적치료제는 수술이 불가능한 진행된 또는 전이성 신세포암의 1차 또는 2차 전신 항암요법으로 널리 사용되고 있으며 현재까지 수니티닙(sunitinib), 소라페닙(sorafenib), 베바시주맙(bevacizumab), 파조파닙(pazopanib), 템시롤리무스(temsirolimus), 에버로리무스(everolimus) 등의 약제가 임상에서 사용되고 있다.

수니티닙은 미국 FDA에서 2006년과 2008년에 각각 위장관 기질종양(gastrointestinal stromal tumor)과 전이성 신세포암 치료에 승인된 경구용 캡슐제이다. 수니티닙은 혈관내피성장인자 수용체(VEGFR)와 혈소판유도성장인자 수용체(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR), 줄기세포인자 수용체(stem cell factor receptor, c-Kit), 태아 간 티로신 키나아제 수용체 3(fetal liver tyrosine kinase receptor 3, FLT3) 등의 강력한 차단제로 작용한다. 이들 중 혈관내피성장인자 수용체와 혈소판유도성장인자 수용체와 같은 티로신 키나아제 수용체들은 암세포 증식과 혈관생성에 중요한 역할을 하게 되는데, 수니티닙은 이들의 작용을 억제함으로써 혈관신생을 차단하고 암의 성장을 저해하여 항암 효과를 나타내는 다중표적 티로신 키나아제 저해제(TKIs)에 속한다 (Motzer RJ et al., J Clin Oncol 24: 16-24, 2006). 현재 수니티닙은 우리나라를 비롯한 국외에서 진행성 또는 전이성 신세포암에 사용 승인되어 있으며, NCCN, ESMO, EAU 등의 최신 임상 치료 가이드라인에서 수술이 불가능한 진행성 또는 전이성 신세포암의 1차 치료제로, 기존의 사이토카인 치료에 실패한 환자의 2차 치료제로 인정되고 있다 (Escudier B et al., Ann Oncol 21: 137-139, 2010). 표적치료제인 수니티닙군과 사이토카인 치료제인 인터페론-알파(interferon-alfa)군을 무작위로 배정한 3상 임상연구에서 수니티닙군과 인터페론-알파군에서 무진행 생존기간 11개월 대 5개월, 반응율 31% 대 6%를 나타내어 표적치료제인 수니티닙의 우월한 치료 효과가 보고된 바 있다 (Motzer RJ et al., N Engl J Med 356: 115-124, 2007). 지금까지 전이성 신세포암 임상연구에 포함된 환자들은 대부분 투명세포암(clear cell carcinoma)의 조직형을 보이고 있어 비투명세포 신세포암의 치료에 있어서는 새로운 표적치료제 뿐만 아니라 각 항암요법의 효과에 대한 연구결과가 매우 제한적이었는데, 최근의 연구결과에 따르면, 비투명세포암(non-clear cell carcinoma)에서 수니티닙과 소라페닙의 항암효과를 분석한 결과 반응율 10%, 무진행 생존기간 8.6개월, 전체 생존기간 19.6개월을 보고한 바 있다. 특히 수니티닙은 유두상 신세포암에서 17%의 반응율을 나타내었으며, 소라페닙에 비해 무진행 생존기간을 유의적으로 연장시켰다 (Choueiri TK et al., J Clin Oncol 26: 127-131, 2008).

따라서 수니티닙에 대한 약제내성은 신세포암을 비롯한 여러 종류의 암을 치료하는데 있어 매우 중요한 문제이다. 기존에 연구된 수니티닙에 대한 내성기전은 Akt와 MAPK 경로의 인산화에 의한 것으로 보고되고 있으며 (Sakai I et al., BJU Int 112: E211-E220, 2013), 세포 내 PTEN 발현 여부가 연관된다는 보고와 수니티닙이 라이소좀에 축적되어 수니티닙 내성을 유도한다는 보고도 있으나 (Marhov PB et al., Mol Cancer Ther 11: 1510-1517, 2012), 현재까지 Caki-2 신세포암 세포에서 수니티닙 내성 세포주 수립에 대한 보고는 없다.

본 발명에서는, 신세포암 세포들 중에서 수니티닙에 내성을 갖는 세포주를 수립하고 수니티닙 내성 세포주와 모세포주에서의 유전자 발현을 실시간 중합효소반응과 웨스턴 블로팅 방법을 이용하여 비교 분석하여 수니티닙 내성 기전을 알아내고자 하였다.

또한, 항암제들의 유의한 발전에도 불구하고, 많은 환자들이 약물에 대한 획득 내성을 나타내기 때문에 암을 장기간 제어하기는 어렵다. 그러므로 환자의 지속적인 치료를 위해서는 이들 약물에 의해 발생하는 내성 메커니즘을 연구하는 것이 필수적일 것이다 (Engelman JA et al., Clin Cancer Res 14: 2895-2899, 2008). 따라서 항암제 중에서 수니티닙에 대한 약제내성은 신세포암을 비롯한 여러 종류의 암을 치료하는데 있어 매우 중요한 문제로 대두되고 있으므로, 수니티닙 내성 연구를 위한 새로운 세포 모델의 필요성 또한 요구되고 있다.

따라서 본 발명의 목적은 수니티닙에 내성을 갖는 인체 신장암 세포주를 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 상기 수니티닙 내성 세포주와 모세포주의 유전자 발현 차이를 비교함으로써 항암제에 대한 내성 기전을 확인하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 모세포주인 신장암 세포주 Caki-2에 대하여 2배의 수니티닙 내성을 갖는 신장암 세포주 KCTC18274P를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 신장암 세포주는 소라페닙 및 파조페닙에 대해 교차내성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시에에 있어서, 상기 신장암 세포주는 모세포주인 신장암 세포주 Caki-2에 대하여 혈소판유도성장인자 수용체-A의 발현이 4.5배 높은 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은, 상기 신장암 세포주 KCTC18274P에 후보물질을 처리하고 수니티닙에 대한 내성 극복여부를 확인하는 것을 포함하는 수니티닙 내성을 가진 신장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 수니티닙에 내성을 갖는 신장암 세포주를 제공하여, 수니티닙의 약제내성 기전을 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 수니티닙에 내성을 갖는 암을 치료할 수 있는 새로운 항암제의 스크리닝을 위해서도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 Caki-2 및 Caki-2SR5 세포의 수니티닙에 대한 내성 획득 여부를 검증한 결과이다.
도 2는 Caki-2 및 Caki-2SR5 세포의 소라페닙과 파조파닙에 대한 교차내성을 확인한 결과이다.
도 3은 Caki-2 및 Caki-2SR5 세포에 수니티닙을 처리한 후 혈소판유도성장인자 수용체-A의 발현을 분석한 결과이다.
도 4는 Caki-2 및 Caki-2SR5 세포에 수니티닙을 처리한 후 웨스턴 블로팅 방법으로 혈관내피성장인자-A 발현을 분석한 결과이다.

본 발명은 모세포주인 신장암 세포주 Caki-2에 대하여 2배의 수니티닙 내성을 갖는 신장암 세포주 KCTC18274P를 제공한다.

본 발명에서 사용된 ‘신장암 세포주’는 미국 ATCC(American Type Culture Collection, Rocknille, MD)에서 도입한 인체 신장암 세포주 Caki-2이다. 상기 Caki-2 세포주에 수니티닙 1 μM부터 시작하여 약제에 내성을 가지는 세포주를 선택하는 방법으로 점진적으로 수니티닙의 농도를 올려서 5 μM에 내성을 가지는 내성 세포주 Caki-2SR5를 수립하였고, 상기 수니티닙 내성 세포주 Caki-2SR5는 한국생명공학연구원에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC18274P).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 Caki-2SR5 세포주는 수니티닙에 대하여 모세포주인 Caki-2에 비해 약 2배의 내성을 나타내었다. 또한, Caki-2SR5의 내성기전을 규명하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응 방법과 웨스턴 블로팅 방법을 이용하여 두 세포주간의 혈소판유도성장인자수용체-A와 혈관내피성장인자-A의 발현 차이를 분석하였다. 또한 같은 항암 기전을 갖는 약물인 소라페닙과 파조파닙 및 다른 항암기전을 갖는 약물인 템시롤리무스와 에버로리무스에 대하여 세포 생존율을 비교하여 교차내성 여부를 분석하였다.

본 발명의 실시예에서, 48시간 모세포(Caki-2)와 Caki-2SR5 세포에 수니티닙 8 μM을 처리한 결과, 본 발명의 Caki-2SR5 세포주에서는 세포생존의 감소가 거의 없었으나, Caki-2 세포에서는 세포생존율이 약 51% 정도로 감소하였다 (도 1 참조). 따라서 본 발명의 세포주는 2배 이상의 수니티닙 내성을 나타냄을 확인하였다. 또한 본 발명의 세포주는 수니티닙과 같은 항암 기전을 갖는 약물인 소라페닙과 파조파닙에 대해 교차내성을 나타내었으며 (도 2 참조), 다른 항암 기전을 갖는 약물인 템시롤리무스와 에버로리무스에 대해서는 교차내성을 나타내지 않았다 (도 3 참조). 뿐만 아니라, 본 발명의 신장암 세포주는 모세포주인 신장암 세포주 Caki-2에 대하여 혈소판유도성장인자 수용체-A의 발현이 4.5배 높은 것으로 나타나 혈소판유도성장인자 수용체-A의 발현 유지를 통해 수니티닙 내성에 기여하고 (도 4 참조), 또한 혈관내피성장인자-A의 발현 유지를 통하여 수니티닙에 대한 내성을 나타내고 있음을 밝혀내었다 (도 5 참조). 따라서, 본 발명은 수니티닙에 내성을 갖는 신장암 세포주를 제공함으로써, 수니티닙의 약제내성 기전을 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있고, 본 발명의 세포주를 이용하여 수니티닙에 내성을 갖는 암을 치료할 수 있는 새로운 항암제를 효과적으로 스크리닝 할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 신장암 세포주 KCTC18274P에 후보물질을 처리하고 수니티닙에 대한 내성 극복여부를 확인하는 것을 포함하는 수니티닙 내성을 가진 신장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 스크리닝 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 항암 효과를 갖는 것으로 1차 스크리닝된 후보물질들에 대한 2차 스크리닝 방법으로서 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 이러한 단계를 거쳐 스크리닝된 후보물질은 항암 효과를 가지면서도 수니티닙에 대한 내성을 나타내지 않을 것이므로 수니티닙과 함께 병용 사용함으로써 효과적으로 신장암을 치료할 수 있게 된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 신세포암 세포주 배양 및 내성 세포주의 확립

신세포암 세포주는 미국 ATCC(American Type Culture Collection, Rocknille, MD)에서 도입한 인체 신장암 세포주 Caki-2를 사용하였다. Caki-2는 69세 백인 남성의 신장암 조직에서 수립된 세포주로서 신장암의 여러 특성을 보이고 있어 널리 이용되는 세포주이다. 세포주 배양을 위한 배지로는 RPMI 배양액(Gibco, Laboratories, Grand Island, NY)에 10 mg/mL의 겐타마이신(Gentamicin Reagent Solution, Gibco Laboratories, Grand Island, NY)과, 56℃에서 30분간 비등화시킨 10% 우태혈청(FBS: fetal bovine serum, Gibco Laboratories, Grand Island, NY)을 첨가하여 사용하였다. Caki-2 세포주는 37℃로 5% CO₂-95% 에어(air) 항온항습기에서 배양하고 단세포층으로 부착하게 하여 성장시켰다.

수니티닙 내성 세포주의 확립을 위해, 수니티닙(sunitinib malate, Sutent, Pfizer Inc., NY) 농도를 1 μM부터 노출시켜 내성을 가지는 세포주를 선택하는 방법으로 점진적으로 항암제 용량을 올려서 5 μM에 내성을 가지는 세포주(Caki-2SR5)를 수립하고, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2014년 2월 4일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC18274P를 부여받았다.

실시예 2. 세포독성 분석 1

세포가 내성을 획득했는지 검증하기 위하여, Caki-2 및 Caki-2SR5 세포에 수니티닙의 농도를 0~20 μM로 증가시키면서 처리한 후, CCK-8(cell counting kit-8) 분석으로 세포생존(cell viability)을 평가하였다. 세포들을 2×10³ 세포/웰의 밀도로 96-웰 컬쳐 플레이트에 씨딩하고, 24시간 동안 배양하였다. 세포들을 수니티닙에 24, 48 및 72시간 동안 처리한 후, CCK-8(Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD, USA)을 각각의 웰에 첨가한 후 5시간 동안 배양하고 마이크로플레이트 리더(SpectraMax Plus384 microplate reader; Molecular Devices, Hercules, CA, USA)로 450 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였다.

도 1은 Caki-2 및 Caki-2SR5 세포가 수니티닙에 대한 내성을 획득했는지를 검증하기 위한 세포독성 분석 결과이다. 도 1에서, a)의 빨간색 그래프는 Caki-2 세포, 파란색 그래프는 Caki-2SR5 세포의 세포생존능을 나타내고, b)는 수니티닙 처리 48시간에서 세포 성장을 보여주는 현미경 사진이다.

도 1에서 볼 수 있듯이, 24시간과 48시간에서 Caki-2SR5 세포에서는 수니티닙의 농도를 8 μM 정도로 증가시킬 때까지 세포생존의 감소가 거의 없었으며, 이와는 반대로 Caki-2 세포에서는 8 μM 농도에서 24시간과 48시간 동안 수니티닙을 처리한 경우 세포생존율이 약 36%와 51% 정도로 감소하였다. 특히 Caki-2SR5 세포에 수니티닙을 72시간 동안 처리한 경우는 모든 농도에서 Caki-2 모세포와 비교할 때 13~55% 정도로 세포 생존율이 증가하였다. 상기 분석을 통하여, 본 발명의 Caki-2SR5 세포는 8 μM 이상의 수니티닙 고농도에서도 강한 내성을 보이면서 생존함을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 세포독성 분석 2

세포의 교차내성 여부를 검토하기 위하여, Caki-2 및 Caki-2SR5 세포에 소라페닙과 파조파닙의 농도를 증가시키면서 처리한 후 CCK-8 분석으로 세포생존을 평가하였다. 소라페닙과 파조파닙은 수니티닙과 마찬가지로 세포내에서 혈관내피성장인자 수용체, 혈소판유도성장인자 수용체, c-Kit 등의 다양한 키나아제(kinase)를 표적으로 하는 다표적 혈관생성 억제 약물이다 (Flaherty KT. Clin Cancer Res 13: 747-751, 2007).

도 2는 Caki-2 및 Caki-2SR5 세포가 소라페닙과 파조파닙에 대한 교차내성을 나타내는지를 검토하기 위한 세포독성 분석 결과이다. a)는 소라페닙, b)는 파조파닙을 처리한 후 세포생존을 분석한 결과이다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 24시간과 48시간 동안 소라페닙을 처리에 했을 때 Caki-2SR5 세포는 Caki-2 모세포와 비교할 때 5, 7.5, 10, 12.5, 15 μM에서 약 20~40% 정도의 세포생존율 증가를 나타내었으며, 특히 48시간 7.5 μM을 처리한 세포에서는 약 40% 세포생존율 증가를 나타내어 소라페닙 약물에 대한 교차내성을 보였다 (도 2의 a). 또한 파조파닙 처리에 의해서도 24, 48 및 72시간 모두에서 Caki-2SR5 세포는 Caki-2 모세포와 비교할 때 5, 10, 25, 50, 75 μM에서 약 15~47% 정도의 세포생존율 증가를 나타내었으며, 파조파닙에 대한 교차내성을 내성을 나타내었다 (도 2의 b).

실시예 4. 교차내성 분석

Caki-2와 Caki-2SR5 세포에서 각 약물의 세포독성 여부를 통해 약물에 대한 내성 여부를 판단하기 위하여, 상기 실시예 2 내지 3의 CCK-8 분석 결과를 바탕으로 Sigma plot 10 프로그램을 사용하여 반수저해농도(IC50)를 구한 다음 하기 표 1에 나타내었다.

약물	IC50 (48 시간)
약물	Caki-2	Caki-2SR5
수니티닙 (μM)	8.26±0.47	14.53±0.15
소라페닙 (μM)	9.87±1.19	14.11±1.07
파조페닙 (μM)	41.27±7.14	64.76±9.00

상기 표 1과 같이, 수니티닙 내성세포주인 Caki-2SR5는 Caki-2 모세포주와 비교하여 소라페닙과 파조페닙에 대해 교차내성을 나타내지 않는 것으로 보인다. 상기 세포독성 분석결과를 통하여, 항암제 내성인 세포주에도 효과가 있는 항암제를 찾아낼 수 있다.

실시예 5. 실시간 중합효소연쇄반응

수니티닙은 VEGF 수용체과 혈소판유도성장인자 수용체(PDGFR), c-Kit 등의 티로신 키나아제를 억제함으로써 혈관신생을 차단하고 암의 성장을 억제하는 약제이므로 (Motzer RJ et al., J Clin Oncol 24: 16-24, 2006), Caki-2 및 Caki-2SR5 세포에 48시간 동안 수니티닙을 처리한 후 실시간 중합효소연쇄반응 방법으로 혈소판유도성장인자 수용체-A의 발현을 분석하였다. 세포들에서 RNA 분리키트(RNeasy mini kit; Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 제작사의 방법에 따라 RNA를 분리하였으며, 1 μg RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 2 μl cDNA 및, 2 μl 혈소판유도성장인자 수용체-A (F: AGCTGATCCGTGCTAAGGAA; R: ATCGACCAAGTCCAGAATGG)와 GAPDH (F: TGCACCACCAACTGCTTAG; R: AGAGGCAGGGATGATGTTC) 각각의 프라이머, 염색용 시약(2x FastStart Universal SYBR Green Master) 10 μl, 6 μl 증류수를 넣어 볼륨을 20 μl로 조정하였다. PCR 조건은 초기변성은 95℃에서 15분간, 나머지 40 사이클은 95℃에서 15초, 풀림은 58℃에서 30초간, 연장은 72℃에서 30초간으로 하여 증폭시켰다. 유전자의 발현정도는 GAPDH를 기준으로 발현된 유전자의 상대적인 값을 정량적으로 표현하였다.

도 3은 Caki-2 및 Caki-2SR5 세포에 48시간 동안 수니티닙을 처리한 후 혈소판유도성장인자 수용체-A의 발현을 분석한 결과이다.

도 3에서 볼 수 있듯이, Caki-2SR5 세포는 Caki-2 세포와 비교하여 혈소판유도성장인자 수용체-A의 발현이 4.5배 증가하였으며, Caki-2 세포는 48시간 동안의 수니티닙 처리에 의해서 혈소판유도성장인자 수용체-A 발현이 80% 정도 감소되었으나, Caki-2SR5 세포는 Caki-2 세포와 비교할 때 현저히 높은 혈소판유도성장인자 수용체-A 발현 수준을 유지하고 있었다. 이러한 분석 결과는 혈소판유도성장인자 수용체-A의 발현 유지가 Caki-2S5R 세포의 수니티닙 내성에 기여하고 있음을 제시한다.

실시예 6. 웨스턴 블로팅에 의한 혈관내피성장인자-A 발현 분석

암세포는 혈관내피성장인자들(VEGF-A, -B, -C, -D, -E, -F, PLGF)과 같은 다양한 성장인자를 분비함으로써 혈관 생성을 유도한다. 이러한 성장인자는 생체 내에서의 혈관 침투 및 모세혈관의 성장을 유도하여 암세포에 영양분 및 산소를 공급함으로써, 암세포의 크기 증가를 유도할 수 있다. 뿐만 아니라 신생혈관형성은 암의 전이에도 필수적인 과정으로 잘 알려져 있다 (Kontovinis LF et al., BMC Cancer 9: 82-91, 2009).

Caki-2 및 Caki-2SR5 세포에 48시간 동안 수니티닙을 처리한 후 웨스턴 블로팅 방법으로 혈관내피성장인자-A 발현을 분석하였다. 세포들을 RIPA 버퍼로 용해시킨 후, BCA 단백질 분석 키트 (Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE를 이용하여 분획하고, 니트로셀룰로스막으로 옮겼다. 5% 탈지유가 함유된 PBS+0.1% Tween 20으로 블로킹한 후, 상기 막을 VEGF-A와 β-actin 1차 항체로 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 단백질을 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체 및 ECL 화학발광 탐지 시스템(Amersham-Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)을 이용하여 탐지하였다.

도 4는 Caki-2 및 Caki-2SR5 세포에 48시간 동안 수니티닙을 처리한 후 웨스턴 블로팅 방법으로 혈관내피성장인자-A 발현을 분석한 결과이다.

도 4에서 볼 수 있듯이, 수니티닙은 모세포주인 Caki-2에서는 혈관신생성의 마커인 혈관내피성장인자-A의 현저한 감소를 유도하였으나, 수니티닙 내성세포주인 Caki-2S5R에서는 그러하지 않았다. 이러한 분석을 통해 Caki-2S5R 세포는 혈관내피성장인자-A의 발현 유지를 통하여 수니티닙에 대한 내성을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC18274P

20140210

Claims

모세포주인 신장암 세포주 Caki-2에 대하여 2배의 수니티닙 내성을 갖는 신장암 세포주 KCTC18274P.
제 1항에 있어서, 상기 신장암 세포주는 소라페닙 및 파조페닙에 대해 교차내성을 나타내는 것을 특징으로 하는 신장암 세포주 KCTC18274P.
제 1항에 있어서, 상기 신장암 세포주는 모세포주인 신장암 세포주 Caki-2에 대하여 혈소판유도성장인자 수용체-A의 발현이 4.5배 높은 것을 특징으로 하는 신장암 세포주 KCTC18274P.
제 1항에 따른 신장암 세포주 KCTC18274P에 후보물질을 처리하고 수니티닙에 대한 내성 극복여부를 확인하는 것을 포함하는 수니티닙 내성을 가진 신장암 치료제의 스크리닝 방법.