KR101518121B1 - 자발적 구조 변환에 의한 자극반응성을 지닌 이방성 단백질 나노구조체 및 이의 제조방법 - Google Patents
자발적 구조 변환에 의한 자극반응성을 지닌 이방성 단백질 나노구조체 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101518121B1 KR101518121B1 KR1020130078141A KR20130078141A KR101518121B1 KR 101518121 B1 KR101518121 B1 KR 101518121B1 KR 1020130078141 A KR1020130078141 A KR 1020130078141A KR 20130078141 A KR20130078141 A KR 20130078141A KR 101518121 B1 KR101518121 B1 KR 101518121B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gly
- protein
- val
- anisotropic
- block
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 41
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 title claims description 13
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 title abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 110
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 45
- 230000007794 irritation Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 22
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 claims description 84
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 43
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 claims description 32
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 19
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 19
- LFTRJWKKLPVMNE-RCBQFDQVSA-N 2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-1-[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O LFTRJWKKLPVMNE-RCBQFDQVSA-N 0.000 claims description 16
- 108010054022 valyl-prolyl-glycyl-valyl-glycine Proteins 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 9
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 claims description 9
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 9
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 8
- DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N methacrylic anhydride Chemical compound CC(=C)C(=O)OC(=O)C(C)=C DCUFMVPCXCSVNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims description 6
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 6
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 claims description 6
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000011888 foil Substances 0.000 claims description 4
- 239000003999 initiator Substances 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 3
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical class 0.000 claims 10
- RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N Gly-Val-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 4
- IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N Valylglycine Chemical compound CC(C)C(N)C(=O)NCC(O)=O IOUPEELXVYPCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000002085 irritant Substances 0.000 claims 2
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 claims 2
- GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GIAZPLMMQOERPN-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 claims 1
- 229920002959 polymer blend Polymers 0.000 claims 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 claims 1
- 229920000359 diblock copolymer Polymers 0.000 abstract description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 abstract 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 24
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 7
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 101150118343 ELP gene Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 3
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010556 emulsion polymerization method Methods 0.000 description 2
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000000717 platinum sputter deposition Methods 0.000 description 2
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 2
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013267 controlled drug release Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005232 molecular self-assembly Methods 0.000 description 1
- 239000002159 nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
- D01D—MECHANICAL METHODS OR APPARATUS IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS
- D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
- D01D5/0007—Electro-spinning
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D04—BRAIDING; LACE-MAKING; KNITTING; TRIMMINGS; NON-WOVEN FABRICS
- D04H—MAKING TEXTILE FABRICS, e.g. FROM FIBRES OR FILAMENTARY MATERIAL; FABRICS MADE BY SUCH PROCESSES OR APPARATUS, e.g. FELTS, NON-WOVEN FABRICS; COTTON-WOOL; WADDING ; NON-WOVEN FABRICS FROM STAPLE FIBRES, FILAMENTS OR YARNS, BONDED WITH AT LEAST ONE WEB-LIKE MATERIAL DURING THEIR CONSOLIDATION
- D04H1/00—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of staple fibres or like relatively short fibres
- D04H1/40—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of staple fibres or like relatively short fibres from fleeces or layers composed of fibres without existing or potential cohesive properties
- D04H1/42—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of staple fibres or like relatively short fibres from fleeces or layers composed of fibres without existing or potential cohesive properties characterised by the use of certain kinds of fibres insofar as this use has no preponderant influence on the consolidation of the fleece
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Textile Engineering (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 자발적 구조 변환에 의한 이방성 단백질 나노구조체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합(Chemical crosslinking)이 가능한 블록 및 을 포함하는 단일 중합체(Monoblock polymer) 단백질 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록 및 화학적 비가교 결합(Chemical uncrosslinking)이 가능한 블록을 포함하는 이중 공중합체(Diblock copolymer) 엘라스틴 폴리펩타이드(Elastin-like polypeptide, ELP)로부터 자발적 구조 변환을 이용하여 물리화학적으로 구획화를 유지하고 동시에 자극 반응성을 가진 이방성 단백질 나노입자 구조체를 제조하는 방법, 상기 제조 방법에 의해 제조된 이방성 단백질 나노구조체, 상기 이방성 단백질 나노구조체가 수용액 상에서 자발적 구조 변환된 이방성 나노입자 구조체 및 상기 이방성 단백질 나노구조체를 이용한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 이방성 단백질 나노구조체는 물리화학적으로 구획화를 유지하고 동시에 자극 반응성을 가지므로 약물전달체, 바이오 이미징, 바이오 센싱 및 바이오메디칼 나노디바이스에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 자발적 구조 변환에 의한 자극 반응성을 가진 이방성 단백질 나노구조체, 이의 제조방법, 및 상기 나노구조체의 용도에 관한 것이다.
마이크로 및 나노 크기의 구획을 가지는 이방성 구조체는 스마트한 약물 전달 시스템 및 분자 이미징과 같은 다양한 생물 의학의 적용에서 매우 관심을 받고 있다. 별개의 다중 구획 및 조절된 모양을 가지는 이방성 구조체의 제작은 각 구획 내로 독특한 물리적 및 화학적 특성을 제공하고 그것의 표면에 선택적인 생기능화를 제공하여, 조절되는 약물 방출 시스템, 선택적인 세포 이미징 프로브 및 입자를 기초로 하는 진단에 유용하다. 특히, 치료 약제 또는 금 나노크리스탈, 자철석 또는 이산화티타늄을 포함하는 무기물의 나노소재의 각 구획으로의 통합은 진보된 입자를 기초로 하는 진단을 위한 강한 도구를 제공하고, 환경적 반응성은 전환이 가능한 표면으로 적용을 나타낸다.
나노구조체를 만드는 일반적인 방법은 크게 상향식(Bottom-up)과 하향식(Top-down)이 있다. 상향식(Bottom-up)은 한 개의 원자 또는 분자의 크기를 점점 늘려 수백 내지 수천 개의 입자로 구성되어 있는 나노구조체를 만드는 방식으로 화학적인 분자 자기조립 방법이다. 유화 중화(Emulsion polymerization) 방법과 자기조립(Self-assembly) 방식 등이 대표적이다. 특히 자기조립(Self-assembly) 방식으로 제조된 나노구조체는 재현성을 가지기 어렵고 부산물의 분리가 필요한 경우가 있어 대량생산에 한계가 있다. 하향식(Top-down)은 크기가 큰 재료를 작게 만드는 방식으로 밀링(Milling)이 대표적이며 기계적 분쇄 방법으로 대량생산이 가능하며 마이크론(Micron) 크기의 입자를 가공하는 것은 비교적 용이하다. 그러나, 100 nm 이하의 작은 입자를 만드는 데는 한계가 따른다. 나노구조체를 만드는 일반적인 방법인 유화중화법(Emulsion polymerization)과 밀링(Milling) 방법 등은 각각의 제조방식에 의해서 형태 및 크기를 조절에 한계가 있거나, 고분자 물질의 특성에 따라 적용에 한계가 있다.
최근에는 전기 수력학적 분사 및 공동분사 방법(Electrohydrodynamic jetting & co-jetting)을 이용하여 등방성(Isotropy) 및 이방성(Anisotropy) 나노구조체를 제작하고 있다. 이런 방법의 원리는 분사 용액에 고전압을 가할 때 정전기적인 반발력(Electrostatic repulsion)이 용액의 점도(Viscosity)를 능가하면 테일러콘(Taylor cone)이라 불리는 원추 형태를 형성하며 용액이 분사되어 수십 내지 수천 나노크기의 구조체를 제작할 수 있다. 이때 분사 용액의 점도(Viscosity), 표면 장력(Surface tension), 전도도(Conductivity), 인가 전압(Voltage), 용액의 토출속도(Flow rate) 및 전극간 거리(Distance)의 조절을 통하여 나노구조체의 직경 및 형태의 조절이 가능하다. 가장 주요한 인자(Parameter)는 고분자 용액의 점도(Viscosity)이며, 등방성 나노구조체의 경우에는 고점도에서 나노섬유(Nanofiber) 구조체, 저점도에서는 나노입자(Nanoparticle)를 간편하게 얻을 수 있다. 그러나, 이방성 나노입자 구조체 제작 시 가장 큰 한계점으로 각각의 고분자 용액이 저점도(Viscosity)가 균형을 이루어 테일러콘에서 두 고분자 용액의 경계가 명확하게 구분되어 공동분사가 이루어지기가 매우 어렵다.
현재까지 전기 수력학적 분사 및 공동분사 방법(Electrohydrodynamic jetting & co-jetting)을 이용한 등방성(Isotropy) 및 이방성(Anisotropy) 나노구조체는 합성 고분자(Synthetic polymers)를 이용하였으나, 생체고분자인 단백질 또는 폴리펩타이드들을 전기 수력학적 분사방법에 의해 등방성 나노입자를 제작한 연구 논문 및 특허들은 테일러콘(Taylor cone)이 매우 불안정해서 거의 없는 실정이다. 특히 생체고분자인 단백질 또는 폴리펩타이드들을 이용해서 공동분사 방법(Electrohydrodynamic jetting & co-jetting)에 의해 이방성(Anisotropy) 나노구조체를 제작한 논문 및 특허가 전무한 상태이다.
이에, 본 발명자들은 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합(Chemical crosslinking)이 가능한 블록을 포함하는 단일 중합체(Monoblock polymer) 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합(Chemical crosslinking)이 가능한 블록 및 화학적 비가교 결합(Chemical uncrosslinking)이 가능한 블록을 포함한 이중 공중합체(Diblock copolymer) 구조의 자극 반응성(Stimuli-responsiveness)을 지닌 엘라스틴 폴리펩타이드(Elastin-like polypeptides, ELPs)를 이용해서, 각각의 고분자 용액의 고점도(Viscosity)가 균형을 이루어 용이하게 물리적 및 화학적으로 구획화(Compartmentalization)된 자극 반응성을 지닌 이방성 단백질 나노섬유 구조체(Anisotropic polypeptide nanofiber structures)를 제작하였다. 또한 수용액 상(Aqueous conditions)에서 화학적 비가교 결합(Chemical uncrosslinking)된 블록의 재용해(Resolubilization)에 의한 자발적 구조 변환(Spontaneous structure transformation)으로 물리적 및 화학적으로 구획화(Compartmentalization)를 유지하고 동시에 자극 반응성을 지닌 이방성 단백질 나노입자 구조체를 제조함으로써, 약물 전달체 시스템, 바이오 센싱, 바이오 이미징 및 바이오메디칼 나노디바이스 개발에 유용하게 사용될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
Roh, K. H.; Martin, D. C.; Lahann, J., Biphasic Janus particles with nanoscale anisotropy. Nat Mater 2005, 4 (10), 759-63.
Hwang, S.; Roh, K. H.; Lim, D. W.; Wang, G.; Uher, C.; Lahann, J., Anisotropic hybrid particles based on electrohydrodynamic co-jetting of nanoparticle suspensions. Phys Chem Chem Phys 2010, 12 (38), 11894-9.
Lim, D. W.; Hwang, S.; Uzun, O.; Stellacci, F.; Lahann, J., Compartmentalization of Gold Nanocrystals in Polymer Microparticles using Electrohydrodynamic Co-Jetting. Macromol Rapid Comm 2010, 31 (2), 176-182.
Kim, O.; Na, K.; Lee, J.; Jung, J.; Kim, D.; Park, S.; Yun, K.; Hyun, J., Polystyrene microbeads modified with an elastin-like biopolymer for stimuli-responsive immunodetection. J Biomat Sci-Polym E 2008, 19 (7), 863-873.
Lim, D. W.; Nettles, D. L.; Setton, L. A.; Chilkoti, A., Rapid cross-linking of elastin-like polypeptides with (hydroxymethyl)phosphines in aqueous solution. Biomacromolecules 2007, 8 (5), 1463-70.
Lim, D. W.; Trabbic-Carlson, K.; Mackay, J. A.; Chilkoti, A., Improved non-chromatographic purification of a recombinant protein by cationic elastin-like polypeptides. Biomacromolecules 2007, 8 (5), 1417-24.
Lim, D. W.; Nettles, D. L.; Setton, L. A.; Chilkoti, A., In situ cross-linking of elastin-like polypeptide block copolymers for tissue repair. Biomacromolecules 2008, 9 (1), 222-30.
Nagapudi, K.; Brinkman, W. T.; Leisen, J. E.; Huang, L.; McMillan, R. A.; Apkarian, R. P.; Conticello, V. P.; Chaikof, E. L., Photomediated solid-state cross-linking of an elastin-mimetic recombinant protein polymer. Macromolecules 2002, 35 (5), 1730-1737.
본 발명의 목적은 물리화학적으로 구획화된 자극 반응성을 지닌 이방성 단백질 나노섬유 구조체(Anisotropic polypeptide nanofiber structures) 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자발적 구조 변환에 의한 물리화학적으로 구획화된 자극 반응성을 지닌 이방성 단백질 나노입자 구조체(Anisotropic polypeptide nanoparticle structures) 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또 다른 목적은 본 발명에 따른 이방성 단백질 나노구조체를 이용한 의학적 또는 생물학적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록을 포함하는 단일 중합체(Monoblock polymer) 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록 및 화학적 비가교 결합이 가능한 블록으로 구성된 이중 공중합체(Diblock copolymer) 단백질을 아크릴화 반응시켜 분자적으로 변형시킨 후 정제하는 단계;
2) 단계 1)에서 변형된 단일 중합체 또는 이중 공중합체 단백질을 전기 수력학적 공동분사(Electrohydrodynamic co-jetting) 방법을 통해 이방성 나노섬유의 형태로 제조하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 제조된 단백질에 대해 화학적으로 가교 결합이 가능한 블록을 자외선을 조사하여 가교 결합을 형성시키는 단계를 포함하는, 이방성 단백질 나노섬유 구조체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이방성 단백질 나노섬유 구조체를 수용액 상태에서 자발적 구조 변환(Spontaneous Structure Transformation)시키는 단계를 포함하는 이방성 단백질 나노입자 구조체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일 중합체 또는 이중 공중합체 단백질을 아크릴화 반응시켜 분자적으로 변형한 단백질로 이루어진 이방성 단백질 나노섬유 구조체로서, 이방성의 구획화(Compartmentalization)를 유지하고 동시에 자극 반응성을 가진 이방성 단백질 나노섬유 구조체를 제공한다.
또한, 상기 단일 중합체 또는 이중 공중합체 단백질을 아크릴화 반응시켜 분자적으로 변형한 단백질로 이루어진 이방성 단백질 나노섬유 구조체가 수용액 상태에서 자발적 구조 변환된 이방성 단백질 나노섬유 구조체로서, 이방성의 구획화를 유지하고 동시에 자극 반응성을 가진 이방성 단백질 나노입자 구조체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 나노입자 구조체를 포함하는 약물 전달용 의약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 나노입자 구조체를 포함하는 조영제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 나노입자 구조체를 포함하는 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 나노입자 구조체를 포함하는 센서를 제공한다.
본 발명은 수용액 상에서 화학적 비가교 결합(Chemical uncrosslinking)된 블록의 재용해(Resolubilization)에 의한 자발적 구조 변환(Spontaneous structure transformation)으로 물리적 및 화학적으로 구획화(Compartmentalization)를 유지하고 동시에 자극 반응성을 지닌 이방성 단백질 나노구조체를 제조하는 방법을 확립한 것이다.
특히, 고분자 재료의 종류에 상관없이 전기유체역학적 공동분사 방법을 통하여 다기능성 나노입자를 만들 경우, 2가지 이상성 고분자용액의 저점도 상에서 균형을 맞추기 어려우나, 다기능성 나노섬유를 제조하는 경우에는 2가지 이상성 고분자용액의 고점도로 인하여 용이하게 균형을 맞출 수 있다는 장점을 갖고 있으므로, 본 발명은 높은 점도로 인하여 비교적 제조가 용이한 다기능성 나노섬유를 제조하고, 수용액상에서 자발적인 구조 변환을 통해서 다기능성 나노입자를 제조하는 방법을 확립한 것이다.
본 발명에 따라 제조된 이방성 단백질 나노구조체는 수용액 상에서 열 반응성 등의 자극 반응성에 의해 가역적으로 팽창 및 수축하므로 스마트한 약물 전달체 시스템, 바이오 센싱, 바이오 이미징 및 바이오메디칼 나노디바이스의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 단일 중합체 및 이중 공중합체 ELP의 아미노산 서열 구조를 나타내는 그림이다. 상기 ELP 유전자는 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly 반복을 암호화하고, 여기서 Xaa는 Pro을 제외한 임의의 아미노산이다. 본 발명에 사용된 각각의 ELP 분자는 총 600, 800개의 아미노산 중에서 8개의 라이신기를 포함한다.
도 2는 이중 공중합체 ELP의 역 전이 온도의 특성을 나타내는 그래프이다. 350 nm의 흡광도에서 나타낸 탁도 프로파일은 다양한 농도(25, 50, 및 100 uM)로 1℃/min의 비율에서 PBS에서 ELP 용액을 가열함에 의해 획득한 결과이다.
도 3은 메타크릴레이트로 변환된 단일 중합체 또는 이중 공중합체 ELP의 합성 구조를 나타내는 그림이다. 도 3a는 화학적으로 가교 결합된 ELP의 라이신 잔기와 메타크릴 무수물의 화학적 반응을 나타내는 그림이다. 도 3b는 단일 중합체 ELP, 변형된 단일 중합체 ELP, 이중 공중합체 ELP 및 변형된 이중 공중합체 ELP의 SDS-PAGE 이미지를 나타내는 그림이다.
도 4는 실온에서 D2O에서의 이중 공중합체 ELP 및 변형된 이중 공중합체 ELP의 1H NMR 스펙트럼을 각각 나타내는 그림이다. (a)는 이중 공중합체 ELP의 1H NMR 스펙트럼이다. (b)는 변형된 이중 공중합체 ELP의 1H NMR 스펙트럼이다. (c)는 2.8 및 3.4 ppm 사이에서 이중 공중합체 ELP와 변형된 이중 공중합체 ELP의 1H NMR 스펙트럼이다. (d)는 5.6 및 6.1 ppm 사이에서 이중 공중합체 ELP와 변형된 이중 공중합체 ELP의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 5는 이중 공중합체 ELP 및 변형된 이중 공중합체 ELP의 역 전이 특성을 나타내는 그래프이다. 이들의 전이 온도는 pH 7.4에서 10 mM 인산완충식염수에서 50 uM 농도의 각 단백질로부터 측정한 결과이다.
도 6은 전기 수력학적 공동분사 방법을 통하여 단백질 나노섬유 구조체를 제작하는 공정을 나타내는 그림이다. 상기 전기 수력학적 공동분사는 이방성으로 구획화된 구조를 가진 조절되는 입자 또는 섬유를 만들기 위해 유체를 촉진시키는 방법이다.
도 7은 전기 수력학적 공동분사 방법을 통해 제작된 이방성 ELP 나노섬유를 두 변형된 ELP 용액(16 w/v%)과 다른 형광 염색제(FITC-conjugated ELPs 및 Nile red)를 이용한 공초점레이저주사현미경(CLSM) 및 주사전자현미경(SEM) 이미지를 나타내는 그림이다.
A) 5,000 배율의 SEM 이미지;
B) 10,000 배율의 SEM 이미지;
C) bright-field 채널로 관찰한 CLSM 이미지;
D) FITC 형광 염색제에 대한 CLSM 이미지;
E) Nile red 형광 염색제에 대한 CLSM 이미지; 및
F) 두 가지 채널을 하나로 통합한 FITC-Nile red에 대한 CLSM 이미지.
도 8은 이중 공중합체 ELP 나노섬유가 수용액 상에서 인큐베이트될 때 화학적 비가교결합된 블록의 재용해에 의한 자발적 구조변환되는 메커니즘을 나타내는 그림이다.
도 9는 이방성 ELP 나노섬유가 PBS에서 인큐베이트될 때 가교결합을 형성하지 못한 구역을 기준으로 분열하여 이방성 ELP 나노섬유의 형태에서 이방성 ELP 나노입자의 형태로의 변화를 공초점레이저주사현미경(CLSM)에 의한 이미지를 나타내는 그림이다.
A) FITC 형광 염색제에 대한 CLSM 이미지;
B) Nile red 형광 염색제에 대한 CLSM 이미지; 및
C) 두 가지 채널을 하나로 통합한 FITC-Nile red에 대한 CLSM 이미지.
도 10은 이방성 ELP 나노섬유가 PBS에서 인큐베이트될 때 가교 결합을 형성하지 못한 구역을 기준으로 분열하여 이방성 ELP 나노섬유의 형태에서 이방성 ELP 나노입자의 형태로의 변화를 주사전자현미경(SEM)에 의한 이미지를 나타내는 그림이다.
A) 7,000 배율의 SEM 이미지; 및
B) 20,000 배율의 SEM 이미지.
도 11은 팽윤 상태(0.01M PBS, pH 7.4)에서 열 작동을 갖는 이방성 ELP 나노입자의 공초점레이저주사현미경(CLSM)의 이미지를 나타내는 그림이다.
A) 20℃에서 bright-field 채널로 관찰한 CLSM 이미지;
B) 25℃에서 bright-field 채널로 관찰한 CLSM 이미지;
C) 30℃에서 bright-field 채널로 관찰한 CLSM 이미지; 및
D) 35℃에서 bright-field 채널로 관찰한 CLSM 이미지.
도 12는 서로 다른 분자량과 블록 구조로 이루어진 ELP를 통해 제조한 나노섬유와 PBS에서 인큐베이트 될 때, 자발적으로 변형된 나노입자의 주사전자현미경(SEM) 및 공초점레이저주사현미경(CLSM) 이미지이다.
A) 단일 중합체 ELP로 제조된 나노섬유의 SEM 이미지;
B) 단일 중합체 ELP로 제조된 나노섬유의 CLSM 이미지;
C) 단일 중합체 ELP로 나노섬유에서 분열한 입자의 SEM 이미지;
D) 단일 중합체 ELP로 나노섬유에서 분열한 입자의 SEM 이미지;
E) 이중 공중합체 ELP로 제조된 나노섬유의 SEM 이미지;
F) 이중 공중합체 ELP로 제조된 나노섬유의 CLSM 이미지;
G) 이중 공중합체 ELP로 나노섬유에서 분열한 입자의 SEM 이미지; 및
H) 이중 공중합체 ELP로 나노섬유에서 분열한 입자의 CLSM 이미지.
도 2는 이중 공중합체 ELP의 역 전이 온도의 특성을 나타내는 그래프이다. 350 nm의 흡광도에서 나타낸 탁도 프로파일은 다양한 농도(25, 50, 및 100 uM)로 1℃/min의 비율에서 PBS에서 ELP 용액을 가열함에 의해 획득한 결과이다.
도 3은 메타크릴레이트로 변환된 단일 중합체 또는 이중 공중합체 ELP의 합성 구조를 나타내는 그림이다. 도 3a는 화학적으로 가교 결합된 ELP의 라이신 잔기와 메타크릴 무수물의 화학적 반응을 나타내는 그림이다. 도 3b는 단일 중합체 ELP, 변형된 단일 중합체 ELP, 이중 공중합체 ELP 및 변형된 이중 공중합체 ELP의 SDS-PAGE 이미지를 나타내는 그림이다.
도 4는 실온에서 D2O에서의 이중 공중합체 ELP 및 변형된 이중 공중합체 ELP의 1H NMR 스펙트럼을 각각 나타내는 그림이다. (a)는 이중 공중합체 ELP의 1H NMR 스펙트럼이다. (b)는 변형된 이중 공중합체 ELP의 1H NMR 스펙트럼이다. (c)는 2.8 및 3.4 ppm 사이에서 이중 공중합체 ELP와 변형된 이중 공중합체 ELP의 1H NMR 스펙트럼이다. (d)는 5.6 및 6.1 ppm 사이에서 이중 공중합체 ELP와 변형된 이중 공중합체 ELP의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 5는 이중 공중합체 ELP 및 변형된 이중 공중합체 ELP의 역 전이 특성을 나타내는 그래프이다. 이들의 전이 온도는 pH 7.4에서 10 mM 인산완충식염수에서 50 uM 농도의 각 단백질로부터 측정한 결과이다.
도 6은 전기 수력학적 공동분사 방법을 통하여 단백질 나노섬유 구조체를 제작하는 공정을 나타내는 그림이다. 상기 전기 수력학적 공동분사는 이방성으로 구획화된 구조를 가진 조절되는 입자 또는 섬유를 만들기 위해 유체를 촉진시키는 방법이다.
도 7은 전기 수력학적 공동분사 방법을 통해 제작된 이방성 ELP 나노섬유를 두 변형된 ELP 용액(16 w/v%)과 다른 형광 염색제(FITC-conjugated ELPs 및 Nile red)를 이용한 공초점레이저주사현미경(CLSM) 및 주사전자현미경(SEM) 이미지를 나타내는 그림이다.
A) 5,000 배율의 SEM 이미지;
B) 10,000 배율의 SEM 이미지;
C) bright-field 채널로 관찰한 CLSM 이미지;
D) FITC 형광 염색제에 대한 CLSM 이미지;
E) Nile red 형광 염색제에 대한 CLSM 이미지; 및
F) 두 가지 채널을 하나로 통합한 FITC-Nile red에 대한 CLSM 이미지.
도 8은 이중 공중합체 ELP 나노섬유가 수용액 상에서 인큐베이트될 때 화학적 비가교결합된 블록의 재용해에 의한 자발적 구조변환되는 메커니즘을 나타내는 그림이다.
도 9는 이방성 ELP 나노섬유가 PBS에서 인큐베이트될 때 가교결합을 형성하지 못한 구역을 기준으로 분열하여 이방성 ELP 나노섬유의 형태에서 이방성 ELP 나노입자의 형태로의 변화를 공초점레이저주사현미경(CLSM)에 의한 이미지를 나타내는 그림이다.
A) FITC 형광 염색제에 대한 CLSM 이미지;
B) Nile red 형광 염색제에 대한 CLSM 이미지; 및
C) 두 가지 채널을 하나로 통합한 FITC-Nile red에 대한 CLSM 이미지.
도 10은 이방성 ELP 나노섬유가 PBS에서 인큐베이트될 때 가교 결합을 형성하지 못한 구역을 기준으로 분열하여 이방성 ELP 나노섬유의 형태에서 이방성 ELP 나노입자의 형태로의 변화를 주사전자현미경(SEM)에 의한 이미지를 나타내는 그림이다.
A) 7,000 배율의 SEM 이미지; 및
B) 20,000 배율의 SEM 이미지.
도 11은 팽윤 상태(0.01M PBS, pH 7.4)에서 열 작동을 갖는 이방성 ELP 나노입자의 공초점레이저주사현미경(CLSM)의 이미지를 나타내는 그림이다.
A) 20℃에서 bright-field 채널로 관찰한 CLSM 이미지;
B) 25℃에서 bright-field 채널로 관찰한 CLSM 이미지;
C) 30℃에서 bright-field 채널로 관찰한 CLSM 이미지; 및
D) 35℃에서 bright-field 채널로 관찰한 CLSM 이미지.
도 12는 서로 다른 분자량과 블록 구조로 이루어진 ELP를 통해 제조한 나노섬유와 PBS에서 인큐베이트 될 때, 자발적으로 변형된 나노입자의 주사전자현미경(SEM) 및 공초점레이저주사현미경(CLSM) 이미지이다.
A) 단일 중합체 ELP로 제조된 나노섬유의 SEM 이미지;
B) 단일 중합체 ELP로 제조된 나노섬유의 CLSM 이미지;
C) 단일 중합체 ELP로 나노섬유에서 분열한 입자의 SEM 이미지;
D) 단일 중합체 ELP로 나노섬유에서 분열한 입자의 SEM 이미지;
E) 이중 공중합체 ELP로 제조된 나노섬유의 SEM 이미지;
F) 이중 공중합체 ELP로 제조된 나노섬유의 CLSM 이미지;
G) 이중 공중합체 ELP로 나노섬유에서 분열한 입자의 SEM 이미지; 및
H) 이중 공중합체 ELP로 나노섬유에서 분열한 입자의 CLSM 이미지.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합(Chemical crosslinking)이 가능한 블록을 포함하는 단일 중합체 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록 및 화학적 비가교 결합(Chemical uncrosslinking)이 가능한 블록을 포함하는 이중 공중합체(Diblock copolymer) 단백질을 아크릴화 반응시켜 분자적으로 변형시킨 후 정제하는 단계;
2) 단계 1)에서 변형된 단일 중합체 또는 이중 공중합체 단백질을 전기 수력학적 공동분사(Electrohydrodynamic co-jetting) 방법을 통해 나노섬유의 형태로 제조하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 제조된 단백질에 대해 화학적으로 가교 결합이 가능한 블록을 자외선을 조사하여 가교 결합을 형성시키는 단계를 포함하는, 이방성 단백질 나노섬유 구조체의 제조 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 단일 중합체 또는 이중 공중합체 단백질은 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(elastin-like polypepyide, ELP)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 ELP는 V(Valine)-P(Proline)-G(Glycine)-V(Valine)-G(Glycine)의 아미노산 서열의 반복을 기본으로 하며, 15번의 반복 서열마다 4번째에 위치하는 V(Valine) 대신 K(Lysine)을 포함하는 단일블록을 기초로 하여, 단일블록만으로 이루어진 ELP분자와 추가적으로 K(Lysine)을 포함하지 않는 블록이 결합되어 이중블록으로 나누어져있는 ELP분자의 두 종류의 구조를 갖는다. 이를 통하여 자극 반응성을 지닌 화학적 가교결합(Chemical crosslinking)이 가능한 블록을 포함하는 단일 중합체(Monoblock polymer) 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교결합이 가능한 블록 및 화학적 비가교결합(Chemical uncrosslinking)이 가능한 블록을 포함하는 이중 공중합체(Diblock copolymer)의 구조를 갖는다(도 1).
단일 중합체 및 이중 공중합체 ELP의 각 분자는 자극 반응성을 지닌 화학적으로 가교 결합이 가능한 블록으로서 8회 반복의 ELP[(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]블록을 포함하며, 이중 공중합체의 경우 상기 자극 반응성을 지닌 화학적으로 가교 결합이 가능한 블록에 추가적으로 화학적으로 비가교 결합이 가능한 블록인 1회 반복의 ELP(Val-Pro-Gly-Val-Gly)40를 포함한다. 상기 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)] 블록에서, 주기적인 Lys(K) 잔기는 ELP[(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)] 블록 내에서 주기적으로 위치하여 부위를 화학적으로 가교 결합이 가능하게 한다.
상기 각각의 ELP[(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]8 또는 ELP[(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]8(Val-Pro-Gly-Val-Gly)40를 암호화하는 이중블럭 ELP 유전자를 RDL 방법을 이용하여 E. coli 종에서 1,800, 2,400 bp의 ELP 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 DNA로부터 합성하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 유전자 클로닝(Gene cloning)을 통해 제작된 DNA를 단백질 발현에 사용되는 대장균 BL21(DE3)에 형질전환(Transformation) 시켰고, 형질전환된 대장균은 IPTG(Isopropyl-betaD-thiogalactopyranoside)의 유도를 통하여 24시간 동안 37℃의 배양 적정온도에서 단일 중합체 또는 이중 공중합체 엘라스틴 단백질을 과발현(Over-expression) 하도록 하였으며, 과발현된 단일 중합체 또는 이중 공중합체 엘라스틴 단백질은 ITC(Inverse Transition Cycling) 방법을 통하여 분리 및 정제하였다(도 3b).
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 아크릴화는 상기 단일 중합체 또는 이중 공중합체 단백질을 메타크릴 무수물(Methacrylic anhydride, MAA), 메타크릴산 또는 아크릴산에 혼합하여 반응시킴으로써 상기 이중 공중합체 단백질의 아미노산 서열에서 라이신(Lysine, K)의 아민(amine)을 이중결합을 가진 형태로 변형시키는 방법인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 정제된 단일 중합체 또는 이중 공중합체 ELP를 MAA와 8시간 동안 저온(4℃)에서 반응시켜 아미노산 중 K(Lysine)의 아민(Amine, -NH2)을 이중결합(Double bond)을 가진 형태로 분자적인 변형을 시켰다.(도 3a) 이 과정에서 이중 공중합체 엘라스틴 단백질의 K(Lysine)을 포함하는 부분은 이중결합(Double Bond)를 가진 형태로 변형되지만 K(Lysine)을 포함하지 않는 부분은 변형되지 않았고, 반응이 종료된 후에는 ITC(Inverse Transition Cycling) 방법을 통하여 정제하였다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 전기 수력학적 공동분사 방법은
1) 상기 변형된 단일 중합체 또는 이중 공중합체 단백질을 광중합개시제 (Photo-initiator)와 함께 유기용매에 용해시켜 혼합액을 제조하는 단계;
2) 상기 혼합액을 상부에 듀얼 채널 바늘(dual channel needle)이 연결되고 하부에 게이지 금속 노즐이 연결된 주사기에 적재하는 단계;
3) 발전기를 통해 금속 노즐에 5.0-6.5 kV의 양 전압을 형성시키는 단계;
4) 상기 혼합액을 주사기로부터 금속 노즐에 흘리는 단계; 및
5) 금속 노즐 하부에서 알루미늄 박을 이용하여 기질을 수집하는 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다(도 6 참조).
본 발명에서는 변형된 단일 중합체 또는 이중 공중합체 ELP를 용매로서 에탄올(Ethanol)과 TFE(2,2,2-Trifluoroethanol)의 1:1 혼합액에 용해시켰고, 완전하게 용해된 엘라스틴 단백질의 혼합액은 전기 수력학적 공동분사 방법을 통하여 나노섬유 구조체의 형태를 획득하였다. 상기 전기 수력학적 공동분사 방법은 FITC-ELP 컨쥬게이트(Fluorescein isothiocyanate-ELP conjugates)와 Nile Red의 두 개의 형광 염료를 사용한 후, 공초점레이저주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM) 및 주사전자현미경(Scanning Electron Microscopy, SEM)을 통하여 관찰하였다(도 7 및 도 12).
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 자외선 조사는 200 내지 300 nm의 흡광도로 30분 내지 2시간 동안 조사하는 것이 바람직하고, 250 내지 260 nm의 흡광도로 1시간 내지 1시간 30분 동안 조사하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 자외선 조사를 통해 화학결합한 안정화된 이방성 단백질 나노구조체를 제조하는 것이 가능하다.
본 발명에서는 전기 수력학적 공동분사 방법을 통하여 획득한 나노섬유 구조체에 대해 화학적 가교결합(Chemical crosslinking)이 가능한 블록을 자외선 조사(UV irradiation)하여 분자간의 가교결합(Cross link)을 형성시켰다. 이때 K(Lysine)을 포함하는 블럭은 이중결합(Double bond)를 가지고 있기 때문에 가교 결합을 형성하지만, K(Lysine)을 포함하지 않은 블록은 가교결합을 형성하지 못하였다. 가교 결합 형성을 통해 화학결합한 안정화된 이방성 단백질 나노구조체를 제조하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 이방성 단백질 나노섬유 구조체를 수용액 상태에서 자발적 구조 변환(Spontaneous Structure Transformation)을 시키는 단계를 포함하는 이방성 단백질 나노입자 구조체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 이중 공중합체 단백질로 제조된 이방성 단백질 나노섬유 구조체는 수용액 상에서 화학적 비가교 결합된 블록의 재용해에 의한 자발적 구조 변환으로 물리화학적으로 구획화를 유지하고 동시에 자극 반응성을 지닌 다기능성 단백질 나노입자 구조체의 형성이 가능하다(도 8).
본 발명자들은 자외선이 조사된 단백질 나노섬유 구조체를 PBS에서 인큐베이트시킨 결과, 가교 결합을 형성하지 못한 블록의 재용해에 의해 분열하여 나노섬유 구조체의 형태에서 나노입자의 형태로 변화하는 것을 공초점레이저주사현미경 및 주사전자현미경을 통해 관찰하였다(도 9 및 도 10).
또한, 본 발명은 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록을 포함하는 단일 중합체 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록 및 화학적 비가교 결합이 가능한 블록으로 구성된 이중 공중합체 단백질을 아크릴화 반응시켜 분자적으로 변형한 단백질로 이루어진 이방성 단백질 나노섬유 구조체로서, 이방성의 구획화를 유지하고 동시에 자극 반응성을 가진 이방성 단백질 나노섬유 구조체를 제공한다.
또한, 본 발명은 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록을 포함하는 단일 중합체 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록 및 화학적 비가교 결합이 가능한 블록으로 구성된 이중 공중합체 단백질을 아크릴화 반응시켜 분자적으로 변형한 단백질로 이루어진 이방성 단백질 나노섬유 구조체가 수용액 상태에서 자발적 구조 변환된 이방성 단백질 나노섬유 구조체로서, 이방성의 구획화를 유지하고 동시에 자극 반응성을 가진 이방성 단백질 나노입자 구조체를 제공한다.
상기 이방성 단백질 나노섬유 구조체는 가교 결합이 가능한 도메인으로 구성된 ELP 단일 중합체 또는 가교 결합이 가능한 도메인과 비가교 결합이 가능한 도메인으로 구성된 ELP 이중 공중합체를 유전 공학적으로 합성한 후, 역 전이 사이클링 방법에 의해 정제된 다음, 아크릴 부분의 가교 결합이 가능한 도메인으로의 통합에 의해 제조될 수 있다. 이때, 아크릴화된 ELP 단일 중합체 또는 이중 공중합체의 이방성 ELP 나노섬유는 처음에 전기 수력학적 공동분사에 의해 나란히 배열된 모양으로 합성된 후, UV 조사를 통해 화학적으로 안정화된다.
상기 이방성 단백질 나노입자 구조체는 이중 공중합체 단백질로 제조된 이방성 ELP 나노섬유가 수용액 상에서 인큐베이트될 때, ELP의 두 블록 중 비가교 결합이 가능한 블록의 재용해에 의해 자발적으로 해체된 후 이방성 ELP 나노입자로 안정화됨으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 이방성 단백질 나노섬유 구조체 및 나노입자 구조체는 수용액 상에서 자극 반응성에 의해 가역적으로 팽창 또는 수축하는 특성이 있으므로, 스마트한 약물전달시스템 또는 분자 이미징에 유용하게 적용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 나노입자 구조체를 포함하는 약물 전달용 의약 조성물을 제공한다.
상기 약물 전달용 의약 조성물은 단백질, DNA, RNA, 화합물 의약 및 조영 물질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약물을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 약물 전달용 의약 조성물은 약물을 상기 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 나노입자 구조체와 혼합하거나 결합시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 나노입자 구조체를 포함하는 조영제를 제공한다.
상기 조영제는 상기 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 나노입자 구조체에 단백질, DNA, RNA, 화합물 의약 및 조영 물질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 약물이 물리적 또는 화학적으로 결합되어 있는 것이 바람직하고, 상기 조영 물질은 형광 물질, 방사성 동위원소 또는 양자점인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 나노입자 구조체를 포함하는 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 나노입자 구조체를 포함하는 센서를 제공한다.
본 발명에 따른 이방성 단백질 나노구조체는 수용액 상에서 자극 반응성에 의해 가역적으로 팽창 또는 수축하는 특성이 있으므로, 약물 전달체 시스템, 바이오이미징, 바이오센서 및 바이오메디칼 나노디바이스의 소재로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기의 실시예는 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
이중 공중합체 엘라스틴 유사 폴리펩타이드의 발현 및 정제
엘라스틴 유사 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 유전자 클로닝을 통해 제작한 후, 상기 DNA를 대장균에 형질전환한 후, 형질전환된 대장균을 IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)의 유도를 통하여 배양 적정 온도에서 배양하여 엘라스틴 유사 폴리펩타이드를 과발현한 다음, ITC(Inverse Transition Cycling) 방법을 통해 분리 및 정제하였다(비특허문헌 5, 6 및 7 참조).
구체적으로, 엘라스틴 유사 폴리펩타이드(Elastin-like Polypeptide, ELP)[(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]8 또는 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]8(Val-Pro-Gly-Val-Gly)40]를 암호화하는 유전자를 포함하는 변형된 플라스미드 DNA로 E. coli strain BL21(DE3) 세포(Novagen Inc., Milwaukee, WI, US)를 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 세포를 250 mL 플라스크에서 50 ㎍/mL 앰피실린(ampicillin)(Sigma-Aldrich)을 포함한 50 mL LB 배지에 배양하였다. 상기 세포를 배양한 배지를 밤새 200 rpm 및 37℃에서 진탕배양기에서 배양한 다음, 50 mL의 LB 배지를 2 L 플라스크에서 50 ㎍/mL 암피실린을 포함한 500 mL LB 배지에 배양하였다. 상기 배양 배지를 600nm의 흡광도에서 측정하여서 1.0의 수치를 나타내는 배양수준에서 IPTG (Isopropyl-betaD-thiogalactopyranoside)를 1mM의 농도로 넣어주고 총 24시간 동안 200 rpm 및 37℃에서 배양한 후, 15분 동안 3000 rpm으로 원심분리시켰다. 세포 펠렛을 40 ml 인산완충식염수(Phosphate buffered saline, PBS)(pH 7.4)(Sigma-Aldrich)에 현탁시킨 후, 상기 세포를 냉각 상태에서 20초 간격으로 각각 10초 동안 음파처리(VC-505, Sonic and materials Inc, Danbury, CT)를 통해 용해시켰다. 세포 용해물의 비가용성 잔해를 침전시키기 위해, 상기 세포 용해물을 50 mL 원심관에서 4℃에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리시켰다. 그런 다음, 가용성 ELP를 포함하는 상청액을 새로운 50 mL 원심관으로 옮긴 후, 0.5% w/v의 폴리에틸렌아민(Sigma-Aldrich)과 균질하게 혼합시킨 다음, 핵산을 침전시키기 위해 4℃에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리시켰다. NaCl(3-4 M)의 첨가에 의해 ELP의 역상 전이를 개시시켰고, Tt 이상의 37℃에서 15분 동안 13,000 rpm에서 원심분리를 통해 응집된 ELP를 분리시켰다. 상기 응집된 ELP을 Tt 이하의 4℃에서 차가운 PBS에서 재현탁시킨 후, 상기 ELP 용액을 입자성 오염물을 제거하기 위해 4℃에서 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리시켰다. 이런 ELP의 응집 및 재용해를 상기 ELP의 순도가 SDS-PAGE에 의해 결정된 수치로서 대략 95%일 때까지 3-4회 반복시켰다. 25, 50 및 100 uM 농도를 갖는 다양한 탁도의 ELP 용액에서 온도의 효과를 1℃/min의 가열 속도로 10 내지 50℃ 사이에서 다중세포 열전기 온도 조절기(Varian Instruments, Walnut Creek, CA)가 장착된 Cary 100 Bio UV/Vis 분광광도계에서 350 nm(OD350)의 흡광도로 측정하여 분석하였다.
그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, PBS에서 상기 이중 공중합체 ELP의 Tt는 ELP 농도가 감소함에 따라 1℃/min의 열 비율로 30 및 34℃ 사이에서 점차적으로 증가하는 것으로 나타났다(도 2).
변형된 엘라스틴 유사 폴리펩타이드의 합성
상기 <실시예 1>에서 정제된 ELP를 메타크릴 무수물(Methacrylic anhydride, MAA)과 반응시켜 아미노산 중 라이신(Lysine, K)의 아민(amine)을 이중결합을 가진 형태로 분자적으로 변형된 ELP를 제조하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 정제된 ELP를 pH 7.4의 PBS에서 용해시킨 후, 4℃로 냉각시킨 다음, 100배 이상의 몰랄 농도의 메타크릴 무수물(94%)(Sigma-Aldrich)을 첨가하면서 교반시켰다. 상기 반응을 밤새 진행시킨 후, 반응 혼합물을 3회 ITC(Inverse Transition Cycling) 방법을 통해 정제하고, 희석한 후, 셀롤로오스 막에 투석하였다(투석막, Cellu Sep TI, 상대적인 분자량 컷오프, 3,500). 그런 다음, 정제된 반응 산물을 동결건조시켰다. 변형된 ELP의 1H NMR 스펙트럼을 400 MHz의 공명 진동수에서 작동하는 Bruker AMX 400 분광계로 실온에서 기록하였다. 모든 경우, D2O를 국제 표준으로 사용하였고, 10 mg/mL의 농도를 사용하였다. 농도를 갖는 다양한 탁도의 변형된 ELP 용액에서 온도의 효과를 1℃/min의 가열속도로 10 내지 50℃ 사이에서 다중세포 열 전기 온도 조절기가 장착된 Cary 100 Bio UV/Vis 분광광도계에서 350 nm(OD350)의 흡광도로 측정하였다.
그 결과, 도면 3의 B, 4 및 5에서 보는 바와 같이, 고유의 ELP 및 변형된 ELP 단일 중합체 및 이중 공중합체 간에 물리적인 구조 변형 및 화학적인 특성 변화를 확인하였다(도 3, 4 및 5).
전기 수력학적 공동분사 방법을 통해 이방성(biphasic) ELP 나노섬유의 제조
상기 <실시예 2>에서 합성된 변형된 단일 중합체 또는 이중 공중합체 ELP를 에탄올과 TFE의 1:1 혼합유기용매에 용해시키고 광중합개시제(Photo-initiator)를 첨가한 혼합액을 제조한 후, 전기 수력학적 공동분사 방법을 통하여 나노섬유 구조체의 형태를 얻은 다음, 가교 결합이 가능한 블록을 자외선 조사하여 분자 간 가교 결합을 형성시켰다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 합성된 변형된 단일 중합체 또는 이중 공중합체 ELP를 이용하여, 각각의 경우에 필요한 2가지 분리된 중합체 용액을 제조하였다. 하나의 용액은 유기용매로서 에탄올(Sigma-Aldrich)과 TFE(Sigma-Aldrich), 의 1:1 부피 비율의 용액 혼합물에 15.6 w/v%의 변형된 ELP 및 0.4 w/v%의 FITC 표지된 변형된 ELP를 용해시키고 광중합개시제(Photo-initiator)를 첨가하여 제조하였다. 나머지 용액은 유기용매로서 에탄올과 TFE의 1:1 부피 비율의 용액 혼합물에 16 w/v%의 변형된 ELP 및 0.01 w/v%의 나일 레드(Nile Red)를 용해시키고 광중합개시제(Photo-initiator)를 첨가하여 제조하였다. 상기 각각의 용액을 나란히 배열된 모양을 가진 듀얼 채널 바늘(dual channel needle)(Fibrijet SA-3610, micromedics, NM, US)에 연결된 Norm-Ject 1.0 ml 주사기(Henke Sass Wolf, Tut- tlingen, Germany)에 적재시켰다. 26 게이지의 팁 및 3.25 인치의 길이를 가진 듀얼 채널 바늘을 21 게이지 금속 노즐(Nano NC, Seoul, Korea)을 가진 주사기에 연결시켰다. 단일 주사기 펌프(KDS-100, Nano NC, Seoul, Korea)로 두 용액의 흐름율을 조절하였다(0.10-0.25 mL/h). 높은 전위의 발전기(ESN-HV30, Nano NC, Seoul, Korea)를 이용하여 양전압(5.0-6.5 kV)을 모세관에 적용시켰고, 바늘의 말단으로부터 15 cm 떨어진 곳에서 기질을 수집하기 위해 알루미늄 박에 연결시켰다. 전기 수력학적 공동분사 방법을 통하여 ELP 나노섬유 구조체의 형태를 획득하였다. 상기 전기 수력학적 공동분사 방법은 FITC-ELP 컨쥬게이트 및 Nile Red의 두 개의 형광 염료를 각각 사용하였다. 그런 다음, 상기 ELP 나노섬유에 대해 화학적으로 가교 결합이 가능한 블록을 1시간 동안 UV 조사(254 nm, ETX-F20.C, VilberLourmat, Marne-la-Vallee, France)를 통해 가교 결합시킨 다음, 엣지 블레이드(edge blade)를 이용하여 분말형태로 수집하였다. 또한 공초점주사전자현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM)(Leica TCS SP2, Leica, Germany)을 통한 관찰을 위해 전기 수력학적 공동분사 동안, 알루미늄 기질의 위에 커버 글래스를 놓아두었다. 그런 다음, 상기 커버 글래스에 접착된 ELP 나노섬유를 UV 조사한 후 공초점레이저주사현미경을 이용하여 유침 렌즈로 100 배로 확대하여 이미지화하였다. ELP 나노섬유의 이방성 특성을 두 개별적인 형광 채널에 의해 분석하였다. 주사전자현미경(MIRA3 model, TESCAN)에 의해 구조적으로 변형된 ELP 나노섬유의 형태를 확인하기 위해, 작은 네모 조각의 스테인리스스틸 판(5 x 5 mm)을 전기 수력학적 공동분사 동안 알루미늄 박의 표면에 두었다. 이런 ELP 나노섬유들을 K575X turbosputter coater(Emitech, Houston, TX)를 이용하여 플래티넘 스퍼터링으로 코팅한 다음, 0.5 내지 30 kV의 가속전압에서 작동되는 주사전자현미경을 이용하여 이미지화하였다.
그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 건조한 상태에서 이방성 ELP 나노섬유의 다른 구획이 분명히 나타났다(도 7).
수용액 상에서 자발적 구조 변환을 통해 ELP 나노입자의 제조
상기 <실시예 3>에서 제조된 ELP 나노섬유 구조체를 수용액 상태에 두어서 화학적 비가교 결합된 블록의 재용해(Resolubilization)를 통한 자발적 구조 변환을 야기시켜 나노입자 구조체를 형성시켰다.
구체적으로, 화학적으로 가교결합된 이방성 ELP 나노섬유 1 밀리그램을 pH 7.4의 200 uL의 PBS에 용해시켰다. PBS에 현탁시킨 이방성 ELP 나노섬유를 커버 글래스에 둔 다음, 자발적으로 구조 변환으로 이방성 ELP 나노섬유가 이방성 ELP 나노입자로 변환되는 과정을 두 형광 구획의 개별적인 채널을 가진 공초점 레이저 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)을 이용하여 100 X 확대하여 수용액상에서 관찰하였다. 또한, PBS에 현탁시킨 이방성 나노섬유를 스테인리스틸에 둔 후 건조시킨 다음, K575X turbosputter coater를 이용하여 플래티넘 스퍼터링으로 코팅한 후, 0.5 내지 30 kV의 가속전압에서 작동되는 주사전자현미경(Scanning Electrron Microscopy, SEM)을 이용하여 이미지화하였다.
그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이, 상기 구조 변환된 이방성 ELP 나노입자가 CLSM 이미지 분석에 의해 수용액상에서 2개의 분리된 구획을 분명히 나타내었다. 또한, 도 10에서 보는 바와 같이, 상기 구조 변환된 이방성 ELP 나노입자가 건조 상태에서 특정 크기의 구형임을 나타내었다. 또한, 도 11에서 보는 바와 같이, 20 내지 35℃의 범위의 온도에서 상기 구조 변환된 이방성 ELP 나노입자가 온도에 대한 열 반응성이 있음을 나타내었다(도 9, 10, 11 및 12).
Claims (16)
- 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록을 포함하는 단일 중합체 단백질 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록 및 화학적 비가교 결합이 가능한 블록으로 구성된 이중 공중합체 단백질을 아크릴화 반응시켜 분자적으로 변형한 단백질로 이루어진 이방성 단백질 나노섬유 구조체로서,
상기 단일 중합체 단백질은 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록(block) 형태이고; 그리고,
상기 이중 공중합체 단백질은 상기 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록에 (Val-Pro-Gly-Val-Gly)로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록이 결합되어 있는 블록(block) 형태인 것을 특징으로 하는 이방성의 구획화를 유지하고 동시에 자극 반응성을 가진 이방성 단백질 나노섬유 구조체.
- 청구항 1에 있어서, 자극 반응성은 열 반응성인 것을 특징으로 하는 이방성 단백질 나노섬유 구조체.
- 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록을 포함하는 단일 중합체 단백질 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록 및 화학적 비가교 결합이 가능한 블록으로 구성된 이중 공중합체 단백질을 아크릴화 반응시켜 분자적으로 변형한 단백질로 이루어진 이방성 단백질 나노섬유 구조체가 수용액 상태에서 자발적 구조 변환된 이방성 단백질 나노입자 구조체로서,
상기 단일 중합체 단백질은 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록(block) 형태이고; 그리고,
상기 이중 공중합체 단백질은 상기 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록에 (Val-Pro-Gly-Val-Gly)로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록이 결합되어 있는 블록(block) 형태인 것을 특징으로 하는
이방성의 구획화를 유지하고 동시에 자극 반응성을 가진 이방성 단백질 나노입자 구조체.
- 청구항 3에 있어서, 자극 반응성은 열 반응성인 것을 특징으로 하는 이방성 단백질 나노입자 구조체.
- 청구항 1의 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 청구항 3의 이방성 단백질 나노입자 구조체를 포함하는 약물 전달용 조성물.
- 청구항 1의 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 청구항 3의 이방성 단백질 나노입자 구조체를 포함하는 조영제.
- 청구항 1의 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 청구항 3의 이방성 단백질 나노입자 구조체를 포함하는 키트.
- 청구항 1의 이방성 단백질 나노섬유 구조체 또는 청구항 3의 이방성 단백질 나노입자 구조체를 포함하는 센서.
- 1) 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록을 포함하는 단일 중합체 단백질 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록 및 화학적 비가교 결합이 가능한 블록을 포함하는 이중 공중합체 단백질을 아크릴화 반응시켜 분자적으로 변형시킨 후 정제하는 단계;
2) 단계 1)에서 변형된 단일 중합체 단백질 또는 이중 공중합체 단백질을 전기 수력학적 공동분사 방법을 통해 나노섬유의 형태로 제조하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 제조된 단백질에 대해 화학적으로 가교 결합이 가능한 블록을 자외선을 조사하여 가교 결합을 형성시키는 단계를 포함하는,
이방성 단백질 나노섬유 구조체의 제조 방법으로,
상기 단일 중합체 단백질은 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록(block) 형태이고; 그리고,
상기 이중 공중합체 단백질은 상기 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록에 (Val-Pro-Gly-Val-Gly)로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록이 결합되어 있는 블록(block) 형태인 것을 특징으로 하는 이방성 단백질 나노섬유 구조체의 제조 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 단계 1)의 상기 단일 중합체 단백질 또는 이중 공중합체 단백질은 엘라스틴 유사 폴리펩타이드이고,
상기 엘라스틴 유사 폴리펩타이드는 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]8, 또는 (Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]8(Val-Pro-Gly-Val-Gly)40의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 이방성 단백질 나노섬유 구조체의 제조 방법.
- 삭제
- 청구항 9에 있어서, 상기 단계 1)의 아크릴화는 상기 블록(block) 형태의 단일 중합체 단백질 또는 블록(block) 형태의 이중 공중합체 단백질을 메타크릴 무수물, 메타크릴산 또는 아크릴산을 혼합하여 반응시킴으로써 상기 단일 중합체 단백질 또는 이중 공중합체 단백질의 아미노산 서열에서 라이신의 아민을 이중결합을 가진 형태로 변형시키는 것을 특징으로 하는 이방성 단백질 나노섬유 구조체의 제조 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 단계 2)의 전기 수력학적 공동분사 방법은
1) 상기 변형된 블록(block) 형태의 단일 중합체 단백질 또는 블록(block) 형태의 이중 공중합체 단백질을 광중합개시제를 첨가한 혼합유기용매에 용해시켜 중합체 혼합액을 제조하는 단계;
2) 상기 혼합액을 상부에 듀얼 채널 바늘이 연결되고 하부에 게이지 금속 노즐이 연결된 주사기에 적재하는 단계;
3) 발전기를 통해 금속 노즐에 5.0-6.5 kV의 양 전압을 형성시키는 단계;
4) 상기 혼합액을 주사기로부터 금속 노즐에 흘리는 단계; 및
5) 금속 노즐 하부에서 알루미늄 박을 이용하여 기질을 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이방성 단백질 나노섬유 구조체의 제조 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 단계 3)의 자외선 조사는 200 내지 300 nm의 흡광도로 30분 내지 2시간 동안 조사하는 것을 특징으로 하는 이방성 단백질 나노섬유 구조체의 제조 방법.
- 1) 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록을 포함하는 블록(block) 형태의 단일 중합체 단백질 또는 자극 반응성을 지닌 화학적 가교 결합이 가능한 블록 및 화학적 비가교 결합이 가능한 블록을 포함하는 블록(block) 형태의 이중 공중합체 단백질을 아크릴화 반응시켜 분자적으로 변형시킨 후 정제하는 단계;
2) 단계 1)에서 변형된 블록(block) 형태의 단일 중합체 단백질 또는 블록(block) 형태의 이중 공중합체 단백질을 전기 수력학적 공동분사 방법을 통해 나노섬유의 형태로 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 단백질에 대해 화학적으로 가교 결합이 가능한 블록을 자외선을 조사하여 가교 결합을 형성시켜 이방성 단백질 나노섬유 구조체를 제조하는 단계;
4) 단계 3)에 의해 제조된 이방성 단백질 나노섬유 구조체를 수용액 상태에서 자발적 구조 변환 시키는 단계를 더 포함하는 이방성 단백질 나노입자 구조체의 제조 방법으로,
상기 단일 중합체 단백질은 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록(block) 형태이고; 그리고,
상기 이중 공중합체 단백질은 상기 [(Val-Pro-Gly-Val-Gly)14(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)]로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록에 (Val-Pro-Gly-Val-Gly)로 이루어진 아미노산 서열의 반복구조를 갖는 블록이 결합되어 있는 블록(block) 형태인 것을 특징으로 하는 이방성 단백질 나노입자 구조체의 제조 방법.
- 청구항 15에 있어서, 상기 자발적 구조 변환은 상기 이방성 단백질 나노섬유 구조체의 두 블록 중 비가교 결합이 가능한 블록의 재용해에 의해 자발적으로 해체된 후 안정화되어 나노섬유 구조체의 형태에서 나노입자의 형태로 변환하는 것을 특징으로 하는 이방성 단백질 나노입자 구조체의 제조 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120073362 | 2012-07-05 | ||
| KR20120073362 | 2012-07-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140006721A KR20140006721A (ko) | 2014-01-16 |
| KR101518121B1 true KR101518121B1 (ko) | 2015-05-07 |
Family
ID=50141595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130078141A KR101518121B1 (ko) | 2012-07-05 | 2013-07-04 | 자발적 구조 변환에 의한 자극반응성을 지닌 이방성 단백질 나노구조체 및 이의 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101518121B1 (ko) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11059870B2 (en) * | 2016-03-14 | 2021-07-13 | Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University Erica Campus | Polypeptides with phase transition, triblock polypeptides of the polypeptide-calmodulin-polypeptide with multi-stimuli responsiveness, hydrogel of the triblock polypeptides, and its uses |
| KR102028931B1 (ko) * | 2016-03-24 | 2019-10-08 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 지능형 약물 전달을 위한 다중 자극 반응성을 지닌 칼모듈린-엘라스틴 이중 블럭 폴리펩타이드의 동적 나노 전달체 및 제조방법 |
| CN110101868B (zh) * | 2019-05-24 | 2021-03-23 | 北京大学 | 一种环境刺激响应性蛋白质高分子偶联物自组装体及其制备方法与应用 |
-
2013
- 2013-07-04 KR KR1020130078141A patent/KR101518121B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 다중검출용 바이오센싱 빛 스마트 약물전달을 위한 이방성 고분자 나노구조체 개발. 한양대학교 대학원 석사학위 논문. 정찬우. (2012.02.) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140006721A (ko) | 2014-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mohammed et al. | Poly (N-vinyl caprolactam) thermoresponsive polymer in novel drug delivery systems: A review | |
| Hill et al. | Thermoresponsive protein-engineered coiled-coil hydrogel for sustained small molecule release | |
| Chiu et al. | Biomineralization and size control of stable calcium phosphate core–protein shell nanoparticles: potential for vaccine applications | |
| Adler-Abramovich et al. | Controlling the physical dimensions of peptide nanotubes by supramolecular polymer coassembly | |
| Frandsen et al. | Recombinant protein-based polymers for advanced drug delivery | |
| Shen et al. | Chiral self-assembly of peptides: Toward the design of supramolecular polymers with enhanced chemical and biological functions | |
| Matsumoto et al. | Smart vaults: thermally-responsive protein nanocapsules | |
| Colombo et al. | Site‐specific conjugation of ScFvs antibodies to nanoparticles by bioorthogonal strain‐promoted alkyne–nitrone cycloaddition | |
| Ebara et al. | Smart hydrogels | |
| Lim et al. | Multi stimuli-responsive hydrogel microfibers containing magnetite nanoparticles prepared using microcapillary devices | |
| Okesola et al. | De novo design of functional coassembling organic–inorganic hydrogels for hierarchical mineralization and neovascularization | |
| Wang et al. | Multifunctional 1D magnetic and fluorescent nanoparticle chains for enhanced MRI, fluorescent cell imaging, and combined photothermal/chemotherapy | |
| Dao et al. | Self-Assembling Peptide—Polymer Nano-Objects via Polymerization-Induced Self-Assembly | |
| CN107412877B (zh) | 一种磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的制备方法及其应用 | |
| Machado et al. | Self-assembly of oligo-and polypeptide-based amphiphiles: recent advances and future possibilities | |
| KR101518121B1 (ko) | 자발적 구조 변환에 의한 자극반응성을 지닌 이방성 단백질 나노구조체 및 이의 제조방법 | |
| Chen et al. | Approaches and materials for endocytosis-independent intracellular delivery of proteins | |
| Morales et al. | Targeted intracellular delivery of proteins with spatial and temporal control | |
| TWI392869B (zh) | 功能化量子點及其製備方法 | |
| Xuan et al. | Diblock copolypeptoids: a review of phase separation, crystallization, self-assembly and biological applications | |
| Florczak et al. | Systemic and local silk-based drug delivery systems for cancer therapy | |
| Channon et al. | Possibilities for ‘smart’materials exploiting the self-assembly of polypeptides into fibrils | |
| Castillo-León et al. | Self–assembled peptide nanostructures for biomedical applications: advantages and challenges | |
| Zanna et al. | Hydrogelation induced by Fmoc-protected peptidomimetics | |
| Cheng et al. | New synthesis route of hydrogel through a bioinspired supramolecular approach: Gelation, binding interaction, and in vitro dressing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180417 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190408 Year of fee payment: 5 |