KR101530210B1 - Marker for gastric cancer diagnosis using N-glycopeptide - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 바이오마커로서 부위 특이적으로 Ｎ-당쇄화된 당펩타이드를 이용하여 바이오마커의 N-당쇄변화를 탐지하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for detecting N-sugar chain change of a biomarker using a site specific N-glycosylated sugar peptide as a biomarker.
임상에서의 암 진단은 전형적으로 병력 조사, 물리적 검사 및 임상적 평가후 조직 생검을 수행하여 확인하고 있다. 그러나, 임상 실험에 의한 암 진단은 암 세포의 수가 10억 개 이상이고 암의 직경이 1 cm 이상일 경우에만 가능하다. 이 경우, 암 세포는 이미 전이능력을 가지고 있으며, 적어도 이들 중 반은 이미 전이된 상태이다. 또한, 암으로부터 직접 또는 간접적으로 생산되는 물질을 모니터링하기 위한 종양 마커가 암 스크리닝에 사용되고 있지만, 암이 존재하는 경우에도 종양 마커 스크리닝 결과 반 이상이 정상으로 나타나고, 암이 없는 경우에도 자주 양성으로 나타나기 때문에, 정확성에 한계가 있어 혼란을 초래하고 있다. 뿐만 아니라, 암 치료에 주로 사용되는 항암물질은 종양의 크기가 작을 때만 효과를 나타낸다는 문제가 있다.
Clinical cancer diagnosis is typically confirmed by histologic biopsy after history, physical examination, and clinical evaluation. However, clinical diagnosis of cancer is possible only when the number of cancer cells is over 1 billion and the diameter of cancer is more than 1 cm. In this case, the cancer cells already have the ability to transform, and at least half of them have already metastasized. In addition, although tumor markers for monitoring substances produced directly or indirectly from cancer are used for cancer screening, even when cancer is present, more than half of the tumor marker screening results are normal, and even when there is no cancer, Therefore, there is a limit to the accuracy, causing confusion. In addition, anticancer substances, which are mainly used for cancer treatment, have a problem in that they are effective only when the tumor size is small.
위암환자의 조기진단 및 진단을 위한 방법 중 가장 많이 이용되는 방법은 위내시경 검사와 위장 조영술이 있다. 이러한 검사로 위암이 진단되면 암이 위에만 있는지 혹은 주위의 다른 장기에 퍼졌는지를 확인하기 위해, 즉 위암의 병기를 진단하기 위해 컴퓨터 단층 촬영(CT)을 시행하며 때로는 초음파 내시경, 복부 초음파 검사를 시행하게 된다. 그 외에 추가로 시행할 수 있는 검사로 혈액 내 종양 표지자 검사 등이 있다. 이는 생체조직검사나 고가의 의료장비를 필요로 하므로 피검자에게 육체적, 경제적인 부담을 줄 수 있다.
The most commonly used methods for early diagnosis and diagnosis of gastric cancer patients are stomach endoscopy and gastroenterography. When the diagnosis of stomach cancer is made by these tests, a computerized tomography (CT) is performed to diagnose the stage of the stomach cancer, and ultrasound endoscopy and abdominal ultrasonography . Other possible tests include tumor markers in the blood. This requires a biopsy or expensive medical equipment, which can give physical and economic burdens to the subject.
글라이코믹스는 글라이칸 구조 및 특성에 관한 광범위한 연구를 포함한다. 글라이칸은 단당류 구조, 가지뻗기 (branching)의 정도 및 연결구조가 다양하기 때문에 구조가 매우 복잡하여 분석이 용이하지 않다. 게놈의 단선적인 DNA 주형과 직접적으로 관련되어 있는 단백질 구조와 달리, 글라이칸 구성은 일련의 글라이코실트랜스퍼레이즈 효소반응에 의해 결정된다. Glicomics involves extensive research on glycan structure and properties. Glycans are difficult to analyze because of their complex structure because of the diversity of the monosaccharide structure, the degree of branching, and the connection structure. Unlike the protein structure, which is directly related to the discrete DNA template of the genome, the glycan structure is determined by a series of glycosyltransferase enzymatic reactions.
N-당쇄화 (N-Glycosylation)는 펩타이드 골격의 아스파라긴에 올리고당이 부가되는 것이다. 이것은 그 위치와 구조적 다양성을 결정하는 생물학적 원칙에 의해 지배된다. N-당쇄화의 변화는 종양과 같은 질환에서 정상적인 당쇄화 장치에 오류가 생긴 것이다. 이러한 이유로, N-당쇄를 질병 마커로 사용하려는 시도가 있어왔다.N-Glycosylation is the addition of oligosaccharides to the asparagine of the peptide backbone. This is governed by the biological principles that determine its location and structural diversity. Changes in N-glycosylation are the result of errors in normal glycosylation systems in diseases such as tumors. For this reason, attempts have been made to use N-sugar chains as disease markers.
N-당쇄는 아주 다양하지만, O-당쇄, 글라이코스아미노글라이칸, 및 글라이코리피드와 같은 다른 글라이코콘쥬게이트와 구별되는 특징이 있다. N-당쇄는 아스파라긴 다음 다양한 아미노산이 오고 그 뒤에 세린, 트레오닌 또는 덜 일반적인 시스테인 아미노산이 오는 구조에서만 발견된다. 프롤린을 제외하고, 다양한 아미노산들이 아스파라긴 다음에 올 수 있다. 펩타이드 N-글라이코시데이즈 F (PNGase F)와 같은 효소가 생리학적 조건 하에서 N-연결 당쇄를 자르는데 이용될 수 있다. N-연결 코어는 키토바이오스 코어 (chitobiose core; Man3GlcNAc2)에 부착된 세 개의 만노스 당으로 이루어져 있다. N-연결 당쇄는 N-연결 코어에 어떤 단당이 부가되느냐에 따라 종종 세 개의 주요 타입으로 분류된다. 고만노스 당쇄 (High Mannose Glycan) 형은 N-연결코어에 만노스 단당이 여섯 개 더해진 구조이다. 복합형 (Complex type) 당쇄는 N-연결 코어에서 돌리콜 전구체가 분해된 후 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 디옥시헥소스 (퓨코스) 및 사이알릭산 단당들이 효소적으로 결합된다. 하이브리드형 당쇄는 고만노스 구조와 복합형 구조를 모두 포함한다.
N-sugar chains are very diverse, but are distinguished from other glycoconjugates such as O-sugar chains, glycosaminoglycans, and glycolipids. N-glycans are found only in asparagine followed by various amino acids followed by serine, threonine or a less common cysteine amino acid. Except for proline, various amino acids can come after asparagine. Enzymes such as the peptide N-glycosides F (PNGase F) can be used to cleave N-linked sugar chains under physiological conditions. The N-linked core consists of three mannose sugars attached to chitobiose core (Man 3 GlcNAc 2 ). N-linked sugar chains often fall into three main types, depending on which monosaccharide is added to the N-linked core. The High Mannose Glycan type is a structure in which six mannose monosaccharides are added to the N-linked core. The complex type sugar chain is enzymatically bound to N-acetylglucosamine (GlcNAc), galactose, dioxyhexose (fucose), and cialic acid monosaccharides after the digestion precursor is degraded in the N-linked core. The hybrid type sugar chain includes both the hypertonic structure and the hybrid structure.
발암 및 전이 과정에서 일어나는 세포 생물학적 변화를 보면, 세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 당단백질이나 당지질이 암유전자(oncogene)와 같은 특정 신호의 명령을 받아 "잘못된 당질화(aberrant glycosylation)"가 일어나고 이로 인한 당쇄(sugar chain)의 변화가 세포간의 접착(adhesion), 인식(recognition)에 변화를 일으켜 세포의 암화 및 암전이를 일으키게 된다(Hakomori and Kannagi, 1983, J. Natl. Cancer Inst., 71:231-251; Feizi, 1985, Nature, 314:53-571). 세포 외부에서 자극이 오면 암유전자 ras, 전사인자 ets-1의 신호전달을 거쳐 당전이효소 GnT-V(Nacetylglucosaminyltransferase)의 발현이 강화된다. 상기 GnT-V는 당단백질의 기본적인 당쇄에 N-아세틸글루코사민을 β1,6의 위치로 부가하는 반응을 촉매하는 효소로 암의 공격(invasion)과 전이(metastasis)에 직접 연관성이 있는 것으로 알려져 있다(Dennis et al., 1987, Science, 236:582-5853). The cellular biologic changes that occur during carcinogenesis and metastasis show that many kinds of glycoproteins or glycolipids present on the surface of the cell membrane undergo a specific signal such as an oncogene leading to "aberrant glycosylation" (1983), J. Natl. Cancer Inst., 71: 371-357, 1985. However, it has been suggested that the changes in the sugar chain caused by the changes in cell adhesion and recognition may lead to cell carcinogenesis and metastasis (Hakomori and Kannagi, 231-251; Feizi, 1985, Nature, 314: 53-571). When stimulation occurs outside the cell, the expression of the glycosyltransferase GnT-V (Nacetylglucosaminyltransferase) is enhanced through the signaling of the cancer gene ras and the transcription factor ets-1. It is known that GnT-V is an enzyme that catalyzes the addition of N-acetylglucosamine to the basic sugar chain of the glycoprotein at the positions of [beta] 1,6, and is directly related to the invasion and metastasis of cancer ( Dennis et al., 1987, Science, 236: 582-5853).
일반적으로 당단백질은 단백질이 합성된 후 ER(endoplasmic reticulum)에서 기본적인 당쇄가 만들어진 후 골지체로 이동하여 세포의 다양한 생명현상의 결과로 여러 당전이효소에 의해 당의 부가가 이루어지는데 1차적으로 만들어지는 N-아세틸글루코사민 당전이효소 여섯가지(I-Ⅵ)가 촉매하여 얻어지는 당쇄들을 보여주고 있으며, 이중 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄를 만드는 GnT-V가 암의 발생과 전이에 가장 많이 관여한다고 알려져 있다. GnT-V 효소는 골지체에 위치하며, 목표 단백질들은 당쇄에 변화를 받아 세포 표면이나 밖으로 분비된다. 이때 당단백질은 대상세포의 표면 단백질과 인식(recognition), 접착(adhesion)하여 암을 유발하게 된다.
In general, the glycoprotein is synthesized after protein synthesis in the endoplasmic reticulum (ER) and then transferred to the Golgi body. As a result of diverse life events of the cells, the sugar is added by several sugar transferases. -Acetylglucosamine glycosyltransferase (GnT-V), which is catalyzed by six kinds of enzymes (I-Ⅵ), is known to be involved in the development and metastasis of cancer. have. GnT-V enzymes are located in the Golgi, and target proteins are secreted to the cell surface or to the cell surface by changes in sugar chains. At this time, the glycoprotein causes cancer by recognizing and adhering to the surface protein of the target cell.
이와 같이, 최근 유전자와 단백질의 기능에 관한 학문인 지노믹스, 프로테오믹스에 이어 단백질의 표면에 존재하면서 단백질의 기능, 인식 등에 매우 중요한 역할을 수행하는 당에 관한 연구인 글라이코믹스 (Glycomics)가 과학자들의 관심사로 떠오르고 있다. 글라이코믹스 중에서도 특히 각종 종양세포에서 특정 단백질의 당쇄에 의미 있는 변화가 일어난다는 것이 밝혀지면서 많은 연구자들은 당쇄의 변화를 탐지하여 종양을 초기에 진단하는 바이오마커 발굴에 관한 연구가 활발하게 진행되고 있다. N-당쇄화의 변화는 특정 종양에서만 발견되는 것이 아니라, 다양한 종양을 비롯한 여러 질병에서 발견되어 왔다.Glycomics, a research on glycans that play a very important role in the function and recognition of proteins as they exist on the surface of proteins following genomics and proteomics, which is a recent study on the functions of genes and proteins, . It has been found that among glycocytes, a significant change occurs in the sugar chains of specific proteins in various tumor cells. Many researchers have been actively studying biomarkers for detecting the change of sugar chains and diagnosing tumors at an early stage. Changes in N-glycosylation have not been found in specific tumors, but have been found in a variety of diseases, including various tumors.
혈액 등의 생체 시료에서 추출한 당(glycan)들을 질량분석기를 이용하여 프로파일하는 분석법은 글라이코믹스 기반 바이오마커 발굴 연구에서 널리 사용되고 있다.A method of profiling glycans extracted from biological samples such as blood using a mass spectrometer has been widely used in research on digestion of biomarkers based on glycomics.
한국특허 제475642호는 암의 발생과 전이에 관여하여 N-연결형 당쇄의 변화를 나타내는 단백질의 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 상기 단백질의 당쇄변화를 측정하는 방법을 이용한 진단킷트에 관한 것이다. 이 방법은 펩타이드의 변화를 측정함으로써 당펩타이드가 변했을 것으로 추정하는 것이다.Korean Patent No. 475642 discloses a diagnostic kit using a method for diagnosing cancer by measuring a sugar chain change of a protein which is involved in the development and metastasis of cancer and showing a change in N-linked sugar chain and a method for measuring sugar chain change of the protein will be. This method estimates that the glycopeptide has changed by measuring the change in the peptide.
미국특허 제7,651,847호(2010.01.26.특허)는 종양에 특이적인 올리고당을 확인하는 방법, 개인의 종양 계통 (strain)을 결정하는 방법 및 특정 종양 마커의 존재 또는 부재를 탐지함으로써 개인의 종양을 진단 또는 종양 진행단계를 진단하는 방법에 관한 것이다.U.S. Patent No. 7,651,847 (Jan. 26, 2010) discloses a method of identifying a tumor-specific oligosaccharide, a method of determining an individual tumor strain, and detecting the presence or absence of a specific tumor marker Or a method for diagnosing a tumor progression stage.
그러나, 상기 종래 기술들은 민감성과 특이성이 그다지 높지 않으며 진단방법이 복잡하다는 문제점이 있다.However, the conventional techniques have a problem that the sensitivity and specificity are not so high and the diagnostic method is complicated.
또한, M. Nakano et al.의 Int . J. Cancer:122, 2301-2309 (2008)는 췌장암 환자 혈청에서 햅토글로빈 N-당쇄의 부위 특이적 분석법에 대하여 개시한다. 본 발명이 비특이적 단백질 분해효소를 사용하여 단백질을 N-당쇄화된 당펩타이드로 만드는데 비하여 M. Nakano et al.의 이 논문은 트립신을 이용한다. 트립신을 이용하여 단백질을 분해하는 경우 207번과 211번 아스파라긴은 트립신 처리만으로는 서로 분리되지 않기 때문에 시알산을 제거한 후 GluC 엔도펩티데이즈로 한 번 더 처리해야만 207번 아스파라긴 포함 펩타이드와 211번 아스파라긴 포함 펩타이드가 분리된다. 그러므로, 당사슬 정보 중 시알산에 대한 정보는 없어지므로 정확한 당쇄 분석이 불가능해진다. 또한, 이 논문에 개시된 바와 같이 트립신을 처리하면 최소 5개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 얻어지지만, 본 발명의 경우 비특이적 단백질 분해효소를 사용하면 두 개 내지 네 개의 아미노산으로 이루어진 당펩타이드를 얻게 되어 좀 더 민감하게 당쇄 변이를 탐지할 수 있다. 뿐만 아니라, 이 논문은 췌장암 환자에서 퓨코스 증가 여부에 따른 진단 결과만을 제시하기 때문에 본 발명의 N-당사슬이 결합된 상태의 당펩타이드 분석방법과 같이 민감성과 특이성이 높지 않다.
Also, M. Nakano et al., Int . J. Cancer : 122, 2301-2309 (2008) discloses a site-specific assay for the Haptoglobin N-glycans in pancreatic cancer patients serum. The present invention uses trypsin as compared to making N-glycosylated glycoprotein using a nonspecific protease as an alternative to M. Nakano et al. In the case of protein degradation using trypsin, 207 and 211 asparagine are not separated from each other only by trypsin treatment. Therefore, the sialic acid should be removed and then further treated with GluC endopeptidase to obtain a peptide containing 207 asparagine and a peptide containing 211 asparagine . Therefore, information on sialic acid in the oligosaccharide information is lost, and accurate sugar chain analysis becomes impossible. In addition, as described in this paper, when trypsin is treated, a peptide consisting of at least 5 amino acids is obtained. However, in the case of the present invention, when a nonspecific protease is used, a glycopeptide composed of two to four amino acids is obtained, Sensitive sugar chain transitions can be detected. In addition, this paper suggests only the diagnosis result according to the increase of fucose in pancreatic cancer patients, so that the sensitivity and specificity are not as high as that of the glycopeptide analysis method in which the N-glycoconjugate of the present invention is combined.
본 발명은 좀 더 민감하고 특이적으로 N-당쇄 변화를 간편하고 좀 더 빠르게 탐지하는 방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a method for detecting N-sugar chains more easily and more rapidly, more sensitively and specifically.
또한, 본 발명은 좀 더 민감하고 특이적으로 이용 가능한 종양 바이오마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.
It is also an object of the present invention to provide a more sensitive and specifically available tumor biomarker.
단백질 분해효소로 당단백질을 처리하여 당펩타이드로 만들면 하나의 당 부위에 하나의 당사슬이 결합된 형태의 당펩타이드를 얻게 된다. 이를 통하여 어떠한 아미노산 부위에 어떠한 당사슬이 결합되어 있는지 정성 및 정량정보를 얻을 수 있다. 이 방법은 당사슬만 분리하여 실시하는 당사슬 바이오마커보다 특이성을 높임으로써 고특이성 고민감성 바이오마커 발굴에 유용할 것이다.When a glycoprotein is treated with a protease to form a glycopeptide, a glycopeptide in which one oligosaccharide is bound to one sugar site is obtained. Through this, qualitative and quantitative information on which oligosaccharide is bound to any amino acid site can be obtained. This method will be more useful for the identification of high specificity and sensitive biomarkers by increasing the specificity of the oligosaccharide biomarkers.
따라서, 본 발명에서는 비특이적 단백질 분해효소를 이용하여 혈액의 햅토글로빈을 펩타이드와 당펩타이드로 분해하였으며, 207번과 211번 등 총 4개의 N-당쇄화 부위만을 순수하게 분리하였다. 본 발명자들은 이렇게 얻은 4개의 N-당쇄화 부위에 결합된 당펩타이드를 이용하여 위암 특이적 바이오마커를 발굴함으로써 고특이적이고 고감도 위암 진단 방법을 발명하기에 이르렀다.
Therefore, in the present invention, the human hepatoglobin of the blood was decomposed into peptides and glycopeptides using nonspecific protease, and only four N-glycosylation sites such as 207 and 211 were isolated purely. The inventors of the present invention have invented a method for diagnosing high-specific and highly sensitive gastric cancer by using the glycopeptide bound to the four N-glycosylation sites thus obtained to identify gastric cancer-specific biomarkers.
본 발명에서 사용한 비특이적 단백질 분해효소를 사용하지 않으면 햅토글로빈의 207번 아미노산과 211번 아미노산을 구별할 수 없으므로 본 발명자들이 발명한 방법은 암환자의 바이오마커 개발에서 강력한 분석도구로 활용될 수 있다. Since the 207 amino acid and 211 amino acid can not be distinguished without using the nonspecific protease used in the present invention, the inventors of the present invention can be used as a powerful analysis tool in the development of biomarkers for cancer patients .
햅토글로빈의 4개의 N-당쇄화 위치를 구별하여 각 당쇄화 위치에 대한 당사슬의 정성 및 정량정보를 얻는 방법은 지금까지 없었던 새롭고 진보적인 기술이다.The method of distinguishing the four N-glycosylation sites of human hepatoglobin and obtaining the qualitative and quantitative information of the oligosaccharide at each glycosylation site is a new and progressive technology that has never been available.
본 발명자들은 단백질 수준이나 당사슬만 분리하여 바이오마커를 찾는 경우보다 당펩타이드를 이용하여 특정 4개의 부위와 관련된 바이오마커를 발굴함으로써 고감도, 고특이성 바이오마커를 발굴하였으며, 당펩타이드를 이용한 바이오마커의 발굴은 본 발명이 세계 최초이다. 본 발명은 N-당쇄화 위치에 특이적으로 결합한 당쇄 구조중 가지 (antennae)의 증가와 당쇄화 위치, 당쇄 합성과정에 관련된 당쇄의 조합을 이용한 고감도 진단 바이오마커에 관한 것이다.The present inventors discovered a biomarker with high specificity and high specificity by digesting biomarkers related to four specific regions using glycopeptide rather than separating only the protein level or oligosaccharide to find a biomarker, and discovered a biomarker using the glycopeptide The present invention is the first in the world. The present invention relates to a high sensitivity diagnostic biomarker using a combination of an increase in an antigenic sugar chain structure specifically bound to an N-glycosylation site, a glycosylation site, and a sugar chain involved in a sugar chain synthesis process.
현재까지 FDA에서 승인된 바이오마커 중 위암관련 바이오마커는 없는 실정이며, 특히 본 발명을 통하여 발굴한 위암 당펩타이드 바이오마커는 AUC값 1을 보이는 고특이성 고민감성을 가진 강력한 바이오마커이다. 본 발명자들이 발굴한 바이오마커 리스트는 표 1에 나타내었으며, 이들은 p-값 0.005 이하의 값을 보이는 유의성이 높은 바이오마커들이다. 본 발명은 위암 환자에서 정상인에 비해 당쇄의 가지 (antennae)가 증가하는 것을 이용하였고, 또한 말단이 잘린 복합 타입 당쇄와 퓨코스가 결합된 복합 타입 당쇄가 증가하였으며, 생합성적으로 관련되는 당펩타이드의 조합이 증가하는 것을 이용하여 위암을 진단하는 방법을 제공한다.
There is no biomarker related to gastric cancer among the biomarkers approved by the FDA to date. In particular, peptide biomarkers per gastric cancer discovered through the present invention are highly specific biomarkers with high specificity and sensitivity, having an AUC value of 1. The biomarkers discovered by the present inventors are shown in Table 1, and these are highly significant biomarkers having a p-value of 0.005 or less. The present invention utilizes an increase in the amount of sugar chain (antennae) in gastric cancer patients compared with that of a normal person. In addition, the complex type sugar chain in which a terminal type of truncated complex type sugar chain and fucose is combined is increased, and a biosynthetically related sugar peptide And a method for diagnosing stomach cancer by using an increase in the combination.
본 발명은 바이오마커로서 부위 특이적으로 Ｎ-당쇄화된 당펩타이드를 이용하여 바이오마커의 N-당쇄변화를 탐지하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting N-sugar chain change of a biomarker using a site specific N-glycosylated sugar peptide as a biomarker.
또한, 본 발명은 상기 부위 특이적으로 N-당쇄화된 당펩타이드가 혈청 햅토글로빈에서 유래한 것임을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the site-specific N-glycosylated sugar peptide is derived from serum tryptophilin.
또한, 본 발명은 상기 부위 특이적으로 N-당쇄화된 당펩타이드가 혈청 햅토글로빈의 184번, 207번, 211번 및 241번 아스파라긴 부위가 당쇄화된 것임을 특징으로 한다.In addition, the site-specific N-glycosylated sugar peptide of the present invention is characterized in that
또한, 본 발명은 상기 부위 특이적으로 N-당쇄화된 당펩타이드가 혈청 햅토글로빈 유래 당펩타이드이며,Further, in the present invention, the site-specific N-glycosylated sugar peptide is a serum tryptophan-derived sugar peptide,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4_Fucose1,Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4_Fucose1,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5_Fucose1,Histidine-184 asparagine-Hexose6_HexNAc5_Fucose1,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose4_HexNAc3,Histidine-184 asparagine-Hexose4_HexNAc3,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4,Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4_NeuAc1,Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4_NeuAc1,
Hexose4_HexNAc3-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose4_HexNAc3-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose5_HexNAc4-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose5_HexNAc4-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose4_HexNAc4-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose4_HexNAc4-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose6_HexNAc5_Fucose1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose6_HexNAc5-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose8_HexNAc2-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose8_HexNAc2-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose5_HexNAc4_Fucose1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose5_HexNAc4_Fucose1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose7_HexNAc6-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose7_HexNAc6-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose6_HexNAc5_Fucose 1-21 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose7_HexNAc6_Fucose 1-21 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose5_HexNAc5_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose5_HexNAc5_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
Hexose4_HexNAc4_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose4_HexNAc4_Fucose 1-21 times asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_Fucose1_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose7_HexNAc6_Fucose1_NeuAc1-211 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose7_HexNAc6_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4,Histidine-proline -241 asparagine-Hexose5_HexNAc4,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc5_Fucose1,Histidine-proline-241 asparagine-Hexose5_HexNAc5_Fucose1,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1,Histidine-proline-241 asparagine-Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5,Histidine-proline-241 asparagine-Hexose6_HexNAc5,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose7_HexNAc6_Fucose1 및Histidine-proline-241 asparagine-Hexose7_HexNAc6_Fucose1 and
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose7_HexNAc6 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.Histidine-proline-241-asparagine-Hexose7_HexNAc6.
또한, 본 발명은In addition,
a) 시료에서 타겟 단백질을 분리 및 정제하는 단계;a) separating and purifying the target protein from the sample;
b) 분리한 타겟 단백질에 비특이적 단백질 분해효소를 처리하는 단계;b) treating the isolated target protein with a nonspecific protease;
c) 효소 처리 후 N-당쇄화된 당펩타이드를 분리하는 단계;c) separating the N-glycosylated glycopeptide after the enzyme treatment;
d) 분리한 N-당쇄화된 당펩타이드를 질량분석하여 이성질체를 분리하는 단계;d) separating the isomer by mass analysis of the separated N-glycosylated sugar peptide;
e) 분리한 이성질체의 구조 분석 및 당쇄와 펩타이드 구성을 확인하는 단계; 및e) analyzing the structure of the separated isomers and confirming the sugar chain and peptide structure; And
f) 분리한 이성질체의 정량적 프로파일링을 수행하는 단계;를 포함하는 바이오마커 단백질의 N-당쇄변화 탐지방법에 관한 것이다.and f) performing quantitative profiling of the separated isomer. The present invention also relates to a method for detecting N-sugar chain change of a biomarker protein.
상기 e)단계의 분리한 이성질체의 구조 분석 및 당쇄와 펩타이드 구성을 확인하는 방법 중 대표적인 방법은 PGC 컬럼을 이용하여 질량값은 같으나 구조가 다른 당펩타이드 이성질체들을 컬럼 내 머무름 시간이 다름을 이용하여 분리한 후 각각에 대하여 텐덤 질량분석법을 이용하여 구조분석을 수행하였다. 이때 펩타이드와 당쇄의 조성은 같으나 구조가 다른 당펩타이드의 구조를 확인하였다. 텐덤 질량분석시 얻어지는 산물 이온 (product ion) 중 당펩타이드에서 떨어진 당쇄 이온과 펩타이드에 당쇄 파편이 결합된 당펩타이드 이온을 확인하여 당쇄와 펩타이드의 구성을 확인하였다. A typical method for analyzing the structure of the separated isomers in step e) and confirming the sugar chain and peptide structure is to separate the sugar peptide isomers having the same mass value but different structures using the PGC column by using different retention times in the column After that, structural analysis was performed using tandem mass spectrometry. At this time, the structure of the peptide having the same composition but different in structure of the peptide and the sugar chain was confirmed. In the product ion obtained from the tandem mass spectrometric analysis, the sugar chain peptide separated from the peptide and the sugar peptide fragment in which the sugar chain fragment was bonded to the peptide were identified to confirm the structure of the sugar chain and the peptide.
또한, 본 발명은 상기 f) 단계의 정량적 프로파일링이 T 검정 p-값 분석, ROC 커브 (Receiver-Operating Characteristic curve) 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석임을 특징으로 한다.Also, the present invention is characterized in that the quantitative profiling of the step (f) is a T-test p-value analysis, an ROC curve (receiver-operating characteristic curve) and an AUC (Area under the ROC curve) analysis.
또한, 본 발명은 상기 타겟 단백질이 햅토글로빈임을 특징으로 한다.In addition, the present invention is characterized in that the target protein is a haptoglobin.
또한, 본 발명은 상기 d) 단계의 분리한 N-당쇄화된 당펩타이드가In addition, the present invention relates to a method for producing the N-glycosylated sugar peptide of step d)
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4_Fucose1,Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4_Fucose1,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5_Fucose1,Histidine-184 asparagine-Hexose6_HexNAc5_Fucose1,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose4_HexNAc3,Histidine-184 asparagine-Hexose4_HexNAc3,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4,Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4_NeuAc1,Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4_NeuAc1,
Hexose4_HexNAc3-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose4_HexNAc3-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose5_HexNAc4-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose5_HexNAc4-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose4_HexNAc4-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose4_HexNAc4-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose6_HexNAc5_Fucose1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose6_HexNAc5-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose8_HexNAc2-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose8_HexNAc2-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose5_HexNAc4_Fucose1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose5_HexNAc4_Fucose1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose7_HexNAc6-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose7_HexNAc6-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose6_HexNAc5_Fucose 1-21 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose7_HexNAc6_Fucose 1-21 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose5_HexNAc5_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose5_HexNAc5_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
Hexose4_HexNAc4_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose4_HexNAc4_Fucose 1-21 times asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_Fucose1_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose7_HexNAc6_Fucose1_NeuAc1-211 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose7_HexNAc6_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4,Histidine-proline -241 asparagine-Hexose5_HexNAc4,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc5_Fucose1,Histidine-proline-241 asparagine-Hexose5_HexNAc5_Fucose1,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1,Histidine-proline-241 asparagine-Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5,Histidine-proline-241 asparagine-Hexose6_HexNAc5,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose7_HexNAc6_Fucose1 및Histidine-proline-241 asparagine-Hexose7_HexNAc6_Fucose1 and
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose7_HexNAc6 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.Histidine-proline-241-asparagine-Hexose7_HexNAc6.
또한, 본 발명은 상기 f) 단계의 프로파일링 수행시 T 검정 p-값 분석 및 AUC (Area under the ROC curve) 분석에 N-당쇄화된 당펩타이드의 가지 (antennae) 양 (abundance) 변수를 부가함을 특징으로 하는, 바이오마커 단백질의 N-당쇄변화 탐지방법에 관한 것이다.Further, the present invention is characterized in that when the profiling of step (f) is performed, the antennae abundance parameter of the N-glycosylated sugar peptide is added to the T-test p-value analysis and Area under the ROC curve analysis The present invention relates to a method for detecting N-sugar chain change of a biomarker protein.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계의 당펩타이드 분리를 다공성 흑연화 탄소 카트리지 (Porous Graphitzed Carbon Cartridge)를 이용하여 고체상 추출 (Solid Phase Extraction)함을 특징으로 하는, 바이오마커 단백질의 N-당쇄변화 탐지방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for detecting the N-sugar chain change of a biomarker protein, which comprises performing solid phase extraction using a porous graphitized carbon cartridge, ≪ / RTI >
또한, 본 발명은 상기 다공성 흑연화 탄소 카트리지에 흡착된 펩타이드를 아세토나이트릴 및 트리플루오로아세트산을 함유한 용액으로 용출하여 당펩타이드만 선택적으로 분리함을 특징으로 하는, 바이오마커 단백질의 N-당쇄변화 탐지방법에 관한 것이다.Further, the present invention relates to a method for producing a biomarker protein, which comprises eluting the peptide adsorbed on the porous graphitized carbon cartridge with a solution containing acetonitrile and trifluoroacetic acid to selectively separate only the glycopeptide, Change detection method.
또한, 본 발명은 햅토글로빈의 184번, 207번, 211번 또는 241번 아스파라긴 부위가 N-당쇄화된 위암 진단용 당펩타이드 바이오마커에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a peptide biomarker for gastric cancer diagnosis in which N-glycosylated aspartic acid residue at
또한, 본 발명은 상기 당펩타이드 바이오마커가In addition, the present invention relates to a method for producing the above-mentioned peptide biomarker
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4_Fucose1,Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4_Fucose1,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5_Fucose1,Histidine-184 asparagine-Hexose6_HexNAc5_Fucose1,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose4_HexNAc3,Histidine-184 asparagine-Hexose4_HexNAc3,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4,Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4_NeuAc1,Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4_NeuAc1,
Hexose4_HexNAc3-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose4_HexNAc3-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose5_HexNAc4-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose5_HexNAc4-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose4_HexNAc4-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose4_HexNAc4-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose6_HexNAc5_Fucose1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose6_HexNAc5-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose8_HexNAc2-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose8_HexNAc2-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose5_HexNAc4_Fucose1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose5_HexNAc4_Fucose1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose7_HexNAc6-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,Hexose7_HexNAc6-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose6_HexNAc5_Fucose 1-21 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose7_HexNAc6_Fucose 1-21 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose5_HexNAc5_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose5_HexNAc5_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
Hexose4_HexNAc4_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose4_HexNAc4_Fucose 1-21 times asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_Fucose1_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose7_HexNAc6_Fucose1_NeuAc1-211 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,Hexose7_HexNAc6_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4,Histidine-proline -241 asparagine-Hexose5_HexNAc4,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc5_Fucose1,Histidine-proline-241 asparagine-Hexose5_HexNAc5_Fucose1,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1,Histidine-proline-241 asparagine-Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5,Histidine-proline-241 asparagine-Hexose6_HexNAc5,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose7_HexNAc6_Fucose1 및Histidine-proline-241 asparagine-Hexose7_HexNAc6_Fucose1 and
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose7_HexNAc6 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.
Histidine-proline-241-asparagine-Hexose7_HexNAc6.
상기 방법에서, 시료로는 혈액뿐만 아니라, 혈장, 혈청, 타액, 소변 등의 체액을 이용하는 것이 바람직하다. In the above method, it is preferable to use not only blood but also body fluids such as plasma, serum, saliva, and urine.
또한, 상기 방법에서, a) 단계의 단백질은 크기에 특별한 제한이 없으며, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 모두 가능하다.Further, in the above method, the protein of step a) is not particularly limited in size, and it is possible to use both oligopeptides, polypeptides or proteins.
또한, 상기 a) 단계의 타겟 단백질 분리 및 정제는 1차원 겔 단백질 분리 (1D-gel protein separation), 2D-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 (Size Exclusion Chromatography), 자유흐름 전기영동시스템 (Free Flow Electrophoresis System) 등을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, the separation and purification of the target protein in step a) can be performed using 1D-gel protein separation, 2D-PAGE, size exclusion chromatography, free flow electrophoresis system ), But the present invention is not limited thereto.
또한, 본 발명의 방법에서 상기 b) 단계의 비특이적 단백질 분해효소는 특정 펩타이드 결합에만 작용하는 특이적 단백질 분해효소가 아닌 단백질 분해효소를 말하며, 예컨대 돼지 엘라스테이즈 (porcine elastase), 파파인 (papain), 돼지 펩신 (porcine pepsine), 프로네이즈 (pronase), 프로테이네이즈 K (proteinase K), 섭틸리신 (subtilisin), 써모라이신 (thermolysin) 등이 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
In addition, in the method of the present invention, the nonspecific protease of step b) refers to a protease which is not a specific protease that acts only on a specific peptide bond. Examples of the protease include porcine elastase, papain, , Porcine pepsine, pronase, proteinase K, subtilisin, thermolysin, and the like, but the present invention is not limited thereto.
본 발명의 방법에 따르면 종래의 방법과 같이 당쇄의 당만을 분석하는 것보다 당펩타이드를 분석하는 것이 더 특이적이며, 민감도가 높은 결과를 얻을 수 있다.According to the method of the present invention, it is more specific and more sensitive to analyze the glycopeptide than to analyze only the sugar of the sugar chains as in the conventional method.
또한, 본 발명의 방법에 따르면, 특정 단백질에서 부위 특이적으로 N-당쇄화 변화가 일어나기 때문에 AUC 값을 높여주어 종양 환자와 정상인을 확연하게 구분할 수 있다.
In addition, according to the method of the present invention, because the N-glycosylation change occurs locally in a specific protein, the AUC value can be increased to distinguish a tumor patient from a normal person.
도 1은 혈청 햅토글로빈의 부위-특이적 N-당쇄화 맵을 나타낸다.
녹색 원은 만노스, 노란색 원은 갈락토스, 청색 네모는 N-아세틸글루코사민, 적색 마름모는 시알산, 적색 세모는 퓨코스를 나타낸다.
도 2는 같은 글라이칸 모이어티를 갖는 세 개의 당펩타이드의 크로마토그램이다. 초기암은 핑크색, 말기암은 적색, 정상은 청색으로 표시하였다.
도 3은 암환자에서 특이적으로 글라이칸의 가지 (antennae) 수가 증가하는 경향성을 보여주는 결과이다.
도 4는 글라이칸 생합성 경로에 따라 구분한 경우 AUC가 증가하는 결과를 얻을 수 있음을 보여준다.
도 5는 위암 바이오마커로 이용 가능한 당펩타이드를 보여준다.Figure 1 shows a site-specific N-glycosylation map of serum human hepatoglobin.
The green circle represents mannose, the yellow circle represents galactose, the blue square represents N-acetylglucosamine, the red rhombus represents sialic acid, and the red triangle represents fucose.
Figure 2 is a chromatogram of three glycopeptides having the same glycane moiety. The initial cancer was pink, the terminal cancer was red, and the normal was blue.
FIG. 3 shows the tendency of increasing the number of glycans in the cancer cells. FIG.
FIG. 4 shows that an increase in AUC can be obtained when the glycan biosynthesis pathway is classified according to the glycan biosynthesis pathway.
Figure 5 shows the glycopeptide available as a gastric cancer biomarker.
아래에서는 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in more detail with reference to embodiments. However, it should be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to the description of the embodiments.
실시예Example
1. 정상인 15명, 초기 위암환자 5명, 말기 위암환자 5명의 혈청에서 햅토글로빈을 선택적으로 분리하였다.
1. Hepatoglobin was selectively isolated from the serum of 15 normal subjects, 5 early gastric cancer patients and 5 late gastric cancer patients.
2. 분리된 햅토글로빈 50 ㎍은 50 ㎕ PBS (pH 7.5)에 충분히 녹인 후 비특이적 단백질 분해효소 50 ㎍ (1:1)를 첨가하여 37℃에서 6시간 동안 반응시켜 당펩타이드를 얻었다.
2. 50 ㎍ of isolated fetaloglobin was dissolved in 50 ㎕ PBS (pH 7.5), and 50 ㎍ of non-specific protease (1: 1) was added and reacted at 37 캜 for 6 hours to obtain the peptide.
3. 얻어진 당펩타이드 (glycopeptide)는 다공성 흑연화 탄소 카트리지 (Porous Graphitized Carbon Cartridge)를 이용하여 고체상 추출 (Solid Phase Extraction)하였다. 좀 더 자세히는, 흑연화 탄소 카트리지를 80% 아세토나이트릴 및 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) 수용액으로 세척한 후 순수로 헹구었다. 당펩타이드 수용액을 카트리지에 로딩한 후 염과 완충액 제거를 위해 약 1 ㎖/min의 속도로 순수로 워싱하였다. 당펩타이드는 40%(v/v) ACN (acrylonitrile) 및 0.1%(v/v) TFA (trifluoroacetic acid)를 함유한 용액으로 용출하여 당펩타이드만 선택적으로 분리하였다.
3. The obtained glycopeptide was subjected to solid phase extraction using a Porous Graphitized Carbon Cartridge. More specifically, the graphitized carbon cartridge was washed with 80% acetonitrile and 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) aqueous solution and then rinsed with pure water. The peptide solution was loaded onto the cartridge and washed with pure water at a rate of about 1 ml / min to remove salts and buffer. The peptide was eluted with a solution containing 40% (v / v) ACN (acrylonitrile) and 0.1% (v / v) TFA (trifluoroacetic acid)
4. nanoLC chip/Q-TOF MS 분석을 통하여 이성질체를 분리하고, 구조를 분석하였고, 당쇄 및 펩타이드 구성을 확인하고, 정량적인 프로파일링을 수행하였다.4. Analysis of nanoLC chip / Q-TOF MS was performed to isolate the isomers, analyze the structure, identify the sugar chain and peptide structure, and perform quantitative profiling.
분리된 당펩타이드를 물에 재용해하여 오토샘플러 (4 ℃로 유지됨), 모세관 펌프, 나노펌프, HPLC-Chip/MS 인터페이스 및 6530 Q-TOF MS 탐지기를 갖춘 HPLC-Chip/Q-TOF(Chip Quadrupole Time-of-Flight) MS system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 이용하여 분석하였다. 9 × 0.75 ㎜ 농축용 컬럼 및 43 × 0.075 ㎜ 분석용 컬럼의 정지상 (stationary phase)으로 통합된 나노-ESI 스프레이 팁과 함께 5 ㎛ 다공성 흑연화 탄소 칩을 패킹하여 사용하였다. 크로마토그래피 방법에 의한 분리는 종래 최적화된 방법에 따라 수행하였다. 간단히 설명하면, 시료를 로딩한 후, 빠른 당펩타이드 용출 농도구배 용액을 분당 0.3 ㎕씩 흘려주었다. 농도구배 용액은 (A) 3.0% 아세토나이트릴 및 0.5% 포름산(v/v) 수용액, 및 (B) 90.0% 아세토나이트릴 및 0.5% 포름산(v/v) 수용액이고, 각각 아래 시각에 아래 농도로 처리하였다: 6% B, 0~2.5min; 6~16% B, 2.5~5min; 16~44% B, 5~15min; 및 44~99.9% B, 15~20min. 남아있는 당펩타이드는 99.9% B 용액으로 10분간 씻어내었다. 최종적으로 분석용 컬럼은 6% B로 20분간 재평형화하고, 농축용 컬럼은 0% B로 20분간 재평형화하였다.The separated glycopeptide was re-dissolved in water and purified by HPLC-Chip / Q-TOF (HPLC) with an autosampler (maintained at 4 ° C), capillary pump, nano-pump, HPLC-Chip / MS interface and 6530 Q- Time-of-Flight MS system (Agilent Technologies, Santa Clara, Calif.). A 5 μm porous graphitized carbon chip was packed with a nano-ESI spray tip integrated into a stationary phase of a 9 × 0.75 mm concentrating column and a 43 × 0.075 mm analytical column. Separation by the chromatographic method was carried out according to the conventional optimized method. Briefly, after loading the sample, 0.3 μl of a fast glycopeptide elution gradient solution was flowed per minute. The concentration gradient solution was (A) 3.0% acetonitrile and 0.5% formic acid (v / v) aqueous solution, and (B) 90.0% acetonitrile and 0.5% formic acid (v / v) : 6% B, 0 to 2.5 min; 6 to 16% B, 2.5 to 5 min; 16 to 44% B, 5 to 15 min; And 44 to 99.9% B, 15 to 20 min. The remaining glycopeptide was washed with 99.9% B solution for 10 minutes. Finally, the analytical column was re-equilibrated at 6% B for 20 minutes and the column for concentration was re-equilibrated at 0% B for 20 minutes.
건조가스 온도는 325 ℃로 조정하고 흐름 속도는 4 ℓ/min(여과한 질소가스 2 ℓ와 여과한 건조 압축공기 2 ℓ)로 하였다.The drying gas temperature was adjusted to 325 ° C and the flow rate was 4 L / min (2 L of filtered nitrogen gas and 2 L of filtered dry compressed air).
MS 스펙트럼은 스펙트럼당 1.5초의 획득시간 (acquisition time)으로 m/z 500-2000의 질량 범위로 양성 이온화 모드에서 얻었다. MS/MS 스펙트럼은 스펙트럼당 1.5초의 획득시간으로 m/z 100-3000 질량 범위로 양성 이온화 모드에서 얻었다. MS 스캔 후 전구체 화합물들은 이온의 양과 대전 상태 (z = 2, 3 또는 4)를 기초로 획득 소프트웨어에 의해 자동으로 MS/MS 분석을 위해 선택되었고 질량 밴드패스 fwhm (full width at half-maximum) 1.3m/z로 4극자 (quadrupole)에서 분리되었다. 통상 CID 단편화의 충돌 에너지는 다음의 식을 기초로 전구체 화합물에 대해 계산하였다: MS spectra were obtained in positive ionization mode with a mass range of m / z 500-2000 with an acquisition time of 1.5 seconds per spectrum. MS / MS spectra were obtained in positive ionization mode with m / z 100-3000 mass range with acquisition time of 1.5 seconds per spectrum. After the MS scan, the precursor compounds were selected for MS / MS analysis automatically by acquisition software based on the amount of ions and charge state (z = 2, 3 or 4) and the mass bandpass fwhm (full width at half-maximum) m / z in the quadrupole. The impact energy of a typical CID fragmentation was calculated for a precursor compound based on the following equation:
위 식에서, Vcollision은 전 충돌 세포에서의 전위차이다. 기울기와 에너지 m/z 램프의 오프셋 값은 필요에 따라 다소의 단편화 (fragmentation)를 제조하기 위하여 변화시킬 수 있다.In the above equation, V collision is the potential difference in all collision cells. The offset value of the slope and energy m / z ramp can be varied to produce some fragmentation if needed.
데이타를 얻은 후, LC/MS의 원래 데이타는 Mass Hunter Qualitative Analysis software (version B.04.00 SP2, Agilent Technologies)에 포함된 분자 특성 추출 알고리즘 (Molecular Feature Extractor algorithm)을 이용하여 처리되었다. MS 피크는 5.0의 신호 대 노이즈 비율로 여과되었고, 개별 이온 종으로 분석되었다.After obtaining the data, the original data of LC / MS was processed using the Molecular Feature Extractor algorithm included in Mass Hunter Qualitative Analysis software (version B.04.00 SP2, Agilent Technologies). MS peaks were filtered with a signal to noise ratio of 5.0 and analyzed as individual ion species.
예상 동위원소 분포 (expected isotopic distribution)를 이용하여 전위상태정보 및 머무름 시간, 단일 화합물과 연관된 모든 이온종 {예컨대, 이중 양성자화된 이온, 삼중 양성자화된 이온 및 모든 관련 동위 이성질체(isotopologue)}을 함께 합산하여 화합물의 중성질량 (neutral mass)을 계산하였다.Using the expected isotopic distribution, the dislocation state information and retention time, all ionic species associated with a single compound {eg, double protonated ion, tripletonized ion and all related isotopologues} Were added together to calculate the neutral mass of the compound.
이 정보를 이용하여, 크로마토그래피 피크 면적에 의해 나타나는 양으로 시료 내 모든 화합물 피크의 리스트를 생성하였다. 당펩타이드들은 GlycoX 알고리즘에 기반한 본 발명자들의 소프트웨어 툴로 확인하였다. 가능한 당펩타이드의 질량을 고려하여 당쇄화 타입 (N 또는 O) 및 질량 내성 (mass tolerance) (여기서는 5 ppm), 주어진 화합물과 연관된 당쇄 구조와 가능한 아미노산 리스트를 생성하는 알고리즘이 단백질 또는 단백질들의 아미노산 서열들로부터 유래하였다. 결과는 알려진 당쇄화 패턴 및/또는 다른 생물학적 법칙들에 기반하여 좀 더 여과되었다.
Using this information, a list of all compound peaks in the sample was generated in an amount indicated by the chromatographic peak area. The peptide peptides were identified by our inventor's software tool based on the GlycoX algorithm. (N or O) and mass tolerance (here, 5 ppm), taking into account the mass of possible sugar glycoproteins, the algorithm for generating a list of possible sugar chains and possible amino acids associated with a given compound is the amino acid sequence of the protein or proteins ≪ / RTI > The results were further filtered based on known glycosylation patterns and / or other biological laws.
5. 당펩타이드 분석 결과를 이용하여 T 검정 p-값 분석, ROC 커브 (Receiver-Operating Characteristic curve), AUC (Area under the ROC curve) 분석을 통하여 위암환자의 진단을 위한 고감도, 고특이적 바이오마커를 발굴하였다.
5. High-sensitivity, high-specific biomarkers for the diagnosis of gastric cancer patients by T-test p-value analysis, ROC curve (Receiver-Operating Characteristic curve) and AUC (Area under the ROC curve) .
진단 방법의 효율성을 판단하는 방법 중 널리 사용되는 것이 ROC 커브이다. 민감도 (sensitivity)와 특이도 (specificity)가 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면상에 표현한 것이 ROC 커브인데, ROC 커브 아래의 면적 즉, AUC (area under ROC curve)가 넓을수록 좋은 진단 방법이라 할 수 있다.The ROC curve is widely used to determine the efficiency of diagnostic methods. The ROC curves represent the relationship between sensitivity and specificity on the two-dimensional plane. The larger the area under the ROC curve, the AUC (area under ROC curve), is a better diagnostic method have.
ROC 커브 (Receiver-Operating Characteristic curve)는 특정 진단 방법의 민감도와 특이도가 어떤 관계를 갖고 있는지를 표현한 그래프이다. 진단 방법에 의한 환자의 분류는, 점수에 따라 사람을 환자/정상으로 분류하는 것으로 결국 분류 (classification)의 한 예이다. 민감도는 진짜 환자 중 검사 방법이 환자를 얼마나 잘 골라내는가, 하는 것이고, 특이도는 진짜 정상 중 검사 방법이 정상을 얼마나 잘 골라내는가를 의미한다. 예를 들어 혈압으로 심근경색을 진단할 수 있다고 가정할 때, '혈압이 얼마 이상이면 심근경색이다'라는 진단은 민감도 100%, 특이도 100%를 갖게 혈압의 기준을 설정할 수 있다. 가령, '혈압이 5 이상이면 심근경색' 이러면 전체 인구가 모두 환자로 판별되어, 누구나 환자로 판정이 나고, 따라서 환자를 100% 환자라고 진단할 수 있다. 문제는, 환자가 아닌 사람도 몽땅 환자라고 하기 때문에 민감도가 거의 0에 가깝게 떨어진다는 것. 또는 반대로 혈압이 '1000 이상이면 심근경색' 이러면 모두 정상이라 판별되기 때문에 정상을 100% 골라낼 수 있기 때문에 특이도가 1 이 되지만 환자는 하나도 못 골라내기 때문에 민감도가 0 이 된다. 이렇게, 모든 분류 방법은 민감도와 특이도를 동시에 보아야 좋은 진단 방법인지 확인할 수 있다. 현재 적당한 기준은 민감도/특이도 모두 0.8에서 0.9 정도는 되어야 임상에서 사용할 수 있다.The ROC curve (Receiver-Operating Characteristic curve) is a graph showing how the sensitivity and specificity of a particular diagnostic method are related. The classification of the patients by the diagnostic method is classified into patients / normal according to the score, which is an example of classification. Sensitivity refers to how well the test method in a real patient selects the patient, and the specificity means how well the normal normal test method selects the normal. For example, assuming that myocardial infarction can be diagnosed by blood pressure, the diagnosis of myocardial infarction when the blood pressure is greater than or equal to 100 may be used to set the blood pressure to have a sensitivity of 100% and a specificity of 100%. For example, if the blood pressure is 5 or more, myocardial infarction, the entire population is judged to be a patient, and everyone can be diagnosed as a patient, thus diagnosing the patient as a 100% patient. The problem is that even people who are not patients are all patients, so the sensitivity drops to almost zero. In contrast, if my blood pressure is above 1000, myocardial infarction is all normal. Therefore, I can select 100% of the normal, so the specificity is 1, but the sensitivity is 0 because no patient can pick one. In this way, all classification methods can be confirmed as a good diagnostic method if sensitivity and specificity are simultaneously observed. Currently, the appropriate criteria should be 0.8 to 0.9 for sensitivity / specificity in clinical practice.
ROC 커브를 이용하여 만든 영역 즉, AUC (area under the ROC curve)는 측정하고자 하는 이분형 변수를 판별하는데 얼마만큼의 정확도가 있는지를 평가하는데 쓰인다. 일반적으로 AUC 의 수치를 해석하는 방법은 다음과 같다. The area under the ROC curve, or area under the ROC curve, is used to assess the accuracy of the determination of this bifurcation variable to be measured. In general, the method of interpreting the numerical value of AUC is as follows.
AUC=0.5 ; 전혀 구분에 도움이 되지 못함.AUC = 0.5; It does not help at all.
0.7≤AUC<0.8 ; 구분을 받아들일 만함.0.7 AUC <0.8; It is acceptable to accept the distinction.
0.8≤AUC<0.9 ; 구분하는 능력이 뛰어남.0.8 AUC <0.9; Excellent ability to distinguish.
AUC≥0.9 ; 거의 완벽한 구분 능력.
AUC≥0.9; Almost perfect separation ability.
p-값 유의확률probability of p-value significance
통계분석에서 가장 많이 나오는 중요한 개념 중의 하나로, 일반적으로 어느 집단 간의 통계적 유의성(A와 B가 서로 차이가 있는가? 아닌가?)을 검정할 때 F 검정이나, t 검정을 사용하며 그 값으로 p-값을 얻게 된다.One of the most important concepts in statistical analysis is the F-test or the t-test, which is generally used to test statistical significance (difference between A and B) .
t 검정은 표본 수가 아주 작은(보통 30 이하) 두 실험구간의 평균을 비교할 때 사용하고, F 검정은 그 이상의 경우에 활용한다. 이때 t 검정, F 검정의 결과로 나타나는 p-값이 내가 제시한 위험율 (a)보다 낮으면 비교한 집단 간에 유의차이가 인정된다고 말할 수 있다. 즉 통계처리의 신뢰도를 의미한다. p-값은 값이 낮아질수록 신뢰도가 좋은 것으로 판단하며 P<0.01에서의 값이 가장 좋은 것이겠지만, 이 신뢰구간에서 통계처리가 무의미한 경우엔 p<0.05로 표기를 하기도 하며 p<0.05에서도 통계처리의 의미가 없게 나타나면 이는 데이타로 사용할 수 없다는 것을 의미한다.
The t test is used to compare the mean of the two experimental sections with a very small number of samples (usually less than 30), and the F test is used for more cases. If the p-value as a result of t-test and f-test is lower than the hazard ratio (a), it can be said that there is a significant difference between the comparison groups. That is, the reliability of the statistical processing. The value of p-value is considered to be better when the value is lower, and the value at P <0.01 is the best value. However, p <0.05 when statistical treatment is meaningless in this confidence interval and p <0.05 Is meaningless, it means that it can not be used as data.
도 1은 햅토글로빈의 N-당쇄화 부위-특이적 당쇄 지도를 나타낸다. 그림에 표기된 당쇄의 크기는 LC/MS 분석을 통하여 얻어진 강도를 표준화한 값을 이용하여 표시한다. 즉, 가장 높은 강도를 보이는 값을 100%로 환산하여 상대적인 값을 비교하였다. 50~100%는 큰 크기; 10-50%, 중간 크기; 1-10%, 작은 크기로 나타내고, 1% 이하의 값을 보이는 당쇄는 나타내지 않았다. 당쇄 구조 위에 표시된 별표는 정상인에서는 확인되지 않았지만 위암 환자에서는 1% 이상 존재하는 당쇄로서, 위암환자 진단용 바이오마커로 사용할 수 있다.Figure 1 shows the N-glycosylated site-specific sugar chain map of Happtoglobin. The size of the sugar chain shown in the figure is expressed using the standardized value obtained by LC / MS analysis. That is, the value showing the highest strength was converted into 100%, and the relative values were compared. 50 ~ 100% are large size; 10-50%, medium size; 1-10%, small size, and no sugar chain showing a value of 1% or less was shown. Glycoconjugate structure The star shown above is not identified in normal persons, but is present in more than 1% of gastric cancer patients. It can be used as a biomarker for the diagnosis of gastric cancer patients.
도 2는 위암 초기와 말기 환자, 정상인의 햅토글로빈에서 부위-특이적인 바이오마커를 나타낸다. 그림에서 보여주는 크로마토그램은 같은 당쇄 구조 (Hex7 HexNAc6 Fucose1)를 가지고, 세 개의 다른 N-당쇄화 부위에 결합되어 있는 당펩타이드의 정량분석 정보를 나타낸다. 184번에는 위와 같은 당쇄는 결합되어있지 않았다. 각 세 개의 다른 당펩타이드는 다른 정량정보를 가지고 있으며, T-검정 p-값, ROC 커브, AUCs (Area under the ROC curve)에서 각기 다른 값을 보여주고 있다. 세 개의 당펩타이드 모두 정상인과 암환자를 명확히 구별할 수 있으며, 211번 당펩타이드의 AUC=0.92, 207번 당펩타이드는 AUC=0.94로 높은 AUC 값을 보여주며, 특히 241번 당펩타이드는 AUC=1의 값을 보여 정상인과 암환자를 완벽히 구별할 수 있는 강력한 바이오마커로 보인다. 즉, 같은 당쇄 구조를 가지고 있더라도 어느 당쇄화 위치에 어떠한 당이 결합되어 있는지에 따라 위암환자와 정상인을 완벽하게 구별할 수 있는 바이오마커로 사용 가능하다. 부위-특이적인 당펩타이드를 이용한 바이오마커는 고감도 고특이성을 가진 바이오마커이다.FIG. 2 shows site-specific biomarkers in early gastric cancer, end-stage patients, and normal human hepatoglobin. The chromatogram shown in the figure shows quantitative analysis information of the glycopeptide bound to three different N-glycosylation sites with the same sugar chain structure (Hex7 HexNAc6 Fucose1). At 184, the sugar chain was not bound. Each of the three different glycopeptides has different quantitative information and shows different values for T-test p-value, ROC curve, and Area under the ROC curve (AUCs). All of the three glycopeptides can differentiate between normal and cancer patients. The AUC of the peptide at 211 = 0.92 and the peptide at 207 = AUC = 0.94 show a high AUC value. In particular, the peptide at 241 has AUC = 1 , Which is a powerful biomarker that can distinguish between normal and cancer patients. That is, even if the same sugar chain structure is present, it can be used as a biomarker capable of completely distinguishing a gastric cancer patient from a normal person depending on which sugar is bonded to which sugar chain position. Biomarkers using site-specific glycopeptides are highly sensitive and highly specific biomarkers.
도 3은 암환자에서 특이적으로 당펩타이드에 결합된 당쇄의 가지 (antennae) 수가 증가하는 경향성을 보여주는 결과이다. 햅토글로빈은 정상인에서는 주로 두 가지 (bi-antennae)의 구조를 가지지만, 암환자에서는 한 가지 (mono-antennae), 세 가지 (tri-antennae), 네 가지 (tetra-antennae)의 양이 증가하는 경향을 보여준다.FIG. 3 shows the tendency of increasing the number of antennae of the sugar chains bound to the glycopeptide specifically in cancer patients. Haptoglobin has two structures (bi-antennae) in normal subjects, but in cancer patients, one (mono-antennae), three (tri-antennae), and four (tetra-antennae) .
당펩타이드의 정량정보는 LC/MS 분석시 얻은 피크 크로마토그램의 면적을 이용하여 정량값을 얻었다. N-당쇄의 기본 구조인 만노스 (Man)3, 엔-아세틸-글루코사민 (GlcNAc)2( 
찾아진 당펩타이드에서 모든 당쇄화 위치에 결합된 당쇄 가지 (antennae) 구조에 따라 당펩타이드를 구분하여 가지의 양 (abundance)을 합산한다. 즉, LC/MS 분석시 얻은 피크 크로마토그램의 면적을 이용하여 당펩타이드의 정량정보를 얻고, p-값과 AUC 값을 얻었다. 이와 같이, 각 당쇄화 위치별로 결합된 N-당쇄의 가지 (antennae)의 양을 계산에 넣은 경우 유의성이 높고 고특이성, 고민감도를 나타내어 당쇄 변화를 탐지하기에 효과적이다.
In the peptide of interest, the glycopeptide is separated according to the structure of the sugar chain bound to all glycosylation sites to add the abundance of the branches. That is, quantitative information of the glycopeptide was obtained using the area of peak chromatogram obtained by LC / MS analysis, and p-value and AUC value were obtained. Thus, when the amount of the antennae of the N-sugar chains bound to each sugar chain position is calculated, it is highly effective in detecting sugar chain changes because of high significance, high specificity and high sensitivity.
각 특정 부위에 결합된 당사슬의 가지 구조를 분석함으로써 고감도 고특이성의 바이오마커를 발굴하였다. 이러한 경향성은 부위-특이적인 분석에서 유의성을 가진다. 예컨대, p-값은 모든 부위를 통합하여 분석하였을 때보다 하나의 부위만을 이용하여 분석하였을 경우 더 낮은 값을 나타낸다. 유사한 결과로, AUC 또한 하나의 부위를 분석한 경우 더 높은 값을 보였다. 즉 부위-특이적으로 분석한 경우 암환자 진단을 위한 유의성 및 민감도와 특이성이 증가되는 결과를 보였다.High specificity biomarkers were identified by analyzing the structure of the oligosaccharide bound to each specific site. This tendency is significant in site-specific analyzes. For example, the p-value shows a lower value when analyzed using only one site than when all sites are analyzed. Similar results, AUC was also higher when one site was analyzed. In other words, site-specific analysis showed significant significance, sensitivity and specificity for cancer patient diagnosis.
예컨대 모든 N-당쇄화 위치에서 한 가지 (mono-antennae)의 양이 증가되는 경향은 p-값=9.50x10-5 와 AUC=0.9067의 값을 보였으나, 184 당쇄화 위치에서 한 가지 (mono-antennae)가 증가되는 경향은 p-값=1.81x10-5 와 AUC=0.9533의 값을 보여 더 높은 유의성과 고감도 고특이성을 나타내었다.For example, the tendency for one mono-antennae to increase in all N-glycosylation sites was p-value = 9.50x10 -5 and AUC = 0.9067, The increased tendency of antennae showed higher significance and high sensitivity and high specificity with p-value = 1.81x10 -5 and AUC = 0.9533.
또한, 모든 N-당쇄화 위치에서 네 가지 (tetra-antennae)의 양이 증가되는 경향은 p-값= 3.64x10-5 와 AUC=0.9400의 값을 보였으나 241 당쇄화 위치에서 네 가지 (tetra-antennae)의 증가는 p-값e=2.32x10-6 와 AUC=0.9667로 나타나 더 높은 유의성과 고감도 고특이성을 보여주었다.In addition, the tendency of increasing the amount of tetra-antennae at all N-glycosylation sites was found to be p-value = 3.64x10 -5 and AUC = 0.9400, but the tetra- The increase of antennae was shown as p-value e = 2.32x10 -6 and AUC = 0.9667, indicating higher significance and high sensitivity and high specificity.
도 4는 당쇄의 생물학적 합성경로에 따라 구별하였을 경우 AUC 가 증가되는 결과를 보여준다. 고-만노스 (high-mannose) 타입, 복합 (complex) 타입, 퓨코스가 결합된 복합 타입, 시알산이 결합된 복합 타입 당쇄로 나누어 바이오마커 검증분석을 수행하였다. 말단이 잘린 복합 타입 (truncated complex type)과 퓨코스가 결합된 복합 타입에서 유의성이 높은 고감도의 바이오마커를 발굴하였다. 두 당쇄 타입에서 보면 정상인에 비해 암환자에서 두 당쇄가 확연히 증가한 것을 확인할 수 있으며, 각 당쇄화 부위에서 모두 특이적으로 양이 증가하였다.FIG. 4 shows the results of increasing the AUC when differentiated according to the biological synthesis pathway of the sugar chain. Biomarker assays were performed by dividing into high-mannose type, complex type, complex type conjugated with fucose, and complex type sugar chain conjugated with sialic acid. A highly sensitive biomarker with a high degree of significance was found in a complex type in which truncated complex type and fucose were combined. In both types of glycans, the two glycans were significantly increased in cancer patients compared to normal, and the amount of glycation was increased specifically in each glycated site.
또한, 이러한 경향성은 부위-특이적으로 분석할 경우 유의성이 커진다. p-값은 모든 부위를 통합하여 분석하였을 때보다 하나의 부위만을 이용하여 분석하였을 경우 더 낮은 값을 나타내었다. 유사한 결과로, AUC 또한 하나의 부위를 분석한 경우 더 높은 값을 보였다. 즉, 부위-특이적으로 분석한 경우 암환자 진단을 위한 유의성, 민감도와 특이성이 증가되는 결과를 보였다.Also, this tendency is significant when analyzed by site-specific analysis. The p-values were lower when analyzed using only one region than when all regions were integrated. Similar results, AUC was also higher when one site was analyzed. In other words, when site-specific analysis was performed, the significance, sensitivity, and specificity for diagnosis of cancer patients were increased.
말단이 잘린 복합 타입 당쇄가 결합된 당펩티드의 증가를 이용하여 암환자와 정상인을 구별할 수 있으며, 이는 고감도 고특이적 바이오마커로 사용가능하다. 특히 부위-특이적으로 분석할 경우 감도와 특이성은 더욱 증가한다. It is possible to distinguish cancer patients from normal persons by using an increase in glycoprotein conjugated with a complex type sugar chain having a truncated terminus, which can be used as a highly sensitive and specific biomarker. Especially when site-specific analysis is performed, sensitivity and specificity are further increased.
모든 부위의 말단이 잘린 복합 타입 당쇄가 결합된 당펩타이드의 양적 증가를 이용한 경우 p-값=5.52x10-5 와 AUC=0.9533 값을 보였으나, 부위 207의 복합 타입 당사슬이 결합된 당펩타이드의 증가를 이용한 경우 p-값=8.78x10-6 와 이의 AUC 값은 0.973으로 고감도, 고특이적인 바이오마커로 사용 가능하다.The p-value = 5.52 × 10 -5 and AUC = 0.9533 values were obtained when the quantitative increase of the glycoprotein conjugated with the complex-type sugar chain truncated at all sites was observed, but the increase of the glycopeptide bound to the complex type sugar chain at
퓨코실화 복합 타입 (fucosylated complex type) 당쇄가 결합된 당펩타이드의 양적 증가를 이용하여 정상인과 암환자를 구별할 수 있으며 이는 고감도 고특이적 바이오마커로 사용가능하다. 특히 부위-특이적으로 분석할 경우 유의성은 더욱 높아진다.Fucosylated complex type It is possible to distinguish between normal and cancer patients by using the quantitative increase of sugar chains bound with sugar chains and it can be used as a high sensitivity and specific biomarker. Particularly, when the site-specific analysis is performed, the significance becomes even higher.
모든 부위의 퓨코실화 복합 타입 당쇄가 결합된 당펩타이드의 증가를 이용하여 p-값과 AUC 값을 분석한 경우 각각 2.27x10-6, 1의 값을 보여 고감도 고특이적인 바이오마커로 사용이 가능하며, 부위-특이적 당펩타이드를 분석한 경우 그 유의성은 더욱 증가되었다.When the p-value and AUC value were analyzed using the increase of sugar chains bound to fucosylated complex-type sugar chains at all sites, the values were 2.27 × 10 -6 , 1, respectively, and thus they can be used as highly sensitive and specific biomarkers , The significance was further increased when the site-specific glycopeptide was analyzed.
부위 211의 퓨코실화 복합 타입 당쇄가 결합된 당펩타이드 증가는 암환자와 정상인을 완벽하게 구별할 수 있는 AUC=1, p-값 2.21x10-7의 값을 보였으며, 따라서 이 당사슬은 고감도, 고특이적 바이오마커로 이용 가능하다.The increase in glycopeptide bound fucosylated complex type sugar chains at
도 5는 바이오마커로 활용가능한 당펩타이드를 보여주고 있다. 도 5에서 보여주는 모든 당펩타이드는 정량적인 양이 암환자와 정상인에서 5배 이상 차이가 난다.FIG. 5 shows a sugar peptide which can be used as a biomarker. The quantitative amounts of all the glycopeptides shown in FIG. 5 differ by more than 5-fold from those of cancer patients and normal persons.
별표로 표시된 모든 당펩타이드는 통계적인 유의성을 가지며 이들의 생합성적으로 관련되는 당펩타이드의 조합을 이용하여 분석한 결과 유의성은 더 증가했다. All glycated peptides marked with an asterisk have statistical significance and their significance was further increased by analysis of their biosynthetically related combination of glycopeptides.
예를 들어, 211번 아미노산 N-당쇄화 위치에서 (Hex6 HexNAc5 Fucose1)을 가진 당펩타이드의 p-값은 6.70x10-5, (Hex6 HexNAc5 Fucose1 NeuAc1)을 가진 당펩타이드의 p-값은 4.91x10-6인데, 이 두 당펩타이드의 조합을 이용하면 p-값은 7.66x10-7, AUC는 1의 값을 보여 정상인과 암환자 구별을 완벽하게 할 수 있는 바이오마커가 된다.For example, p- value of a party with the peptide (Hex6 HexNAc5 Fucose1) 211 amino acids at the N- glycosylated position p- value for the peptide with the sugar 6.70x10 -5, (Hex6 HexNAc5 Fucose1 NeuAc1 ) is 4.91x10 - 6 , with a combination of these two peptides, the p-value is 7.66x10 -7 and the AUC is 1, making it a biomarker that can perfectly differentiate normal and cancer patients.
241번 아미노산 N-당쇄화 위치에 (Hex6 HexNAc5 Fucose1 NeuAc1)과 (Hex7 HexNAc6 Fucose1)을 가진 두 개의 당펩타이드는 p-값이 각각 1.03x10-4, 2.03x10-4인데, 이 두 당펩타이드의 조합을 이용하면, p-값은 9.41x10-5, AUC=1의 값을 가진 바이오마커가 된다. 이와 같이, 부위 특이적 당펩타이드의 조합을 이용하면 고감도, 고특이성의 바이오마커를 발굴할 수 있다.The 241 amino acid N- glycan one screen position (Hex6 HexNAc5 Fucose1 NeuAc1) and (Hex7 HexNAc6 Fucose1) per two peptides with is the p- value of each 1.03x10 -4, 2.03x10 -4, a combination of the two peptides per , The p-value becomes a biomarker having a value of 9.41 x 10 -5 and AUC = 1. As described above, a biomarker with high sensitivity and high specificity can be found using a combination of site specific sugar chains.
표 1은 p-값 0.005 이하의 고감도 고특이성을 가진 바이오마커의 리스트이다. 이와 같이, 본 발명자들은 특정 N-당쇄화 위치에 결합한 당사슬의 정성 및 정량정보를 이용한 바이오마커 발굴 및 진단법을 개발하였다.Table 1 is a list of biomarkers with high sensitivity and high specificity below p-value 0.005. Thus, the present inventors have developed biomarker discovery and diagnostic methods using qualitative and quantitative information of oligosaccharides bound to specific N-glycosylation sites.
Claims (2)
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4_Fucose1,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5_Fucose1,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose4_HexNAc3,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4,
히스티딘-184번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4_NeuAc1,
Hexose4_HexNAc3-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,
Hexose5_HexNAc4-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,
Hexose4_HexNAc4-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,
Hexose6_HexNAc5-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,
Hexose8_HexNAc2-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,
Hexose5_HexNAc4_Fucose1-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,
Hexose7_HexNAc6-207번 아스파라긴-히스티딘-세린-글루탐산,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,
Hexose7_HexNAc6_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,
Hexose5_HexNAc5_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,
Hexose4_HexNAc4_Fucose1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,
Hexose7_HexNAc6_Fucose1_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,
Hexose7_HexNAc6_NeuAc1-211번 아스파라긴-알라닌-트레오닌,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc4,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose5_HexNAc5_Fucose1,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose6_HexNAc5,
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose7_HexNAc6_Fucose1 및
히스티딘-프롤린-241번 아스파라긴-Hexose7_HexNAc6 중 1종 이상의 N-당쇄화된 당펩타이드의 검출제제를 포함하는 위암 진단용 마커 조성물.Aspartic acid at the 184th, 207th, 211th, or 241th positions of the haptoglobin was added to the N-glycosylated peptide
Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4_Fucose1,
Histidine-184 asparagine-Hexose6_HexNAc5_Fucose1,
Histidine-184 asparagine-Hexose4_HexNAc3,
Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4,
Histidine-184 asparagine-Hexose5_HexNAc4_NeuAc1,
Hexose4_HexNAc3-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose5_HexNAc4-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose4_HexNAc4-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose8_HexNAc2-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose5_HexNAc4_Fucose1-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose7_HexNAc6-207 asparagine-histidine-serine-glutamic acid,
Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
Hexose6_HexNAc5_Fucose 1-21 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_Fucose 1-21 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose5_HexNAc5_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
Hexose4_HexNAc4_Fucose 1-21 times asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_Fucose1_NeuAc1-211 Asparagine-alanine-threonine,
Hexose7_HexNAc6_NeuAc1-211 asparagine-alanine-threonine,
Histidine-proline -241 asparagine-Hexose5_HexNAc4,
Histidine-proline-241 asparagine-Hexose5_HexNAc5_Fucose1,
Histidine-proline-241 asparagine-Hexose6_HexNAc5_Fucose1_NeuAc1,
Histidine-proline-241 asparagine-Hexose6_HexNAc5,
Histidine-proline-241 asparagine-Hexose7_HexNAc6_Fucose1 and
Histidine-proline-241-asparagine-Hexose7_HexNAc6, wherein the detection marker comprises at least one N-glycosylated glycoprotein.
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|---|---|---|---|---|
| KR102222002B1 (en) | 2019-09-11 | 2021-03-02 | 충남대학교산학협력단 | Gastric Cancer Biomarkers Derived from Target Glycoproteins Discovered by Middle-up-down Analysis |
| KR102222001B1 (en) | 2019-09-11 | 2021-03-02 | 충남대학교산학협력단 | Disease diagnosing methods through a middle-up-down approach to targeted glycoproteins |
Citations (3)
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| JP2009168470A (en) * | 2008-01-10 | 2009-07-30 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Pancreas cancer marker and examination method of pancreas cancer |
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2014
- 2014-10-07 KR KR1020140135330A patent/KR101530210B1/en active IP Right Grant
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