KR101493935B1 - Amyloid-β-specific two-photon fluorescent probe, and method for imaging amyloid-β plaque in vivo using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아밀로이드 베타 플라크에 특이적인 이광자 형광 프로브, 및 이를 이용한 생체 내 아밀로이드 베타 플라크의 영상화 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 혈관뇌장벽을 통과할 수 있고, 아밀로이드 베타에 특이적인 기존의 이광자 형광 프로브(PIB, MeO-X04)에 비하여 염색의 특이성 및 발광강도가 우수할 뿐만 아니라, 생체 내외(ex vivo/in vivo)에서 영상화 능력이 우수하여 알츠하이머 질환의 진단에 유용한 아밀로이드 베타에 특이적인 이광자 형광 프로브로서 유용하게 사용할 수 있다. The present invention relates to a two-photon fluorescent probe specific to an amyloid beta plaque, and a method of imaging the amyloid beta plaque in vivo using the same. The two-photon fluorescence probe according to the present invention is excellent in dyeing specificity and luminescence intensity as compared with a conventional two-photon fluorescent probe (PIB, MeO-X04) capable of passing through a blood vessel brain barrier and specific to amyloid beta, ( ex vivo / in vivo , and thus can be usefully used as a two-photon fluorescent probe specific to amyloid beta, which is useful for diagnosis of Alzheimer's disease.
Description
본 발명은 아밀로이드 베타의 플라크에 특이적인 이광자 형광 프로브, 및 이를 이용한 생체 내 아밀로이드 베타의 영상화 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a two-photon fluorescence probe specific to a plaque of amyloid beta, and a method of imaging amyloid beta in vivo using the same.
알츠하이머 질환은 연령과 관련된 신경퇴행성 장애로 인지능력 손상 및 만성 치매로 이어지는 질환이다. 알츠하이머 질환의 병인은 특정한 뇌 영역에 발생하는 아밀로이드 플라크(amyloid plaque) 및 신경섬유 다발을 포함하는, 베타 아밀로이드의 축적과 관련되어 있는 것으로 알려져 있다. Alzheimer's disease is an age-related neurodegenerative disorder that leads to cognitive impairment and chronic dementia. The pathogenesis of Alzheimer's disease is known to be related to the accumulation of beta amyloid, including amyloid plaques and bundles of nerve fibers that occur in specific brain regions.
현재 알츠하이머 환자의 진단 등에 있어서 이용 가능한 생체 내(in vivo) 영상화 방법은 PET(positron emission tomography), 단일광자방출단층촬영(single photon emission computed tomography), MRI(magnetic resonance imaging), FI(fluorescent imaging) 등이 있다. 합성 프로브(synthetic probe)를 사용하는, PET 및 FI는 아밀로이드 베타의 생체 내 영상화에 적용되어 왔다. 그러나 PET는 단기적인 데이터의 획득에 그칠 뿐이고, 상대적으로 낮은 공간 해상도(spatial resolution)를 갖는다는 한계가 있다. Currently available in vivo for the diagnosis of Alzheimer's patients ( in Vivo imaging methods include positron emission tomography (PET), single photon emission computed tomography (MRI), magnetic resonance imaging (MRI), and fluorescent imaging (FI). PET and FI, which use synthetic probes, have been applied in vivo imaging of amyloid beta. However, PET has a limitation in that it only acquires short-term data and has a relatively low spatial resolution.
형광을 활용한 영상화 방법 중, 단일 광자 형광 프로브를 사용하는 경우는 여기 파장이 짧아(<500 nm) 투과 깊이가 얕고(<100 μm), 광표백(photobleaching) 및 자가 형광 등의 문제를 야기하여 조직에 적용할 수 있는 영상화 방법으로서 한계점이 있었다. Among fluorescence imaging methods, the use of single-photon fluorescence probes causes problems such as short excitation wavelength (<500 nm), shallow depth (<100 μm), photobleaching and autofluorescence, There were limitations as applicable imaging methods.
이에 대한 해결책으로 이광자 형광 프로브 및 이광자 현미경(TPM, Two-photon microscopy)을 이용한 영상화 방법이 개발되었는데, 이광자 현미경은 낮은 여기 에너지를 갖는 2개의 근적외선 광자(near-infrared photon)를 여기원(excitation source)으로 사용하여, 에너지가 높은 자외선에 비해 광표백 및 광손상(photodamage) 현상이 적어 장시간 동안 영상화가 가능할 뿐만 아니라, 영상의 투과 깊이가 깊어서 살아있는 개체의 환부에 직접적으로 적용할 수 있는 능력이 우수하다. As a solution to this problem, an imaging method using a two-photon fluorescence probe and two-photon microscopy (TPM) has been developed. The two-photon microscope employs two near-infrared photons with low excitation energy as an excitation source ), It is possible to perform imaging for a long time due to less photobleaching and photodamage phenomenon than an ultraviolet ray having a high energy, and it has a deep penetration depth of an image and is excellent in ability to be directly applied to a living entity .
현재 아밀로이드 베타의 검출을 위해 사용되고 있는 이광자 형광 프로브의 예로는 MeO-X04(methoxy X04, bisstyrylbenzene) 및 PIB(Pittsburgh Compound-B)가 있다. 상기 두 프로브는 모두 아밀로이드 베타 플라크에 대해 높은 선택성을 보이며 혈관뇌장벽(BBB, blood brain barrier)을 통과하는 능력이 우수하지만, 생체 내(in vivo) 영상화에는 적용이 불가능하다. Examples of two-photon fluorescent probes currently used for the detection of amyloid beta include MeO-XO4 (methoxy XO4, bisstyrylbenzene) and PIB (Pittsburgh Compound-B). The two probes, all showed a high selectivity for beta amyloid plaques has excellent ability to pass the blood brain barrier (BBB, blood brain barrier), but in vivo (in vivo imaging.
아직까지 생체 내에서 아밀로이드 베타의 직접적인 영상화가 가능한 이광자 형광 프로브의 개발은 전무한 상태이며, 생체 내 아밀로이드 베타의 직접적인 영상화는 알츠하이머 질환의 조기 진단 및 질환의 진행에 관한 근본적인 연구에 핵심적인 역할을 할 수 있을 것으로 기대되고 있다. There is no development of two-photon fluorescence probes capable of directly imaging amyloid beta in vivo, and direct imaging of the amyloid beta in vivo can play a key role in the early diagnosis of Alzheimer's disease and fundamental research on the progress of the disease It is expected to be.
따라서, 아밀로이드 베타를 생체 내에서 직접적으로 검출이 가능한 이광자 형광 프로브에 대한 개발의 필요성이 절실히 요구된다.
Therefore, there is a desperate need to develop a two-photon fluorescence probe capable of directly detecting amyloid beta in vivo.
본 발명자들은 아밀로이드 베타를 생체 내에서 직접적으로 검출할 수 있는 이광자 형광 프로브에 대해 연구하던 중, 아밀로이드 베타 플라크에 특이적인 이광자 형광 프로브를 개발하였으며, 개발된 이광자 형광 프로브가 아밀로이드 베타에 특이적인 기존의 이광자 형광 프로브(PIB, MeO-X04)에 비하여 염색의 특이성 및 발광강도가 우수할 뿐만 아니라, 생체 내외(ex vivo/in vivo)에서 영상화 능력이 우수한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.The inventors of the present invention developed a two-photon fluorescent probe specific to amyloid beta plaque while studying a two-photon fluorescent probe capable of directly detecting amyloid beta in vivo. The inventors of the present invention have developed a two-photon fluorescent probe that is specific to amyloid beta two-photon fluorescent probe (PIB, MeO-X04), as well as the specificity and strength of the light-emitting dye superior to, biological and out (ex vivo / in vivo ), and completed the present invention.
따라서, 본 발명은 아밀로이드 베타 플라크에 특이적인 이광자 형광 프로브, 및 이를 이용한 생체 내 아밀로이드 베타의 영상화 방법을 제공하고자 한다.
Accordingly, the present invention provides a two-photon fluorescent probe specific to amyloid beta-plaques, and a method of imaging amyloid beta in vivo using the same.
본 발명은 아밀로이드 베타 플라크에 특이적인 이광자 형광 프로브(SAD1), 및 상기 이광자 형광 프로브를 이용한 아밀로이드 베타의 영상화 방법을 제공한다.
The present invention provides a two-photon fluorescent probe (SAD1) specific to amyloid beta plaques, and a method of imaging amyloid beta using the two-photon fluorescence probe.
본 발명에 따른 이광자 형광 프로브는 혈관뇌장벽을 통과할 수 있고, 아밀로이드 베타에 특이적인 기존의 이광자 형광 프로브(PIB, MeO-X04)에 비하여 염색의 특이성 및 발광강도가 우수할 뿐만 아니라, 생체 내외(ex vivo/in vivo)에서 영상화 능력이 우수하여 알츠하이머 질환의 진단에 유용한 아밀로이드 베타에 특이적인 이광자 형광 프로브로서 유용하게 사용할 수 있다.
The two-photon fluorescence probe according to the present invention is excellent in dyeing specificity and luminescence intensity as compared with a conventional two-photon fluorescent probe (PIB, MeO-X04) capable of passing through a blood vessel brain barrier and specific to amyloid beta, ( ex vivo / in vivo , and thus can be usefully used as a two-photon fluorescent probe specific to amyloid beta, which is useful for diagnosis of Alzheimer's disease.
도 1은 본 발명의 SAD1, PIB, MeO-X04의 일광자 형광 스펙트럼(a,c,e) 및 이들 염료의 PBS 완충용액(pH 7.4) 내에서의 용해도를 나타낸 도이다.
도 2a는 본 발명의 SAD1의 PBS 완충 용액(pH 7.4)에서의 일광자 흡수(실선), 방출(점선) 스펙트럼, 및 SAD1으로 라벨링 된 뇌조직 절편의 아밀로이드 베타 플라크로부터 얻은 이광자 형광 스펙트럼(●)을 나타낸 도이고, 도 2b는 에탄올(EtOH)에서의 SAD1, MeO-X04, 및 PIB의 이광자 작동 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 3는 PBS 완충용액(pH 7.4)에서의 PIB, MeO-X04, 및 SAD1의 이광자 작동 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 pH가 SAD1의 형광 강도에 미치는 영향을, 다양한 완충용액(0.1 M 시트르산 용액, 0.1 M KH2PO4 - 용액, 0.1 M Na2B4O7 용액, 0.1 M Tris 용액, 0.1 M KCl 용액) 에서 측정한 결과로 나타낸 도이다.
도 5는 1,4-dioxane, DMF, EtOH, 및 PBS 완충용액(pH 7.4)에서의 PIB(a,b), MeO-X04(c,d), SAD1(e,f) 각각의 정규화된 흡수(a,c,e) 및 방출(b,d,f) 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 6a, 및 도 6c는 알츠하이머 질환모델 마우스의 해마 조직절편을 SAD1으로 염색한 후 이광자 현미경으로 관찰한 도이고, 도 6b는 도 6a의 밝은 점에서 측정한 정규화된 이광자 형광 스펙트럼을 나타낸 도이며, 도 6d는 도 6c의 A-C 세 점에서 측정한 상대적인 TPEF(Two-photon excited fluorescence) 강도를 시간에 대한 함수로 나타낸 도이다.
도 7a 및 도 7c는 알츠하이머 질환모델 마우스의 뇌조직 절편을 이광자 현미경으로 관찰한 도이고(7a: SAD1, 7c: MeO-X04), 도 7b 및 도 7d는 각각 도 7a 및 도 7c에 대응하는 3차원 영상을 나타낸 도이다.
도 8은 알츠하이머 질환모델 마우스의 뇌조직 절편을 각각, 아밀로이드 베타 플라크와 특이적으로 반응하는 본 발명의 SAD1(a, d) 및 Congo Red 염료(b, e)로 염색한 뒤 관찰한 사진 및 이를 합성하여 겹친 사진을 나타낸 도이다.
도 9는 알츠하이머 질환모델 마우스의 전두엽 피질을 본 발명의 SAD1(a) 및 MeO-X04(b)로 염색한 뒤, 이광자 현미경으로부터 3차원적으로 재건한 영상을 나타낸 도이다.1 is a graph showing the one-photon fluorescence spectra (a, c, e) of SAD1, PIB, MeO-X04 of the present invention and solubility of these dyes in PBS buffer solution (pH 7.4).
Figure 2a shows the photon absorption (solid line), emission (dotted line) spectrum and SAD1-labeled two-photon fluorescence spectrum (●) obtained from amyloid beta plaques of brain tissue sections in PBS buffer (pH 7.4) 2B shows a two-photon operation spectrum of SAD1, MeO-XO4, and PIB in ethanol (EtOH). FIG.
Figure 3 is a diagram showing the two-photon operating spectra of PIB, MeO-XO4, and SADl in PBS buffer (pH 7.4).
Figure 4 is a variety of buffer affected the pH of the present invention on the fluorescence intensity of SAD1, (0.1 M citric acid solution, 0.1 M KH 2 PO 4 - solution, 0.1 M Na 2 B 4 O 7 solution, 0.1 M Tris solution, 0.1 M KCl solution).
Figure 5 shows the normalized absorption of PIB (a, b), MeO-XO4 (c, d) and SAD1 (e, f) in 1,4-dioxane, DMF, EtOH, and PBS buffer (a, c, e) and emission (b, d, f) spectra.
FIGS. 6A and 6C are photographs of hippocampal tissue sections of Alzheimer's disease model mice stained with SAD1 and observed with a two-photon microscope. FIG. 6B is a diagram showing normalized two-photon fluorescence spectra measured at the light points of FIG. FIG. 6D is a graph showing the relative intensity of two-photon excited fluorescence (TPEF) measured at three AC points in FIG. 6C as a function of time. FIG.
7A and 7C are diagrams showing a brain tissue section of a model mouse of Alzheimer's disease with a two-photon microscope (7a: SAD1, 7c: MeO-X04) FIG.
FIG. 8 is a photograph showing the brain tissue sections of Alzheimer's disease model mice stained with SAD1 (a, d) and Congo Red dyes (b, e) of the present invention which specifically react with amyloid beta plaques, And Fig.
FIG. 9 is a diagram showing images reconstructed three-dimensionally from a two-photon microscope after dyeing the frontal cortex of Alzheimer's disease model mouse with SAD1 (a) and MeO-X04 (b) of the present invention.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 포함하는, 생체 세포 또는 생체 조직의 아밀로이드 베타 플라크 검출용 이광자 형광 프로브를 제공한다.The present invention provides a two-photon fluorescence probe for detecting amyloid beta-plaques of living cells or living tissues, comprising a compound represented by the following formula (1).
[화학식 1][Chemical Formula 1]
상기 화학식 1의 화합물의 화학명칭은 6-(6-hydroxy-benzo[d]thiazol-2'-yl)-2-(N,N-dimethylamino)naphthalene이며, 이하에서는 SAD1이라고 명명한다.
The chemical name of the compound of
상기 화학식 1의 화합물은 화합물 1, 화합물 2, 및 p-톨루엔설폰산을 건조 DMF 용매에 넣고 80~100 ℃, 질소대기 하에서 7~10시간 동안, 바람직하게는 90 ℃, 질소대기 하에서 8시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 진공상태에서 용매를 증발시켜 제조된다. 이의 과정은 하기 반응식 1로 나타낸다.
상기 화합물 1: 화합물 2: p-톨루엔설폰산의 몰비율은 10: 10: 1이 바람직하다.
The molar ratio of compound 1: compound 2: p-toluenesulfonic acid is preferably 10: 10: 1.
[반응식 1][Reaction Scheme 1]
본 발명에 따른 상기 화학식 1의 SAD1은 아밀로이드 베타 플라크(amyloid-β plaque)에 특이적으로 결합하며, 상기 SAD1을 아밀로이드 베타 플라크와 특이적으로 결합시킨 뒤 700 내지 800 nm, 바람직하게는 750nm 파장의 이광자 에너지원을 여기(excitation)시키면, 400 내지 600 nm, 바람직하게는 420 내지 480 nm의 파장범위에서 형광을 나타낸다.
SAD1 according to the present invention is specifically bound to an amyloid-β plaque. Specifically, the SAD1 is specifically bound to an amyloid beta-plaque and then bound to an amyloid-β plaque at a wavelength of 700 to 800 nm, Excitation of the two-photon energy source results in fluorescence in the wavelength range of 400 to 600 nm, preferably 420 to 480 nm.
또한, 본 발명에 따른 SAD1은 지질친화성(lipophilicity)이 높아 혈관뇌장벽(BBB, blood brain barrier)을 통과할 수 있어 복강 내(IP, intra peritoneal)주사, 정맥 내(IV, intra venous) 주사 등을 통하여 뇌까지 쉽게 도달하므로, 뇌세포 또는 뇌조직의 아밀로이드 베타 플라크와 결합할 수 있다. In addition, SAD1 according to the present invention has high lipophilicity and can pass through the blood brain barrier (BBB), so that it can be administered intraperitoneally (IP), intravenous (IV) And thus can bind to amyloid beta plaques of brain cells or brain tissue.
또한, 본 발명에 따른 SAD1은 아밀로이드 베타 플라크에 대한 결합 특이성이 높고 형광 강도가 우수하여, 표면으로부터 250 μm 깊이의 생체 세포 또는 생체 조직에서 특이적으로 아밀로이드 베타 플라크를 탐지할 수 있으므로, 생체 내외(ex vivo/in vivo)에서 아밀로이드 베타 플라크의 영상화 능력이 우수하다.
In addition, since SAD1 according to the present invention has high binding specificity to amyloid beta plaques and excellent fluorescence intensity, amyloid beta plaques can be specifically detected in living cells or living tissue at a depth of 250 占 퐉 from the surface, ex vivo / in The ability to image amyloid beta plaques is excellent in vivo .
또한, 본 발명은 In addition,
(a) 상기 화학식 1로 표시되는 SAD1을 포함하는 이광자 형광 프로브를 세포, 조직, 또는 생체 내에 주입하는 단계; (a) injecting a two-photon fluorescent probe comprising SAD1 represented by
(b) 상기 이광자 형광 프로브가 아밀로이드 베타와 결합하는 단계; (b) combining the two-photon fluorescent probe with amyloid beta;
(c) 상기 세포, 조직, 생체 내에 이광자 여기원을 조사하는 단계; 및 (c) irradiating the two-photon excitation source in the cell, tissue, and living body; And
(d) 이광자 현미경으로 상기 이광자 형광 프로브로부터 발생하는 형광을 관측하는 단계; 를 포함하는 세포, 조직, 또는 생체 내에서의 아밀로이드 베타 플라크(amyloid-β plaque)의 영상화 방법을 제공한다.
(d) observing fluorescence generated from the two-photon fluorescent probe with a two-photon microscope; Or an amyloid-beta plaque in vivo in a cell, tissue, or in vivo.
상기 (c) 단계에서, 이광자 여기원은 700 내지 800 nm의 파장을 가질 수 있으며, 바람직하게는 750 nm 파장을 가진다. In the step (c), the two-photon excitation source may have a wavelength of 700 to 800 nm, preferably 750 nm.
또한, 상기 (d) 단계에서 이광자 형광 프로브로부터 발생하는 형광은 400 내지 600 nm의 파장을 가질 수 있으며, 관측에 바람직한 파장은 420 내지 480 nm이다.
The fluorescence generated from the two-photon fluorescence probe in step (d) may have a wavelength of 400 to 600 nm, and a preferable wavelength for observation is 420 to 480 nm.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in order to facilitate understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for the purpose of easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited by the examples.
실시예Example 1. 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물( 1. A compound represented by the formula (1) of the present invention SAD1SAD1 )의 제조)
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물을 제조하기 위하여, 하기의 반응식과 같은 반응을 수행하였다.In order to prepare the compound represented by the formula (1) of the present invention, the following reaction was carried out.
먼저, 0.50 g(2.69 mmol)의 상기 화합물 1, 0.76 g(2.69 mmol)의 상기 화합물 2, 및 0.05 g(0.27mmol)의 p-톨루엔설폰산(p-toluenesulfonic acid)을 30 ml의 건조 DMF(dry dimethylformamide)가 담긴 플라스크에 넣고 90℃, 질소 대기 하에서 8시간 동안 교반시켰다. 상기 교반액의 온도를 실온까지 낮춘 다음, 진공상태에서 용매를 증발시켜 조생성물(crude product)을 얻었다. 얻어진 조생성물은, 클로로포름(CHCl3)에 용해시킨 5% 에틸아세테이트(EtOAc)를 용출액으로 사용한 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제되었고, 그 결과 0.38g의 짙은 녹색의 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다. First, 0.50 g (2.69 mmol) the
-수율: 0.38 g(46%), - Yield: 0.38 g (46%),
-녹는점: 243~245 ℃
- Melting point: 243 ~ 245 ℃
정제물질의 1H NMR 스펙트럼, HRMS 스펙트럼의 조건 및 피크 값은 하기와 같다. The 1 H NMR spectrum of the purified material, the conditions of the HRMS spectrum and the peak value are as follows.
- 1H NMR (400MHz, CDCl3+DMSO-d 6 ): δ 9.17 (s, 1H), 8.27 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H),7.82 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.69 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.01 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.97 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.74 (br s, 1H), 2.95 (s, 3H). - 1 H NMR (400MHz, CDCl 3 + DMSO- d 6): δ 9.17 (s, 1H), 8.27 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.99 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.8 Hz , 1H), 7.69 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.01 ( dd, J = 8.8, 2.4 Hz , 1H), 6.97 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 4.74 (br s, 1H), 2.95 (s, 3H).
- 13C NMR (100 MHz, CDCl3+DMSO-d 6 ): 164.7, 155.9, 149.6, 147.9, 137.1, 136.2, 129.8, 127.1, 126.6, 126.4, 126.3, 124.6, 123.4, 119.6, 116.4, 107.3, 102.1, 30.3; - 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 + DMSO- d 6): 164.7, 155.9, 149.6, 147.9, 137.1, 136.2, 129.8, 127.1, 126.6, 126.4, 126.3, 124.6, 123.4, 119.6, 116.4, 107.3, 102.1 , 30.3;
- HRMS (FAB+): m/z calcd for [C18H14N2OS+H+]: 307.0905, found: 307.0905.
- HRMS (FAB +): m / z calcd for [C 18 H 14 N 2 OS + H +]: 307.0905, found: 307.0905.
실시예Example 2. 본 발명의 2. The present invention SAD1SAD1 의 of PBSPBS 완충용액에 대한 용해도(수용성) 및 The solubility (water solubility) and 옥탄올Octanol -물 분배계수(- Water partition coefficient ( loglog PP octoct ) 측정) Measure
2-1. 2-1. SAD1SAD1 의 of PBSPBS 완충용액에 대한 용해도 측정 Determination of solubility in buffer solution
본 발명의 SAD1의 수용성을 공지된 아밀로이드 베타 검출용 이광자 형광 프로브인 PIB(Pittsburgh Compound-B) 및 Methoxy-X04와 비교하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. In order to compare the water solubility of the SAD1 of the present invention with the known two-photon probe for amyloid beta detection, PIB (Pittsburgh Compound-B) and Methoxy-XO4, the following experiment was conducted.
소량의 염료(SAD1, MeO-X04, PIB)를 DMSO(dimethylsulfoxide)에 혼합하여 1.0X10-2 M 농도의 저장용액(stock solution)을 제조하였다. 상기 저장용액을 6.0X10-3 ~ 6.0X10-5 M 농도로 희석하고, 3.0 ml의 PBS 완충용액(pH 7.4)이 포함된 큐벳(cuvette)에 첨가하였다. 수용액 내의 DMSO의 농도는 0.2 %를 유지하였다. 형광감지기를 이용하여 형광의 강도를 측정하였다. 큐벳에 주입된 염료의 총량에 대한 형광 강도 곡선은, 염료가 저용량일 때에는 선형적으로 증가하다가 염료가 많이 가해질수록 하향되는 곡선을 나타내었으며, 선형적 증가를 나타내는 곡선 영역의 최고점에서의 염료의 PBS 완충용액에 대한 용해도로 보고 기록하였다. A stock solution of 1.0 × 10 -2 M concentration was prepared by mixing a small amount of dye (SAD1, MeO-XO4, PIB) with DMSO (dimethylsulfoxide). The stock solution was diluted to a concentration of 6.0 x 10 -3 to 6.0 x 10 -5 M and added to a cuvette containing 3.0 ml of PBS buffer (pH 7.4). The concentration of DMSO in the aqueous solution was maintained at 0.2%. The fluorescence intensity was measured using a fluorescence detector. The fluorescence intensity curve for the total amount of dyes injected into the cuvette was linearly increased when the dye was low in volume, and then curved downward as the dye was heavily added, and the fluorescence intensity curve of the dye at the peak of the curve area showing linear increase Solubility in buffer solution was reported and recorded.
결과는 도 1에 나타내었다.The results are shown in Fig.
도 1에 나타낸 바와 같이, SAD1, MeO-X04, PIB의 PBS 완충용액에 대한 용해성은 각각 1.0 μM, 0.2 μM, 3.0 μM을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 SAD1의 수용성은 PIB의 1/3이고, MeO-X04의 5배 수준인 것을 알 수 있다.
As shown in Fig. 1, solubilities of SAD1, MeO-XO4 and PIB in PBS buffer solutions were 1.0 μM, 0.2 μM and 3.0 μM, respectively. Therefore, the water solubility of SAD1 of the present invention is 1/3 of the PIB and 5 times that of MeO-XO4.
2-2. 2-2. SAD1SAD1 의 of 옥탄올Octanol -물 분배계수(- Water partition coefficient ( loglog PP octoct )의 측정)
또한, 상기 2-1의 용해도와 관련하여 본 발명의 SAD1이 혈관뇌장벽을 통과할 수 있는지 알아보기 위하여, 옥탄올-물 분배계수(log P oct)를 측정하였다. 염료가 혈관뇌장벽을 통과할 수 있으려면 log P oct 값이 1~3의 범위 내에 있어야 한다고 알려져 있다(W.E. Klunk et al ., 2001). In order to examine whether the SAD1 of the present invention can pass through the blood-brain barrier in relation to the solubility of 2-1, the octanol-water partition coefficient (log P oct ) was measured. It is known that the log P oct value should fall within the range of 1 to 3 in order for the dye to pass through the blood-brain barrier (WE Klunk et al . , 2001).
log P oct의 값은 각 염료의 몰흡광계수를 측정한 다음 하기와 같은 수학식에 의하여 계산하였다. The value of log P oct was calculated by the following equation after measuring the molar extinction coefficient of each dye.
[수학식][Mathematical Expression]
log P oct = log [probe]oct - log [probe]PBS
log P oct = log [probe] oct -log [probe] PBS
각 염료의 몰흡광계수의 측정 결과는 표 1에 나타내었다.The measurement results of the molar extinction coefficient of each dye are shown in Table 1.
표 1에 나타낸 몰흡광계수를 이용하여 상기 수학식으로 log P oct 를 계산한 결과, SAD1의 경우 1.9를 나타내었고, PIB는 1.2를 나타내었으며, MeO-X04는 2.6을 나타내었다. 따라서, 혈관뇌장벽을 통과하는 염료로 알려진 PIB 및 MeO-X04와 마찬가지로 본 발명의 SAD1은 혈관뇌장벽을 통과할 수 있는 이광자 형광 프로브로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다. Using the molar extinction coefficient shown in Table 1, the log P oct was calculated by the above equation. As a result, SAD1 showed 1.9, PIB showed 1.2, and MeO-X04 showed 2.6. Thus, it can be seen that SADl of the present invention, like PIB and MeO-X04, known as dyes through the blood-brain barrier, can be usefully used as a two-photon fluorescence probe that can pass through blood vessel brain barrier.
실시예Example 3. 본 발명의 3. The SAD1SAD1 의 of 광물리학적Photophysical (( photophysical광학 ) 데이터 비교) Data comparison
본 발명의 SAD1의 광물리학적 특성을 PIB 및 MeO-X04와 비교하기 위하여 당업계에 알려진 통상의 방법으로 광물리학적 데이터를 수집하였다. To compare the photophysical properties of SAD1 of the present invention with PIB and MeO-X04, photophysical data were collected by conventional methods known in the art.
결과는 표 2, 및 도 2 내지 도 5에 나타내었다. The results are shown in Table 2 and Figs. 2 to 5.
[a] 모든 측정은 에탄올 및 PBS 완충용액(pH 7.4)에서 수행되었다.[a] All measurements were performed in ethanol and PBS buffer (pH 7.4).
[b] 일광자 흡수 스펙트럼의 λmax 값의 단위는 nm 이다.[b] The unit of the λ max value of the one-photon absorption spectrum is nm.
[c] 일광자 방출 스펙트럼의 λmax 값의 단위는 nm 이다.[c] The unit of the λ max value of the one-photon emission spectrum is nm.
[d] 형광 양자 수율(Fluorescence quantum yield)[d] Fluorescence quantum yield
[e] 이광자 여기 스펙트럼의 λmax 값의 단위는 nm 이다.[e] The unit of the λ max value of the two-photon excitation spectrum is nm.
[f] 이광자 작용 단면의 피크 값의 단위는 10-50 cm4/photon(GM) 이다.
[f] The unit of the peak value of the two-photon cross section is 10 -50 cm 4 / photon (GM).
표 2 및 도 2a에 나타낸 바와 같이, PBS 완충용액에서 SAD1은 362nm에서 최대흡광(absorption maxima, λabs)를 나타내었고, 497nm에서 최대형광(fluorescence maxima, λfl)을 나타내어 135 nm의 MeO-X04(82 nm)와 PIB(83 nm)에 비하여 135 nm라는 높은 스톡스의 전이(Stokes' shift)를 나타내었다. 이로부터 SAD1의 전하 이동의 안정성이 우수함을 알 수 있었다. Table 2 and as shown in Fig. 2a, PBS showed a maximum absorption (absorption maxima, λ abs) in a buffer solution SAD1 is at 362nm, from 497nm indicated a maximum fluorescence (fluorescence maxima, λ fl) 135 nm of MeO-X04 (Stokes' shift) of 135 nm compared to that of PIB (82 nm) and PIB (83 nm). From this, it was found that the stability of charge transfer of SAD1 was excellent.
또한, 표 2 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 아밀로이드 베타 플라크 환경의 좋은 모델인 EtOH에서의 SAD1의 이광자 발광율(Two-Photon action cross section, фδmax)은 750nm에서 170 GM을 기록하였다. 이 값은 PIB 또는 MeO-X04에 비하여 2~4배나 큰 값으로, SAD1이 PIB에 비하여 긴 접합길이(conjugation length), 및 MeO-X04 보다 향상된 분자 내 전하 전이(ICT, intramolecular charge transfer)를 갖는 것을 설명한다. 상기한 SAD1의 фδmax 값은 PBS 완충용액에서보다, EtOH 에서 17 배나 큰 값을 가지는 것으로 나타났고, 이는 1.1~7.5 배에 불과한 MeO-X04이나 PIB의 фδmax 값보다 훨씬 높은 것으로 SAD1으로 아밀로이드 베타를 염색하여 TPM 영상화(two-photon microscopy imaging)를 할 경우, 훨씬 더 밝고 명확하게 염색이 될 수 있음을 나타낸다. In addition, Table 2 and, SAD1 photon emission rate (Two-Photon action cross section, фδ max) of EtOH in a good model of amyloid-beta plaques environment as shown in Figure 2b was recorded at 170 GM at 750nm. This value is 2 to 4 times larger than that of PIB or MeO-X04. SAD1 has a longer conjugation length than PIB and an intramolecular charge transfer (ICT) that is higher than MeO-X04 . The above 隆max of SAD1 Values were found to be 17 times greater in EtOH than in PBS buffer, which is a MeO-X04 of only 1.1 to 7.5 times, or the ф δ max of PIB , Which indicates that two-photon microscopy imaging with amyloid beta stained with SAD1 can be much brighter and more clearly stained.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 SAD1의 이광자 발광율(Two-Photon action cross section, фδmax)은 일반 생체 조건과 유사한 PBS 완충용액(pH 7.4)에서 약 10 GM 내외로 낮게 기록되었다. 따라서, 상기 결과를 종합하여 보았을 때, 본 발명의 SAD1은 아밀로이드 베타에 염색될 경우, 아밀로이드 베타 플라크가 아닌 영역과 뚜렷하게 구분되는 형광을 나타내어, 아밀로이드 베타를 보다 특이적으로 검출 가능함을 알 수 있다.
Further, as shown in FIG. 3, the two-photon action cross section ( max ) of SAD1 of the present invention was recorded as low as about 10 GM in a PBS buffer solution (pH 7.4) similar to general in vivo conditions . Therefore, when the above results are summarized, it can be seen that the SAD1 of the present invention exhibits fluorescence clearly distinct from the non-amyloid beta-plaque when stained with amyloid beta, so that amyloid beta can be detected more specifically.
한편, 도 4에 나타낸 바와 같이, SAD1은 생물학적으로 관련된 pH 범위 내에서 일정한 형광강도를 나타내어 생체 내에서 안정적으로 형광을 발생시킬 수 있음을 알 수 있다.
On the other hand, as shown in FIG. 4, SAD1 exhibits a constant fluorescence intensity within a biologically relevant pH range, and it can be seen that fluorescence can be stably generated in vivo.
[a] 괄호 안의 숫자는 용매 극성의 평균적인 파라미터이다.[a] Numbers in parentheses are average parameters of solvent polarity.
[b, c] 일광자 흡수 및 방출 스펙트럼의 λmax 값의 단위는 nm 이다.The unit of [lambda] max value of the [b, c] day photon absorption and emission spectrum is nm.
[d] 형광 양자 수율, ±15%[d] Fluorescence quantum yield, ± 15%
[e] PBS 완충용액. 
[e] PBS buffer solution.
또한, 표 3 및 도 5에 나타낸 바와 같이, SAD1의 방출 스펙트럼은 용매의 극성이 증가할수록(극성; 1,4-dioxane<DMF<EtOH<PBS 완충용액), 점차적으로 적색전이(red shift)를 나타내었다. 상기 표 3에서와 같이 SAD1은 MeO-X04(9 nm) 및 PIB(26 nm)에 비하여 용매의 극성에 따른 높은 적색전이도(68 nm)를 나타내므로, SAD1을 환경에 민감하게 반응하는 이광자 형광 프로브로 활용 가능하다는 것을 알 수 있다.
Further, as shown in Table 3 and FIG. 5, the emission spectrum of SAD1 shows a red shift (polarity: 1,4-dioxane <DMF <EtOH <PBS buffer solution) gradually increasing as the polarity of the solvent increases Respectively. As shown in Table 3, SAD1 exhibits a high red transition (68 nm) according to the polarity of the solvent as compared to MeO-XO4 (9 nm) and PIB (26 nm), so that SAD1 is more sensitive to environmentally sensitive two- It can be seen that it can be used as a probe.
실시예Example 4. 본 발명의 4. The SAD1SAD1 및 이광자 현미경을 통한 알츠하이머 질환모델 마우스의 해마 And hippocampus of Alzheimer's disease model mouse through two-photon microscope 조직절편Tissue section 내부 영상화( Internal imaging exex vivovivo twotwo -- photonphoton imagingimaging ))
본 발명의 SAD1 이광자 형광 프로브 및 이광자 현미경을 이용하여 알츠하이머 질환모델 마우스의 뇌 조직절편을 영상화하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. The following experiment was carried out to image brain tissue sections of Alzheimer's disease model mouse using SAD1 double-photon probe and two-photomicroscope of the present invention.
본 발명의 SAD1 또는 MeO-X04를 이용한 아밀로이드 베타 플라크 염색의 관찰에는 20X water immersion-objective 렌즈(W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 70mm, Carl Zeiss Inc. Germany)를 포함하는 이광자 레이저 주사현미경(LSM 7 MP, Carl Zeiss Inc, Goettingen, Germany)을 사용하였다. SAD1 또는 MeO-X04는 티타늄-사파이어 펨토초 레이저(Chameleon Ultra®, Coherent, Santa Clara, CA)를 이용하여 750nm의 파장으로 여기되었고, 방출 스펙트럼은 420~480 nm 범위에서 수집, 관찰하였다. 또한, 표면으로부터 250 μm 깊이의 영상을 얻어, 이미지 프레임 당(.022 μm/pixel dwell time) 0.77 μm의 깊이, 및 512X512 픽셀(pixel)을 가진 3D 영상을 제작하였다. 최대 강도의 2D 이미지 및 3D 영상은 Zen 2011 소프트웨어(Carl Zeiss Inc, Goettingen, Germany)를 이용하여 제작하였다.
Observation of amyloid beta plaque staining using SAD1 or MeO-XO4 of the present invention was performed using a two-photon laser scanning microscope (LSM) equipped with a 20X water immersion-objective lens (W Plan-Apochromat 20x / 1.0 DIC M27 70mm, Carl Zeiss Inc. Germany) 7 MP, Carl Zeiss Inc, Goettingen, Germany). SAD1 or MeO-X04 was excited with a 750-nm wavelength using a titanium-sapphire femtosecond laser (Chameleon Ultra®, Coherent, Santa Clara, Calif.) And emission spectra were collected and observed in the 420 to 480 nm range. Also, 3D images with a depth of 0.77 μm and 512 × 512 pixels (pixel) per image frame (.022 μm / pixel dwell time) were obtained at a depth of 250 μm from the surface. Maximum intensity 2D and 3D images were produced using Zen 2011 software (Carl Zeiss Inc, Goettingen, Germany).
4-1. 4-1. SAD1SAD1 을 이용한 알츠하이머 질환모델 마우스의 뇌 Of Alzheimer's disease model mice using 조직절편의Tissue section 염색 dyeing
먼저, 4~10개월령의 알츠하이머 질환모델 형질전환 마우스인 5XFAD 마우스를 희생시킨 후, 전체 뇌를 재빠르게 적출하여 124mM의 NaCl, 3mM의 KCl, 1.25mM의 NaH2PO4, 1mM의 MgCl2, 36mM의 NaHCO3, 10mM의 D-glucose, 2mM의 CaCl2을 포함하고 95%의 O2, 5%의 CO2로 버블링(bubbled)한 차가운 인공 뇌척수액(aCSF, artificial cerebrospinal fluid)에 30초 동안 침지하였다. 그 다음 해마 영역을 노출시켜 미세톱(microtome, Model VT1000S; Leica, Nussloch, Germany)으로 350μm의 두께로 절단하여 조직 절편을 제조하였다. 제조한 조직절편은 10μM 농도의 SAD1 또는 MeO-X04 염료를 포함하는 인공 뇌척수액에 37℃ 하에서 45분 동안 정치(incubation)시켜 뇌조직 내 아밀로이드 플라크를 염색하였다. 염색을 종료한 후, 750nm의 여기 파장을 가진 여기원을 조사하여 TPEF(TP excited fluorescence) 스펙트럼을 측정하였다. First, 4-10 months of age Alzheimer's disease model transgenic mouse of 5XFAD After sacrificing the mouse, by quickly extracting the whole brain of 124mM NaCl, the 3mM KCl, NaH 2 PO 4 1.25mM of, 1mM of MgCl 2, 36mM of (ACSF, artificial cerebrospinal fluid) containing NaHCO 3 , 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl 2 and 95% O 2 , 5% CO 2 for 30 seconds Respectively. The hippocampal region was then exposed and the tissue section was cut with a microtome (Model VT1000S; Leica, Nussloch, Germany) to a thickness of 350 mu m. The prepared tissue sections were stained with artificial cerebrospinal fluid containing SAD1 or MeO-X04 dyes at a concentration of 10 μM for 45 minutes at 37 ° C. to stain amyloid plaques in brain tissue. After completion of the dyeing, the TPEF (TP excited fluorescence) spectrum was measured by irradiating an excitation source having an excitation wavelength of 750 nm.
결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다.The results are shown in FIG. 6 and FIG.
도 6a의 밝은 점으로부터 PBS 완충용액 하에 TPEF 스펙트럼을 측정한 결과, 도 6b와 같이, 스펙트럼이 대칭적이고, 청색 전이를 나타냄을 알 수 있었다.As a result of measuring the TPEF spectrum under the PBS buffer solution from the light point in FIG. 6A, it was found that the spectrum was symmetrical and blue transition was shown, as shown in FIG. 6B.
또한, 도 6c의 밝은 점에서 측정한 시간에 따른 TPEF의 강도는, 도 6d에 나타낸 바와 같이, 60분 이상의 지속적인 펨토-초(fs, femto-second) 펄스 방사에도 감소되지 않고 거의 같았으므로, 본 발명의 SAD1은 높은 광안정성(photostability)을 가짐을 알 수 있다.Further, the intensity of the TPEF with respect to the time measured at the bright point in FIG. 6C was almost the same as that of the fs-femtosecond pulse emission of not less than 60 minutes, as shown in FIG. 6D, It can be seen that the inventive SAD1 has high photostability.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 뇌 조직 절편의 200 μm 깊이에서 측정한 본 발명의 SAD1의 발광 정도(도 7a)는, MeO-X04가 보이는 발광 정도(도 7c)에 비하여 훨씬 밝았으며, 도 7a 및 도 7c에 대응하여 구성한 TPEF 강도의 정량적인 분석 영상(도 7b, 도 7d) 역시 SAD1이 MeO-X04보다 훨씬 높은 S/N(signal-to-noise) 비율을 나타내었다. 7, the degree of luminescence of SAD1 of the present invention (FIG. 7A) measured at a depth of 200 μm of the brain tissue slice was much brighter than that of MeO-X04 (FIG. 7C) 7B and 7D) of the TPEF intensity corresponding to FIGS. 7A and 7C also showed S / N (signal-to-noise) ratio, which is much higher than that of MeO-X04.
따라서, SAD1은 MeO-X04보다 뇌조직 절편에서 아밀로이드 베타 검출을 위한 프로브로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
Thus, it can be seen that SAD1 can be more useful as a probe for amyloid beta detection in brain tissue sections than MeO-X04.
4-2. 4-2. SAD1SAD1 의 아밀로이드 베타에 대한 특이성 분석Specificity of amyloid beta
본 발명의 SAD1의 아밀로이드 베타 플라크에 대한 특이적으로 염색할 수 있는지를 확인하기 위하여, SAD1과 함께, 아밀로이드 베타의 조직학적 분석을 위한 형광 프로브로 잘 알려진 콩고 레드(Congo Red) 염색을 동시에 수행하였다. In order to confirm whether the SAD1 of the present invention can be specifically stained for the amyloid beta plaque, Congo Red staining, which is well known as a fluorescence probe for histological analysis of amyloid beta, was performed simultaneously with SAD1 .
결과는 도 8에 나타내었다. The results are shown in Fig.
도 8에 나타낸 바와 같이, 밝은 점으로 표시되는 SAD1의 TPEF의 영역이 콩고레드에서 발광하는 신호와 잘 합치되어 SAD1이 아밀로이드 베타 플라크를 특이적으로 염색할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. As shown in Fig. 8, it was confirmed that the region of TPEF of SAD1, which is represented by the bright dot, agrees well with the signal emitted from Congoled, so that SAD1 can specifically stain amyloid beta plaques.
실시예Example 5. 본 발명의 5. The SAD1SAD1 및 이광자 현미경을 통한 알츠하이머 질환모델 마우스의 생체 내 영상화( And in vivo imaging of model mice with Alzheimer's disease via two-photon microscope inin vivovivo twotwo -- photonphoton imagingimaging ))
본 발명의 SAD1 및 이광자 현미경을 통하여 알츠하이머 질환모델 마우스의 생체 내에서 아밀로이드 베타 플라크를 영상화하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 하기의 모든 동물 실험과정은 실험동물관리의 원리에 관한 지침(NIH publication No. 85-23, revised 1985) 및 동물관리 및 사용 지침서(the Animal Care and Use Guidelines of Seoul National University, Seoul, Korea.) 하에 수행되었다. The following experiment was carried out in order to image amyloid beta plaques in vivo of Alzheimer's disease model mouse through SAD1 and two-photomicroscope of the present invention. All of the following animal testing procedures are described in the Guidance on Principles of Laboratory Animal Care (NIH publication No. 85-23, revised 1985) and in the Animal Care and Use Guidelines (Seoul National University, Seoul, Korea). Lt; / RTI >
먼저 4~10개월령의 5XFAD 마우스 (Tg6799; B6SJL-Tg [APPSwFlLon, PSEN*M146L*L286V] 6799Vas/J, stock no. 006554, The Jackson laboratory, Bar Harbor, USA)의 우측 전두엽 피질 쪽에 직경 3~4 mm의 창(정수리에서 전방으로 0.5~3.5 mm, 및 두부 정중선에서 우측으로 0.5~3.5 mm 정도)을 수술적으로 만들고, 5mm의 둥근 커버슬립을 경막(dura mater)에 놓은 다음, 치과용 아크릴을 점착제로 사용하여, 앞에서 분리한 두개골 조각으로 다시 두개창을 닫았다. The diameter of the right prefrontal cortex of the 5XFAD mouse (Tg6799; B6SJL-Tg [APPSwFlLon, PSEN * M146L * L286V] 6799Vas / J, stock no. 006554, The Jackson laboratory, Bar Harbor, USA) A 5 mm rounded cover slip was placed on the dura mater and the dental acrylic was placed on the dura mater. It was used as an adhesive and the two windows were closed again with a piece of skull removed from the front.
수술 후, 1주일 동안 이광자 영상화를 위하여 마우스를 회복시키고, 10mg/kg의 SAD1 또는 MeO-X04를 10% DMSO, 45% 프로필렌글리콜, 및 45% 생리식염수가 포함된 용액에 5 mg/ml로 희석하여 마우스의 복강으로 주입하였다. 24시간 후, 마우스를 이소플루란(isoflurane)으로 마취한 후, 이광자 현미경으로 2차원 단면을 관찰한 뒤 이로부터 3차원 영상화하였다. 3차원 영상은 100개의 TPM 단면 사진으로부터 재구성하였다.After surgery, mice were restored for two-photon imaging for one week and SAD1 or MeO-X04 at 10 mg / kg was diluted to 5 mg / ml in a solution containing 10% DMSO, 45% propylene glycol, and 45% physiological saline And injected into the abdominal cavity of the mice. Twenty-four hours later, the mouse was anesthetized with isoflurane, and a two-dimensional cross-section was observed with a two-photon microscope, and then three-dimensionally imaged. Three - dimensional images were reconstructed from 100 TPM cross - sectional photographs.
결과는 도 9에 나타내었다. The results are shown in Fig.
도 9에 나타낸 바와 같이, (a)SAD1은 피질로부터 250 μm 깊이까지, (b)MeO-X04는 피질로부터 160 μm의 깊이까지 측정이 가능하였고, 영상도 SAD1을 프로브로 사용한 쪽이 훨씬 밝고 명확하였다.As shown in FIG. 9, (a) SAD1 can be measured from the cortex to a depth of 250 μm, (b) MeO-X04 can be measured from the cortex to a depth of 160 μm, Respectively.
따라서, SAD1은 아밀로이드 베타 플라크의 영상화에 있어, 특이성 및 발광강도가 대단히 우수한 이광자 형광 프로브로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
Therefore, it can be seen that SAD1 can be used as a two-photon fluorescence probe with excellent specificity and luminescence intensity in the imaging of amyloid beta plaques.
Claims (9)
[화학식 1]
A two-photon fluorescence probe for detecting an amyloid beta plaque in a living cell or tissue, comprising a compound represented by the following formula (1).
[Chemical Formula 1]
The two-photon fluorescence probe according to claim 1, wherein the compound of formula (1) specifically binds to amyloid beta-plaques.
The method according to claim 2, wherein the compound of formula (I) reacts with amyloid beta to exhibit fluorescence in the range of 400 to 600 nm.
2. The two-photon fluorescence probe according to claim 1, wherein the probe is capable of detecting amyloid beta plaques in living cells or living tissue up to a depth of 250 mu m from the surface.
[반응식 1]
The process according to claim 1, wherein the compound of formula (1) is prepared by reacting compound 1, compound 2, and p-toluenesulfonic acid in a dry DMF solvent at 80 to 100 ° C under a nitrogen atmosphere for 7 to 10 hours , And a dry DMF solvent is evaporated to obtain a two-photon fluorescence probe, which is represented by the following reaction formula (1).
[Reaction Scheme 1]
6. The two-photon fluorescence probe according to claim 5, wherein the molar ratio of the compound 1: compound 2: p-toluenesulfonic acid is 10: 10: 1.
(b) 상기 이광자 형광 프로브가 아밀로이드 베타 플라크와 결합하는 단계;
(c) 상기 생체로부터 분리된 세포, 또는 조직에 여기원(excitation source)을 조사하는 단계; 및
(d) 이광자 현미경으로 상기 이광자 형광 프로브로부터 발생하는 형광을 관측하는 단계; 를 포함하는 생체로부터 분리된 세포, 또는 조직의 아밀로이드 베타 플라크의 영상화 방법.
[화학식 1]
(a) injecting a two-photon fluorescent probe comprising a compound represented by the following formula (1) into cells or tissues separated from a living body;
(b) combining the two-photon fluorescent probe with an amyloid beta plaque;
(c) irradiating a cell or tissue separated from the living body with an excitation source; And
(d) observing fluorescence generated from the two-photon fluorescent probe with a two-photon microscope; A method for imaging an amyloid beta-plaque in a cell, or a cell isolated from a living body,
[Chemical Formula 1]
8. The method according to claim 7, wherein the excitation source in step (c) has a wavelength in the range of 700 to 800 nm.
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