KR101516054B1 - A novel method for preparing long-acting human growth hormone monomers - Google Patents
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Abstract
본 발명은 음이온 교환 수지 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 이용하여 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 고순도로 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 NexP-hGH 단백질의 단량체에 관한 것이다. The present invention relates to a method for producing monomers of the NexP-hGH protein, which is a persistent human growth hormone, using anion exchange chromatography in high purity, and a monomer of the NexP-hGH protein prepared by the above method.
Description
본 발명은 음이온 교환 수지 크로마토그래피(anion exchange chromatography)를 이용하여 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 고순도로 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 NexP-hGH 단백질의 단량체에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing monomers of the NexP-hGH protein, which is a persistent human growth hormone, using anion exchange chromatography in high purity, and a monomer of the NexP-hGH protein prepared by the above method.
인간 성장호르몬(human growth hormone, hGH)은 191개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 21,500 Da의 단백질 호르몬으로 체내에서 연골 성장판의 세포 분화를 자극하여 성장을 촉진시키는 기능을 담당한다. 이러한 인간 성장호르몬의 체내 합성 및 분비 결핍이 있을 경우, 저 신장증, 심혈관 질환의 위험도 증가, 근육 및 골밀도 감소 등을 유발할 수 있다.Human growth hormone (hGH) is a protein hormone with a molecular weight of about 21,500 Da, which is composed of 191 amino acids. It stimulates growth of the cartilage growth plate in the body. Such in vivo synthesis and secretion deficiency of human growth hormone can cause hyponaturity, increased risk of cardiovascular disease, and decreased muscle and bone density.
이를 치료하기 위한 하나의 방편으로, 인간은 1950년대 후반부터 인간의 뇌하수체에서 유래한 성장호르몬의 형태로 성장호르몬 치료(growth hormone therapy)를 받게 되었다. 유전공학기술의 발달로 1985년부터 성장호르몬은 대장균이나 효모에서 대량 생산이 가능해져 이를 의약품으로 개발하여 왔으며, 1990년대 후반부터 제약사들은 환자의 투여 편의성을 개선 및 증대시키기 위하여 투여횟수를 크게 줄일 수 있는 지속형 인간 성장호르몬 개발 및 출시하고 있다. 구체적으로, 1999년 제넨텍 사는 봉합체(encapsulation)로 만든 서방형 제품인 뉴트로핀 디팟 (nutropin depot)을 최초로 출시하였으며, 국내에서는 LG 생명과학에서 히알루론산을 매트릭스로 한 서방형 제품인 디클라제를 2007년 국내에 출시하였다.As a way to treat this, humans have been receiving growth hormone therapy in the form of growth hormone from the human pituitary gland since the late 1950s. As a result of the development of genetic engineering technology, growth hormone has been developed as a pharmaceutical product since it can be mass-produced in E. coli or yeast since 1985. Since the late 1990s, pharmaceutical companies have been able to drastically reduce the administration frequency Has developed and released a sustained human growth hormone. Specifically, in 1999, Genentech first launched a sustained release version of the nutropin depot, which is a sustained-release product made from encapsulation. In Korea, LG Life Science released Diclase, a western-type product using hyaluronic acid as a matrix, To the market.
본 발명자들 역시 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 지속형 인간 성장호르몬을 개발하기 위해 노력하였고, 그 결과 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH를 개발하였다. 이의 제작방법 및 단백질 서열 등은 대한민국 등록특허 제10-1183262호에 개시되었다. 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH는 체내 단백질인 알파-1 안티 트립신(A1AT)의 고유한 체내 활성을 없애고 반감기를 증가시키기 위하여 특정 아미노산을 변형한 NexP를 인간 성장호르몬의 N-말단 또는 C-말단에 유전자 재조합 방식으로 융합한 단백질이다. NexP-hGH는 1세대 인간 성장호르몬에 비해 체내 반감기가 개선된 장점을 지니며, 동물세포인 CHO 세포에서 발현되는 경우 당화가 되도록 만들어져 있어 대장균에서 제조되는 대다수의 1세대 인간 성장호르몬 의약품과 차별점을 가진다.
The present inventors have also tried to develop persistent human growth hormone with an increase in the half-life of the body by maintaining persistence in the body, and as a result, developed the persistent human growth hormone NexP-hGH. Its production method and protein sequence are disclosed in Korean Patent No. 10-1183262. NexP-hGH, a sustained-type human growth hormone, was prepared by dissolving NexP modified with a specific amino acid in the N-terminal or C-terminal of human growth hormone to eliminate the intrinsic activity of alpha-1 antitrypsin (A1AT) In a recombinant manner. NexP-hGH has the advantage of improving half-life in the body compared to the first-generation human growth hormone. It is differentiated from the first-generation human growth hormone drug manufactured in E. coli, because it is glycosylated when expressed in animal cells, CHO cells I have.
또한, NexP와 융합된 hGH는 hGH 자체의 구조 및 화학적 특성을 여전히 보유하고 있다. hGH는 중합체를 잘 이루는 단백질로 알려져 있는데, 중합체 형태의 hGH는 체내에서 항원성을 유발할 수 있을 뿐만 아니라, hGH와 이의 수용체 간의 결합을 방해하여 hGH 신호전달을 감소시키는 것으로 알려져 있다. In addition, hGH fused with NexP still retains the structural and chemical properties of hGH itself. It is known that hGH is a protein that forms a polymer well. It is known that hGH in polymer form not only can induce antigenicity in the body, but it also inhibits the binding between hGH and its receptor, thereby reducing hGH signaling.
이러한 중합체는 숙주로부터 목적 단백질 발현시킬 때, 적절한 3차 구조가 형성되지 못한 단백질로부터 발생하거나, 공정 중 목적 단백질의 안정성 저하로 생성될 수 있다. 상업적 생산에서 상기와 같은 중합체는 제품 유래 불순물인 이상 펩타이드로 분류되어 순도시험에서 그 양이 규제되고 있다. 따라서, 생산 공정 중 중합체를 제거하기 위하여 많은 시도가 있었으며, 일반적으로 중합체와 단량체를 분자량으로 분리하는 크기배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography, SEC)가 일반적으로 이용되고 있다. 그러나 크기배제 크로마토그래피의 경우, 컬럼에 로딩하는 부피가 한정적(일반적으로 bed volume의 10% 이내)이기 때문에 목적 단백질을 고농도로 농축해야 하므로, 고농도 농축이 어려운 단백질에 적용할 경우 수율이 저하되는 등의 문제점이 있다. Such a polymer may be generated from a protein in which an appropriate tertiary structure is not formed when the target protein is expressed from the host, or may be generated due to a decrease in the stability of the target protein in the process. In commercial production, such polymers are classified as ideal peptides, which are product-derived impurities, and their amount is regulated in the purity test. Thus, there have been many attempts to remove the polymer during the production process, and size-exclusion chromatography (SEC), which generally separates the polymer and monomer into molecular weights, is generally used. However, in the case of size exclusion chromatography, since the volume to be loaded on the column is limited (generally within 10% of the bed volume), the target protein must be concentrated at a high concentration. .
이러한 문제를 극복하기 위하여 근래에는 크기배제 크로마토그래피 외에 컬럼을 이용한 중합체 분리가 시도되고 있다. 양이온 교환수지를 이용하여 면역 글로불린 중합체와 단량체를 서로 분리하는 방법(일본 공개특허 H7-285885) 및 음이온 교환수지를 이용하여 항체 및 우혈청 알부민 중합체를 단량체와 분리하는 방법(유럽 공개특허 EP 1084136)이 개시된 바 있다. 그러나, 목적 단백질의 단량체를 분리하는 방법은 목적 단백질의 종류 등에 따라 조건이 달라질 수 있으며, 기존에 알려진 방법을 다른 단백질의 분리 및 제조에 적용하는 경우 큰 효과를 나타내지 않는 경우가 빈번하게 존재한다. 따라서, 원하는 목적 단백질에 따라 이의 단량체를 고순도 및 고농도로 분리할 수 있는 적절한 조건을 규명해야 할 필요가 있으며, 이러한 조건을 규명하는 것은 단백질 의약품과 같은 단백질 제조 시장에 있어 매우 중요한 문제이다.
In order to overcome this problem, separation of polymers using columns has been attempted in recent years in addition to size exclusion chromatography. A method of separating an immunoglobulin polymer and a monomer from each other using a cation exchange resin (JP-A H7-285885) and a method of separating an antibody and a bovine serum albumin polymer from a monomer using an anion exchange resin (European Patent Publication EP 1084136) Have been disclosed. However, the method of separating the monomer of the target protein may vary depending on the kind of the target protein and the like, and when the known method is applied to the separation and preparation of other proteins, the case where the monomer does not show a great effect frequently exists. Therefore, it is necessary to identify suitable conditions for separating the monomers thereof into high purity and high concentration according to a desired protein of interest. Identification of such conditions is a very important problem in the protein manufacturing market such as protein drugs.
이에 본 발명자들은 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH의 정제 공정 과정에서 중합체가 형성됨을 확인하여, 기존의 방법으로 정제가 어려웠던 신규한 지속형 인간 성장호르몬의 중합체와 단량체를 서로 분리함으로써, 고순도의 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH의 단량체를 제조하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 음이온 교환 수지를 이용함으로써 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH의 중합체와 단량체를 서로 분리하여 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH의 단량체를 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Accordingly, the present inventors confirmed that a polymer was formed during the purification process of the sustained-type human growth hormone NexP-hGH, and thereby, by separating the new persistent human growth hormone polymer and monomer, which had been difficult to purify by conventional methods, As a result of intensive efforts to develop a method for preparing monomers of human growth hormone NexP-hGH, an anion exchange resin was used to separate the polymer and monomers of the persistent human growth hormone NexP-hGH from each other to form a sustained human growth hormone NexP- hGH can be prepared, and the present invention has been completed.
본 발명의 하나의 목적은 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용하여 인간 성장호르몬 및 알파-1 안티트립신 변이체가 융합된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a method for producing monomers of the NexP-hGH protein, which is a sustained human growth hormone fused with human growth hormone and alpha-1 antitrypsin mutant using anion exchange resin chromatography.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 인간 성장호르몬 및 알파-1 안티트립신 변이체가 융합된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a monomer of NexP-hGH protein, which is a sustained human growth hormone fused with human growth hormone and alpha-1 antitrypsin mutant produced by the above method.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용하여 인간 성장호르몬(hGH) 및 알파-1 안티트립신 변이체(NexP)가 융합된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 제조하는 방법을 제공한다.
In order to accomplish the above object, the present invention provides a method for producing a human growth hormone (hGH) and an alpha-1 antitrypsin variant (NexP), which is a continuous human growth hormone fused with NexP- to provide a method for preparing monomers of hGH protein.
상기 방법은 바람직하게는 a) 전-평형화(pre-equilibration)된 음이온 교환 수지 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 컬럼에 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 혼합액을 포함하는 시료를 주입하는 단계; 및 b) pH 6.0 내지 9.0인 용출 완충용액을 이용하여 0M 내지 0.4M의 염 농도 구배에서 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 용출시키는 단계를 포함할 수 있다.
The method preferably comprises the steps of: a) injecting a sample comprising a mixture of a sustained human growth hormone NexP-hGH protein into a pre-equilibrated anion exchange chromatography column; And b) eluting the monomer of the NexP-hGH protein, a sustained human growth hormone, in a salt concentration gradient from 0 to 0.4 M using an elution buffer solution having a pH of 6.0 to 9.0.
상기 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 숙주세포로부터 생산하는 경우, 인간 성장호르몬 수용체에 결합하여 생물학적 활성을 나타내는 단량체 형태의 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질 외에도, 적절한 3차 구조를 형성하지 못한 NexP-hGH 단백질 또는 NexP-hGH 단백질의 안정성 저하로 인하여 형성된 중합체 형태의 NexP-hGH 단백질이 생산되는 문제점이 있다. 따라서, NexP-hGH 단백질을 숙주 세포로부터 생산하는 경우, NexP-hGH 단백질의 중합체 및 단량체가 모두 포함되어 있는 혼합물로부터 단백질 의약품으로 사용할 수 있는 단량체 형태의 NexP-hGH 단백질을 고순도로 분리해낼 필요성이 존재하였다. 본 발명의 방법은 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용하여 NexP-hGH 단백질의 혼합액으로부터 NexP-hGH 단백질의 단량체를 고순도로 분리하여 제조할 수 있는 방법으로, 단량체 형태의 NexP-hGH 단백질의 분리 및 정제에 유용하게 사용할 수 있다.
When the persistent human growth hormone NexP-hGH protein is produced from a host cell, in addition to the monomeric persistent human growth hormone NexP-hGH protein which binds to the human growth hormone receptor and exhibits a biological activity, it forms an appropriate tertiary structure There is a problem in that the NexP-hGH protein or the NexP-hGH protein, which has not been stabilized, is degraded to produce a polymer-form NexP-hGH protein. Therefore, when a NexP-hGH protein is produced from a host cell, it is necessary to separate NexP-hGH protein in a monomer form which can be used as a protein drug from a mixture containing both a polymer and a monomer of NexP-hGH protein in high purity Respectively. The method of the present invention is a method that can be prepared by separating the monomer of NexP-hGH protein from the mixture of NexP-hGH protein with high purity using anion exchange resin chromatography, and separating and purifying NexP-hGH protein in monomer form It can be useful.
본 발명에서 용어, "인간 성장호르몬(human growth hormone, hGH)"은 펩타이드 호르몬으로서, 인간의 성장, 세포 생산(cell reproduction) 또는 재생(regeneration)을 가져올 수 있는 호르몬을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 인간 성장호르몬은 체내에서 연골 성장판의 세포 분화를 자극하여 성장을 촉진시킬 수 있는 단백질이라면 제한 없이 포함한다. 상기 인간 성장호르몬은 자연적으로 생산된 성장호르몬 및 유전공학기술을 이용하여 생산된 성장호르몬을 모두 포함하며, 바람직하게는 유전공학기술을 이용하여 생산된 성장호르몬이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 인간 성장호르몬에 대한 정보는 미국 국립보건원(NCBI) GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 AAA98618인 인간 성장호르몬 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
The term "human growth hormone (hGH) " in the present invention means a hormone which can induce human growth, cell reproduction or regeneration as a peptide hormone. For the purpose of the present invention, the human growth hormone includes, without limitation, any protein capable of promoting growth by stimulating cell differentiation of a cartilage growth plate in the body. The human growth hormone includes naturally-produced growth hormone and growth hormone produced using genetic engineering techniques, and is preferably, but not limited to, a growth hormone produced using genetic engineering techniques. Information on the human growth hormone can be obtained from a known database such as the National Institute of Health (NCBI) GenBank. Examples of such human growth hormone include, but are not limited to, human growth hormone having an accession number of AAA98618.
상기 인간 성장호르몬은 체내에서 연골 성장판의 세포 분화를 자극함으로써 성장을 촉진시킬 수 있으므로, 체내 합성 또는 분비에 있어 문제가 있는 개체에 있어 치료용 단백질로서 유용하게 사용될 수 있다. 다만, 환자의 투여 편의성 및 치료 효율을 위하여 반감기를 증대시킬 필요성이 있다. 이를 위하여 체내 지속성을 유지함으로써 체내 반감기가 증대된 알파-1 안티트립신 변이체(NexP)를 인간 성장호르몬에 융합시킴으로써, 반감기를 증대시킨 융합 단백질의 형태(NexP-hGH)로서 이용할 수 있다.Since the human growth hormone stimulates cell differentiation of the cartilage growth plate in the body to promote growth, it can be useful as a therapeutic protein in a subject having a problem in the synthesis or secretion of the body. However, there is a need to increase the half-life for ease of administration and therapeutic efficiency of the patient. For this purpose, it can be used as a form of fusion protein (NexP-hGH) having an increased half-life by fusing alpha-1 antitrypsin mutant (NexP) with increased half-life in the body to human growth hormone.
본 발명에서 용어, "NexP-hGH"은 인간 성장호르몬(hGH) 및 알파-1 안티트립신 변이체(NexP)가 융합된 형태의 단백질로서, 본 발명에서 "지속형 인간 성장호르몬"과 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 NexP는 본 발명자들에 의해 개발된 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 체내 단백질인 알파-1 안티 트립신(alpha 1-Antitrypsin, A1AT)의 변이체로, 본 발명자들에 의해 명명된 용어이다. 단백질 분해 효소 억제제의 활성을 없앤 알파-1 안티 트립신의 단백질 서열, 제작 방법 등은 대한민국 등록특허 제10-1183262호에 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1183262호 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로 포함된다. 다만, 본 발명의 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH에 적용될 수 있는 알파-1 안티트립신 변이체는 상기 대한민국 등록특허 제10-1183262호에 개시된 변이체에 한정되지 않고, 알파-1 안티 트립신이 지닌 단백질 분해 효소 억제제로서의 고유한 체내 활성을 없애고 반감기를 증가시킬 목적으로 일정 아미노산을 돌연변이시킨 것을 모두 포함한다. 상기 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH은 이러한 알파-1 안티 트립신(A1AT)의 변이체를 인간 성장호르몬의 N-말단 또는 C-말단에 유전자 재조합 방식으로 융합한 단백질이며, 1세대 인간 성장호르몬에 비해 체내 반감기가 개선된 물질이다. 대다수의 1세대 인간 성장호르몬 의약품은 대장균에서 제조되는 반면, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH는 CHO 세포 등 동물 세포에서 발현되어 당화가 되도록 만들어졌다. 이와 같은 당화는 천연형과 유사한 인간 성장호르몬을 생산하여 인체 내에서 항원성을 유발시킬 위험을 줄일 수 있는 장점이 있다. The term "NexP-hGH" in the present invention is a protein in which human growth hormone (hGH) and alpha-1 antitrypsin mutant (NexP) are fused and can be used in combination with "persistent human growth hormone" have. NexP is a variant of alpha 1-antitrypsin (A1AT), which is an in vivo protein having an increased half-life in the body by maintaining in vivo persistence developed by the present inventors, and is a term named by the present inventors. The protein sequence of alpha-1 antitrypsin, which removes the activity of the protease inhibitor, is disclosed in Korean Patent No. 10-1183262, and Korean Patent No. 10-1183262, the entire specification, . However, the alpha-1 antitrypsin mutant that can be applied to the persistent human growth hormone NexP-hGH of the present invention is not limited to the variants disclosed in Korean Patent No. 10-1183262, but may be a protein degradation product of alpha-1 antitrypsin All of which mutate certain amino acids for the purpose of eliminating the intrinsic activity of the enzyme as an enzyme inhibitor and increasing the half-life. The persistent human growth hormone NexP-hGH is a fusion protein of a mutant of alpha-1 antitrypsin (A1AT) to the N-terminal or C-terminal of human growth hormone in a gene recombinant manner. It is a substance with improved half-life in the body. The majority of first-generation human growth hormone medicines are produced in E. coli, while the sustained human growth hormone NexP-hGH is expressed in animal cells such as CHO cells to be glycosylated. Such glycation has the advantage of reducing the risk of inducing antigenicity in the human body by producing human growth hormone analogous to the natural type.
상기 알파-1 안티트립신은 분자량이 약 50,000Da의 포유류의 혈액 내에 존재하는 단백질 중의 하나로서, 혈액 내 농도는 약 2㎎/㎖에 달하는 주 혈액 단백질 중의 하나이며, 알파-1 프로테아제 억제제(alpha-1 protease inhibitor)라고도 불리운다. 혈액 내에서 추출한 알파-1 안티트립신은 FDA의 허가를 거쳐서 프로라스틴(Prolastin)이라는 상품명으로 폐기종(emphysema) 치료제로 판매되고 있다. 프로라스틴은 통상적으로 60㎎/㎏의 용량으로 1주 간격으로 정맥 주사로 인체에 투여되며, 인체에서의 안전성 및 유해성이 입증이 된 단백질이다. 또한, 알파-1 안티 트립신의 프로테아제 억제제로의 역할 및 구조 등은 이미 잘 알려져 있다(Elliott, P. et al., JMB 275, 419-425, 1998). 상기 알파-1 안티트립신은 자연계에 100여 종 이상의 대립유전자(allele)가 존재하고, 표현형(phenotype)은 IEF(isoelectric focusing) 유형에 따라 A에서 Z로 구분한다(Stoller et al., The Lancet, 365, 2225-2236, 2005). 이중 가장 많은 M 대립 유전자는 정상형으로 아미노산 서열 변이에 의해 다시 M1(Val213), M2, M3와 같이 여러 가지 아형(subtype)으로 구분된다. 따라서, 본 발명에 사용된 알파-1 안티트립신은 자연계에 존재하는 특정 아형이며, 다른 아형에 대하여도 동일한 효과를 얻을 수 있다. 상기 알파-1 안티트립신 단백질에 대한 정보는 미국 국립보건원(NCBI) GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 CAJ15161인 알파-1 안티트립신 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
The alpha-1 antitrypsin is one of the proteins present in the blood of mammals having a molecular weight of about 50,000 Da, one of the main blood proteins having a blood concentration of about 2 mg / ml, and an alpha-1 protease inhibitor 1 protease inhibitor). Alpha-1 antitrypsin extracted from the blood is sold under the FDA's approval as a treatment for emphysema under the trade name Prolastin. Prolactin is a protein that has been shown to be safe and hazardous in humans, administered intravenously to the human body at intervals of one week at a dose of typically 60 mg / kg. In addition, the role and structure of alpha-1 antitrypsin as a protease inhibitor is well known (Elliott, P. et al., JMB 275, 419-425, 1998). The above-mentioned alpha-1 antitrypsin has over 100 kinds of alleles in nature and phenotypes are classified into A to Z according to IEF (isoelectric focusing) type (Stoller et al., The Lancet, 365, 2225-2236, 2005). The most common M allele is a normal type and is divided into several subtypes such as M1 (Val 213 ), M2 and M3 by amino acid sequence mutation. Therefore, the alpha-1 antitrypsin used in the present invention is a specific subtype existing in nature, and the same effect can be obtained for other subtypes. Information on the alpha-1 antitrypsin protein can be obtained from a well-known database such as the National Institute of Health (NCBI) GenBank, for example, but not limited to, the alpha-1 antitrypsin protein with Accession Number CAJ15161.
이러한 알파-1 안티트립신은 특정부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시켜 고유한 체내 활성을 없애고 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 알파-1 안티트립신 변이체에서 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린(Proline, P)이 변이된 것을 특징으로 하며, 보다 구체적으로 아스파라진(Asparagine, N)으로 변이시킨 것을 특징으로 한다. 또한, 알파-1 안티트립신 변이체에서 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이된 것을 포함하고 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 변이시킨 것도 포함한다. 아울러, 상기 다른 위치에 있는 하나 이상의 아미노산의 변이는 9번째 아미노산인 글루타민(Glutamine, Q)이 아스파라진으로의 변이, 232번째 아미노산인 시스테인(Cysteine, C)이 세린(Serine, S)으로의 변이 또는 359번째 세린(Serine, S)이 트레오닌(Threonine, T)으로 변이된 것을 모두 포함한다. 이러한 알파-1 안티트립신 변이체는 357Asn-358X-359Ser 또는 357Asn-358X-359Thr의 새로운 N-당화 부위가 생성되어 알파-1 안티트립신의 프로테아제 억제제의 활성을 중화시키는 동시에 체내 주입시에 아미노산 치환에 의한 면역원성 가능성을 최소화할 수 있으며, 유리 시스테인기에 의한 이중체 형성 등을 제거할 수 있는 장점을 지닌다. Such alpha-1 antitrypsin may be modified by one or more amino acid residues using a site-directed mutagenesis method to eliminate intrinsic activity and increase half-life. In this alpha-1 antitrypsin mutant, the mutation of one or more amino acids is characterized in that Proline (P), which is the 357th amino acid at the P2 position, is mutated, more specifically, asparagine . In addition, the mutation of one or more amino acids in the alpha-1 antitrypsin mutant includes that the proline, which is the 357th amino acid at the P2 position, is mutated to asparagine and mutated at least one amino acid at another position. In addition, the mutation of one or more amino acids at the other position is a mutation of the 9th amino acid Glutamine (Q) to asparagine, a 232th amino acid cysteine (C) to serine (S) Or the 359th serine (S) is mutated to threonine (T). These alpha-1 antitrypsin mutants generate a new N-glycosylation site of 357 Asn- 358 X- 359 Ser or 357 Asn- 358 X- 359 Thr to neutralize the protease inhibitor activity of alpha-1 antitrypsin, It is possible to minimize the possibility of immunogenicity due to amino acid substitution and to remove the formation of a duplex by a free cysteine group.
상기 알파-1 안티트립신 변이체를 융합하여 반감기가 증대된 인간 성장호르몬인 본 발명의 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동물세포에 도입하여 발현함으로써 수득할 수 있다. 상기 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질을 포함하는 수득물은 발현시 적절한 3차 구조를 형성하지 못하거나 정제 과정을 거치는 동안 안정성 저하 등으로 단량체 외에도 중합체를 형성할 수 있다. 이러한 중합체 형태의 지속형 인간 성장호르몬은 생체 내에서 적절한 신호전달을 가져오지 못하거나 항원으로 인식될 수 있어 중합체 및 단량체가 모두 포함되어 있는 시료로부터 단량체를 고순도로 분리해낼 필요가 있다. 본 발명의 제조 방법을 이용하는 경우에는 단량체가 고순도로 포함되어 있는 분획을 분리해낼 수 있다.
The persistent human growth hormone NexP-hGH of the present invention, which is a human growth hormone with an increased half-life by fusing the alpha-1 antitrypsin mutant, is obtained by introducing an expression vector containing a polynucleotide encoding the same into animal cells can do. The resulting product containing the NexP-hGH protein, which is a sustained-type human growth hormone, may not form an appropriate tertiary structure at the time of expression, or the polymer may be formed in addition to the monomer due to decreased stability during purification. Persistent human growth hormone in this polymer form may not be able to deliver adequate signaling in vivo or be recognized as an antigen, so it is necessary to isolate the monomer from the sample containing both the polymer and the monomer in high purity. When the production method of the present invention is used, the fraction containing the monomer in high purity can be separated.
상기 제조 방법의 각 단계를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
Each step of the above manufacturing method will be described in detail as follows.
상기 a) 단계는 전-평형화(pre-equilibration)된 음이온 교환 수지 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 컬럼에 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 혼합액을 포함하는 시료를 주입하는 단계이다. 이와 같은 음이온 교환 수지를 이용하는 경우, 시료 내에 지속형 인간 성장호르몬 외의 다른 성분 등을 제거하는 것이 가능하고, 지속형 인간 성장 호르몬 단량체를 농축할 수 있을 뿐만 아니라, 지속형 인간 성장호르몬의 중합체를 제거할 수 있다.
The step a) is a step of injecting a sample containing a mixture of the sustained-type human growth hormone NexP-hGH protein into a pre-equilibrated anion exchange chromatography column. When such anion exchange resin is used, it is possible to remove components other than the persistent human growth hormone in the sample, and it is possible not only to concentrate the persistent human growth hormone monomer but also to remove the persistent human growth hormone polymer can do.
본 발명에서 용어, "음이온 교환 수지 크로마토그래피(anion exchange chromatography)"는 양으로 하전된 지지체에 음으로 하전된(또는 산성) 분자를 결합시키는 것에 의해 분자들을 이들의 전하에 따라 분리할 수 있는 것으로서, 분자들의 동족체(산성, 염기성 및 중성)는 이 기법에 의해 쉽게 분리할 수 있다. 본 발명의 음이온교환크로마토그래피에 사용될 수 있는 수지로는 강음이온 교환 수지와 약음이온 교환 수지를 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 세파덱스, 세파로즈, 소스, 모노, 미니(상품명, GE healthcare) 등일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 상기 수지의 작용기가 Q(Quaternary amine), DEAE(DiEthylAminoEthyl) 또는 QAE(Quaternary Amino Ethyl) 등인 수지를 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 수지의 작용기가 Q 또는 DEAE 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 강음이온 교환 수지인 Q-세파로즈를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 수지의 작용기가 Q인 Q-세파로즈 수지가 충진된 BPG 컬럼을 사용하였다(실시예 3).
As used herein, the term "anion exchange chromatography" refers to the separation of molecules by their charge by binding negatively charged (or acidic) molecules to a positively charged support , Homologs of the molecules (acidic, basic and neutral) can be easily separated by this technique. As the resin that can be used in the anion exchange chromatography of the present invention, a strong anion exchange resin and a weak anion exchange resin can be used without limitation. Examples thereof include Sephadex, Sepharose, Sauce, Mono, Mini (trade name, GE healthcare) A resin having a functional group Q (Quaternary amine), DEAE (DiEthylminoEthyl) or QAE (Quaternary Amino Ethyl) may be used. Preferably, the functional group of the resin may be Q or DEAE, and most preferably a strong anion exchange resin Q-Sepharose may be used. In one embodiment of the present invention, a BPG column packed with a Q-Sepharose resin in which the functional group of the resin is Q was used (Example 3).
본 발명의 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 사용되는 음이온 교환 수지는 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 혼합액을 포함하는 시료를 주입시키기 전에 수성 완충용액으로 전-평형화(pre-equilibration)시킬 수 있다.
The anion exchange resin used in the anion exchange resin chromatography of the present invention may be pre-equilibrated with an aqueous buffer solution before injecting a sample containing a mixture of the persistent human growth hormone NexP-hGH protein.
본 발명에서 용어, "지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 혼합액을 포함하는 시료"는 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 생산하는 세포의 배양 상등액(cell culture supernant) 또는 상기 세포의 파쇄물(cell extract)로부터 부분 정제된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
In the present invention, the term "a sample containing a mixture solution of a sustained-type human growth hormone NexP-hGH protein" means a culture supernant of a cell producing a sustained human growth hormone NexP-hGH protein, cell extract, but is not limited thereto.
본 발명에서 용어, "부분 정제(partially purified)"는 크로마토그래피와 같은 분류 과정(fractionation procedure)을 하나 이상 수행하였으나 목적하는 NexP-hGH 단백질의 단량체 외에도 중합체 등이 존재하는 상태를 의미한다. 상기 부분 정제 과정은 특별히 그 종류가 제한되지 않으며, 그 예로 소수성 크로마토그래피, 음이온 교환 수지 크로마토그래피, 항체 단편이 부착된 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피 또는/및 정용여과(diafiltration)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 부분 정제는 바람직하게는 소수성 크로마토그래피, 음이온 교환 수지 크로마토그래피 및 항체 단편이 부착된 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 이용하여 정제하는 것이며, 더욱 바람직하게는 a) NexP-hGH를 포함하는 시료를 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계, b) 단계 a)에서 생성된 용출액을 소수성 수지 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및 c) 단계 b)에서 생성된 용출액을 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는 부분 정제 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 친화성 크로마토그래피로 정제한 용액은 정용 여과 없이 본 발명의 단량체를 분리하기 위한 음이온 교환 수지 크로마토그래피에 적용될 수 있으나, 이에 국한되지 않으며 정용여과를 거친 다음 본 발명의 제조 방법에 적용하는 것 또한 가능하다.
The term "partially purified" in the present invention refers to a state where at least one fractionation procedure such as chromatography is performed but a polymer or the like exists in addition to the monomer of the desired NexP-hGH protein. The partial purification process is not particularly limited, and examples thereof may include hydrophobic chromatography, anion exchange resin chromatography, affinity chromatography using a resin having an antibody fragment attached thereto, and / or diafiltration, It is not limited. The partial purification is preferably performed using one or more methods selected from the group consisting of affinity chromatography using hydrophobic chromatography, anion exchange resin chromatography and affinity chromatography using an antibody fragment-attached resin, more preferably a ) Applying the sample comprising NexP-hGH to anion exchange resin chromatography, b) applying the eluate produced in step a) to hydrophobic resin chromatography; And c) applying the eluate produced in step b) to an affinity chromatography packed with a resin to which the anti-alpha-1 antitrypsin antibody fragment is attached, but is not limited thereto. The solution purified by affinity chromatography may be applied to anion exchange resin chromatography for separating the monomers of the present invention without dyestuff filtration, but the present invention is not limited to this and is applicable to the production method of the present invention through dyestuff filtration It is possible.
본 발명의 일 실시예에서는 형질전환된 CHO 세포로부터 수득한 배양액을 정용여과하고 이를 Q-세파로즈 수지를 이용한 음이온 교환 수지 크로마토그래피, 페닐 세파로즈를 이용한 소수성 크로마토그래피를 이용하여 순차적으로 정제한 다음, 다시 정용여과를 수행하고, 안티-알파1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피 공정으로 부분 정제하였다(실시예 1 및 2).
In one embodiment of the present invention, the culture obtained from the transformed CHO cells is diallyfiltrated and purified sequentially by anion exchange resin chromatography using Q-Sepharose resin and hydrophobic chromatography using phenyl Sepharose , And further subjected to diafiltration and partially purified by an affinity chromatography process using a resin having an anti-alpha1 antitrypsin antibody fragment (Examples 1 and 2).
또한, 부분 정제된 용출액은 정용여과 단계 없이 pH 6.0 내지 9.0인 0 내지 20mM 트리스(Tris) 완충용액으로 희석한 최종 염 농도가 0 내지 50mM NaCl 또는 0 내지 50mM 염화마그네슘(MgCl2)인 시료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 시료를 여과단계 없이 최종 염 농도가 50mM 이하의 NaCl 또는 50mM 이하 염화마그네슘(MgCl2)으로 희석시켜 사용하는 경우, 정용여과로 인한 중합체의 증가 및 단백질의 손실을 줄일 수 있는 이점을 지닌다.
In addition, the partially purified eluate may be a sample with a final salt concentration of 0 to 50 mM NaCl or 0 to 50 mM magnesium chloride (MgCl 2 ) diluted with a 0 to 20 mM Tris buffer solution having a pH of 6.0 to 9.0 without a dentifrice step But is not limited thereto. When the sample is diluted with NaCl or 50 mM or less of magnesium chloride (MgCl 2 ) having a final salt concentration of 50 mM or less without filtration step, it has an advantage of being able to reduce polymer increase and protein loss due to dentifrice filtration.
상기 b) 단계는 pH 6.0 내지 9.0인 용출 완충용액을 이용하여 0M 내지 0.4M의 염 농도 구배에서 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 용출시키는 단계이다.The step b) is a step of eluting the monomer of the NexP-hGH protein as a sustained-type human growth hormone in a salt concentration gradient of 0 to 0.4M using an elution buffer solution having a pH of 6.0 to 9.0.
구체적으로, b) 단계에서는 시료를 주입한 컬럼을 세척 완충액으로 세척하고, pH 6.0 내지 9.0인 용출 완충용액을 이용하여 염 구배(salt gradient)로 용출시킨다. 상기 염 구배는 연속식 염 구배(continuous salt gradient) 또는 단계식 염 구배(stepwise salt gradient)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 연속식 염 구배 또는 단계식 염 구배는 지속형 인간 성장호르몬의 단량체를 고순도로 분리할 수만 있다면 어느것이든 무방하다. 본 발명의 일 실시예에서는 연속식 염 구배로 지속형 인간 성장호르몬의 단량체를 고순도로 용출하였다(실시예 3).
Specifically, in step b), the column into which the sample is injected is washed with washing buffer and eluted with a salt gradient using an elution buffer solution having a pH of 6.0 to 9.0. The salt gradient can be, but is not limited to, a continuous salt gradient or a stepwise salt gradient. The continuous salt gradient or stepwise salt gradient may be any one as long as it can separate the monomer of the persistent human growth hormone with high purity. In one embodiment of the present invention, the monomer of the sustained-type human growth hormone was eluted with high purity by continuous salt gradient (Example 3).
본 발명의 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 분리할 수 있는 염 농도는 0M 내지 0.4M의 염 농도일 수 있으며, 바람직하게는 50mM 내지 300mM의 염 농도이며, 더욱 바람직하게는 100mM 내지 250mM의 염 농도일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염은 바람직하게는 나트륨 염이며, 더욱 바람직하게는 염화나트륨이나, 이에 제한되지 않는다.
The salt concentration at which the monomer of the NexP-hGH protein of the present invention can be isolated may be a salt concentration of 0M to 0.4M, preferably a salt concentration of 50 mM to 300 mM, more preferably 100 mM ≪ / RTI > to 250 mM, but is not limited thereto. In addition, the salt is preferably a sodium salt, more preferably, but not limited to, sodium chloride.
상기 세척 및 용출 단계에서 사용되는 완충용액은 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로 인산나트륨(Sodium phosphate) 완충용액, 인산칼륨(Potassium phosphate) 완충용액 또는 트리스(Tris) 완충용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 단, MgCl2 가 포함된 트리스(Tris) 완충용액에서 NexP-hGH의 보관시간이 길어지면 중합체가 증가하므로 세척 및 용출단계에는 MgCl2를 제거하는 것이 바람직하다.The buffer solution used in the washing and elution steps is not particularly limited and may be, for example, a sodium phosphate buffer solution, a potassium phosphate buffer solution or a Tris buffer solution. It is not limited. However, MgCl 2 , It is preferable to remove MgCl 2 in the washing and elution steps, since the polymer is increased when the storage time of NexP-hGH is prolonged in the Tris buffer solution containing Tris buffer.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 포함하는 배양액을 형질전환된 CHO 세포로부터 수득하였고, 이를 정용여과한 다음, 음이온 교환 수지 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 순차적으로 수행하여 정제하였다. 그 다음, 다시 정용여과하고 항-알파1-안티트립신 항체 단편이 부착된 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 이와 같은 과정으로 부분정제한 SE-HPLC 상 순도 약 90%인 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 단량체를 포함하는 시료를 Q-세파로즈 수지를 사용한 음이온 크로마토그래피 컬럼(BPG 컬럼, 직경 7cm)에 40㎖/min의 유속으로 주입하여 결합시킨 후, 20mM 트리스 완충용액(pH 7.4) 및 20mM 인산나트륨 용출 완충용액(pH 7.4)를 순차적으로 40㎖/min의 유속으로 3 컬럼 용량을 흘려 불순물을 세척하였다. 그 다음, 0.4M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 용출 용매(pH 7.4)를 사용하여 40㎖/min의 유속으로 10 컬럼 용량만큼 연속식 염 농도구배로 흘려 지속형 인간 성장호르몬을 용출하였다. 그 결과, 100mM 내지 250mM의 NaCl 농도에서 지속형 인간 성장호르몬을 고순도로 분리해냈으며, 반면, 250mM 내지 350mM의 NaCl 농도에서는 단량체에 비하여 60% 이상의 중합체를 포함하는 지속형 인간 성장호르몬이 분리되었다(도 1 및 2). 또한 이와 같은 방법으로 중합체가 분리된 고순도의 지속형 인간 성장호르몬은 12mg/㎖ 이상의 고농도로 농축하여도 중합체가 1% 이상 증가되지 않음을 확인하였다. According to one embodiment of the present invention, a culture medium containing the persistent human growth hormone NexP-hGH protein is obtained from transformed CHO cells, subjected to dentifrice filtration, and then subjected to anion exchange resin chromatography and hydrophobic chromatography sequentially Respectively. Then, it was again filtered by diafiltration and purified by affinity chromatography using a resin to which an anti-alpha1-antitrypsin antibody fragment was attached. A sample containing monomers of the persistent human growth hormone NexP-hGH protein having a purity of about 90% on partially purified SE-HPLC was subjected to an anion chromatography column (BPG column, diameter 7 cm) using Q-Sepharose resin, (PH 7.4) and 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) were sequentially passed through the column at a flow rate of 40 ml / min to obtain impurities And washed. Then, continuous human growth hormone was eluted using a 20 mM sodium phosphate elution solvent (pH 7.4) containing 0.4 M NaCl at a flow rate of 40 ml / min to a continuous salt concentration gradient of 10 column volumes. As a result, persistent human growth hormone was isolated at a NaCl concentration of 100 mM to 250 mM in high purity, whereas at a NaCl concentration of 250 mM to 350 mM, persistent human growth hormone containing 60% or more polymer was isolated 1 and 2). In addition, it was confirmed that the high-purity persistent human growth hormone in which the polymer was isolated in this manner was not increased by more than 1% even when the concentration was as high as 12 mg / ml or more.
따라서, 본 발명은 분리가 용이하지 않은 중합체 형태의 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 효율적으로 제거하여 단량체 형태의 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질만을 고순도로 분리할 수 있는 방법으로, 바람직하게는 95 내지 100%의 순도로 NexP-hGH를 분리하여 제조하는데 이용할 수 있다.
Accordingly, the present invention provides a method for efficiently separating the monomeric persistent human growth hormone NexP-hGH protein in high purity by efficiently removing the persistent human growth hormone NexP-hGH protein, which is not easily separated from the polymer, To isolate NexP-hGH at a purity of 95 to 100%.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인간 성장호르몬(hGH) 및 알파-1 안티트립신 변이체(NexP)가 융합된 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 제공한다.In another aspect, the present invention provides monomers of the NexP-hGH protein, which is a sustained human growth hormone fused with human growth hormone (hGH) and alpha-1 antitrypsin mutant (NexP) produced by the above method.
상기 인간 성장호르몬, 알파-1 안티트립신 변이체 및 NexP-hGH에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
The above human growth hormone, alpha-1 antitrypsin mutant and NexP-hGH are as described above.
본 발명의 방법은 음이온 교환 수지를 이용하여 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 중합체와 단량체를 포함하는 혼합물로부터 단량체만을 99% 이상의 높은 순도로 얻을 수 있는 장점을 지닌다. 본 발명의 방법에서 제공하는 고순도의 정제 방법을 생산 공정에 적용할 경우, 대량으로 고농도 및 고순도의 지속형 인간 성장호르몬을 정제할 수 있으며, 이로 인해 생활성(bioactivity)를 높이고 항원성을 감소시킬 수 있는 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 제조할 수 있어, 본 발명은 지속형 인간 성장호르몬의 산업적 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
The method of the present invention has an advantage that only monomers can be obtained from a mixture containing a polymer of NexP-hGH, which is a persistent human growth hormone, and monomers using an anion exchange resin at a high purity of 99% or more. When the high purity purification method provided by the method of the present invention is applied to the production process, it is possible to purify the high-concentration and high-purity persistent human growth hormone in a large amount, thereby increasing the bioactivity and reducing the antigenicity The present invention can be usefully used for the industrial production of sustained human growth hormone.
도 1은, 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용하여 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH의 중합체 및 단량체를 분리한 크로마토그래피를 나타낸 도이다.
도 2는, 음이온 교환 수지 크로마토그래피에서 분획(fraction)별 지속형 인간 성장호르몬 단량체의 순도를 SE-HPLC(Size exclusion-HPLC)로 측정한 결과를 나타내는 도이다. 도 2a는, 음이온 교환 수지 크로마토그래피에서 100mM 내지 250mM의 염 농도에서 수득한 고순도의 지속형 인간 성장호르몬 단량체를 나타내며, 도 2b는, 음이온 교환 수지 크로마토그래피에서 250mM 내지 350mM의 염 농도에서 수득한 인간성장호르몬 단량체의 순도를 나타낸다.Brief Description of the Drawings Figure 1 is a chromatogram showing the separation of polymers and monomers of the persistent human growth hormone NexP-hGH using anion exchange resin chromatography.
FIG. 2 shows the results of SE-HPLC (size exclusion-HPLC) measurement of the purity of the persistent human growth hormone monomer by fraction in anion exchange resin chromatography. Figure 2a shows a high purity sustained human growth hormone monomer obtained at salt concentrations of 100 mM to 250 mM in anion exchange resin chromatography and Figure 2b shows the concentration of human It represents the purity of the growth hormone monomer.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example
1: 지속형 인간 성장호르몬 1: Persistent human growth hormone
NexPNexP
--
hGHhGH
의 제조Manufacturing
<1-1> 인간 성장호르몬/알파-1 <1-1> Human growth hormone / alpha-1 안티트립신Antitrypsin 변이융합체를Mutant fusions 발현하는 벡터의 제조[ Preparation of Expression Vector [ hGHhGH /A1 AT(/ A1 AT ( Q9NQ9N ,, P357NP357N )])]
인간 성장호르몬을 알파-1 안티트립신 변이융합체의 N 말단에 융합시킨 단백질을 발현하는 벡터를 제조하기 위하여 우선, 부위 특이적 돌연변이(site directed mutagenesis)를 통하여 357번 프롤린(Proline, P)을 아스파라진(Asparagine, N)으로 치환시킨 알파-1 안티트립신 변이체(A1AT(P357N))를 제조하였다. 그 다음, 이를 Xho1과 BamH1 제한효소 부위를 가지는 pG001 유래 PCR product hGH 및 벡터 pAV1과 클로닝하여 pT107을 제조하였다. pT107은 hGH와 A1AT가 링커 없이 결합되어 있는 P357N 변이체이다. 당화 증가를 위하여 이 클론의 A1AT(P357N)를 9번 글루타민을 아스파라진으로 점 돌연변이(point mutation)시켜서 이중 변이체(A1AT(Q9N, P357N))을 만들고 DHFR 유전자 및 Kozac 서열 등을 추가 삽입하여 벡터를 제조하였다. 상기 벡터에서 발현되는 인간 성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체를 107N으로 명명하였다.
In order to prepare a vector expressing a protein in which human growth hormone is fused to the N-terminus of the alpha-1 antitrypsin mutant fusions, proline (P) 357 is first converted to asparagine through a site directed mutagenesis (A1AT (P357N)) substituted with Asparagine (N) to prepare an alpha-1 antitrypsin mutant. Then, it was cloned with pG001-derived PCR product hGH and vector pAV1 having restriction sites of Xho1 and BamH1 to prepare pT107. pT107 is a P357N variant in which hGH and A1AT are linked without a linker. To increase glycosylation, the A1AT (P357N) of this clone was subjected to point mutation of 9 glutamine with asparagine to make a double mutant (A1AT (Q9N, P357N)), DHFR gene and Kozac sequence were further inserted, . The human growth hormone / alpha-1 antitrypsin mutant fusion expressed in this vector was designated 107N.
<1-2> 지속형 인간성장호르몬 <1-2> Persistent human growth hormone NexPNexP -- hGHhGH 인 인간 성장호르몬/알파-1 Human Growth Hormone / Alpha-1 안티트립신Antitrypsin 변이융합체Mutant fusant 107N의 발현 Expression of 107N
상기 <1-1>의 벡터로 만들어진 클론을 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO)에 형질도입시키고 인간 성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체(107N)의 발현을 확인하였다. 인간 성장호르몬/알파-1 안티트립신 변이융합체(107N) 발현 세포는 8% CO2및 37℃ 온도 조건에서, CD Opti-CHO 배지에서 배양하였고, 0.5x106 cells/㎖ 농도로 접종하여 현탁 배양하였다.
The clones made from the vector of <1-1> were transfected into Chinese hamster ovary cells (CHO) and the expression of the human growth hormone / alpha-1 antitrypsin mutant fusion (107N) was confirmed. Human growth hormone / alpha-1 antitrypsin mutant fusions (107N) expressing cells were cultured in CD Opti-CHO medium at 8% CO 2 and 37 ° C temperature conditions and suspended in 0.5 × 10 6 cells / .
실시예Example 2: 음이온 교환 수지, 소수성 수지 크로마토그래피 및 2: anion exchange resin, hydrophobic resin chromatography and 안티Anti 알파1Alpha 1 -- 안within 티트립신 항체 단편이 부착된 수지를 이용한 지속형 인간 성장호르몬 A sustained-type human growth hormone using a resin with a trypticin antibody fragment attached thereto NexPNexP -- hGHhGH 의 정제Purification of
상기에서 형질 전환된 CHO 세포로부터 제조한 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH을 발현하여 얻은 배양액 약 2ℓ를 20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 8.0)을 이용하여 한외 여과 시스템(분자량 컷 오프 30,000)을 이용하여 정용여과 (diafiltration)하였다. Approximately 2 L of the culture obtained by expressing the persistent human growth hormone NexP-hGH prepared from the transformed CHO cells was cultured in an ultrafiltration system (molecular weight cut-off 30,000) using 20 mM sodium phosphate buffer solution (pH 8.0) Followed by diafiltration.
약 250㎖ Q-sepharose(GE Healthcare사) 수지를 XK-50컬럼(GE Healthcare사)에 충진 한 다음, 20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 8.0)을 충분히 흘려 컬럼을 평형화시켰다. 준비된 Q-sepharose 컬럼에 상기 정용여과액 약 1ℓ를 20㎖/min의 유속으로 흘린 후, 다시 20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 8.0)을 약 3CV(column volume)흘려 컬럼을 세척하였다. 그 다음, 100mM NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 8.0)을 20㎖/min의 유속으로 약 3CV정도 흘려 불순 단백질들을 제거한 후, 180mM NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 8.0)을 20㎖/min의 유속으로 약 3CV정도 흘려 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH가 포함된 용액을 회수하였다.
Approximately 250 ml of Q-sepharose (GE Healthcare) resin was filled in an XK-50 column (GE Healthcare), and the column was equilibrated by sufficiently flowing 20 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0). About 1 L of the above-mentioned filtrate was passed through a prepared Q-sepharose column at a flow rate of 20 mL / min, and then the column was washed with about 20 CV of sodium phosphate buffer solution (pH 8.0). Then, 20 mM sodium phosphate buffer solution (pH 8.0) containing 100 mM NaCl was flown at about 20 C / min at a flow rate of 20 ml / min to remove impurity proteins. Then, 20 mM sodium phosphate buffer solution (pH 8.0) containing 180 mM NaCl was added The solution containing the sustained-type human growth hormone NexP-hGH was recovered by flowing about 3 CV at a flow rate of 20 ml / min.
Q-sepharose 컬럼 용출액에 4M NaCl/20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 8.0)을 첨가하여 약 2.5M NaCl/20mM 소듐 포스페이트(pH 8.0)가 되도록 하여 페닐-세파로즈(Phenyl-sepharose) 로딩액을 준비하였다.A phenyl-sepharose loading solution was prepared by adding 4M NaCl / 20mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) to the Q-sepharose column eluate to make about 2.5M NaCl / 20mM sodium phosphate (pH 8.0) .
약 250㎖ 페닐-세파로즈(GE Healthcare사) 수지를 XK-50컬럼(GE Healthcare사)에 충진한 다음, 2.5M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.5)을 충분히 흘려 컬럼을 평형화시켰다. 준비된 페닐-세파로즈 컬럼에 상기 페닐-세파로즈 로딩액 약 1.2ℓ를 20㎖/min의 유속으로 흘린 후, 다시 2.5M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 8.0)을 약 3CV(column volume)흘려 컬럼을 세척하였다.About 250 ml of phenyl-sepharose (GE Healthcare) resin was filled into an XK-50 column (GE Healthcare) and the column was equilibrated by flowing 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) containing 2.5 M NaCl . About 1.2 L of the phenyl-Sepharose loading solution was passed through the prepared phenyl-Sepharose column at a flow rate of 20 mL / min, and then 20 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) containing 2.5 M NaCl was added to about 3 CV ) To wash the column.
20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 8.0)을 20㎖/min의 유속으로 약 4CV정도 흘려 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH가 포함된 용액을 회수하였다.20 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0) was flowed at a flow rate of about 4 CV at a flow rate of 20 ml / min to recover a solution containing the sustained-type human growth hormone NexP-hGH.
그 다음, 상기에서 얻은 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH가 포함된 용액 약 1ℓ를 150mM NaCl이 포함된 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.4)을 이용하여 한외 여과 시스템(분자량 컷 오프 30,000)으로 정용여과(diafiltration)하였다.Next, about 1 L of the solution containing the persistent human growth hormone NexP-hGH obtained above was diluted with an ultrafiltration system (molecular weight cut-off 30,000) using a Tris buffer solution (pH 7.4) containing 150 mM NaCl Followed by diafiltration.
약 250㎖ 안티 알파1-안티트립신(A1AT) 항체 단편이 부착된 수지(GE Healthcare사, 이하 'AIAT'로 명명)를 XK-50컬럼(GE Healthcare사)에 충진한 다음, 150mM NaCl이 포함된 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.4)을 충분히 흘려 컬럼을 평형화시켰다. 준비된 A1AT 컬럼에 상기 정용여과액 약 1ℓ를 20㎖/min의 유속으로 흘린 후, 다시 150mM NaCl이 포함된 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.4)을 약 3CV(column volume)흘려 컬럼을 세척하였다. 이후 50mM MgCl2가 포함된 트리스(Tris) 완충용액 (pH 7.4)으로 컬럼을 세척한 후, 180mM MgCl2가 포함된 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.4)을 흘려 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH가 포함된 분획을 용출하였다.
(GE Healthcare, hereinafter referred to as "AIAT") was packed in an XK-50 column (GE Healthcare), and about 150 ml of a solution containing 150 mM NaCl was added to a 250 ml anti-1-antitrypsin The column was equilibrated by flowing a sufficient amount of Tris buffer (pH 7.4). About 1 L of the above-mentioned filtrate was passed through the prepared A1AT column at a flow rate of 20 mL / min, and then the column was washed with about 3 CV (column volume) of a Tris buffer solution (pH 7.4) containing 150 mM NaCl. Thereafter, the column was washed with a Tris buffer solution (pH 7.4) containing 50 mM MgCl 2 , and then a Tris buffer solution (pH 7.4) containing 180 mM MgCl 2 was added thereto to obtain a sustained human growth hormone NexP-hGH Was eluted.
상기의 방법으로 정제한 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH은 단량체 대비 중합체의 비율이 10% 이상 존재하였다.
In the persistent human growth hormone NexP-hGH purified by the above method, the ratio of polymer to monomer was more than 10%.
실시예Example
3: 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용한 지속형 인간 성장호르몬 3: Persistent human growth hormone using anion exchange resin chromatography
NexPNexP
--
hGHhGH
중합체와 단량체의 분리 및 정제 Separation and purification of polymer and monomer
상기 실시예 2의 정제된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH는 단량체 대비 중합체의 비율이 10% 이상으로, 단량체 및 중합체가 모두 존재하는 혼합물로부터 단량체만을 특이적으로 분리정제할 필요성이 있다. 이에 본 발명자들은 하기와 같은 방법으로 중합체 및 단량체의 혼합액으로부터 단량체만을 분리정제하였다.The purified sustained-type human growth hormone NexP-hGH of Example 2 has a polymer-to-monomer ratio of 10% or more, and it is necessary to specifically separate and purify only monomers from a mixture in which both monomers and polymers are present. Thus, the present inventors isolated and purified only monomers from a mixture of polymer and monomer by the following method.
상기 실시예 2에서 용출한 NexP-hGH를 Q컬럼 평형 완충용액으로 7배 희석한 다음, Q-세파로즈 수지가 충진된 BPG 컬럼(직경 7cm)에 40㎖/min의 유속으로 부하하여 결합시켰다. 그 다음, 20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.4)을 40㎖/min의 유속으로 3 컬럼 용량으로 사용하여 컬럼에 붙지 못한 불순물을 세척하였다. 지속형 인간 성장 호르몬 NexP-hGH 단량체를 고순도로 분리정제하기 위하여, 0.4M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 용출 용매(pH 7.4)를 40㎖/min 유속으로 10 컬럼 용량만큼 연속식 염 농도 구배로 흘려 NexP-hGH를 용출시켰다. 그 결과, 약 100mM 내지 250 mM의 염 농도에서 단량체가 약 98% 이상인 지속형 인간 성장호르몬이 분리되며, 250mM 내지 350mM의 염 농도에서 단량체 대비 60% 이상의 중합체를 포함하는 지속형 인간 성장호르몬이 분리되는 것을 확인하였다(도 1 내지 2). 또한, 중합체가 분리된 고순도의 지속형 인간 성장호르몬의 경우, 12mg/mL 이상의 고농도로 농축하여도 중합체가 1% 이상 증가되지 않음을 확인하였다.
The NexP-hGH eluted in Example 2 was diluted seven times with a Q column equilibrium buffer solution, and then loaded on a BPG column (diameter 7 cm) packed with Q-Sepharose resin at a flow rate of 40 ml / min to bind. Subsequently, 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) was used at a flow rate of 40 ml / min in three column volumes to wash impurities that were not attached to the column. In order to separate and purify the persistent human growth hormone NexP-hGH monomer in high purity, 20 mM sodium phosphate eluting solvent (pH 7.4) containing 0.4 M NaCl was flowed at a flow rate of 40 ml / min in a continuous salt concentration gradient of 10 column volumes NexP-hGH was eluted. As a result, a persistent human growth hormone with about 98% or more monomer is isolated at a salt concentration of about 100 mM to 250 mM, and a sustained human growth hormone comprising 60% or more polymer relative to monomer at a salt concentration of 250 mM to 350 mM is isolated (Figs. 1 and 2). In addition, it was confirmed that, in the case of the high-purity persistent human growth hormone from which the polymer was isolated, the concentration of the polymer was not increased by more than 1% even when the concentration was as high as 12 mg / mL or more.
상기와 같은 결과는 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용한 본 발명의 방법이 단량체 형태의 NexP-hGH 단백질을 고순도로 분리하는데 매우 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것으로, 특히 100mM 내지 250mM의 염 농도에서 단량체 형태의 NexP-hGH 단백질을 고순도로 분리할 수 있음을 나타내는 결과이다.
The above results show that the method of the present invention using anion exchange resin chromatography can be very useful for separating monomeric NexP-hGH protein in high purity. Especially, it has been found that the monomeric form of NexP-hGH protein at salt concentration of 100 mM to 250 mM This shows that the NexP-hGH protein can be separated in high purity.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.
Claims (11)
b) pH 6.0 내지 9.0인 용출 완충용액을 이용하여 염화나트륨 100mM 내지 250mM의 염 농도 구배에서 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 용출시키는 단계를 포함하는,
지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH 단백질의 단량체를 제조하는 방법.
a) A pre-equilibrated anion exchange chromatography column is loaded with an anion exchange resin chromatography, hydrophobic chromatography, and a resin attached with a resin having an anti-alpha-1 antitrypsin antibody fragment attached thereto. Followed by sequential chromatography to inject a sample containing a mixed solution of a partially purified human growth hormone (hGH) and NexP-hGH protein, which is a persistent human growth hormone fused with alpha-1 antitrypsin mutant (NexP) step; And
b) eluting the monomer of the NexP-hGH protein, a sustained human growth hormone, in a salt concentration gradient of 100 mM to 250 mM sodium chloride using an elution buffer solution having a pH of 6.0 to 9.0.
A method for producing monomers of NexP-hGH protein, a sustained human growth hormone.
2. The method according to claim 1, wherein the sample comprising the mixture of the sustained-type human growth hormone NexP-hGH protein of step (a) has a final salt concentration of from 0 to 50 mM sodium chloride (NaCl) or 0 to 50 mM magnesium chloride (MgCl 2 ).
The method of claim 1, wherein the buffer solution used is a sodium phosphate buffer solution, a potassium phosphate buffer solution or a Tris buffer solution.
2. The method of claim 1, wherein the persistent human growth hormone NexP-hGH protein is a protein produced in animal cells.
The method of claim 1, wherein the salt concentration gradient in step b) is a continuous salt gradient.
The method of claim 1, wherein the salt of step b) is sodium chloride (NaCl).
The process according to claim 1, wherein the functional groups of the anion exchange resin are selected from the group consisting of Quaternary amine, DEEE (DiEthylminoEthyl) and QAE (Quaternary Amino Ethyl).
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