KR101483182B1

KR101483182B1 - 신규한 엔도 베타－１，３－글루카네이즈 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR101483182B1
Application number: KR20140116196A
Authority: KR
Inventors: 강도형; 이영득; 오철홍; 허수진
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2015-01-19

Abstract

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈(endo-β-1,3-glucanase) 및 이를 코드하는 유전자에 대한 것이다. 또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 이용한 엔도 베타-1,3-글루카네이즈의 생산 방법에 대한 것이다.

Description

신규한 엔도 베타－１，３－글루카네이즈 및 그 제조 방법{NOVEL ENDO BETA-1,3-GLUCANASE AND A PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 신규한 엔도 베타-1,3-글루카네이즈 및 그 제조 방법에 대한 것이다.

글루코스 단당체(D-glucose monomer)들이 β-1,3-글리코시딕 연결로 연결된 다당류는 효모와 곰팡이 그리고 버섯 등의 세포벽구성에 필수적인 성분이며 다양한 식물과 이끼 등의 생물에도 분포되어 있다. 해양환경에서 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan)은 다양한 갈조류에서 발견된다.

베타-1,3-글리코시딕 연결을 분해하는 효소는 베타-1,3-글루카네이즈(β-1,3-glucanase; EC 3.2.1.39), 베타-1,3-1,4글루카네이즈(β-1,3-1,4-glucanase; 3.2.1.73) 와 베타-1,3-글루카네이즈(β-1,3(4)-glucanase; EC 3.2.1.6)로 구분된다. 베타-1,3-글루카네이즈 (EC 3.2.1.39)는 베타글루칸의 베타-1,3-글리코시딕 연결을 무작위로 분해할 수 있으며, 베타-1,3-1,4-글루카네이즈는 베타-1,3-결합뒤에 오는 베타-1,4-결합을 분해할 수 있고, 베타-1,3(4)-글루카네이즈 (EC 3.2.1.6)는 베타-1,3-과 베타-1,4-글리코시딕 연결을 무작위로 분해 할 수 있다.

베타-1,3-글루카네이즈는 그들의 아미노산서열과 구조에 기반을 두고 당류가수분해효소 패밀리(Glycosyl hydrolase family; GHF) 16, 17, 55, 64 및 81로 구분할 수 있으며, 이 효소들은 다양한 식물, 동물, 곰팡이, 고세균, 박테리아 등의 생물들에서 관찰된다(Clarke and Stone, Bio, Chem. J., 96, 793-801, 1965; Abd-E1-A1 and Phaff, Bio, Chem. J., 109, 347-360, 1968; Notario, V. et al., Biochem. J., 159, 555-562, 1976). 박테리아 베타-1,3-글루카네이즈와 베타-1,3-1,4-글루카네이즈가 GHF16에 포함 된다 (Shi et al., 2010).

그러나 베타-1,3-글루카네이즈는 그 종류에 따라 효소 활성 및 효소 사용의 최적 조건 등이 상이하여, 용도에 따른 베타-1,3-글루카네이즈의 필요성이 대두되고 있다.

본 발명의 목적은 신규한 엔도 베타-1,3-글루카네이즈 및 그 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈(endo-β-1,3-glucanase), 이를 코드하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 등을 제공한다.

본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 라미나린, 베타-글루칸, 리체난의 분해능을 갖는다.

도 1은 서열번호 1의 유전자로 형질전환된 대장균의 세포 파쇄액의 SDS-PAGE 및 염색 사진을 나타낸다.
도 2 내지 도 5는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈의 효소 특성을 나타낸다.
도 6은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈의 기질에 따른 분해능을 나타내는 TLC 사진이다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈(endo-β-1,3-glucanase)에 대한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈를 코드하는 유전자에 대한 것이다.

또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 대한 것이다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 대한 것이다.

또한 본 발명은,

상기 재조합 벡터를 준비하는 단계;

상기 재조합 벡터를 숙주에 형질전환시키는 단계;및

상기 숙주를 배양하는 단계를 포함하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈의 생산 방법에 대한 것이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 엔도 베타-1,3- 글루카네이즈

본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 효소로, 이는 서열번호 2와 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함한다. 당업자는 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈의 효소 활성을 유지하는 한 당업계에 알려진 방법으로 아미노산을 결실, 치환 또는 삽입하여 서열번호 2와 80% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 제조할 수 있을 것이다. 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 바람직하게는 메소플라비박터(Mesoflavibacter) 속 유래이고, 더욱 바람직하게는 메소플라비박터 지아크산시니파시엔스(M. zeaxanthinifaciens) 유래이다. 또한 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 재조합 벡터를 이용하여 형질전환체로부터 생산, 분리한 재조합 효소일 수 있다.

본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 라미나린, 베타-글루칸 및 리체난의 분해능을 가지며, 특히 라미나린의 분해 활성은 베타-글루칸 및 리체난의 2 배 이상으로 우수하다. 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 라미나린을 분해하여 라미나리바이오스(laminaribiose) 및 글루코스(glucose)를 생성하며, 베타글루칸(barley β-glucan)과 리체난(lichenan)을 분해하여 라미나리트라이오스(laminaritriose)를 주된 생산물로 생산할 수 있다. 그러나 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 자일란 및 카복시메틸 셀룰로스의 분해능은 갖고 있지 않다.

본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 45~60 ℃에서 효소 활성이 높으며, 바람직하게는 50~55 ℃에서 효소 활성이 특히 높다. 특히, 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 50 ℃에서 최적의 효소 활성을 갖는다. 바람직하게는 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 50~55 ℃에서의 효소 활성이 30 ℃에서의 효소 활성의 2 배 이상이다.

또한 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 pH 6-9, 바람직하게는 pH 7-9에서 효소 활성이 높은데, 특히 pH 8에서 최적의 효소 활성을 갖는다. 바람직하게는 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 pH 7-9에서의 효소 활성이 pH 11에서의 효소 활성의 2 배 이상이다.

본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈는 Mn2+ 이온의 존재 하 효소 활성이 증가하며, Fe2+, Cu2+ 또는 Zn2+ 이온들의 존재 하에서는 효소 활성이 유의하게 감소한다.

엔도 베타-1,3- 글루카네이즈를 코드하는 유전자

본 발명은 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈를 코드하는 유전자에 대한 것이다. 상기 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈를 코드하는 유전자이다. 바람직하게는 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열을 포함하는 유전자로, 이는 서열번호 1과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 포함하는 유전자를 포함한다. 당업자는 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈의 효소 활성을 유지하는 한 당업계에 알려진 방법으로 염기를 결실, 치환 또는 삽입하여 서열번호 1과 80% 이상의 상동성을 갖는 염기서열을 포함하는 유전자를 제조할 수 있을 것이다. 바람직하게는 상기 유전자는 총 2109 base pair의 뉴클레오티드를 포함하며, 총 703개의 아미노산을 코드하고, 상기 아미노산들의 분자량은 77 kDa이다.

재조합 벡터

본 발명은 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈를 코드하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 대한 것이다. 상기 재조합 벡터의 종류는 pET11a 등과 같은 대장균 발현 벡터 등이 될 수 있으나, 특별히 제한되는 것은 아니며 당업자는 적절한 벡터를 선택하여 이용할 수 있다. 또한 당업자는 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈의 생산, 분리, 정제에 유용하도록 재조합 벡터를 이용할 수 있다. 예컨대 본 발명의 재조합 벡터는 융합 파트너(fusion-tag)를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있는데, 이는 상기 재조합 벡터를 도입한 형질전환체에 의하여 생산된 단백질을 정제할 수 있는 융합 파트너를 코드한다.

형질전환체

본 발명은 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈를 코드하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 대한 것이다. 상기 형질전환체는 원핵세포 또는 진핵세포 등이 될 수 있으며, 예컨대, 대장균, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주, 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 균주, 효모, 곰팡이 등이 될 수 있다. 예컨대 상기 대장균은 E.coli DH5α 또는 E.coli BL21(DE3)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

엔도 베타-1,3- 글루카네이즈의 생산 방법

본 발명은, 본 발명의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈를 코드하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 준비하는 단계; 상기 재조합 벡터를 숙주에 형질전환시키는 단계;및 상기 숙주를 배양하는 단계를 포함하는 엔도 베타-1,3-클루카네이즈의 생산 방법에 대한 것이다. 상기 숙주는 상기 형질전환체가 될 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

재료 및 방법

마이크로네시아(Micronesia) 축 주(Chuuk state)의 해수 시료를 채집하여 메소플라비박터 지아크산시니파시엔스(Mesoflavibacter zeaxanthinifaciens)를 분리하고, 이를 메소플라비박터 지아크산시니파시엔스(M. zeaxanthinifaciens) S86으로 명명하였다. M. 지아크산시니파시엔스 S86의 genomic DNA를 Genome sequencer-Flex system (GS-FLX)를 이용하여 염기서열 분석을 수행하였다.

<실험예 1>

바이오니아사의 Genomic DNA extraction kit을 이용하여 메소플라비박터 지아크산시니파시엔스(Mesoflavibacter zeaxanthinifaciens) S86으로부터 genomic DNA를 분리하고, 하기 표 1의 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 엔도 베타-1,3-글루카네이즈를 코딩하는 유전자(서열번호 1)를 PCR반응을 통하여 증폭하였다.

서열번호 3번의 프라이머는 NdeI 제한효소 서열과 6개의 histidine을 코딩하는 서열을 포함하며, 서열번호 4번의 프라이머는 BamHI 제한효소 인식부위를 포함한다. PCR 반응액은 총 50 μL로 5 μL의 10 × LA PCR buffer II (Mg2+ free; TaKaRa, Japan), 5 μL의 25 mM MgCl2, 500 ng의 gDNA를 혼합하고 10 pmol의 프라이머 2개를 각각 1 μL를 첨가한 후 TaKaRa 사의 Thermal cycler를 이용하여 변성단계(94℃, 5분), 25 cycle의 증폭단계(94℃ 30초, 45℃ 30초, 72℃ 150초) 그리고 마지막으로 안정화단계(72℃ 5분)를 통하여 엔도 베타-1,3-글루카네이즈를 코딩하는 염기서열을 증폭하였다. 그 후 PCR product를 1% agarose gel에 전기영동 하여 확인하였다.

그리고 확인된 엔도 베타-1,3-글루카네이즈의 PCR 산물을 gel purification kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다.

<실험예 2>

상기 실험예 1에서 PCR을 통하여 증폭된 산물을 정제한 후 pET-11a 발현벡터와 함께 제한효소 Nde I 및 BamH I로 절단하였다. 각각 절단된 PCR 산물과 pET-11a 발현벡터는 T4 DNA ligase (TaKaRa, Japan)를 이용하여 ligation하였고, 이를 E. coli DH5α에 형질전환하였다. 그리고 상기 엔도 베타-1,3-글루카네이즈 유전자를 포함하는 pET-11a 발현벡터를 plasmid extraction kit를 이용하여 정제한 후, 다시 발현세포인 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균 세포를 ampicillin이 첨가된 5 mL의 LB broth에 접종하고 37℃에서 진탕배양하였다. 그리고 그 후, 이를 500 ml의 동일한 배지에서 OD600=0.6까지 배양한 후, 여기에 IPTG (Isopropyl-β-D-thiolgalactoside)를 최종농도 1 mM이 되도록 첨가하여 25℃에서 16시간 동안 발현을 유도하였다. 발현된 단백질의 확인을 위하여 세포를 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 세포 내 단백질을 수집하여 SDS-PAGE로 단백질 발현을 확인하였으며, 이를 His bind kit(Novagen)을 이용하여 정제하였다.

그 결과는 도 1과 같다. 도 1은 SDS-PAGE 겔 전기영동을 이용하여 정제된 재조합 단백질을 확인한 것이다(M: molecular size marker, lane 1: 단백질 발현을 유도하지 않은 재조합 벡터를 포함하는 대장균과 배양액 내의 단백질, lane 2: IPTG를 이용한 재조합 벡터의 단백질 발현을 유도한의 대장균과 배양액 내의 단백질, lane 3: 재조합 단백질의 발현을 유도한 대장균을 파쇄한 후 원심분리하여 침전물을 제거한 후의 상등액상에 존재하는 단백질, lane 4: Lane 3의 단백질들을 his bind kit을 이용하여 정제한 단백질). 이를 보면, 본 발명의 유전자로 형질전환된 대장균의 세포 파쇄액을 SDS-PAGE 분석결과 형질전환 후에 특이적 밴드가 강하게 발현된 것을 확인할 수 있었다. 또한 또한 아미노산 서열 분석에 의하여 밝혀진 상기 엔도 베타-1,3-글루카네이즈로 75 kDa의 단백질이 발현된 것을 확인 할 수 있었다. 상기 분리, 정제된 재조합 엔도 베타-1,3-글루카네이즈 효소는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것으로 확인되었다(표 2).

<실험예 3>

상기 실험예 2에서 분리, 정제된 재조합 엔도 베타-1,3-글루카네이즈 효소의 기질 특이성을 평가하였다.

기질로는 라미나린(laminarin), 발리 베타-글루칸(Barley β-glucan), 리체난(lichenan), 자일란(xylan) 및 CMC(카복시메틸 셀룰로스, carboxymethyl cellulose)를 사용하였다. 기질과 효소의 반응은 100 μL의 10 mM phosphate buffer pH 6.0에 증류수에 1%로 녹인 기질을 95 μL를 첨가하고 재조합 효소를 5 μL첨가하여 최종 부피가 200 μL가 되도록 하여 50℃에서 10분간 반응시킨 후, 여기에 3,5-디니트로살리시크산(dinitrosalicylic acid; DNS)을 첨가하고 100℃에서 20분간 끓인 후 570 nm에서 흡광도를 측정하여 비색정량하여 수행하였다. 50℃에서 1분간 1 μmol의 환원당을 생성하는 효소량을 1 unit으로 표시하였다.

그 결과는 표 3과 같다.

<실험예 4>

상기 실험예 2에서 분리, 정제된 재조합 엔도 베타-1,3-글루카네이즈 효소의 온도, pH에 따른 효소 활성을 평가하였다.

온도의 영향을 조사하기 위하여 30 내지 80℃의 범위에서 5℃ 간격으로 재조합 효소들을 반응시킨 후 각각의 활성을 측정하였고, 활성이 가장 높은 온도를 기준으로 상대적인 활성을 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 재조합 효소는 최적 반응온도가 50 ℃였으며, 45 내지 60℃에서 높은 활성을 유지하는 것으로 확인되었다(도 2).

한편, 효소 활성에 미치는 pH의 영향을 조사하기 위하여 Citrate-phosphate buffer (pH 3-7), phosphate buffer (7-8) 및 glycine-sodium hydroxide buffer (9-11)를 이용하여 상기 재조합 효소를 50℃에서 반응시킨 후, 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 재조합 효소는 pH 8에서 가장 높은 활성을 나타내었으며 pH6 내지 9사이에서 높은 활성을 유지하는 것으로 확인되었다 (도 3).

본 발명의 재조합 효소의 열안정성을 확인하기 위하여 50 내지 60℃에서 10, 20, 30, 40, 50, 60분간 재조합 효소를 방치한 후, 남아있는 효소의 잔존활성을 측정하였다. 그 결과 60℃에서는 방치 10분만에 20% 미만의 활성만이 남아있는 것을 확인하였으며, 50℃에서는 60분 후에도 80℃정도의 활성을 유지하는 것을 확인 할 수 있었다(도 4).

<실험예 5>

실험예 2에서 분리, 정제한 본 발명의 재조합 효소의 활성에 각종 금속 또는 킬레이트화제가 미치는 영향을 평가하였다. KCl, MgSO4, CaCl2, EDTA, MnSO4, FeSO4, CuSO4, ZnSO4의 존재 하, 본 발명의 재조합 효소를 라미나린과 반응시켜, 올리고당 생성 정도를 평가하였다. 이 때 금속 또는 킬레이트화제를 첨가하지 않은 대조군의 올리고당 생성 정도를 100으로 놓고 타 실험군들의 활성을 상대적으로 평가하였다. 구체적인 시험 방법은 하기와 같다. Phosphate buffer 90 μL에 1% 라미나린 용액 100 μL를 첨가하고 5 μL의 금속이온 또는 킬레이트화제를 첨가하고 희석된 재조합 효소 10 μL를 첨가하여 10분간 반응시켰다. 이 때, 금속이온 및 킬레이트화제는 각각 최종 농도가 1 mM과 2.5 mM이 되도록 하여 두 가지 조건에서 각각의 실험을 진행하였다.

그 결과, 본 발명의 재조합 단백질은 Mn2+이온의 존재 하에서 효소 활성이 유의적으로 증가하는 결과를 나타내었으며, Fe2+, Cu2+, Zn2+이온의 존재할 때 활성이 유의적으로 감소하는 것으로 확인되었다(도 5. 파란색: 킬레이트화제 2.5 mM 첨가군, 노란색: 금속이온 1 mM 첨가군).

<실험예 6>

thin layer chromatography (TLC)를 수행하여, 본 발명의 재조합 단백질의 분해 패턴을 평가하였다.

구체적인 평가 방법은 하기와 같다. 10 mM phosphate buffer (pH 7.0)을 이용하여 라미나린, 베타글루칸, 리체난과 라미나리올리고당(2당 내지 6당)을 0.2%가 되도록 녹인 후, 이를 실험예 2에서 분리, 정제한 본 발명의 재조합 엔도 베타-1,3-글루카네이즈와 반응시켰다. 상기 TLC의 용매는 ethyl acetate, acetic acid 및 증류수를 2:2:1(ethyl acetate: acetic acid: water)의 부피비로 혼합한 혼합액을 사용하였고, 반응 산물을 1 μL씩 로딩(loading)하였다. 상기 플레이트는 silica gel 60 glass plate를 사용하여 전개시켰고, 전개 후에 플레이트를 완전히 건조시켰으며, 여기에 10% 황산 용액을 분사한 후, 이를 130℃에서 10분간 방치하여 당 분해 패턴을 확인하였다.

그 결과는 도 6과 같다. 도 6은 TLC를 이용한 엔도 베타-1,3-글루카네이즈의 기질에 따른 분해 패턴을 분석한 결과이다(G: 글루코스, LM: 리미나리올리고당 혼합액(L2, L3, L4, L5, L6), L2: 라미나리바이오스(laminaribiose; 2당), L3: 라미나리트라이오스(laminaritriose; 3당), L4: 라미나리테트라오스(laminarintetraose; 4당), L5: 라미나리펜토오스(laminaripentose; 5당), L6: 라미나리헥소오스(laminarihexose; 6당), LAM: 라미나린, BBG: 발리 베타-글루칸, LIC: 리체난.).

이 때, G와 LM은 표준 물질로 사용하였다. L2, 즉 라미나리바이오스는 더 이상 분해 되지 않았으나 L3, 즉 라미나리트라이오스보다 큰 올리고당은 엔도 글루카네이즈와 반응하여 1당과, 2당으로 분해되었다. 라미나린은 분해되어 1당과 2당으로 분해된 것에 반하여, 발리 베타글루칸과 리체난은 분해되어 2당과 3당을 주로 생성하였다. 그러므로 본 발명의 재조합 단백질은 라미나리바이오스 분해능은 없으나 라미나리트라이오스보다 큰 라미나리올리고당에 대하여는 분해능이 있는 것을 알 수 있었다.

<110> KIOST <120> NOVEL ENDO BETA-1,3-GLUCANASE AND A PREPARATION METHOD THEREOF <130> LNP140002 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a gene of endo-beta-1,3-glucanase <400> 1 atgaaaagca taaaaacatt aagttacctt ttgggcttgc tttgcttggt attggcttgc 60 caagaagaag aaccagaatt acaagcattg gtaacgccaa caaatttggt gttgaccact 120 aatgtggcag aagaccaatc tggttttgtt acggtaacac caacggcaga aaatgccttg 180 tattatcatg tgttttttaa tccaggagca gagcctgttg tcgtttcagc aggggaaacg 240 gcaagcttta gatatacccg ttctggagaa taccaacagc ctattacagc cgtagccttt 300 gcccgtggcg gattaagttc aagcgctacg gtgctggtag acttaaatgt gcggttgcga 360 atagatgcgg caaccttagg attattggca ggtggtgatg gtactacgcc tagcagtaaa 420 agatgggtat gggaccgtac cgttggtggg cactttggtg taggcccttt aacgaatgat 480 tttcctgagt tttttagtgc aggccctaat caattaaaca gttgtttgta tgatgatgtc 540 ttaacttttg agcacgatgg caacgataat tatacctatt ctttagatgc aggtgcggat 600 aatctagtat tcattaactg gacagaggta aaccgttttt ttccagatgc tacgccccaa 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acggtgaaca atgcgtggga agaattaaca tttgattttt ctgccgcagg taatttcaac 1560 tataaccgca ttgtggtatt ctttgatttt ggcgaagtag gccccgctgc atccgggtat 1620 acctccgcaa gaataaaaac cgaagggtta caagagttta cctacggtag ggtagcggct 1680 agggcaaaac tgccaacagg tggcggtaca tggcctgcca tttggatgct aggtgcagat 1740 taccaaacca acccttggcc agctgctggt gaaattgata ttatggaaca tgtaggcaac 1800 caacaagata ttatatttgg ttctacgcac gatcaaaata attctgccgg taatgccaga 1860 acggggtcta ctttggtacc aggcgtatcg gacgattttc atatttatga ggtagaatgg 1920 accagtacgg aaattcaatt tgccgtagat ggggtagtgt atcacacggt gagcaacgat 1980 ggtagtttgc cctttaacaa agattttttc ttgatactta acgtggccat gggcggtacg 2040 tttggcggag aagtagatgc agaatttacg gaatctacca tggaagtgga ctatatacgc 2100 gtatatcaat aa 2112 <210> 2 <211> 703 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of endo-beta-1,3-glucanase <400> 2 Met Lys Ser Ile Lys Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Leu Leu Cys Leu 1 5 10 15 Val Leu Ala Cys Gln Glu Glu Glu Pro Glu Leu Gln Ala Leu Val Thr 20 25 30 Pro Thr Asn Leu Val Leu Thr Thr Asn Val Ala Glu Asp Gln Ser Gly 35 40 45 Phe Val Thr Val Thr Pro Thr Ala Glu Asn Ala Leu Tyr Tyr His Val 50 55 60 Phe Phe Asn Pro Gly Ala Glu Pro Val Val Val Ser Ala Gly Glu Thr 65 70 75 80 Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Arg Ser Gly Glu Tyr Gln Gln Pro Ile Thr 85 90 95 Ala Val Ala Phe Ala Arg Gly Gly Leu Ser Ser Ser Ala Thr Val Leu 100 105 110 Val Asp Leu Asn Val Arg Leu Arg Ile Asp Ala Ala Thr Leu Gly Leu 115 120 125 Leu Ala Gly Gly Asp Gly Thr Thr Pro Ser Ser Lys Arg Trp Val Trp 130 135 140 Asp Arg Thr Val Gly Gly His Phe Gly Val Gly Pro Leu Thr Asn Asp 145 150 155 160 Phe Pro Glu Phe Phe Ser Ala Gly Pro Asn Gln Leu Asn Ser Cys Leu 165 170 175 Tyr Asp Asp Val Leu Thr Phe Glu His Asp Gly Asn Asp Asn Tyr Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Asp Ala Gly Ala Asp Asn Leu Val Phe Ile Asn Trp Thr 195 200 205 Glu Val Asn Arg Phe Phe Pro Asp Ala Thr Pro Gln Gln Phe Ala Asp 210 215 220 Glu Cys Arg Asp Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Thr Thr Asn Tyr Ala 225 230 235 240 Val Ile Glu Asn Thr Asp Gly Thr Gln Thr Leu Asp Val Gly Ser Ser 245 250 255 Phe Leu Ser Tyr Trp Ala Val Ile Pro Gly Gln Tyr Gln Ile Leu Glu 260 265 270 Leu Ser Glu Asn Arg Leu Ala Val Arg Gly Ile Ser Gln Pro Phe Asn 275 280 285 Gly Asp Asp Pro Leu Ala Trp Tyr Ala Val Phe Val Pro Glu Thr Met 290 295 300 Thr Asp Thr Gly Ser Glu Met Leu Glu Thr Gln Tyr Asp Thr Leu Val 305 310 315 320 Trp Ser Asp Glu Phe Asp Val Asp Gly Ala Pro Asn Pro Ile Asn Trp 325 330 335 Thr Tyr Asp Leu Gly Thr Gly Asn Asn Gly Trp Gly Asn Asn Glu Leu 340 345 350 Gln Ser Tyr Thr Asp Ala Thr Glu Asn Val Arg Val Ala Asn Asp Val 355 360 365 Leu Gln Ile Thr Ala Arg Ala Thr Gly Ser Thr Gly Ala Glu Val Tyr 370 375 380 Tyr Phe Asp Asp Val Thr Val Ala Asp Asp Ala Gly Thr Val Thr Gln 385 390 395 400 Thr Val Ser Asp Phe Glu Gly Thr Ala Pro Glu Phe Thr Asp Phe Glu 405 410 415 Gly Ala Ser Ala Thr Val Val Thr Asn Pro Asp Thr Asn Gly Asn Ala 420 425 430 Ser Gly Asn Val Val Gln Phe Thr Lys Asn Pro Gly Ala Ala Phe Phe 435 440 445 Ala Gly Ser Phe Tyr Glu Val Ser Thr Pro Ile Asp Leu Ser Val Asn 450 455 460 Lys Asn Ile Lys Leu Lys Thr Trp Ser Pro Lys Ile Gly Ala Val Val 465 470 475 480 Arg Val Lys Leu Glu Asn Ala Ala Asn Thr Asp Glu Phe Tyr Glu Ala 485 490 495 Asp Ala Thr Thr Thr Val Asn Asn Ala Trp Glu Glu Leu Thr Phe Asp 500 505 510 Phe Ser Ala Ala Gly Asn Phe Asn Tyr Asn Arg Ile Val Val Phe Phe 515 520 525 Asp Phe Gly Glu Val Gly Pro Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Ser Ala Arg 530 535 540 Ile Lys Thr Glu Gly Leu Gln Glu Phe Thr Tyr Gly Arg Val Ala Ala 545 550 555 560 Arg Ala Lys Leu Pro Thr Gly Gly Gly Thr Trp Pro Ala Ile Trp Met 565 570 575 Leu Gly Ala Asp Tyr Gln Thr Asn Pro Trp Pro Ala Ala Gly Glu Ile 580 585 590 Asp Ile Met Glu His Val Gly Asn Gln Gln Asp Ile Ile Phe Gly Ser 595 600 605 Thr His Asp Gln Asn Asn Ser Ala Gly Asn Ala Arg Thr Gly Ser Thr 610 615 620 Leu Val Pro Gly Val Ser Asp Asp Phe His Ile Tyr Glu Val Glu Trp 625 630 635 640 Thr Ser Thr Glu Ile Gln Phe Ala Val Asp Gly Val Val Tyr His Thr 645 650 655 Val Ser Asn Asp Gly Ser Leu Pro Phe Asn Lys Asp Phe Phe Leu Ile 660 665 670 Leu Asn Val Ala Met Gly Gly Thr Phe Gly Gly Glu Val Asp Ala Glu 675 680 685 Phe Thr Glu Ser Thr Met Glu Val Asp Tyr Ile Arg Val Tyr Gln 690 695 700 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gagagacata tgatgcatca tcatcatcat cattgccaag aagaagaacc agaa 54 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gagagaggat ccttattgat atacgcgtat atagtccact tc 42

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 엔도 베타-1,3-글루카네이즈(endo-β-1,3-glucanase).
제 1항에 있어서,
라미나린의 분해능을 갖는 것을 특징으로 하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈.
제 1항에 있어서,
베타-글루칸의 분해능을 갖는 것을 특징으로 하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈.
제 1항에 있어서,
리체난의 분해능을 갖는 것을 특징으로 하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈.
제 1항에 있어서,
메소플라비박터 속 유래인 것을 특징으로 하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈.
제 1항에 있어서,
자일란 및 카복시메틸 셀룰로스의 분해능이 없는 것을 특징으로 하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈.
제 1항에 있어서,
50~55 ℃에서의 효소 활성이 30 ℃에서의 효소 활성의 2 배 이상인 것을 특징으로 하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈.
제 1항에 있어서,
pH 7-9에서의 효소 활성이 pH 11에서의 효소 활성의 2 배 이상인 것을 특징으로 하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈
제 1항에 있어서,
라미나리바이오스에 대하여는 분해능이 없으나 라미나리트리오스 이상의 라미나리올리고당에 대하여는 분해능을 갖는 것을 특징으로 하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈.
제 1항의 엔도 베타-1,3-글루카네이즈를 코드하는 유전자.
제 10항에 있어서,
서열번호 1의 염기 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 10항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제 12항의 재조합 벡터는
pET11a인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제 13항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 14항에 있어서,
대장균, 바실러스, 슈도모나스, 효모 또는 진균인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제 12항의 재조합 벡터를 준비하는 단계;
상기 재조합 벡터를 숙주에 형질전환시키는 단계;및
상기 숙주를 배양하는 단계를 포함하는 엔도 베타-1,3-글루카네이즈의 생산 방법.
서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자.