KR101498942B1 - Pharmaceutical Composition for Treatment of Tuberculosis - Google Patents
Pharmaceutical Composition for Treatment of Tuberculosis Download PDFInfo
- Publication number
- KR101498942B1 KR101498942B1 KR1020130082754A KR20130082754A KR101498942B1 KR 101498942 B1 KR101498942 B1 KR 101498942B1 KR 1020130082754 A KR1020130082754 A KR 1020130082754A KR 20130082754 A KR20130082754 A KR 20130082754A KR 101498942 B1 KR101498942 B1 KR 101498942B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- tuberculosis
- mycobacterium tuberculosis
- treatment
- infected
- pharmaceutical composition
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
- A61K31/7056—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing five-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 결핵 치료용 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 AMPK(AMP-activated Kinase) 조절자로 잘 알려진 아이카(AICAR)를 유효성분으로 하는 결핵 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for treating tuberculosis, and more particularly, to a pharmaceutical composition for treating tuberculosis comprising AICAR, which is well known as an AMP-activated kinase (AMPK) modulator, as an active ingredient.
Description
본 발명은 결핵 치료용 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 AMPK(AMP-activated Kinase) 조절자로 잘 알려진 아이카(AICAR)를 유효성분으로 하는 결핵 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a composition for treating tuberculosis, and more particularly, to a pharmaceutical composition for treating tuberculosis comprising AICAR, which is well known as an AMP-activated kinase (AMPK) modulator, as an active ingredient.
결핵(tuberculosis)은 미코박테륨, 특히 결핵균의 감염에 의해 발생하는 전염성 질환이다. 세계적으로 전체 인구의 1/3이 결핵균에 감염되어 있는 것으로 추정되며 매년 약 800백만 명의 새로운 환자가 발생한다. 대부분의 감염자들은 증상이 없고 그 중 1/10 정도가 발병하며. 발병 시 적절한 치료를 하지 않으면 그 중 절반 이상이 사망에 이르게 된다. 전형적인 증상은 피가 섞인 가래를 동반한 기침, 오한, 식은땀, 체중 감소로 몸의 어느 기관에나 감염될 수 있기 때문에 감염된 기관에 따라 다양한 증상을 초래한다.
Tuberculosis is a contagious disease caused by infection with Mycobacterium, especially Mycobacterium tuberculosis. Globally, one third of the total population is estimated to be infected with tuberculosis, and about 800 million new cases occur each year. Most infected people have no symptoms and about one - tenth of them develop. If the disease is not treated properly, more than half of the cases will result in death. Typical symptoms include coughing, chills, cold sweats, and weight loss accompanied by sputum mixed with blood, which can cause infection in any organ of the body, resulting in a variety of symptoms depending on the affected organ.
현재 결핵에 대한 예방 및 치료방법으로 화학요법과 백신법(BCG 접종법)이 있다. 화학요법은 약 85% 정도의 결핵 치료율을 나타내는 매우 효과적인 결핵 치료 방법임에도 불구하고, 6개월 이상 지속적인 투여가 필요하고, 상당한 부작용을 초래하며, 비용이 많이 들 뿐만 아니라 다약제내성 결핵에 대해서는 효능이 불투명하다는 문제가 있다. 특히 결핵균은 약 106세포분열마다 한 개의 돌연변이주가 출현하기 때문에 최소한 2종 이상, 가능하면 4종 이상의 약제를 병용해야 하는데, 그럼에도 하나의 약제에 대한 내성이 생기는 경우 특별한 대처방법이 없다는 것이 화학요법의 가장 큰 문제점이다. 현재 전 세계적으로 약 5000만명의 다약제내성 결핵 환자가 있지만, 이에 대한 치료효율은 50% 정도 밖에 되지 않는다. 실제로 결핵으로 인한 사망률은 90년대 이후 다시 증가하고 있는데 이는 다약제내성(multi-drug resistant; MDR) 결핵균에 의한 감염 증가와 HIV/TB 동시감염의 증가가 주원인으로 판단된다. Currently, there is chemotherapy and vaccination (BCG vaccination) as a preventive and therapeutic method for tuberculosis. Although chemotherapy is a highly effective method of treating tuberculosis with approximately 85% of tuberculosis, it requires continuous administration for more than 6 months, causes considerable side effects, is costly, and has efficacy for multidrug-resistant tuberculosis There is a problem of opacity. In particular, in the case of tubercle bacillus, one mutation occurs at about 10 6 cell division. Therefore, at least two or more, possibly four or more, drugs should be used. Nevertheless, when there is resistance to one drug, Is the biggest problem. Currently, there are about 50 million multidrug-resistant tuberculosis patients worldwide, but the treatment efficiency is only about 50%. In fact, the mortality rate from tuberculosis has increased since the 1990s. This is mainly attributable to the increase in infection by multi-drug resistant (MDR) tuberculosis and the increase in HIV / TB co-infection.
체내 에너지 상태는 ATP(Adenosine Triphosphate) 및 AMP(Adenosine Monophosphate)의 비율에 의해 결정되는데 ATP농도가 높아지면 세포는 자신의 에너지 상태가 충분한 것으로 인식하고 잉여 에너지를 글리코겐이나 지방산 등의 형태로 저장하는 반면, ATP농도가 낮아지고 AMP 농도가 높아지면 에너지가 부족한 일종의 절식 상태로 인식해 저장된 에너지원을 분해해 ATP를 생성한다. The energy state of the body is determined by the ratio of ATP (Adenosine Triphosphate) and AMP (Adenosine Monophosphate). When the ATP concentration is high, the cell recognizes that its energy state is sufficient and stores the surplus energy in the form of glycogen or fatty acid When the ATP concentration is lowered and the AMP concentration is increased, it is recognized as a kind of fasting state in which the energy is insufficient and decomposes the stored energy source to generate ATP.
AMPK(AMP-activated Kinase)는 세포내 AMP/ATP비율을 감지하는 센서 역할을 하며, AMP 증가 시 즉, 세포의 에너지가 부족하면 활성이 증가해 대사 관련 효소들을 촉진시키는 방향으로 조절한다. 이 때문에 AMPK는 당뇨병, 비만 등 여러 대사 질환의 치료제를 개발하는데 표적 유전자로 주목받아 왔고 실제 AMPK를 표적으로 하는 많은 약물이 국내외에서 개발 중이다. AMPK (AMP-activated kinase) acts as a sensor to detect the intracellular AMP / ATP ratio. When the AMP increases, that is, when the energy of the cell is insufficient, the activity is increased to control the metabolism-related enzymes. Because of this, AMPK has been attracting attention as a target gene for the development of therapeutic agents for various metabolic diseases such as diabetes and obesity, and many drugs targeting AMPK are being developed at home and abroad.
실례로 AMPK를 활성화하는 메트포르민(metformin)은 강력한 혈당강하 작용이 있어 제2형 당뇨병 치료제로 널리 사용되어 지난 50년간 부작용 없는 당뇨병 치료제로 인정받아 왔다. 또한 AMPK 조절을 통해 일부 암을 치료할 수 있을 것이라는 연구 결과에 따라 당뇨병 치료제인 메트포르민을 항암제로도 이용할 수 있는 가능성이 제기됐다. 또 다른 AMPK의 조절자이며, AMP-analog(ZMP)로 잘 알려진 아이카(AICAR, 5-amino-1-β-d-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide)는 AMPK의 활성을 촉진시켜서 중성지방을 비롯한 지질 생합성 과정을 억제한다고 알려져 있으나, 아직까지 아이카가 대사관련 질환이 아닌 박테리아에 의한 감염질환인 결핵에 효과가 있다는 것은 보고된 바 없다. For example, metformin, which activates AMPK, has been widely used as a treatment for
본 발명자들은 결핵균에 감염된 대식세포에서 항결핵제가 결핵균의 생존률을 감소시키고, 자가포식을 유도하며, 활성 산소종을 분석시키는 것을 확인하고, (A) 대식세포에 결핵균을 감염시키는 단계; (B) 결핵균이 감염된 대식세포에 항결핵 효능을 측정하고자 하는 시료를 처리하는 단계; (C) 상기 시료의 처리에 의한 ① 자가포식의 유도 여부, ② 활성산소종의 증가 여부 및 ③ 결핵균 생존률의 감소 여부로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 확인하는 단계;를 포함한 항결핵제의 스크리닝 방법에 대해 2012년 3월 5자로 특허출원 제10-2012-22323호로 출원한 바 있다. 본 발명은 상기 방법에 의해 아이카가 항결핵 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
The present inventors confirmed that the anti-tuberculosis agent in the macrophage infected with Mycobacterium tuberculosis reduces the survival rate of Mycobacterium tuberculosis, induces autophagy, and analyzes active oxygen species, (A) infecting macrophages with Mycobacterium tuberculosis; (B) treating a sample to be tested for anti-tuberculosis efficacy against macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis; (C) confirming at least one selected from the group consisting of (1) induction of self-predation by treatment of the sample, (2) increase of active oxygen species and (3) decrease of survival rate of Mycobacterium tuberculosis Filed on March 5, 2012 with a patent application No. 10-2012-22323. The present invention confirms that Aika has an anti-tuberculosis effect by the above method and completed the present invention.
본 발명은 AMPK의 조절자로 알려진 아이카에 대해 결핵균 치료제로서의 새로운 용도를 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.
It is an object of the present invention to provide a new use as a therapeutic agent for Mycobacterium tuberculosis against aka known as an AMPK modulator.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 아이카를 유효성분으로 하는 결핵 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.In order to achieve the above-mentioned object, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating tuberculosis comprising an ace as an active ingredient.
본 발명에서 결핵이라 함은 상기 결핵은 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선결핵, 폐허증, 유방결핵 또는 척추결핵 등을 포함한다.In the present invention, the term " tuberculosis " includes the following: multidrug-resistant tuberculosis, pulmonary tuberculosis, tuberculosis, bone tuberculosis, throat tuberculosis, lymph tuberculosis, pulmonary hypertension, breast tuberculosis or spinal tuberculosis.
하기 실시예에 기재된 바와 같이 특허출원 제10-2012-22323호의 방법에 의해 결핵균에 감염된 대식세포에서 아이카의 처리에 의한 ① 결핵균 생존률의 감소 여부, ② 자가포식의 유도 여부 및 ③ 활성산소종의 증가 여부를 분석한 결과 세 가지 실험 항목 모두에서 아이카가 항결핵 활성이 있음을 나타내어 아이카가 자가포식을 유도함으로써 면역을 유도하여 세포 내에서 결핵균을 사멸시키는 것을 시사하였다. As described in the following examples, it was confirmed by the method of Patent Application No. 10-2012-22323 whether or not the decrease of the survival rate of M. tuberculosis caused by the treatment of AICA in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis, the induction of self-predation and the increase of active oxygen species The results of this study suggest that AICA has antituberculous activity in all three experimental groups, suggesting that AICA induces autophagy and induces immunity and kills Mycobacterium tuberculosis in the cells.
또한, 결핵균 감염 마우스에 대한 아이카의 항결핵효능 분석에 의한 결과, 결핵균 감염 마우스에서 아이카는 자가포식의 증가에 의한 항결핵효능을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
In addition, as a result of the analysis of the anti-tuberculosis effect of Aika against the Mycobacterium tuberculosis-infected mouse, it was confirmed that AICA has antituberculous effect by the increase of self-feeding in the Mycobacterium tuberculosis-infected mouse.
아이카는 심근허혈의 예방과 치료, 급성 림프구성 백혈병의 치료에 이용되고 있으며, 당뇨병의 치료에도 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 운동 효과를 증진시키고 지구력을 향상시키는 효능이 알려지면서 올림픽과 같은 경기에서 도핑 테스트의 대상이 되고 있는 의약품이다. 본 발명에서 아이카의 제형이 한정되는 것은 아니며 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의하여, 그 자체 또는 약학적 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. AICA has been used in the prevention and treatment of myocardial ischemia, in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, and has been shown to be effective in the treatment of diabetes. In addition, it is known that the effect of improving exercise effect and improving endurance is a drug that is subject to doping test in Olympic games. The pharmaceutical composition of the present invention is not limited in the present invention and may be prepared by mixing the pharmaceutical composition with a carrier, a pharmaceutically acceptable carrier, a diluent or the like by a known method in the pharmaceutical field to prepare powder, granule, Or an injectable preparation or the like.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택하여 투여할 수 있다.
The dose of the active ingredient according to the present invention can be appropriately selected depending on the degree of absorption of the active ingredient in the body, the rate of water activation and excretion, the age, sex and condition of the patient, severity of the disease to be treated,
이상과 같이 본 발명의 아이카를 유효성분으로 함유하는 조성물은 자가포식 현상과 활성산소족의 생성을 활성화시키고, 결핵균의 생존율을 현저하게 감소시켜 새로운 결핵 치료제로 사용될 수 있다.
As described above, the composition containing the aika as an active ingredient of the present invention activates autophagic phenomenon and active oxygen group generation, and remarkably reduces the survival rate of Mycobacterium tuberculosis, and can be used as a new therapeutic agent for tuberculosis.
도 1는 결핵균의 세포 내 생존률에 의한 아이카의 항결핵 효능을 보여주는 그래프.
도 2는 결핵균 감염 대식세포에서 자가포식의 마커인 자가포식소체에 대한 아이카의 영향을 보여주는 전자현미경 사진 및 그래프.
도 3과 4은 자가포식의 마커인 LC3B에 의한 아이카의 항결핵 효능 보여주는 그래프.
도 5는 ROS 생성에 의한 아이카의 항결핵 효능을 보여주는 그래프
도 6은 결핵균 감염 마우스에서 아이카에 의한 자가포식의 영향을 보여주는 전기영동 사진.
도 7은 결핵균 감염 마우스에서 아이카에 의한 결핵균 생존률의 영향을 보여주는 그래프.FIG. 1 is a graph showing the anti-tuberculosis efficacy of aika caused by the intracellular survival rate of Mycobacterium tuberculosis.
FIG. 2 is an electron micrograph and graph showing the effect of aika on autoregulated somatic cells, which are self-predominant markers in M. tuberculosis-infected macrophages.
Figures 3 and 4 are graphs showing the anti-tuberculosis efficacy of AICA by LC3B, a self-predominant marker.
FIG. 5 is a graph showing the anti-tuberculosis efficacy of Aika caused by ROS generation
FIG. 6 is an electrophoresis image showing the effect of self-feeding by aika in a Mycobacterium tuberculosis-infected mouse.
FIG. 7 is a graph showing the effect of the survival rate of Mycobacterium tuberculosis caused by aika in a Mycobacterium tuberculosis-infected mouse.
이하 첨부된 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에게는 당연할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, these embodiments are merely examples for explaining the content and scope of the technical idea of the present invention, and thus the technical scope of the present invention is not limited or changed. It will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made within the scope of the technical idea of the present invention based on these examples.
실시예Example
마우스의 대식세포에 결핵균을 감염시킨 후에 아이카(sigma)를 처리하고 세포 내 결핵균 생존율, 자가포식 현상 및 활성산소종의 생성이 아이카에 의해 영향을 받는 지 확인하였다. 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
After infecting the macrophages of mouse with Mycobacterium tuberculosis, the cells were treated with Sigma to determine whether the survival rate of mycobacterium tuberculosis, autopatching phenomenon and production of reactive oxygen species were affected by aikas. Specific experimental methods are as follows.
실시예 1 : 결핵균 감염 대식세포에서의 항결핵 효능 관측Example 1: Observation of anti-tuberculosis efficacy in macrophage infected with Mycobacterium tuberculosis
1. 대식세포의 결핵균 감염 및 아이카 처리1. Mycobacterium tuberculosis infection and aika treatment of macrophages
1) 대식세포 수집 및 배양1) Collection and culture of macrophages
8주령의 야생형 C57BL/6 마우스의 골수로부터 대식세포(macrophage)를 수집하였다. 수집한 골수세포는 배양액[DMEM(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) with 10% fetal bovine serum (Gibco- BRL), sodium pyruvate, nonessential amino acids, penicillin G (100 IU/ml) 및 streptomycin (100 mg/ml)]에 1×105/ml의 농도로 부유시켜 37℃, 5% CO2 조건에서 100파이 petri dish에 부착시켰다. 2시간 후에 세포를 수집하고 원심분리하였다. 세포 배지에 대식세포 집락 인자(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)를 25 ng/ml의 농도로 첨가하여 배양액에 3~4일 동안 대식세포로 분화하여 실험에 사용하였다. 분화한 대식세포가 아닌 림프구들은 기계적인 파괴로 제거하였다.
Macrophages were collected from the bone marrow of 8-week-old wild-type C57BL / 6 mice. The collected bone marrow cells were cultured in DMEM (Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) with 10% fetal bovine serum (Gibco-BRL), sodium pyruvate, nonessential amino acids, penicillin G (100 IU / ml) and
2) 결핵균 감염 및 아이카 처리2) Mycobacterium tuberculosis infection and aika treatment
1)에서 준비한 마우스 대식세포 배지 내에 병원성 결핵균인 Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis)를 배양 세포 1개당 감염된 균의 개체 평균수(multiplicity of infection, MOI)가 1:1~1:10이 되도록 첨가하여 2~4시간 동안 감염시켰다. 감염시킨 후에 AMPK 조절자인 아이카를 0.1, 0.5 또는 1mM의 농도가 되도록 처리하였다. 하기 실험에서 아이카의 농도에 대해 별도의 언급이 없는 경우는 0.5mM의 농도로 처리한 실험군에 대한 것이다.
1) the pathogenic mycobacteria Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) to cultured cells average number per one object (multiplicity of infection, MOI of infected bacteria) in the mouse macrophage culture medium prepared in a 1: 1 to 1: 2 to 10 is added so that the Infected for 4 hours. After infection, the AMPK regulator aka was treated to a concentration of 0.1, 0.5 or 1 mM. In the following experiment, if there is no mention about the concentration of aikachine, it is for the experiment group treated with 0.5 mM concentration.
2. 결핵균 생존률에 대한 아이카의 영향 분석2. Analysis of the effect of Aika on the survival rate of Mycobacterium tuberculosis
1의 2)에 의해 아이카를 처리한 결핵균 감염 대식세포에 대해 아이카의 처리 직전, 처리 3일 후 또는 처리 7일 후 대식세포의 배양액을 제거한 후 멸균 증류수를 가하여 대식세포를 터트렸다. 대식세포 내에 존재하는 결핵균을 동정하기 위하여 7H10 배지를 사용하였고, 37℃ incubator에서 14일 정도 배양한 후 집락형성단위(CFU)를 측정하여 세포내 균 생존율(intracellular survival, ICS)을 확인하고 그 결과를 도 1에 도시하였다. 1, 2, 3, 4, or 7 days after treatment with AICA, the culture medium of macrophages was removed, and sterile distilled water was added to the macrophages. In order to identify mycobacteria present in macrophages, 7H10 medium was used. After culturing for 14 days at 37 ℃ incubator, intracellular survival (ICS) was determined by measuring the CFU Is shown in Fig.
도 1에서 확인할 수 있듯이 결핵균의 세포 내 생존률은 아이카의 첨가 3일 후 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
As can be seen in FIG. 1, the survival rate of the Mycobacterium tuberculosis was significantly decreased 3 days after the addition of the ace.
3. 자가포식에 대한 아이카의 영향 분석3. Analysis of the effect of Aika on self-feeding
1의 2)에 의해 아이카를 처리한 결핵균 감염 대식세포에서 자가포식 마커인 자가포식소체(autophagosome)와 LC3B를 관측하여 자가포식에 대한 아이카의 영향을 분석하였다. The authors investigated the effects of AICA on autophagosomes and autophagosomes and LC3B, which are self-predominant markers, in M. tuberculosis-infected macrophages treated with AICA.
보다 구체적으로 자가포식소체의 확인을 위하여 전자현미경을 이용하여 대식세포 내에 증가한 자가포식소체를 확인하고, 그 결과를 도 2에 도시하였다. 도 2에서 아이카 처리 군에서 식포(phagosome)는 감소한 것에 비해 자가포식소체가 크게 증가하여 자가포식이 증가한 것을 확인할 수 있었다. More specifically, an autogenous phagocyte increased in macrophages using an electron microscope was identified for identification of the autoporosis body, and the results are shown in FIG. In Fig. 2, it was confirmed that the phagosome was decreased in the aika treatment group, but the self-feeding was increased and the self-feeding was increased.
LC3B의 측정을 위하여 1의 대조군 또는 아이카를 24 시간 처리한 대식세포 배양액에 LC3B의 1차 항체인 항LC3B(MBL; 면역형광염색, Cell singaling; 유세포 분석, 1:400)를 이용하여 2 시간동안 실온에서 반응시킨 후, 형광물질이 표지된 2차 항체인 Alexa 488-conjugated anti-rabbit IgG(Molecular probes, 1:400)를 사용하여 1시간동안 실온에서 반응시켰다. For LC3B measurement, the cells were incubated for 2 hours with LC3B primary antibody, anti LC3B (MBL; cell singing; flow cytometry, 1: 400), in a control group or a macrophage culture medium treated for 24 hours After reacting at room temperature, the reaction was carried out at room temperature for 1 hour using Alexa 488-conjugated anti-rabbit IgG (Molecular Probes, 1: 400), a secondary antibody labeled with a fluorescent substance.
이후 공초점 현미경(Confocal microscope)과 유세포 분석기(FACSCanto II)를 이용하여 puncta/cell 또는 평균 형광 강도(Mean fluorescence Intensity, MFI)를 측정하고 그 결과를 도 3과 도 4에 도시하였다. 도 3과 도 4에서 UN 또는 UI는 결핵균으로 감염되지 않은 대식세포군(uninfected), AICAR는 결핵균을 감염시키지 않고 아이카만을 처리한 대식세포군, Mtb는 약제를 처리하지 않은 결핵균 감염 대식세포군, Mtb+AICAR는 아이카를 처리한 결핵균 감염 대식세포군을 나타낸다. The puncta / cell or mean fluorescence intensity (MFI) was measured using a confocal microscope and a flow cytometer (FACSCanto II), and the results are shown in FIGS. 3 and 4. In FIG. 3 and FIG. 4, the UN or UI is uninfected without infection with the Mycobacterium tuberculosis, AICAR is the macrophage group treated with AICA alone without infecting the Mycobacterium tuberculosis, Mtb is the tuberculous infected macrophage group without the drug treatment, Mtb + AICAR Indicates a group of tuberculosis-infected macrophage cells treated with aikase.
도 2 내지 도 4의 결과로부터, 아이카의 처리에 의해 결핵균 감염 대식세포에서 자가포식이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.
From the results shown in Figs. 2 to 4, it was confirmed that self-predation is induced in the mycobacterium-infected macrophages by treatment with aikawa.
4. 활성산소종(ROS) 생성에 대한 아이카의 영향 분석4. Analysis of the effect of AICA on the production of reactive oxygen species (ROS)
1의 2)에 의해 아이카를 처리한 결핵균 감염 대식세포에서 ROS의 생성량을 분석하여 ROS 생성에 대한 아이카의 영향을 분석하였다.1). The effect of AICA on the production of ROS was analyzed by analyzing the amount of ROS produced by the mycobacterium-infected macrophages treated with AICA.
보다 구체적으로 대조군 또는 아이카를 24 시간 처리한 대식세포 배양액에 산화적 형광 염색시약인 mitochondria-specific fluorescent hydroethidine-derivative dye (MitoSOX, Calbiochem)을 10uM의 농도로 첨가하고 30분간 37℃ incubator에서 암실환경 조건으로 반응시켰다. 반응시킨 세포를 유세포 분석기(FACSCanto II system, Becton Dickinsom, USA)를 사용하여 30,000~100,000의 세포를 측정하고 FlowJo software를 이용하여 분석한 후 그 결과를 도 5에 나타내었다. More specifically, mitochondria-specific fluorescent hydro- didine-derivative dye (MitoSOX, Calbiochem), an oxidative fluorescent staining reagent, was added to the macrophage culture medium treated with the control or aikar for 24 hours at a concentration of 10 uM, Lt; / RTI > The reacted cells were counted from 30,000 to 100,000 cells using a flow cytometer (FACSCanto II system, Becton Dickinson, USA) and analyzed using FlowJo software. The results are shown in FIG.
도 5에 의하면 결핵균의 감염 후 아이카를 처리한 군에서만 Mitochondrial ROS가 검출된 것을 확인할 수 있다.
FIG. 5 shows that mitochondrial ROS was detected only in a group treated with aiker after infection with Mycobacterium tuberculosis.
실시예 2 : 결핵균 감염 마우스에서의 항결핵 효능 관측Example 2: Anti-tuberculosis efficacy in mice infected with Mycobacterium tuberculosis
1. 마우스의 결핵균 감염 및 아이카 투여 1. Infections of Mycobacterium tuberculosis and administration of aka
Atg7f/fLysM-Cre- 마우스와 자가포식이 결핍된 마우스 Atg7f/fLysM-Cre+에 BCG를 1x107 CFU의 농도로 정맥주사하여 결핵균에 감염시켰다. 3주 후 결핵균이 감염된 마우스에 아이카를 250, 400 또는 500mg/kg의 용량으로 3일간 복강투여 하였다. 대조군으로는 아이카 대신 PBS 버퍼를 투여하였다.
Atg7 f / f LysM-Cre-mice and autogamy-deficient mouse Atg7 f / f LysM-Cre + were infected with Mycobacterium tuberculosis by intravenous injection of BCG at a concentration of 1 × 10 7 CFU. Three weeks later, mice infected with Mycobacterium tuberculosis were intraperitoneally injected with icecar at a dose of 250, 400 or 500 mg / kg for 3 days. As a control group, PBS buffer was administered instead of AICA.
2. 자가포식에 대한 아이카의 영향 분석2. Effects of Aika on self-feeding
1에서 아이카를 투여한 마우스 및 대조군 마우스를 결핵 감염 4주째에 희생시킨 후 비장을 채취하고 전기영동에 의해 자가포식 마커인 LC3와 p62를 정량하였다. 1 mice were sacrificed after 4 weeks of tuberculosis infection, and spleens were collected and quantified by electrophoresis, LC3 and p62.
보다 상세하게는, 비장을 적출한 후 리파버퍼(Ripa buffer)를 넣고 homogenizer를 이용하여 곱게 갈았다. 이후 일정량의 단백질에 샘플버퍼를 첨가한 후 100℃에서 10분간 끓이고 SDS-page gel에 샘플을 넣고 웨스턴블럿(Western blot)을 실시하여 그 결과를 도 6에 도시하였다. More specifically, the spleen was removed, and then Ripa buffer was added thereto and finely ground using a homogenizer. Thereafter, a sample buffer was added to a certain amount of protein, followed by boiling at 100 ° C for 10 minutes. A sample was added to SDS-PAGE gel and subjected to Western blotting. The results are shown in FIG.
도 6에서 대조군인 Atg7f/fLysM-Cre-에서 AICAR 투여에 의해 LC3는 증가하는 반면, p62는 감소하여 자가포식이 증가함을 확인할 수 있었다. 반면 자가포식 결핍 마우스인 Atg7f/fLysM-Cre+에서는 자가포식의 증가가 대조군에 비해 훨씬 적었다.
In FIG. 6, the control group, Atg7 f / f LysM-Cre-, showed that LC3 was increased by administration of AICAR, while p62 was decreased and self-feeding was increased. On the other hand, in Atg7 f / f LysM-Cre +, an autophagic deficient mouse, the increase of self-feeding was much smaller than in the control group.
3. 결핵균 생존률에 대한 아이카의 영향 분석3. Analysis of the effect of Aika on the survival rate of M. tuberculosis
1에서 500mg/kg의 AICAR를 투여한 실험군과 대조군 마우스를 대상으로 결핵 감염 4주째에 희생시킨 후 비장을 채취하고 세포 내 결핵균의 생존률을 분석하였다. The survival rate of intracellular Mycobacterium tuberculosis was analyzed by collecting the spleen after sacrifice of the AICAR of 1 to 500 mg / kg in the experimental group and control mice at 4 weeks of the tuberculosis infection.
구체적으로, 비장을 적출한 후 homogenizer를 이용하여 곱게 갈았다. 이후 멸균증류수를 넣고 세포를 터트린 후 세포 내에 존재하는 결핵균을 동정하기 위하여 7H10배지, 37℃ incubator에서 14일간 배양한 후 집락형성단위(CFU)를 측정하여 세포내 균 생존율(intracellular survival, ICS)을 확인하였다. Specifically, the spleen was extracted and finely ground using a homogenizer. After incubation with sterile distilled water, the cells were incubated for 14 days at 37 ° C in 7H10 medium to determine the presence of intracellular survival (ICS) by measuring the number of colony forming units (CFU) Respectively.
도 7은 결핵균 감염 마우스에서 아이카에 의한 결핵균 생존률의 영향을 보여주는 그래프로 대조군인 Atg7f/fLysM-Cre-에서는 아이카의 투여에 의해 결핵균의 생존률이 유의하게 감소하였음을 보여준다. 반면 자가포식 결핍 마우스인 Atg7f/fLysM-Cre+에서는 아이카가 결핵균의 생존률에 유의한 영향을 미치지 않아, 아이카의 항결핵능이 자가포식의 증가에 의한 것임을 확인할 수 있었다.
FIG. 7 is a graph showing the effect of the aika-induced Mycobacterium tuberculosis survival rate on the Mycobacterium tuberculosis-infected mouse. In the control group, Atg7 f / f LysM-Cre-, the survival rate of Mycobacterium tuberculosis was significantly decreased by the administration of ace. On the other hand, in the case of Atg7 f / f LysM-Cre +, which is an autophagic deficient mouse, it was confirmed that Aika did not have a significant effect on the survival rate of M. tuberculosis,
Claims (3)
A pharmaceutical composition for the treatment of tuberculosis comprising AICAR (5-amino-1-β-d-ribofuranosyl-imidazole-4-carboxamide) as an active ingredient.
상기 결핵은 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선결핵, 폐허증, 유방결핵 또는 척추결핵인 결핵 치료용 약학 조성물.
The method according to claim 1,
The pharmaceutical composition for treating tuberculosis, wherein the tuberculosis is multidrug-resistant tuberculosis, pulmonary tuberculosis, tuberculosis, bone tuberculosis, throat tuberculosis, lymphatic tuberculosis, pulmonary hypertension, breast tuberculosis or spinal tuberculosis.
상기 조성물은 자가포식을 증가시키는 것을 특징으로 하는 결핵 치료용 약학 조성물.
3. The method according to claim 1 or 2,
Wherein said composition increases autopatch. ≪ RTI ID = 0.0 > 8. < / RTI >
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020120098951 | 2012-09-06 | ||
| KR20120098951 | 2012-09-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20140032312A KR20140032312A (en) | 2014-03-14 |
| KR101498942B1 true KR101498942B1 (en) | 2015-03-05 |
Family
ID=50643968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130082754A KR101498942B1 (en) | 2012-09-06 | 2013-07-15 | Pharmaceutical Composition for Treatment of Tuberculosis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101498942B1 (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104189499A (en) * | 2014-09-24 | 2014-12-10 | 王书美 | Blood-activating and scrofula-removing preparation for treating scrofula and preparation method thereof |
| KR102082285B1 (en) * | 2017-04-13 | 2020-02-28 | 충남대학교산학협력단 | Nutlin-3 And p53 expression modulating composition or method for controlling intracellular Mycobacterium tuberculosis |
| WO2018190680A1 (en) * | 2017-04-13 | 2018-10-18 | 충남대학교산학협력단 | NUTLIN-3α FOR CONTROLLING INTRACELLULAR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, AND COMPOSITION AND METHOD FOR REGULATING EXPRESSION OF P53 |
| KR102107659B1 (en) * | 2018-12-07 | 2020-05-07 | 경상대학교 산학협력단 | Composition for preventing or treating Mycobacterium tuberculosis or nontuberculous mycobacteria infection comprising MMAGNU1 compound |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070270350A1 (en) * | 2003-12-23 | 2007-11-22 | Musc Foundation For Research Development | Methods and Compositions for the Prevention and Treatment of Inflammatory Diseases or Conditions |
| JP4585186B2 (en) * | 2003-07-31 | 2010-11-24 | 杏林製薬株式会社 | Novel preventive or therapeutic agent for obesity, diabetes and abnormal lipid metabolism |
| KR101007044B1 (en) * | 2002-03-21 | 2011-01-12 | 어드밴스드 인 비트로 셀 테크놀로지스, 에스.에이 | New therapeutic use of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribosideacadesine |
-
2013
- 2013-07-15 KR KR1020130082754A patent/KR101498942B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101007044B1 (en) * | 2002-03-21 | 2011-01-12 | 어드밴스드 인 비트로 셀 테크놀로지스, 에스.에이 | New therapeutic use of 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribosideacadesine |
| JP4585186B2 (en) * | 2003-07-31 | 2010-11-24 | 杏林製薬株式会社 | Novel preventive or therapeutic agent for obesity, diabetes and abnormal lipid metabolism |
| US20070270350A1 (en) * | 2003-12-23 | 2007-11-22 | Musc Foundation For Research Development | Methods and Compositions for the Prevention and Treatment of Inflammatory Diseases or Conditions |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140032312A (en) | 2014-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| McCune Jr et al. | Fate of Mycobacterium tuberculosis in mouse tissues as determined by the microbial enumeration technique: I. The persistence of drug-susceptible tubercle bacilli in the tissues despite prolonged antimicrobial therapy | |
| Huffnagle et al. | Down-regulation of the afferent phase of T cell-mediated pulmonary inflammation and immunity by a high melanin-producing strain of Cryptococcus neoformans. | |
| von Koenig et al. | Failure of killed Listeria monocytogenes vaccine to produce protective immunity | |
| KR101498942B1 (en) | Pharmaceutical Composition for Treatment of Tuberculosis | |
| Sano et al. | Comparative in vitro and in vivo antimicrobial activities of sitafloxacin, gatifloxacin and moxifloxacin against Mycobacterium avium | |
| JP2022516983A (en) | Rhodococcus louver products and their pharmaceutical use | |
| Kansal et al. | Change in colony morphology influences the virulence as well as the biochemical properties of theMycobacterium aviumcomplex | |
| Gambrill et al. | Mechanisms of Immunity in Typhus Infections II. Multiplication of Typhus Rickettsiae in Human Macrophage Cell Cultures in the Nonimmune System: Influence of Virulence of Rickettsial Strains and of Chloramphenicol | |
| KR101751930B1 (en) | Pharmaceutical Composition for Treating Mycobacterium tuberculosis or Mycobacterium abscessus Infection | |
| CN111419829B (en) | Application of honokiol in inhibiting streptococcus suis or biofilm thereof | |
| Steenken Jr et al. | Streptomycin in Experimental Tuberculosis, II. Response in Guinea Pigs Infected with Strains of Varying Degrees of Streptomycin Resistance | |
| Murtiastutik et al. | Profile of Candida resistancy to fluconazole in male patient with oral candidiasis and HIV/AIDS | |
| KR101344218B1 (en) | Pharmaceutical composition for treatment of tuberculosis containing fenofibrate | |
| CN110946862B (en) | Application of sanguinarine in inhibition of growth of multiple drug-resistant enterobacter hopcalis | |
| Babalola | The strengths, weaknesses, opportunities and threats (SWOT) analysis of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review | |
| Jamasbi et al. | Phenotypic and genotypic characteristics of clinical isolates of pseudomonas aeruginosa: rate of occurrence and distribution of different serotypes, antimicrobial susceptibility profiles, and molecular typing | |
| Yanamura et al. | Active immunity to the microbacterium multiforme psittacosis in the mouse | |
| Wolinsky et al. | Infrequent appearance of drug resistant strains of tubercle bacilli in experimental animals treated with streptomycin and p-amino-salicylic acid | |
| CN105168139A (en) | Application of silver-coated-palladium nano preparation in preparing medicine for preventing cryptococcus infection | |
| CN110742877B (en) | Medical application of aspidin ABBA in preparation of anti-pneumolysin | |
| KR102659126B1 (en) | Pharmaceutical Anti-Tuberculosis Composition | |
| Erlandson et al. | Characteristics of strains of Escherichia coli associated with severe infections in adults | |
| CN113151083B (en) | Bacteroides dorsalis probiotics and application thereof in preparation of influenza treatment or prevention medicine | |
| CN114159474B (en) | Application of liushen pills in preparation of medicines for treating fungal pneumonia | |
| KR102365657B1 (en) | Pharmaceutical Composition for Prophylaxis or Treating Nontuberculous Mycobacterium Infectious Disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180206 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190207 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200212 Year of fee payment: 6 |