KR101517692B1 - MARCH5 발현 안정화를 통해 HBx 분해를 유도하는 간암 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5) 발현 안정화를 통해 B형 간염 바이러스 X 단백질(hepatitis B virus X protein; HBx) 분해를 유도하는 간암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, (1) 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5)를 발현하는 간암 세포주를 구축하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 구축된 간암 세포주에 시험물질을 접촉시키고 MARCH5 발현정도를 측정하는 단계; (3) 상기 (1) 단계에서 구축된 간암 세포주에 B형 간염 바이러스 X 단백질(hepatitis B virus X protein; HBx)을 발현시키고 MARCH5 발현정도를 측정하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 측정된 MARCH5 발현정도를 대조군으로 하여 상기 (2) 단계에서 측정된 MARCH5 발현정도가 대조군보다 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 간암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

MARCH5 발현 안정화를 통해 HBx 분해를 유도하는 간암 치료제 스크리닝 방법{Method for screening therapeutic agent of liver cancer by inducing HBx degradation via stabilization of MARCH5 expression}
본 발명은 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5) 발현 안정화를 통해 B형 간염 바이러스 X 단백질(hepatitis B virus X protein; HBx) 분해를 유도하는 간암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
우리나라에서 발생하는 간암의 70%는 B형 간염 바이러스 감염과 관련된 것으로 알려져 있다. B형 간염 바이러스 genome에 의해 만들어지는 여러 단백질 중 하나인 B형 간염 바이러스 X 단백질(hepatitis B virus X protein; HBx)은 multi-player이다. HBx는 154개의 아미노산으로 이루어진 작은 단백질이면서도 세포 내의 많은 단백질과 결합하고, 그들의 기능을 과활성 또는 무력화시킴으로써 간세포의 암화를 촉진한다. 일반적인 암화 과정에 적어도 3-6개의 암유전자와 암억제유전자의 변이가 필요하다고 알려져 있다. HBx는 Ras를 비롯한 다양한 신호전달체계를 활성화시키고, p53 암억제 단백질과 결합하여 그 기능을 무력화시킴으로써 암화과정시 필요한 여러 변이를 대체한다.
미토콘드리아는 가장 다양한 기능을 담당하는 세포 내 소기관이다. ATP 합성 등 물질대사를 담당할 뿐 아니라, 세포사멸 조절의 중심부에 있으며, 암 및 파킨슨병을 비롯한 여러 신경질환과 밀접하게 연관되어 있다. 한편, 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase)인 MARCH5(MITOL이라고도 알려짐)는 유비퀴틴화(ubiquitylation)를 통하여 미토콘드리아 형태 조절 단백질을 조절한다. MARCH5는 미토콘드리아 다이나믹스(dynamics) 단백질인 hFis1 및 Mfns(Mfn1,2)을 조절하고, Drp1을 세포질(cytosol)로부터 미토콘드리아로 이동시킨다. 최근 연구에 의하면, MARCH5는 돌연변이 수퍼옥사이드 디스뮤타제 1(superoxide dismutase 1; mSOD1)의 미토콘드리아 축적에 의해 야기되는 미토콘드리아 기능 장애에 대응한 방어적 역할을 수행하는 것으로 나타났다. 잘못 접힌(misfolded) mSOD1은 심각한 신경퇴행성 질환인 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS) 환자의 신경 세포에 축적되는 것으로 나타났다. 또한, MARCH5는 미토콘드리아에 축적되고 미토콘드리아 기능 장애를 유발하는 폴리글루타민-확장 단백질(polyglutamine-expanded protein; PolyQ)에 대한 세포 독성을 조절한다고 밝혀졌는데, PolyQ는 헌팅턴병, 마카도 조셉병(machado joseph disease) 또는 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia)과 같은 질병에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.
한편, 한국등록특허 제10-1118880호는 간암 억제제 스크리닝 방법에 관한 것으로, B형 간염바이러스의 단백질인 HBx과 APC 단백질 간의 상호작용을 방해하는 물질의 스크리닝 시스템에 관한 것이다. HBx는 숙주세포의 APC 단백질과 결합하여 간암을 일으키는 신호전달 경로를 활성화하므로, 상기 단백질 간의 상호작용을 방해하면 간암을 효과적으로 억제할 수 있다고 개시하고 있지만, 본원발명의 MARCH5 발현 안정화를 통해 HBx 분해를 유도하는 간암 치료제 스크리닝 방법에 대한 언급은 없다.
따라서, 본 발명자들은 MARCH5-GFP-HeLa 세포주를 구축하고, 상기 세포주에 HBx를 발현시킬 경우, MARCH5가 안정화되는 것을 확인하였으며, 이와 같이 MARCH5의 발현을 안정화시켜 HBx 분해를 유도함으로써 간암을 치료할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 MARCH5의 발현을 안정화시켜 HBx 분해를 유도할 수 있는 간암 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5)를 발현하는 간암 세포주를 구축하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 구축된 간암 세포주에 시험물질을 접촉시키고 MARCH5 발현정도를 측정하는 단계; (3) 상기 (1) 단계에서 구축된 간암 세포주에 B형 간염 바이러스 X 단백질(hepatitis B virus X protein; HBx)을 발현시키고 MARCH5 발현정도를 측정하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 측정된 MARCH5 발현정도를 대조군으로 하여 상기 (2) 단계에서 측정된 MARCH5 발현정도가 대조군보다 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 간암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 간암 세포주는 HeLa 세포가 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는 상기 (4) 단계의 MARCH5 발현정도가 대조군보다 증가한 시험물질은 대조군에 비해 0.5 내지 5 % 증가한 것을 특징으로 한다.
상세하게는, 상기 MARCH5 발현 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 측정할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5) 발현 안정화를 통해 B형 간염 바이러스 X 단백질(hepatitis B virus X protein; HBx) 분해를 유도하는 간암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로서, MARCH5-GFP-HeLa 세포주를 구축하고, 상기 세포주에 HBx를 발현시킬 경우, MARCH5가 안정화되는 것을 확인하였으며, 이와 같이 MARCH5의 발현을 안정화시켜 HBx 분해를 유도할 수 있는 약물을 스크리닝함으로써 간암치료제를 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 MARCH5-GFP 발현 세포주(MARCH5-GFP-HeLa cells)에 Flag-HBx 단백질을 농도별로 형질감염(transfection)하여 MARCH5 발현을 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : MARCH5 의 발현 안정화를 통한 HBx 분해 유도
1. 세포 배양
본 발명에 사용한 HeLa 세포는 ATCC (the global biosource center; atcc.org)에서 구매하여 사용하였으며, DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium; Gibco) 배지에 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 항생제를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 세포를 배양하였다.
2. MARCH5-GFP-HeLa 세포주 구축
Human MARCH5 (GenBank/EMBL/DDBJ accession no. NM_017824)를 PCR을 통해 증폭한 후, XhoI, BamH1 제한효소를 이용하여, pEGFP-N1(clonetech)에 재조합하여 획득하였다. 획득한 MARCH5-GFP 유전자를 HeLa 세포주에 리포펙타민(lipofectamin) 2000을 이용하여 형질감염(transfection) 한 뒤, pEGFP-C1 vector의 제네티신(geneticin) 저항성을 이용하여, 세포배양시 제네티신(geneticin; 1000 ug/ml) 을 이용하여 형질감염된(transfection) 세포만을 얻도록 2주간 선별한 뒤, 낮은 농도 (800 ug/ml)에서 MARCH5-GFP를 발현시키는 세포주를 확립하고 유지하였다.
3. 면역블롯팅(immunoblotting)
세포를 트립신(trypsin)을 이용하여 모은 뒤, 1x 단백질 sample buffer로 direct lysis하여 얻어진 단백질을 폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동한 후에, NC(nitrocellulose membrane)로 옮겼다. 얻어진 NC blot을 5% non-fat milk를 포함한 TBST buffer에 1시간 동안 블로킹(blocking) 한 후, 각각의 1,2차 항체를 각각 반응(incubation)시킨 뒤, ECL(enhanced chemiluminescence systeme)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다.
4. 유세포 분석(Fluorescence Activated Cell Sorting; FACS)
세포를 트립신(trypsin)을 이용하여 모든 뒤, phsophate buffered saline (PBS)로 세척(washing) 후에 원심분리(centrifugation) 하여 세포를 침전시키는 세척 과정을 2회 반복한 뒤, FACS를 통해 세포(10000 cells/sample)를 흐르는 유액 상태에서 각각의 세포 하나하나를 분석하여, GFP 발현하는 정도를 정량적으로 측정하였다.
5. 결과
B형 간염 바이러스 간염에 의해 형성되는 암 유발 단백질 HBx는 MARCH5 단백질에 의하여 분해된다. 또한, HBx 단백질 양이 증가함에 따라 상위조절자 MARCH5의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
Flag-HBx를 HeLa 세포주에 Myc MARCH5 WT를 농도별로 함께 형질감염(transfection)한 후 세포 용출액(cell lysate)으로 면역블롯팅(immunoblotting)하여 Flag-HBx의 발현수준을 관찰하였다(도 1A). 또한, Myc-MARCH5를 일정하게 발현시킨 MARCH5-GFP-HeLa 세포주를 구축하고, 상기 세포에 Flag-HBx를 농도별로 발현시킨 후 Myc-MARCH5의 수준을 면역블롯팅(immunoblotting)하여 관찰하였다(도 1A)
그 결과, HBx가 동일하게 발현하는 세포에, Myc-MARCH5를 농도를 달리하여 세포 내에 형질감염(transfection) 한 후, HBx의 발현량을 조사한 결과, MARCH5 양이 증가함에 따라 HBx의 발현량이 감소하는 것을 관찰하였다(도 1A 왼쪽).
반대로 Myc-MARCH5 WT을 동일한 양을 세포 내에 발현 시킨 뒤, Flag-HBx를 농도를 달리하여 세포 내에 형질감염(transfection)후 단백질 발현량을 웨스턴 블랏팅(western blotting)으로 관찰한 결과 MARCH5의 발현량이 HBx 농도가 증가함에 따라 함께 증가하는 것으로 관찰되었다(도 1A 오른쪽).
한편, GFP-MARCH5 단백질을 안정적으로 발현시키는 HeLa 세포주를 구축한 후, Flag-HBx 단백질을 농도별로 형질감염(transfection)하여 FACS를 이용하여 GFP형광의 발현 정도로 MARCH5 발현을 측정하여 그 값을 fold 값으로 전환하여 그래프로 나타내었다(도 1B). 같은 세포 용출액(lysates)을 면역블롯팅(immunoblotting)을 이용하여 단백질 발현량을 측정한 뒤, 로딩 대조군(loading control), 튜불린(tubulin)으로 표준화(normalization)하여 그 양을 fold change 값으로 전환하여 그래프로 나타냈다(도 1C).
그 결과, 6 well culture dish의 한 well에 MARCH5-GFP 세포주를 2*105로 세팅한 뒤, Flag-HBx DNA 를 10ng, 20ng 형질감염(transfection)한 뒤, 24시간 뒤에 세포를 모아 FACS를 이용하여 GFP 발현정도를 정량적으로 나타냈다. 이때, control vector로 사용한 pcDNA에 비교하여 볼 때, HBx를 발현시킨 세포에서는 MARCH5-GFP의 발현량이 1~3 % 증가하는 것이 관찰되었다. 이때, 수거한 세포에서 단백질 발현량을 웨스턴 블랏팅(western blotting)을 이용하여 단백질량을 측정하였을 때, 단백질의 양이 1.5~2.5배 이상 증가하는 것을 관찰하였다. FACS를 통하여 GFP의 발현량으로 MARCH5를 측정하였을 때 1%~3%의 증가가 적은 듯하나 그 양을 단백질 양으로 측정하였을 때, 세포 내 단백질이 1.5~2.5배 증가한 것임을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (4)

  1. (1) 미토콘드리아 E3 유비퀴틴 리가제(Mitochondrial E3 Ubiquitin Ligase; MARCH5)를 발현하는 간암 세포주를 구축하는 단계;
    (2) 상기 (1) 단계에서 구축된 간암 세포주에 시험물질을 접촉시키고 MARCH5 발현정도를 측정하는 단계;
    (3) 상기 (1) 단계에서 구축된 간암 세포주에 B형 간염 바이러스 X 단백질(hepatitis B virus X protein; HBx)을 발현시키고 MARCH5 발현정도를 측정하는 단계; 및
    (4) 상기 (3) 단계에서 측정된 MARCH5 발현정도를 대조군으로 하여 상기 (2) 단계에서 측정된 MARCH5 발현정도가 대조군보다 증가한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 간암 치료제 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (4) 단계의 MARCH5 발현정도가 대조군보다 증가한 시험물질은 대조군에 비해 0.5 내지 5 % 증가한 것을 특징으로 하는 간암 치료제 스크리닝 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 MARCH5 발현 정도는 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase chain Reaction, RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블랏(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 간암 치료제 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 간암 세포주는 HeLa 세포인 것을 특징으로 하는 간암 치료제 스크리닝 방법.
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Cho et al. The dual-specificity phosphatase CDC14B bundles and stabilizes microtubules
Hiramoto et al. Dock4 is regulated by RhoG and promotes Rac-dependent cell migration
Skaar et al. INTS3 controls the hSSB1-mediated DNA damage response
Suzuki et al. TRIM39 negatively regulates the NFκB-mediated signaling pathway through stabilization of Cactin
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Park et al. Transglutaminase-2 induces N-cadherin expression in TGF-β1-induced epithelial mesenchymal transition via c-Jun-N-terminal kinase activation by protein phosphatase 2A down-regulation
Dantas et al. Calcium-binding capacity of centrin2 is required for linear POC5 assembly but not for nucleotide excision repair
Dráberová et al. Differential expression of human γ‐tubulin isotypes during neuronal development and oxidative stress points to a γ‐tubulin‐2 prosurvival function
Liu et al. Cyclin I-like (CCNI2) is a cyclin-dependent kinase 5 (CDK5) activator and is involved in cell cycle regulation
Geisler et al. Ubiquitin-specific protease USP36 knockdown impairs Parkin-dependent mitophagy via downregulation of Beclin-1-associated autophagy-related ATG14L
Luo et al. ASK1 controls spindle orientation and positioning by phosphorylating EB1 and stabilizing astral microtubules
Fu et al. Nuclear RNR-α antagonizes cell proliferation by directly inhibiting ZRANB3
Zhang et al. Akt mediated phosphorylation of LARP6; critical step in biosynthesis of type I collagen
Seki et al. CKAP2 is a spindle-associated protein degraded by APC/C-Cdh1 during mitotic exit
Sharma et al. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization
Malonis et al. RNF11 sequestration of the E3 ligase SMURF2 on membranes antagonizes SMAD7 down-regulation of transforming growth factor β signaling
Murakami et al. VCP is an integral component of a novel feedback mechanism that controls intracellular localization of catalase and H2O2 levels
Mora-Santos et al. Glycogen synthase kinase-3β (GSK3β) negatively regulates PTTG1/human securin protein stability, and GSK3β inactivation correlates with securin accumulation in breast tumors
Becker et al. Paucimannosidic glycoepitopes inhibit tumorigenic processes in glioblastoma multiforme

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