KR101518536B1 - 메탄영양세균 고정화 담체 및 이를 이용한 메탄제거 방법 - Google Patents

메탄영양세균 고정화 담체 및 이를 이용한 메탄제거 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메탄영양세균만을 선택적이고 높은 증식율로 성장시킬 수 있는 메탄영양세균용 고정화 담체, 상기 담체에 고정화된 메탄영양세균을 포함하는 바이오필터, 상기 담체에 고정화된 메탄영양세균을 포함하는 바이오커버, 상기 바이오필터 또는 바이오커버를 이용하여 메탄을 제거하는 방법, 메탄영양세균만을 선택적이고 높은 증식율로 성장시킬 수 있는 메탄영양세균 배양용 배지 및 상기 배지를 이용하여 메탄영양세균을 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 고정화 담체를 이용하면, 메탄영양세균을 선택적이고 높은 성장율로 배양할 수 있을 뿐만 아니라, 이로 인하여 메탄제거효율 및 메탄제거용량이 증대되므로, 악취제거용 또는 메탄제거용 바이오필터의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

메탄영양세균 고정화 담체 및 이를 이용한 메탄제거 방법{Immobilized carrier for Methanotrophs and method for removing methane employing the same}
본 발명은 메탄영양세균 고정화 담체 및 이를 이용한 메탄제거 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 메탄영양세균만을 선택적이고 높은 증식율로 성장시킬 수 있는 메탄영양세균용 고정화 담체, 상기 담체에 고정화된 메탄영양세균을 포함하는 바이오필터, 상기 담체에 고정화된 메탄영양세균을 포함하는 바이오커버, 상기 바이오필터 또는 바이오커버를 이용하여 메탄을 제거하는 방법, 메탄영양세균만을 선택적이고 높은 증식율로 성장시킬 수 있는 메탄영양세균 배양용 배지 및 상기 배지를 이용하여 메탄영양세균을 배양하는 방법에 관한 것이다.
산업혁명 이후 도시화, 산업화 및 인구증가에 의해 다양한 환경문제들이 야기되고 있으며, 이 중 온실가스 증가로 인한 기후변화는 지구생태계를 위협하는 전지구적 환경문제로 대두되고 있다. 이에 따라, 기후변화협약(1992년) 이후 탄소배출권 거래, 탄소세 부과 등과 같은 국제 공동대책 및 다양한 정책이 수립되어 시행되고 있으며, 온실가스 저감 관련 분야의 연구가 활발하게 진행되고 있다. 또한, 온실가스의 배출저감에 대한 필요성 및 요구는 산업시설 뿐만 아니라 농축산 및 폐기물 처리 분야까지도 확대되고 있다.
메탄은 전 지구적 기후변화를 초래하는 온실가스 중의 하나로, 이산화탄소에 이어 그 기여도가 2번째이고, 메탄으로 인한 온실효과는 이산화탄소로 인한 온실효과의 20배 이상인 것으로 알려져 있다. 이러한 메탄의 발생원 중에서 주요 인위적인 것은 매립지인데, 매립지로부터 발생하는 메탄의 양은 연간 35 내지 73Tg(tera gram)으로 추정되고 있다. 이에 따라, 매립지에서 발생하는 메탄을 회수하여 에너지원으로서 활용하는 연구가 활발히 진행되고 있으나, 메탄 포집시설을 설치하기에는 경제적으로 타당성이 맞지 않는 소규모 매립지나 매립 종료 후 어느 정도 시간이 소요되어 자원화하기에는 너무 낮은 농도로 메탄이 배출되는 매립지의 경우에는 메탄이 지속적으로 발생하고 있음에도 불구하고, 이를 위한 대책이 마련되어 있지 않은 실정이다.
이처럼, 메탄을 자원으로 회수하기 곤란한 매립지의 메탄 배출량을 저감시키기 위해, 메탄을 탄소원으로 사용하여 증식하는 메탄영양세균(methanotrophs)을 이용하는 방법이 연구되고 있는데, 메탄영양세균은 탄소원 및 에너지원으로서 메탄을 사용하여 증식하기 때문에, 상기 메탄영양세균을 이용하는 방법은 메탄을 제거하는 효과적인 방법으로서 알려져 있다.
그러나, 상기 메탄영양세균을 매립지에서 메탄을 제거하기 위하여 사용할 경우, 메탄제거 효율이 매우 낮은 수준을 나타낸다는 문제점이 있었다. 즉, 상기 메탄영양세균을 매립지에 사용하기 위하여는 illite, montmorillonite 등의 광물성 담체에 고정화시킨 형태로 제조하여야 하는데, 상기 광물성 담체에 메탄영양세균을 접종할 경우, 메탄영양세균이 정상적으로 증식하거나 성장하지 못하기 때문에, 이처럼 고정화된 메탄영양세균을 사용하여도 실제적인 메탄제거 효율이 매우 낮다는 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 메탄제거 효율이 우수한 메탄영양세균을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다(특허공개 제2011-0006962호; 특허공개 제2011-0006964호).
이처럼 메탄제거 효율이 우수한 메탄영양세균을 사용하더라도, 상기 균주가 효과적으로 고정화되어 제기능을 발휘하지 못하는 문제는 해결되지 않았기 때문에, 이러한 문제를 해결하여야 할 필요성이 대두되었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 광물성 담체의 일종인 토버몰라이트(tobermolite)를 메탄영양세균의 고정화 담체로서 사용할 경우, 메탄영양세균만을 선택적이고 높은 증식율로 성장시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 토버몰라이트를 포함하는 메탄영양세균용 고정화 담체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 담체에 고정화된 메탄영양세균을 포함하는 바이오필터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 담체에 고정화된 메탄영양세균을 포함하는 바이오커버를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오필터 또는 바이오커버를 이용하여 메탄을 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 토버몰라이트를 포함하는 메탄영양세균 배양용 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 배지를 이용하여 메탄영양세균을 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 토버몰라이트를 포함하는 메탄영양세균용 고정화 담체를 제공한다.
본 발명의 용어 "토버몰라이트(tobermolite)"란, 실리카(SiO2)와 칼슘이 수열반응에 의하여 생성되고, 높은 강도를 가지는 안정된 규산 칼슘 수화물(5CaO·6SiO2·5H2O)을 의미하는데, 다공성의 가볍고 견고한 결정상을 가지며, CaO/SiO2 몰비가 0.5~1.5인 경우 가장 효과적으로 생성된다. 본 발명의 목적상 상기 토버몰라이트는 메탄영양세균의 고정화 담체로서 사용될 뿐만 아니라, 메탄영양세균 배양용 배지로서도 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "메탄영양세균(methanotroph)"이란, 메틸영양세균(methylotroph) 중에서 메탄만을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있는 미생물을 의미하는데, 세포에서 외부의 메탄을 흡수하여 CH3OH, HCHO, HCOOH 및 CO2로 순차적으로 변화시켜서 메탄을 이산화탄소로 완전히 산화시킴을 통하여 ATP를 획득할 수 있다. 본 발명의 메탄영양세균은 상기 토버몰라이트에 고정화되어 메탄을 제거할 수 있는 효과를 나타내는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, Methylocystis 속 미생물, Methylosarcina 속 미생물, Methylocaldum 속 미생물 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "메틸영양세균(methylotroph)"이란, 메탄, 메탄올, 메틸아민 등의 탄소수 1개의 화합물이나 디메틸아민, 트리메틸아민 등의 분자내에서 C-C결합을 하지 않은 화합물을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있는 미생물을 의미하는데, 상기 화합물 이외에는 이용할 수 없는 편성 메틸영양세균(Methylococcus sp., Methylosinus sp. 등)과 다른 탄소화합물도 이용할 수 있는 임의 메틸영양세균(Pseudomonas sp., Methylobacterium sp. 등)으로 구분된다. 본 발명의 메탄영양세균은 상기 메틸영양세균 중에서 메탄만을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있는 편성 메틸영양세균에 속하지만, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "고정화 담체"란, 미생물을 이용한 산업에 사용하기 위하여 미생물을 고정화시키는 기질을 의미하는데, 상기 기질은 목적 미생물을 고농도로 고정화할 수 있고, 복수의 공극을 포함하며, 상기 공극들이 서로 연장되어 형성된 망상 구조의 네트웍 유로(reticulated network of flow channels)가 형성될 수 있고, 탄성 및 압축강도 등의 기계적 강도가 충분하여 산업적 사용에 적합한 내구성을 갖는 특징을 갖는다.
본 발명의 목적상, 상기 고정화 담체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 메탄영양세균이 접종되지 않은 담체, 이미 메탄영양세균이 접종된 형태의 담체 또는 접종된 메탄영양세균이 이미 증식된 형태의 담체 등이 될 수 있고, 바람직하게는 메탄영양세균이 접종 및 증식된 형태의 담체가 될 수 있다. 또한, 상기 고정화 담체로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 메탄영양세균을 고정화하여 선택적으로 증식시킬 수 있는 토버몰라이트가 단독으로 사용될 수도 있고, 상기 토버몰라이트와 메탄영양세균의 증식에 도움을 줄 수 있는 다른 광물성 물질의 조합이 사용될 수도 있다. 이때, 상기 고정화 담체로서 상기 토버몰라이트와 다른 광물성 물질의 조합이 사용되는 경우, 상기 고정화 담체에 포함되는 토버몰라이트의 함량은 메탄영양세균의 고정화 및 배양에 사용될 수 있는 고정화 담체를 구성할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 10 내지 90%, 보다 바람직하게는 50 내지 90%, 가장 바람직하게는 80 내지 90%가 될 수 있다.
본 발명자들은 토양의 메탄산화를 촉진하기 위하여 메탄영양세균이 고정화된 토버몰라이트를 토양에 도입하였다. 토양을 단독으로 사용한 경우에는 메탄산화가 수행되지 않았고, 토버몰라이트가 도입된 토양에서는 미세한 산화가 수행되었다(도 3). 또한, 토버몰라이트 담체와 펄라이트 담체에 메탄영양세균을 고정화시키고, 이들의 메탄제거 효율을 비교한 결과, 토버몰라이트에 고정화된 메탄영양세균이 펄라이트에 고정화된 메탄영양세균보다도 효율적으로 메탄을 제거할 수 있음을 확인하였다(도 4 및 도 11). 아울러, 토버몰라이트 담체와 펄라이트 담체에 메탄영양세균을 고정화시키고, 메탄을 공급하면서 장기간 동안 배양한 결과, 펄라이트의 표면에서는 바이오필름이 형성되어 바이오필터로서의 활용성이 저하되었으나, 토버몰라이트의 표면에서는 바이오필름이 형성되지 않아 바이오필터로서의 활용성이 저하되지 않았다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 담체에 고정화된 메탄영양세균을 포함하는 바이오필터 또는 바이오커버를 제공하는 것이다.
상기 바이오필터는 메탄영양세균을 이용하여 메탄을 제거하는 기능을 나타내므로, 메탄을 제거할 수 있는 필수 구성요소인 메탄영양세균이 고정화된 토버몰라이트 단독만으로도 상기 바이오필터를 구성할 수 있고, 바람직하게는 상기 메탄영양세균이 고정화된 토버몰라이트 또는 상기 토버몰라이트를 담지할 수 있는 충진부를 필수 구성요소로 포함하고, 상기 충진부를 사용하여 메탄이 포함된 오염가스로부터 메탄을 효율적으로 제거하기 위한 가스공급부(blower), 살수시스템(watering system), 드레인저장부(drainage container) 등의 추가 구성요소를 이용하여 상기 바이오필터를 구성할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 고정화 담체에 메탄영양세균을 고정화시키는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 건조된 토버몰라이트에 메탄영양세균을 포함하는 접종원을 가하고 건조시키는 방법을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 메탄영양세균의 접종원(지렁이 분변토, 매립지 복토 토양, 습지 토양 등)을 물에 현탁시켜 현탁액을 수득하고, 상기 현탁액을 일정시간 동안 정치시켜 중력침강 시킨 후, 상등액을 수득하며, 상기 상등액을 건조된 고정화 담체에 가하고 건조시킴으로써, 메탄영양세균을 고정화 담체에 고정화시킬 수 있다.
본 발명의 바이오필터는 바이오필터에 주입되는 기체에 포함된 메탄을 제거하기 위해 메탄영양세균이 고정화된 토버몰라이트 담체가 구비된 충진부(packing section)를 포함한다. 상기 충진부에 포함된 토버몰라이트 담체는 토버몰라이트 단독 또는 토버몰라이트와 다른 담체와의 혼합물로 구성될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
아울러, 상기 바이오필터의 메탄제거효과를 보다 향상시키기 위하여 상기 충진부 이외에, 가스공급부(blower), 살수시스템(watering system), 드레인저장부(drainage container) 등의 구성요소를 추가로 포함할 수도 있다. 예를 들어, 상기 가스공급부는 메탄이 발생되는 장소로부터 가스를 흡입하여 바이오필터에 공급하는 장치이고; 순환시스템은 순환용 펌프, 살수장치 등으로 구성되어, 바이오필터를 운전하는 동안 고정화 담체의 건조를 방지하고 메탄영양세균 활성 유지를 위해, 고정화 담체의 수분함량을 70% 이상 유지하도록 수분을 공급하는 장치이며; 드레인저장부는 상기 살수 시스템에서 공급되었으나 충진부에서 사용되지 않은 여분의 수분을 저장하고, 상기 살수 시스템으로 수분을 공급하며, 메탄영양세균의 성장에 필요한 각종 영양성분을 상기 수분에 공급할 수 있는 장치가 될 수 있으나, 이들 각 장치의 구성 및 추가적으로 포함되는 장치는 본 발명의 바이오필터가 메탄제거효과를 나타내는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 바이오커버는 메탄이 발생하는 장소에서 실질적으로 메탄을 제거하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 메탄의 발생량이 적어 메탄 포집시설을 설치하기에는 경제적으로 타당성이 맞지 않는 소규모 매립지나 매립 종료 후 어느 정도 시간이 소요되어 자원화하기에는 너무 낮은 농도로 메탄이 배출되는 매립지의 환기구 또는 가스배출구에 본 발명의 바이오커버를 장착시켜서 상기 매립지로부터 발생되는 메탄을 제거할 수 있다(도 12a 및 12b). 도 12는 본 발명의 토버몰라이트 바이오필터를 포함하는 바이오커버의 일 실시예를 나타내는 사진으로서, (a)는 토버몰라이트 바이오필터가 장착되지 않은 바이오커버를 나타내고, (b)는 토버몰라이트 바이오필터가 장착된 바이오커버를 나타낸다. 도 12에서 보듯이, 본 발명의 바이오커버는 매립지의 환기구 또는 가스배출구에 장착시킬 수 있는 뚜껑 형태가 될 수 있고, 상기 뚜껑의 중간에는 본 발명의 토버몰라이트 바이오필터를 유닛의 형태로 삽입하여 장착시킬 수 있도록 구성될 수 있다. 이때, 상기 토버몰라이트 바이오필터는 메탄영양세균을 포함하는 고정화 담체(토버몰라이트 또는 토버몰라이트와 다른 담체와의 혼합물)가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
아울러, 상기 바이오커버에는 토버몰라이트 바이오필터의 메탄제거효과를 보다 향상시킬 수 있도록 상술한 바이오필터 시스템에 포함되는 가스공급부, 살수시스템, 드레인저장부 등을 추가로 포함할 수도 있으나, 이들 추가적인 구성요소는 특별히 이에 제한되지 않는다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 바이오필터 또는 바이오커버를 이용하여 메탄을 제거하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 메탄을 제거하는 방법은 상기 바이오필터 또는 바이오커버를 메탄이 존재하는 장소에 설치하는 단계를 포함한다. 이때, 메탄이 존재하는 장소는 특별히 이에 제한되지 않으나, 매립지 등이 될 수 있다.
또 다른 실시양태로서, 본 발명은 메탄영양세균 배양용 배지를 제공한다.
본 발명자들은 메탄영양세균과 다른 세균을 포함하는 혼합균체를 토버몰라이트 또는 펄라이트에 고정화시키고, 메탄을 공급하면서 배양한 결과, 펄라이트에 고정화된 균체를 배양할 경우에는 메탄영양세균이 전체 세균 군집의 7.7%를 차지하였으나, 토버몰라이트에 고정화된 균체를 배양할 경우에는 메탄영양세균이 전체 세균 군집의 93.5%를 차지하였고, 이는 배양시간의 경과에 따라 증가함을 확인하였다(도 9).
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또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 배지를 이용하여 메탄영양세균을 배양하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 메탄영양세균을 배양하는 방법은 상기 배지에 메탄영양세균을 접종하고, 메탄을 공급하면서 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 고정화 담체를 이용하면, 메탄영양세균을 선택적이고 높은 성장율로 배양할 수 있을 뿐만 아니라, 이로 인하여 메탄제거효율 및 메탄제거용량이 증대되므로, 악취제거용 또는 메탄제거용 바이오필터의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 바이오필터의 개략도이다.
도 2는 메탄영양세균용 담체로서 토버몰라이트의 잠재성을 나타낸다. 토버몰라이트에 고정화된 메탄영양세균은 토양의 메탄산화를 촉진시키기 위하여 토양에 도입된다.
도 3은 단기적으로 운영된 토버몰라이트 바이오필터(a) 및 펄라이트 바이오필터(b)의 메탄영양세균의 효과를 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 단기적으로 운영된 토버몰라이트 바이오필터 및 펄라이트 바이오필터의 메탄제거용량을 비교한 결과를 나타낸다. 접종시점의 데이터는 제외되었다.
도 5는 단기적으로 운영된 토버몰라이트 바이오필터(a) 및 펄라이트 바이오필터(b)의 세균 군집를 비교한 결과를 나타낸다. 화살표는 메탄영양세균을 나타낸다. 서열결정 결과 ≤ 0.2%의 수치를 나타내는 속의 미생물은 제외되었다. 어느 하나의 라이브러리에서 관찰된 속의 미생물만이 보여졌다.
도 6은 단기적으로 운영된 토버몰라이트 바이오필터(a) 및 펄라이트 바이오필터(b)의 세균 군집에서 메탄영양세균의 비율을 비교한 결과를 나타낸다.
도 7은 세균 군집에서 시간의 경과에 따른, 토버몰라이트 바이오필터의 메탄영양세균의 효과를 나타낸다. 유입 및 유출 메탄농도(a)와 제거효율(b)을 나타낸다.
도 8은 토버몰라이트 바이오필터(n=2)에서 미생물 군집체의 시간경과에 따른 변화를 나타낸다. (a)는 접종원이고, (b)는 14일이 경과한 시점이며, (c)는 21일이 경과한 시점이다. 화살표는 메탄영양세균을 나타낸다. 서열결정 결과 ≤ 0.2%의 수치를 나타내는 속의 미생물은 제외되었다. 어느 하나의 라이브러리에서 관찰된 속의 미생물만이 보여졌다.
도 9는 토버몰라이트 바이오필터에서 메탄영양세균의 비율의 시간경과에 따른 변화를 나타낸다.
도 10은 장기적으로 운영된 토버몰라이트 바이오필터(a) 및 펄라이트 바이오필터(b)의 메탄영양세균 효과를 나타낸다.
도 11은 장기적으로 운영된 토버몰라이트 바이오필터(a) 및 펄라이트 바이오필터(b)의 메탄 제거 용량을 나타낸다.
도 12는 본 발명의 토버몰라이트 바이오필터를 포함하는 바이오커버의 일 실시예를 나타내는 사진으로서, (a)는 토버몰라이트 바이오필터가 장착되지 않은 바이오커버를 나타내고, (b)는 토버몰라이트 바이오필터가 장착된 바이오커버를 나타낸다.
도 13은 바이오커버의 메탄의 출구와 입구 농도 및 제거 효율을 나타낸다.
도 14는 바이오커버의 운전 기간에 따른 gas profile 변화를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
실시예 1-1: 필터 바탕물질
토버몰라이트 및 펄라이트는 무기 필터 바탕물질로 사용되었다. 그들의 직경은 4-8 mm이다. 그들을 철저하게 수돗물로 세척하고, 그들의 물 지주 용량(water holding capacity), pH (1:5), 벌크 밀도, 입자 밀도, 다공성(porosity), 표면 영역 및 침입 볼륨(intrusion volume)을 결정하였다. 표면 영역과 침입 볼륨은 WIN9400 Series mercury intrusion porosimetry (Micromeritics, Norcross, USA)을 이용하여 측정하였다. 결과를 표 1에 표시하였다. 일괄 실험은 이들 물질이 메탄 가스를 흡수하지 못함을 확인하는데 사용되었다(데이터가 표시되지 않음) .
실시예 1-2: 단기적으로 운영된 토버몰라이트와 펄라이트 바이오필터의 비교
원통형 아크릴 수지로 만든 실험실 규모의 바이오필터를 본 발명에서 사용하였다. 각 바이오필터는 packing section, watering system 및 medium container의 세부분으로 구성되었다. packing section의 높이 및 내부 직경은 각각 100cm 및 8cm(약 5L)였다. 바이오필터는 가스가 균일하게 확산 수 있도록 하단에 다공 판을 포함하였다. 상기 준비된 필터 바탕물질을 패킹 컬럼에 충진하고, 작업 부피를 5L로 하였다. 높이 20cm 및 내경 8cm의 watering system은 상단에 물 유입구 및 상기 유입구로부터 5cm거리에 다공성 판을 포함한다. 높이 20cm 및 내경 15cm인 medium container는 약 3.5L였다. 그들은 고무 패킹과 여섯개의 볼트/너트에 의해 조립되었다(watering system-packing section-medium container). 설정 후, 반응기의 가스밀폐를 물과 압축 공기로 확인하였다. 메탄 공급없이 겨울을 지낸 실험실 수준의 메탄영양세균 바이오필터(Kim, T.G., et al., Microbial community analysis of a methane-oxidizing biofilm using ribosomal tag pyrosequencing. J. Microbiol. Biotechn., in press., 2012)의 충진물질(펄라이트 and granular 활성탄, 10:1 w:w)로부터 접종원을 제조하였다. 상기 충진물질을 NMS 배지와 혼합하였다(1:10 w:w). NMS는 MgSO4·7H2O 1g, CaCl2·2H2O 0.295 g, KNO3 1g, KH2PO4 0.26g 및 Na2HPO4·2H2O 0.41을 포함한다. CuSO4가 최종농도 30μM이 되도록 추가되었다. 혼합 후, 정적인 상태를 30분 동안 유지하였다. 상층액을 바이오필터용 접종원으로 사용하였다. 접종원(2.5L)을 상기 medium container에 가하고, 7일 동안 하루 4번씩 순환시켜서 상기 충진물질에 세포를 부착시켰다. 메탄과 압축 공기로 구성된 합성 가스를 50 cm 길이 가습기에 통과시켜 가습하였다. 상기 합성 가스를 250 mL/분의 유속(시간 당 3의 공간속도)으로 상기 바이오필터의 하단에 지속적으로 공급하였다. 가스 흐름을 유량계(Dwyer Inc., Michigan city, USA and Kofloc Inc., Kyoto, Japan)를 사용하여 조절하였다. 메탄 유입 농도를 20,000 - 100,000 ppm으로 유지하였다. 상기 바이오필터를 변형된 NMS 배지에서 23일 동안 20 ± 5℃에서 운영하였다. 상기 변형된 NMS 배지는 1L 당 MgSO4·7H2O 1g, CaCl2·2H2O 0.295g, KNO3 10g, Na2HPO4 2.6g 및 Na2HPO4·2H2O 4.1 g을 포함한다. CuSO4가 최종농도 30μM이 되도록 추가되었다. 운영하는 동안, 배지를 하루 4회 순환시키고, 매주 교체하였다.
실시예 1-3: 가스 분석
teflon minnert fitting이 구비된 0.5 mL 가스밀폐형 주사기(Hamilton, Reno, USA)를 이용하여 바이오필터의 유입구와 유출구에서 가스를 채취하였다. 메탄 농도는 불꽃 이온화 검출기 및 왁스 칼럼(30 m×0.32 mm×0.25 μm, Supelco, Bellefonte, USA)이 구비된 가스 크로마토그래피(GC, 6850N, Agilent Technologies, Santa Clara, USA)를 사용하여 모니터하였다. N2는 캐리어 가스로 사용되었다. 오븐, 주입기 및 검출기의 온도는 각각 100, 250 및 250℃로 고정되었다.
실시예 1-4: DNA 추출
필터 바탕물질을 실험 기간의 마지막에 바이오필터로부터 수집하였다. 세포를 Q500 ultrasonic processor (Qsonica, Newton, USA)를 사용한 3종류의 서로다른 초음파 조건에서 필터 바탕물질로부터 분리하였다. 시료 10g을 멸균된 식염수(0.9%) 20 ml이 담겨진 멸균된 원뿔형 튜브(50 mL)에 가하였다. 상기 튜브를 초음파의 열 효과를 방지하기 위해 얼음이 담겨진 용기에 위치시키고, 상기 processor의 원뿔형 팁(직경 6mm)를 용액에 약 1cm 정도 접촉시켰다. 초음파는 5분 동안 처리하였다. 현탁액으로 전달된 실제 전력은 20 kHz에서의 고정 주파수에서 0, 10 또는 50W 이었다. 그런 다음, 30분 동안 250 rpm으로 교반하였다. 현탁액 1.5mL을 1.5mL 마이크로 튜브로 옮기고, 10분동안 16,000 x g로 원심분리하였다. 상층액을 제거하였다. 30초동안 5,000 rpm으로 BeadBeater-8 system (BioSpec, Bartlesville, USA)을 상기 시료에 적용하는 변형된 방법으로 NucleoSpin Soil kit (Macherey-Nagel GmbH, Duren, Germany)를 사용하여 DNA를 추출하였다. DNA를 용출 완충액 100㎕를 사용하여 용출하고, 사용전에는 20℃에서 보관하였다. ASP-2680 spectrophotometer (ACTGene, Piscataway, USA)를 사용하여 DNA를 정량하였다.
실시예 1-5: PCR 과 pyrosequencing
6개의 서로다른 pyrosequencing 라이브러리를 생성하였다(2종의 바이오필터 × 3종의 초음파 처리). PCR을 수행하기 위하여, 프라이머 세트 340F (5'-TCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 및 805R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')이 V3 및 V4 영역을 포함하는 16S rRNA 유전자의 340-805 영역(대장균 기준)을 증폭하기 위하여 사용되었다.
멀티플렉스 pyrosequencing용 프라이머 세트(서열번호 1 및 2)가 340F-805R 서열에 기초하여 제작되었다:
forward primer 5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG- NNNNNNNNNN-TCCTACGGGAGGCAGCAG-3'(서열번호 1)
reverse primer 5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'(서열번호 2)
각각의 DNA 시료를 위하여, 네개의 독립적인 PCR의 혼합물은 PCR 바이어스를 피하기 위해 병렬로 준비되었다. 50㎕ 혼합물은 10X PCR 완충액(Genenmed, Seoul, Korea) 5㎕, BSA 10㎍, 각각의 프라이머(10μM) 2㎕, Ace Taq polymerase (Genenmed) 1U, 2.5 mM dNTP 4㎕ 및 주형 DNA 약 150 ng을 포함한다. 반응은 2700 GeneAmp® PCR system (Applied Biosystems, Foster, USA)에서 수행되었다(95℃ 3분, 25사이클(94℃ 45초, 50℃ 45초 및 72℃ 45초) 및 72℃ 5분). 네개의 PCR 산물을 조합하고, 상기 PCR 산물을 2% 아가로스 겔 전기영동에 적용하였다. PCR 산물의 예상 크기는 약 530bp였다. PCR 산물을 포함하는 아가로스 겔을 적출하고, 제조사 매뉴얼에 따라 QIAquick Gel extraction kit (Qiagen, Valencia, USA)를 사용하여 상기 아가로스 겔로부터 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA의 농도를 ASP-2680 spectrophotometer (ACTgene)를 이용하여 측정하였다. 정제된 DNA와 동일한 양을 단일튜브에 조합하여 pyrosequencing 라이브러리를 생성하고, Macrogen Incorporation (Seoul, Korea)사에 전달하여, Genome Sequencer 454 FLX Titanium system (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)에 적용하였다.
실시예 1-6: pyrosequencing 결과 분석
프라이머 트리밍, RDP pyrosequencing pipeline의 품질 트리밍 툴을 이용한 저 품질 DNA(length < 350 nt; average quality score < 25; and with an ambiguity)의 제거 및 Black Box Chimera Check software를 이용한 키메라의 제외와 같은 다중 단계를 이용하여 서열을 수득하였다. Pyrosequencing 서열은 80% 이상의 bootstrap 값을 가지는 pipeline의 RDP-분류기를 사용하여 분류학적으로 배열되었다. RDP 분류기는 도메인으로부터 속명에 이르는 신속하고 독립적인 분류학적 분류를 제공한다. 분류 결과는 MEGAN software version 4.50를 이용하여 분석되었다. 메탄영양세균 속 미생물에 할당된 서열은 메탄영양세균으로 간주되었고, pyrosequencing 라이브러리에서 그들의 비율이 산출되었다.
실시예 1-7: 토버몰라이트 바이오필터에서 세균 군집 의 시간적 변화
토버몰라이트를 포함하는 실험실 규모의 바이오 필터를 상술한 바와 동일한 조건으로 20일 동안 운영하였다. 접종원은 실시예 2-2의 펄라이트 바이오 필터의 바탕물질로부터 제조하였다. 상기 펄라이트를 NMS 배지와 혼합하였다(1:10 w:w). 혼합한 다음, 정적인 상태를 30분 동안 유지하였다. 상층액(2.5 L)을 medium container에 가하였다. 14일 및 21일의 토버몰라이트 뿐만 아니라 접종원에서 DNA를 추출하였다. 세포를 토버몰라이트에서 분리하고, 상술한 방법으로 DNA를 추출하였다. 10W의 실제 전력이 상기 실험에 사용되었다. 접종원의 1.5㎖ 분취물을 1.5㎖ 마이크로튜브에 옮기고, 10분동안 16,000 x g로 원심분리하였다. 상층액을 제거하였다. DNA를 상술한 방법으로 추출하였다. 각 시료마다 2회 반복실험을 수행하였다. 상술한 바와 같이, Pyroseqeuncing을 수행하고 분석하였다.
실시예 1-8: 바이오필터의 장기간 운영
상기 실시예 1-2에 개시된 방법으로, 두개의 토버몰라이트 바이오필터와 펄라이트 바이오필터를 설정하였다. 접종원은 실시예 1-7에 개시된 방법으로 펄라이트 바이오필터의 바탕물질로부터 제조되었다. 합성 가스(공기와 메탄)를 분당 250 내지 500㎖의 유속(시간 당 3 내지 6의 공간속도)으로 바이오필터의 하단으로 연속적으로 도입하였다. 메탄 유입 농도는 20,000 내지 140,000 ppm을 유지하였다. 변형된 NMS 배지를 사용하여, 토버몰라이트 바이오필터와 펄라이트 바이오필터를 각각 174일 및 204일 동안 20 ± 5℃의 조건에서 운영하였다. 운영하는 동안, 배지를 하루에 4회 순환시켰고, 매주 교체하였다.
실시예 1-9: 메탄영양세균의 담체로서 토버몰라이트의 잠재성
토버몰라이트를 수돗물로 세척하였다. 토버몰라이트를 160일 동안 장기 운영된 바이오필터에서 수집하였다. 그들을 실내에서 일주일 동안 건조하였다. 토양을 매립커버(경기도 가평군)에서 수집하였다. 토양을 건조시키고, 2mm 메쉬에 통과시켰다. 토양 80g과 토버몰라이트 20g을 혼합하고, 토양의 수분함량을 20%로 조정하였으며, 600㎖ 혈청 병에 위치시켰다. 혈청 병을 부틸 고무 마개로 봉인하고, 메탄을 최종농도 100,000 ppm이 되도록 주입하였다. 그들을 상온에서 방치하였다. 상단부의 메탄농도를 시간의 경과에 따라 가스 크로마토그래피를 사용하여 모니터하였다. 세가지로 처리하였다: i) 토양단독; ii) 토양과 토버몰라이트; 및 iii) 토양과 메탄영양세균이 배양된 토버몰라이트. 각 시료마다 5회 반복실험을 수행하였다.
실시예 2: 결과분석
실시예 2-1: 메탄영양세균의 담체로서 토버몰라이트의 잠재성
토양의 메탄산화를 촉진하기 위하여 메탄영양세균이 고정화된 토버몰라이트를 토양에 도입하였다. 토양을 단독으로 사용한 경우에는 메탄산화가 수행되지 않았고, 토버몰라이트가 도입된 토양에서는 미세한 산화가 수행되었다(도 3). 토버몰라이트에 고정화된 메탄영양세균이 적용된 경우에는 토양에서 105시간 이내에 메탄이 완전히 소비되었다. 상기 결과는 토양 환경 및 엔지니어링 시스템에서 메탄영양세균을 적용하기 위한 메탄영양세균을 만들기 위한 토버몰라이트의 유망한 잠재성을 나타낸다.
실시예 2-2: 단기적으로 운영된 토버몰라이트 바이오필터와 펄라이트 바이오필터의 메탄영양세균 수행의 비교
두개의 동일한 바이오필터를 설정하고, 토버몰라이트와 펄라이트를 충진물질로서 사용하였다.
토버몰라이트와 펄라이트의 물리화학적 특성
특성 토버몰라이트 펄라이트
Water holding capacity (%)
pH
Bulk density (g/㎤)
Particle density (g/㎤)
Porosity (%)
Surface area (㎡/g)
Intrusion volume (mL/g)		 109.5 ± 5.1
7.0 ± 0.1
0.276 ± 0.000
1.050 ± 0.022
73.7 ± 0.6
122.0
0.7638 		64.6 ± 12.4
6.0 ± 0.0
0.470 ± 0.002
1.248 ± 0.048
62.3 ± 1.4
27.0
1.2868
토버몰라이트의 표면적은 펄라이트의 표면적보다 4-5 배 이상이고, illite 및 montmorillonite와 같은 점토 광물의 표면적과 유사하였다. 도 3은 토버몰라이트 바이오필터와 펄라이트 바이오필터의 메탄 제거 효율(RE)을 나타낸다. 메탄 제거효율은 두가지 바이오필터에서 모두 7일 이후 안정되었다. 메탄제거용량(EC)이 유입부하와 함께 표시되었다(도 4). 데이터 분석을 위해, 최초의 7일 동안의 결과를 제외하였다. 토버몰라이트 바이오필터와 펄라이트 바이오필터에 각각 133.7 ± 26.6 g/㎥h 및 114.3 ± 26.6 g/㎥h의 메탄을 가하였을 때, EC는 각각 73.7 ± 17.4 g/㎥h 및 52.5 ± 13.3 g/㎥h이었다. 메탄제거 용량(EC)는 메탄의 부하량에 따라 증가하였다. 메탄 제거 효율(RE)에 해당하는 경사값은 토버몰라이트 바이오필터와 펄라이트 바이오필터에 대하여 각각 0.54(54%) 및 0.44(44%)로 산출되었다. 즉, 토버몰라이트 바이오필터가 펄라이트 바이오필터보다 보다 효율적으로 메탄을 제거할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2-3: 단기적으로 운영된 토버몰라이트 바이오필터와 펄라이트 바이오필터의 세균 군집 의 비교
416-424bp의 평균길이를 가지는 총 6개의 pyrosequencing 라이브러리를 필터링단계 이후에 수득하였다(표 2).
pyrosequencing 라이브러리의 서열수 및 평균 길이
시료 N length
The first run of biofilter 토버몰라이트 (0 W)
토버몰라이트 (10 W)
토버몰라이트 (50 W)
펄라이트 (0 W)
펄라이트 (10 W)
펄라이트 (50 W)		 14,051
6,970
8,943
1,793
1,242
1,377		 423.8
423.9
424.2
420.0
421.2
416.2
The second run of biofilter 접종원-1
접종원-2
14-1일
14-2일
21-1일
21-2일		 310
477
599
796
696
136		 418.8
418.2
423.9
423.8
425.5
424.7
모든 서열은 속의 수준에서 개별적으로 규명되었다(도 5). Methylosarcina 속 균주는 토버몰라이트 바이오 필터에 가장 풍부하여 82.6%(50 W)에 이르고, 그 다음으로, Pseudoxanthomonas 속 균주(7%), Flavobacterium 속 균주(4%) 및 Hyphomicrobium 속 균주(4%)의 순서로 풍부하였다. 대조적으로, Aquimonas 속 균주(23%), Pseudoxanthomonas 속 균주(21%), Hyphomicrobium 속 균주(20%), Flavobacterium 속 균주(9%) 및 Bacillus 속 균주(4%)가 풍부하고, 메탄영양세균은 펄라이트 바이오 필터에서 7.7% (0 W)을 구성하였다. 토버몰라이트 바이오필터에서는 Methylosarcina 속 균주가 단독적인 메탄영양세균으로서 발견되었으나, 펄라이트 바이오필터에서는 Methylococcus 속 균주(군집체의 0.17%), Methylocystis 속 균주(1.63%), Methylosarcina 속 균주(3.4%) 및 Methylosinus 속 균주(0.13%)와 같은 4가지 메탄영양세균 속 미생물이 존재하였다. Methylosarcina 속 균주는 두가지 바이오필터 모두에서 가장 풍부하였다. 일반적으로, 메탄영양세균은 생리적 특성과 계통학적 소속에 따라 I형 및 II형의 두가지 유형으로 구분된다. 모든 관찰된 메탄영양세균의 속은 Methylocysitis 속 균주를 제외하고는 I형에 속하였다. 두 가지 바이오필터는 I형 미생물이 우점종으로 존재하였다. 종래의 연구결과에 의하면, II형 메탄영양세균은 메탄영양세균 바이오필터 및 바이오필름에서 I형 메탄영양세균 보다도 더욱 풍부함이 관찰되었다.
일반적으로, 초음파는 하층으로부터 세포와 바이오필름을 분리하는 데 사용되었다. 초음파 입력 전력이 증가함에 따라, 토버몰라이트에서 메탄영양세균의 비율은 72.0%에서 82.6%로 증가하였으나, 펄라이트에서는 7.7%에서 4.1%로 감소하였다(도 6). 상기 결과는 메탄영양세균이 펄라이트 보다는 토버몰라이트에 더욱 단단히 고정되어 있음을 보여준다.
실시예 2-4: 토버몰라이트 바이오필터에서 미생물 군체 구성의 시간적 변화
토버몰라이트가 메탄영양세균용 선택적 담체로 활용됨 수 있음을 재확인하기 위해, 토버몰라이트 바이오필터 실험을 동일한 조건에서 반복하였다. 상기 실시예 2-7에 개시된 바와 같이, 사용된 접종원은 펄라이트 바이오필터로부터 수득하였다. 도 7에서 보듯이, RE 및 EC 결과는 단기적으로 운영 바이오필터의 것과 유사하였다. 메탄 RE는 3일 후 안정화 되었다. 데이터 분석을 위해, 처음 3 일간 결과는 제외하였다. 144.1 ± 31.5 g/㎥h의 메탄을 가하였을 때, EC는 62.1 ± 20.7 g/㎥h이었다.
418-426 bp의 평균길이를 가지는 총 6개의 pyrosequencing 라이브러리를 필터링단계 이후에 수득하였다(표 2). 서열은 속의 수준에서 개별적으로 규명되었다(도 8). Methylocystis 속 균주, Methylosarcina 속 균주 및 Methylocaldum 속 균주를 포함하는 메탄영양세균이 바이오필터에서 관찰되었다. 메탄영양세균은 시간의 경과에 따라 크게 증가하였다(도 9). Leptonema 속 균주, Ignavibacterium 속 균주, Flavobacterium 속 균주, Hyphomicrobium 속 균주, Acidobacteria 속 균주, Proteiniphilum 속 균주, Nannocystis 속 균주 및 Bacillus 속 균주와 같은 비-메탄영양세균이 접종원에 풍부한 반면, 메탄영양세균은 1% 미만으로 존재하였다. 메탄영양세균은 14일이 경과된 시점에서 세균 군집의 78.6%에 달하였고, Methylosarcina 속 균주(총 세균 군집의 76.8%), Methylocaldum 속 균주(1.2%) 및 Methylocystis 속 균주(0.7%)를 포함하였다. Methylophilus 속 균주(8.8%) 및 Hyphomicrobium 속 균주(5.4%) 등의 메틸영양세균(단일 탄소 분해자)이 관찰되었다. 메탄영양세균은 21일이 경과된 시점에서 세균 군집의 93.5%에 달하였고, Methylosarcina 속 균주(세균 군집의 48.1%) 및 Methylocaldum 속 균주(45.5%)를 포함하였다.
우리의 지식의 가장 좋은 것이 되도록, 이는 메탄영양세균 바이오 필터 시스템에서 메탄영양세균의 성장(총 세균의 93% 이상)을 위한 가장 높은 수준의 선택도를 갖는다(총 박테리아의 93% 이상). 이러한 결과는 토버모라이트 담체에서 메탄영양세균만이 선택적으로 성장 가능하여 총 세균의 93%까지 메탄영양세균으로 우점화시킬 수 있으므로 토버모라이트는 메탄영양세균에 대한 선택성이 매우 우수한 담체임을 의미한다.
실시예 2-5: 토버몰라이트와 펄라이트 biofilters 의 장기적인 운영
도 10은 장기적으로 운영된 토버몰라이트 바이오필터와 펄라이트 바이오필터에서 메탄 가스의 제거 효율(RE)을 나타낸다. RE값은 토버몰라이트 바이오필터를 운영하면서 최초 120일 동안 시간의 경과에 따라 증가하였다. 체류시간이 20분인 조건에서 메탄 RE가 거의 100%에 도달한 이후에는, 가스체류시간을 단축하는 방법으로 메탄 부하량을 단계적으로 증가시켰다. 가스체류시간을 15분으로 단축시킨 초기에는 메탄 제거효율이 낮았으나 몇 일 후에는 메탄제거효율이 거의 100%로 증가하였다. 가스체류시간을 10분으로 단축시킨 경우에는 메탄 RE가 약 80%까지 증가하였다. 토버몰라이트 바이오필터에서 메탄 RE의 최대 수준은 357.8g/㎥h(8,592g/㎥d에 상응하는 값)이었다(도 11).
한편, 펄라이트 바이오필터에서 가스체류시간이 20분이 조건에서 RE 값은 150일 동안 40-50%로 유지되었다. RE 값이 60%에 도달하는 150일 경에, 가스체류시간을 15분으로 단축하여 운전한 결과, 메탄 RE 값은 50% 이었다. 최대 메탄 제거 용량은 체류시간 20분과 15분 조건에서 각각 66.3 ± 3.4 및 151.4 ± 2.0g/㎥h이었다. 펄라이트 바이오필터에서 메탄 RE의 최대 수준은 151.4g/㎥h(3,633g/㎥d에 상응하는 값)이었다. 이와같이 바이오필터를 장기간동안 운영할 때, 펄라이트 바이오필터 보다는 토버몰라이트 바이오필터를 사용하는 경우에 메탄제거 효과가 더욱 우수함이 입증되었다.
다양한 담체를 사용한 바이오필터의 메탄제거용량 비교
담체 운영조건 공간속도 최대제거용량
(g/㎥d)		 효율 참고자료
토버몰라이트
펄라이트
펄라이트+활성탄
퇴비
퇴비+토탄+목재섬유
다중층
무기성 gavel+stone
퇴비화된 소나무피+펄라이트
무기성 물질
숙성 퇴비
무기성 석재
다공성 진흙
암석물질(5 mm)
암석물질(2 mm)
토양+지렁이 캐스트
퇴비
퇴비+토탄+목재섬유
퇴비
목재칩+퇴비
펄라이트+퇴비		 실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
실험실용
산업용
산업용
산업용
산업용
산업용		 6
4
3
4.7
4.7
4.7
14.4
0.3
14
14
14
14.6
14.6
14.6
11.8
6.3
6.3
<0.516
<0.516
0.8-8.6		 8,587
3,634
2,544
1,488
960
720
1,440
137
701
300
1,073
408
912
1,200
6,818
960
480
672
576
216		 74%
51%
83%
N/A
N/A
N/A
66%
60%
41%
19%
60%
19%
42%
56%
68%
N/A
N/A
100%
100%
N/A		 본 발명
본 발명
공개안됨
Ref. 1
Ref. 1
Ref. 1
Ref. 2
Ref. 3
Ref. 4
Ref. 4
Ref. 5
Ref. 6
Ref. 6
Ref. 6
Ref. 7
Ref. 1
Ref. 1
Ref. 8
Ref. 8
Ref. 9
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공지된 다양한 종류의 담체를 이용한 바이오필터 메탄제거용량과 본 발명의 토버몰라이트 바이오필터의 메탄제거용량을 보고해 보면, 토버몰라이트 바이오필터는 보고된 값에 비해 더 큰 메탄 제거 용량을 나타낸다. 즉, 상기 결과는 토버몰라이트를 담체로 이용하면 메탄제거 효과가 매우 높음을 의미한다.
막힘현상(Clogging)은 대부분 미생물의 과증식에 의해 유발되고, 바탕압력이 저하되어 운영비용이 증가하고 효율이 감소되는 결과를 나타낸다. 15일경에, 펄라이트 바이오필터용 컬럼에서 바이오필름의 생성을 확인하였다. 펄라이트 바이오필터에서는 막힘현상과 채널링 문제를 야기하는 과대 성장한 바이오매스를 제거하기 위하여 35일 및 110일경에 충진물질을 세척하였다. 그러나, 장기적으로 운영하는 동안 토버몰라이트 바이오필터에서는 막힘현상과 채널링 문제가 나타나지 않았다. 이는 토버몰라이트가 운영 관리의 관점에서 메탄제거용 최고의 담체임을 시사한다.
상기 실시예 2의 결과를 종합하면, 필터 담체에 목적하는 미생물의 선택적 성장은 쉬운 사용과 관리와 같은 많은 장점을 제공한다. 본 발명에서 토버몰라이트와 펄라이트는 메탄제거용 필터 담체로 사용되었다. 토버몰라이트 바이오 필터는 펄라이트 바이오필터보다 우수한 메탄제거 효율을 나타내었다. Pyrosequencing 결과는 메탄영양세균이 토버몰라이트에서 우점종인 반면 펄라이트에서는 일부에 불과함을 보여주었다. 반복적인 바이오필터 실험에 의하여, 메탄영양세균은 토버몰라이트에서 93.5%를 차지함을 확인하였다. 시간의 경과에 따라 관찰한 결과는 토버몰라이트에서 메탄영양세균이 선택적으로 성장하였음을 나타낸다. 따라서, 토버몰라이트는 메탄영양세균의 선택적 성장을 위한 최적의 서식지를 제공한다. 상기 결과는 토버몰라이트가 메탄영양세균의 효과 및 서식지의 관점에서 유망한 바이오필터 담체임을 보여주었다.
실시예 3: 바이오커버 시스템
토버몰라이트를 주요 충전재로 한 기능성 바이오커버에 의한 메탄 제거 특성을 규명하기 위하여, 실험실 규모의 바이오커버를 제작하였다. 실험실 규모 바이오커버는 아크릴 컬럼을 이용하여 제작하였으며, 상세한 장치의 구성도는 그림 1에 도시하였다. 바이오커버는 지름 8 cm, 높이 50cm의 충전부와 지름 8 cm, 높이 15 cm의 환기부, 그리고 지름 8 cm, 높이 5 cm의 가스 주입부로 구성되었다. 충전재는 가평 매립지 토양과 지렁이 분변토, 토버몰라이트를 0.25:0.25:0.5(w/w/w)로 잘 혼합한 후 바이오필터충전부에 채워 넣었다.
바이오커버 하단의 가스 주입부는 유입되는 가스가 바이오커버충전층으로 균일하게 공급되도록 난석(직경 4-8 mm)으로 채워 주었다. 메탄/이산화탄소(40:60% (v/v), Seoul special gas, Korea) 가스를 5 mL/min의 속도로, 바이오커버가 건조되는 것을 방지하기 위해 가스를 가습기(humidifier)를 통과시킨 후 바이오커버에 공급하였다. 바이오커버 상단 환기부는 공기를 20 ml/min의 유량으로 계속적으로 주입하여 매립지 토양과 접해 있는 대기 상태를 모사하였다. 상기 바이오커버는 134일 동안 상온(30±5℃)에서 운영하였고, 상기 바이오커버를 운영하는 동안 1~2일마다 한번씩 바이오커버 입구와 출구의 샘플링 포트로부터 500㎕ 가스 밀폐형 ㅅ주사기를 이용하여 300㎕의 시료를 채취하고, 상기 시료를 대상으로 GC-FID로 각각의 가스 농도를 분석하여, 입구와 출구농도 차이로부터 각 가스의 제거율을 산출하였다. 또한, 바이오커버의 깊이에 따른 가스 profile을 모니터링하기 위하여 O2 및 N2, CH4 및 CO2의 농도를 열전도도 검출기(thermal conductivity detector, TCD)를 장착한 GC로 분석하였다(도 13 및 도 14).
토버몰라이트를 주요 충전재로 한 실험실 규모의 바이오커버에 40% 메탄과 60% CO2(v/v)의 혼합가스를 5 ml/min의 속도로 공급한 경우, 시간에 따라 바이오커버의 유입구(inlet)와 유출구(outlet)에서 검출된 메탄 농도를 도 13에 도시하였다. 운전 초기에는 60% 미만의 메탄 분해 효율을 보였지만, 시간이 지남에 따라 효율이 올라가 안정화된 이후로(30일 이후) 평균 73±5%의 메탄 제거 효율을 나타내었다. 이 때의 메탄 제거 용량은 228.7 내지 291.4 g/㎡d이었다.
또한, 바이오커버의 운전 경과에 따른 25일 및 52, 100, 134일의 gas profile을 도 14에 도시하였다. 초기 안정화 기간인 25일과 비교하여, 안정적으로 메탄 제거가 유지되는 52, 100, 134일의 산소와 질소는 더 깊이 공급되고 있으며 메탄과 이산화탄소의 profile도 일정하게 유지되고 있음을 확인하였다. 또한 높이 30~50 cm에서 메탄의 농도가 급격히 감소하므로, 이 구간에서의 메탄 제거가 가장 활발히 일어나고 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 토버몰라이트를 주요 충진재로 한 바이오커버의 메탄 제거 능력은 고효율에서 안정적으로 운전 및 유지됨을 확인할 수 있었다.
<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation <120> Immobilized carrier for Methanotrophs and method for removing methane employing the same <130> PA120253/KR <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag nnnnnnnnnn tcctacggga ggcagcag 58 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag gactachvgg gtatctaatc c 51

Claims (9)

  1. 메탄영양세균이 고정된 토버몰라이트를 포함하는 메탄 제거용 담체로서,
    상기 메탄영양세균은 메틸로사르시나(Methylosarcina) 속 미생물, 메틸로칼듐(Methylocaldum) 속 미생물 또는 이들의 조합인 것인 담체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 담체를 포함하는 바이오필터.
  5. 제4항의 바이오필터를 포함하는 바이오커버.
  6. 제4항의 바이오필터 또는 제5항의 바이오커버를 메탄이 존재하는 장소에 설치하는 단계를 포함하는 메탄의 제거방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 메탄이 존재하는 장소는 매립지인 것인 방법.
  8. 제1항의 담체를 포함하는 메탄영양세균의 선택적 배양용 배지.
  9. 제8항의 배지에 메탄영양세균을 접종하고, 메탄을 공급하면서 배양하는 단계를 포함하는 메탄영양세균을 선택적으로 배양하는 방법.

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