KR101481741B1 - Method for inhibiting apoptosis caused by PrPsc using IGF-1 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IGF-1을 이용한 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 세포자멸사의 억제방법에 관한 것이다. 본 발명의 IGF-1은 변형 프리온 단백질에 의해 유발되는 활성 산소종의 생성을 감소시켜 세포자멸사를 효과적으로 억제할 수 있다. The present invention relates to a method for inhibiting apoptosis induced by a modified prion protein using IGF-1. IGF-1 of the present invention can effectively inhibit apoptosis by reducing the production of reactive oxygen species induced by modified prion protein.

Description

ⅠＧＦ­１을 이용한 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 세포자멸사의 억제방법{Method for inhibiting apoptosis caused by PrPsc using IGF-1}The present invention relates to a method for inhibiting apoptosis induced by modified prion protein using IGF1,

본 발명은 IGF-1을 이용한, 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 세포자멸사의 억제방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method of inhibiting apoptosis induced by a modified prion protein using IGF-1.

프리온(Prion)은 기존의 병원체(박테리아, 바이러스, 곰팡이, 기생충)와는 전혀 다른 종류의 질병 감염인자로서, 보통의 바이러스보다 훨씬 작고, 유전물질인 핵산 없이 감염성 질환을 일으키는 특징을 가진다. 사람을 포함해 동물에 감염되면 뇌에 스펀지양 공포형성으로 신경세포의 사멸을 일으켜 퇴행성 신경질환을 유발한다.Prion is a disease infectious factor that is completely different from existing pathogens (bacteria, viruses, molds, parasites) and is much smaller than normal viruses and has the characteristic of causing infectious diseases without nucleic acid which is genetic material. Infection with animals, including humans, causes neuronal death by sponge bilobar formation in the brain, leading to degenerative neurological diseases.

프리온 질병은 현재까지도 정확한 발생기전이 밝혀져 있지 않으며, 많은 과학자들은 프리온 질환의 발생이 정상적인 프리온 단백질(PrPc)과 연관이 있을 것으로 추정하고 있다. 특정 상황에서 PrPc가 비정상적인 형태를 취하는데, 이를 변형 프리온 단백질 (PrPSc)이라 한다. PrPSc는 PrPc와 달리 서로 응집하는 경향이 있고, 이러한 PrPsc의 응집체가 전염성 해면상 뇌증(Tansmissible spongiform encephalopathy, TSE)의 전염성을 일으킨다고 추정하고 있다. PrPc는 3개의 나선구조(α helix)와 2개의 병풍구조(β sheet)로 이루어져 있다. PrPc는 현재까지 잘 알려지지 않은 기전을 통해 PrPsc로 전환되며 PrPsc는 PrPc보다 병풍구조가 더 많은 것으로 알려져 있다. 이러한 전환과정이 실제로 일어난다는 증거는, PrPc가 존재하지 않는 쥐에 PrPsc를 외부에서 주입하더라도 TSE가 발생하지 않는다는 것이다. PrPsc가 PrPc로 전환되기 위해서는 1개 이상의 샤페론 단백질이 주요한 역할을 할 것으로 추정된다. PrPc와 달리 PrPsc는 서로 응집하여 비수용성(insoluble)이 되고 단백분해효소 K(proteinase K)에 의해 완전 분해되지 않게 된다. PrPsc는 PrPc와 입체구조가 전혀 다름에도 불구하고, 생체의 면역시스템은 PrPsc를 외부물질로 인식하지 못하고 있다.To date, the precise mechanism of prion disease has not been elucidated, and many scientists suspect that the development of prion diseases may be linked to normal prion protein (PrP c ). Under certain circumstances, PrP c takes an abnormal shape, which is called a modified prion protein (PrP Sc ). PrP Sc tends to coagulate unlike PrP c, and it is estimated that these aggregates of PrP sc cause the infectivity of Tansmissible spongiform encephalopathy (TSE). PrP c consists of three helical structures (α helix) and two screen structures (β sheet). PrP c to PrP sc transition is through a well-known mechanism that is far and PrP sc is known to have many more folding structure than PrP c. The evidence that this conversion process actually occurs is that TSE does not occur when PrP sc is injected externally in rats without PrP c . It is presumed that one or more chaperone proteins play a major role in the conversion of PrP sc to PrP c . Unlike PrP c , PrP sc aggregates and becomes insoluble and is not completely degraded by protease K (proteinase K). Although PrP sc is completely different from PrP c , the immune system of the living body does not recognize PrP sc as an external substance.

정상적인 프리온 단백질은 세포막에 존재하는 당단백질로서 대부분이 뇌에서 발현되며, 생체 내 기능에 대해서는 많이 밝혀져 있지는 않으나, 세포성장 및 부분적인 신호전달 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 모든 TSE 질병에 있어서 발병 기전은 신경세포의 사멸을 유도함으로써 뇌에 스폰지양 공동과 같은 병변을 일으켜, 뇌의 손상을 야기하는 것으로 알려져 있으나, 현재까지도 이러한 병변들이 PrPsc의 단독 작용에 의한 것인지 정상적인 프리온 단백질도 일부 관여를 하는지는 밝혀지지 않았다.The normal prion protein is a glycoprotein present in the cell membrane, most of which is expressed in the brain and is not known much in vivo, but it is known to have cell growth and partial signal transduction. In all TSE diseases, the onset of neuronal death induces neuronal death, which causes brain lesions such as sponge cords, causing damage to the brain. However, until now, whether these lesions are caused by the sole action of PrP sc It is not known whether prion proteins also participate in some.

변형 프리온 단백질은 다양한 포유류에서 진행성 신경질환을 일으키며, 그 치사율은 100%에 이른다. 인간의 CJD, 소의 BSE, 양의 스크래피, 사슴의 CWD, 밍크의 TME 등이 대표적인 프리온 질병으로 알려져 있다. 일반적으로 이 질병은 동종 내에서 전파되지만 이종으로 전이되었을 때 더 큰 문제를 야기한다. 가장 대표적인 예로서 소의 BSE로부터 전이되어 발병한 인간의 vCJD를 들 수 있다. 현재 이러한 프리온 질병에 대한 예방 및 치료제는 실용화되지 않았다. 퀴나크린, 퀴놀린, RNA 엡타머 및 항 PrP 항체 등의 물질들이 항프리온 효과를 보이고 있지만, 세포 및 동물실험단계에 머물러 있고, 만족할만한 성과를 얻지 못한 실정이다. 따라서 프리온 질병의 예방 및 치료를 위한 연구 분야는 무한한 개발 가능성을 가지고 있다.
Modified prion proteins cause progressive neurological disease in a variety of mammals, with a mortality rate of 100%. Human CJD, bovine BSE, sheep scrapie, deer CWD, and mink TME are known as prion diseases. In general, the disease spreads within the same species, but it causes more problems when transferred heterogeneously. The most representative example is human vCJD, which has been metastasized from bovine BSE. Currently, preventive and therapeutic agents for such prion diseases have not been practically used. Quinacrine, quinoline, RNA, and anti-PrP antibodies have been shown to have anti-prion effects, but they remain in the experimental stage of cells and animals and have not achieved satisfactory results. Therefore, research fields for the prevention and treatment of prion diseases have unlimited development potential.

본 발명자들은 변형 프리온 단백질에 의해 유발되는 세포독성으로부터 세포를 보호하는 물질에 대해 연구하던 중, IGF-1이 변형 프리온 단백질에 의해 유발되는 활성 산소종의 생성을 감소시켜 세포자멸사를 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. The present inventors have been studying a substance that protects cells from cytotoxicity caused by modified prion proteins, and it has been found that IGF-1 effectively inhibits apoptosis by decreasing the production of reactive oxygen species induced by modified prion protein And completed the present invention.

따라서, 본 발명의 목적은 IGF-1을 이용한 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 세포자멸사의 억제방법을 제공하는데 있다.
Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for inhibiting apoptosis induced by a modified prion protein using IGF-1.

본 발명은 IGF-1을 이용한, 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 세포자멸사의 억제방법을 제공한다.
The present invention provides a method of inhibiting apoptosis induced by a modified prion protein using IGF-1.

본 발명에 따르면, IGF-1은 인체에 부작용이 없이 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 활성 산소종의 생성을 감소시켜 세포자멸사를 억제하는 효과가 있다.
According to the present invention, IGF-1 has the effect of inhibiting apoptosis by decreasing the production of reactive oxygen species induced by modified prion protein without side effects on the human body.

도 1은 IGF-1 전처리에 의한 세포자멸사의 감소를 광학현미경을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 IGF-1 전처리에 의한 세포자멸사의 감소를 아넥신 V에세이로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 IGF-1 전처리에 의한 활성산소종 생성 감소를 DCFHDA 에세이로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 IGF-1 전처리에 의한 pAKT 및 pERK의 발현량의 변화를 웨스턴 블랏팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.FIG. 1 is a graph showing the results of confirming the decrease of apoptosis by pretreatment with IGF-1 through an optical microscope.
FIG. 2 is a graph showing the analysis of the decrease of apoptosis by IGF-1 pretreatment with the Annexin V assay.
FIG. 3 is a graph showing the results of analyzing the reduction of reactive oxygen species production by IGF-1 pretreatment with the DCFHDA assay. FIG.
FIG. 4 is a graph showing the results of Western blotting of changes in the expression levels of pAKT and pERK by pretreatment with IGF-1.

본 발명은 IGF-1을 이용한 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 세포자멸사의 억제방법을 제공한다. The present invention provides a method for inhibiting apoptosis induced by a modified prion protein using IGF-1.

프리온(Prion)은 기존의 병원체(박테리아, 바이러스, 곰팡이, 기생충)와는 전혀 다른 종류의 질병 감염인자로서, 보통의 바이러스보다 훨씬 작고, 유전물질인 핵산 없이 감염성 질환을 일으키는 특징을 가진다. 사람을 포함해 동물에 감염되면 뇌에 스펀지양 공포형성으로 신경세포의 사멸을 일으켜 퇴행성 신경질환을 유발한다고 알려져 있다. 특정상황에서 정상적인 프리온 단백질 (PrPC)이 비정상적인 형태를 취하는데, 이를 변형 프리온 단백질 (PrPsc)이라 한다.Prion is a disease infectious factor that is completely different from existing pathogens (bacteria, viruses, molds, parasites) and is much smaller than normal viruses and has the characteristic of causing infectious diseases without nucleic acid which is genetic material. It is known that infection with animals, including humans, causes neuronal death by sponge morphogenesis in the brain, leading to degenerative neurological diseases. Under certain circumstances, a normal prion protein (PrP C ) takes an abnormal form, called a modified prion protein (PrP sc ).

변형 프리온 단백질(PrPsc)에 의해 유발되는 질병은 인간의 쿠루병 (KURU), 크로이츠펠트-야콥 질병(Creutzfeldt-Jakob Disease, CJD), 변형크로이츠펠트-야콥 질병(Variant Creutzfeldt-Jakob disease, vCJD), 의원성 크로이츠펠트-야콥 질병 (iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease, iCJD), 가족성 크로이츠펠트-야콥 질병 (Familial Creutzfeldt-Jakob disease, fCJD), 산발성 크로이츠펠트-야콥 질병 (Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease, sCJD), 거츠만-스트로이슬러-쉐인커병( Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome, GSS), 치명적 가족성 불면증(Fatal Familial Insomnia, FFI), 또는 치명적 산발성 불면증(sporadic fatal insomnia, sFI) 등을 포함할 수 있다. Diseases caused by modified prion proteins (PrP sc ) include human KURU, Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD), Variant Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD) Iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease (iCJD), Familial Creutzfeldt-Jakob disease (fCJD), sporadic Creutzfeldt-Jakob disease (sCJD) , Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome (GSS), Fatal Familial Insomnia (FFI), or sporadic fatal insomnia (sFI).

본 발명의 IGF-1은 변형 프리온 단백질에 의한 활성 산소종의 생성을 감소시킴으로써 세포자멸사를 억제한다. IGF-1 of the present invention inhibits apoptosis by reducing the production of reactive oxygen species by the modified prion protein.

본 발명의 변형 프리온 단백질(PrPsc)은 프리온 질병을 유발할 수 있는 비정상적 형태의 변형 프리온 단백질을 제한없이 포함할 수 있으며, 바람직한 일 예로써 변형 프리온 단백질 PrP(106-126)(서열번호 1)를 프리온 유발을 위해 사용할 수 있다. The modified prion protein (PrP sc ) of the present invention may include, without limitation, an abnormal form of the altered prion protein capable of causing prion disease, and as a preferred example, the modified prion protein PrP (106-126) (SEQ ID NO: 1) Can be used for prion induction.

변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 세포자멸사를 억제하기 위하여 IGF-1은 100μg/ml 내지 300μg/ml 농도로 처리할 수 있으며, 바람직하게는 200μg/ml 농도를 처리할 수 있다. In order to inhibit apoptosis induced by the modified prion protein, IGF-1 can be treated at a concentration of 100 μg / ml to 300 μg / ml, preferably at a concentration of 200 μg / ml.

또한 IGF-1은 변형 프리온 단백질 노출 전/후에 모두 처리 가능하나 바람직하게는 변형 프리온 단백질 노출 전에 처리할 수 있으며, 10 시간 내지 15 시간, 바람직하게는 12시간 동안 처리할 수 있다. In addition, IGF-1 can be treated both before and after the modified prion protein exposure, but preferably before the modified prion protein exposure and for 10 to 15 hours, preferably 12 hours.

또한 IGF-1은 pAKT의 발현을 증가시켜 pAKT 경로를 강화함으로써 변형 프리온에 의해 유도되는 세포자멸사로부터 세포를 보호할 수 있다.
In addition, IGF-1 can protect cells from transforming prion-induced apoptosis by enhancing the expression of pAKT and enhancing the pAKT pathway.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

실시예Example 1. 변형  1. Variation 프리온Prion 단백질  protein PrPPrP (106-126)의 제조(106-126)

1.1 세포 배양 및 시약 1.1 Cell culture and reagents

인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)는 ATCC(American Type Culture collection, Rockville, MD, USA)로부터 얻었다. 세포들을 5% CO2, 37℃의 환경조건으로 10%의 소태아혈청(Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, USA), 페니실린(100 units/ml) 및 스트렙토마이신(100 mg/ml)을 포함하는 최소필수배지(Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 배양하였다. IGF-1(Insulin like growth factor-1)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
Human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) was obtained from ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, USA), penicillin (100 units / ml) and streptomycin (100 mg / ml) in an environment of 5% CO 2 and 37 ° C (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, USA). Insulin like growth factor-1 (IGF-1) was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

1.2 변형 프리온 단백질 PrP(106-126) 제조1.2 Preparation of modified prion protein PrP (106-126)

프리온 질병을 유발하기 위한 변형 프리온 단백질로써 합성 PrP(106-126)(서열번호 1: Lys-Thr-Asn-Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly-Ala-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly)를 펩트론(서울, 한국)에 의뢰하여 제조하였다. 제조된 펩티드를 멸균 DMSO에서 10 mM 농도가 되도록 용해시키고 80℃에서 보관하였다.
Met-Lys-His-Met-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-Ala-Gly- Ala-Val-Val-Gly-Gly-Leu-Gly) was purchased from Peptron (Seoul, Korea). The prepared peptides were dissolved in sterile DMSO to a concentration of 10 mM and stored at 80 < 0 > C.

1.3 웨스턴 블랏팅 1.3 Western blotting

인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)는 용해 완충액(lysis buffer; 25mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT, 및 프로테아제 저해제 혼합물)에서 용해시켰다. 단백질을 10-15% SDS(sodium dodecyl sulfate) 겔 전기영동을 통해 분리하였고, 이후 면역블랏팅을 수행하였다. 동일한 양의 용해된 단백질을 10-15% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 용해시키고 전기영동 방법을 이용하여 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. HRP(horseradish peroxidase) 컨쥬케이트 이차 항체 및 ECL 키트를 이용하여 연속 배양을 수행하여 면역활성을 검출하였다. 면역블랏팅에는 phospho-JNK (Santa Cruz Biotechnology), Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology), phospho-AKT(Cell Signaling Technology) phospho-ERK (Cell Signaling Technology) 및 β-엑틴 (Santa Cruz Biotechnology)을 항체로 사용하였다.
Human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) was dissolved in lysis buffer (25 mM HEPES, pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl 2 , 0.1 mM DTT, and protease inhibitor mixture). Proteins were separated by 10-15% SDS (sodium dodecyl sulfate) gel electrophoresis followed by immunoblotting. The same amount of dissolved protein was dissolved in 10-15% SDS-polyacrylamide gel and transferred to the nitrocellulose membrane using electrophoresis. Continuous culture was performed using HRP (horseradish peroxidase) conjugate secondary antibody and ECL kit to detect immune activity. In immunoblotting, phospho-JNK (Santa Cruz Biotechnology), Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology), phospho-AKT (Cell Signaling Technology) Respectively.

실시예Example 2.  2. IGFIGF -1에 처리에 의한 -1 by treatment 세포자멸사Apoptosis 억제 효과-광학현미경 관찰 Suppression effect - Optical microscope observation

변형 프리온 단백질PrP(106-126)에 의해 유도된 인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)의 세포자멸사를 IGF-1 처리에 의하여 억제할 수 있는지 광학 현미경을 통해 확인하였다. 인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)는 12시간 동안 200ng/ml의 IGF-1으로 전처리한 후, 100μM의 PrP(106-126)에 24시간 동안 노출시켰다. 이 후, 200배 광학 현미경으로 세포의 모습을 관찰하였다. (SH-SY5Y) induced by the modified prion protein PrP (106-126) was inhibited by IGF-1 treatment through an optical microscope. Human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) was pretreated with 200 ng / ml of IGF-1 for 12 hours and then exposed to 100 μM of PrP (106-126) for 24 hours. After that, the appearance of the cells was observed with a 200x optical microscope.

결과는 도 1에 나타내었다. The results are shown in Fig.

도 1에 나타낸 바와 같이, IGF-1을 전처리한 인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)세포군의 경우, IGF-1 비처리 군에 비하여 많은 세포의 생존을 확인할 수 있어 IGF-1의 전처리가 변형 프리온 단백질에 의하여 유발되는 세포자멸사를 효과적으로 방지하여 세포의 생존율을 높일 수 있음을 알 수 있다
As shown in FIG. 1, in the case of the human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) cell group pretreated with IGF-1, the survival of many cells can be confirmed as compared with the IGF-1 non-treated group, It is possible to effectively prevent the apoptosis induced by the protein and to increase the survival rate of the cells

실시예Example 3  3 IGFIGF -1에 처리에 의한 -1 by treatment 세포자멸사Apoptosis 억제 효과 - Inhibitory effect - 아넥신Annexin V 에세이 V essay

IGF-1이 인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)의 세포자멸사에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 제조업자의 프로토콜에 따라 아넥신 V 에세이로 세포 생존율을 평가하였다. 아넥신 V 함량은 488nm 여기광 및 525/30nm 방출광에서 Guava EasyCyte HT 시스템 (Millipore,Billerica, MA, USA)을 이용하여 형광을 측정하여 수행하였다. 보다 구체적으로는, 인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)를 200μg/ml의 IGF-1으로 12시간 동안 전처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군으로 나누고 PrP 처리군은 100μM의 변형 프리온 단백질 PrP(106-126)에 24시간 동안 노출시켰다. In order to analyze the effect of IGF-1 on the apoptosis of human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y), the cell survival rate was evaluated with the annexin V assay according to the manufacturer's protocol. Annexin V content was measured by measuring fluorescence using a Guava EasyCyte HT system (Millipore, Billerica, MA, USA) at 488 nm excitation light and 525/30 nm emission light. More specifically, the human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) was divided into an experimental group pretreated with 200 μg / ml of IGF-1 for 12 hours and a control group without treatment. The PrP-treated group was divided into 100 μM of modified prion protein PrP ) For 24 hours.

결과는 도 2에 나타내었다. The results are shown in Fig.

도 2에 나타난 바와 같이, IGF-1을 세포에 전처리 한 경우 재조합 프리온 단백질 PrP(106-126)이 유도하는 세포자멸사가 억제되었으며, IGF-1을 전처리 한 경우, 아넥신 V 양성 세포가 재조합 프리온 단백질 PrP(106-126)를 단독으로 처리한 경우에 비하여 약 17% 감소한 것을 확인하였다. 따라서, IGF-1은 변형 프리온 단백질에 의하여 유발되는 세포자멸사를 효과적으로 방지하여 세포의 생존율을 높일 수 있음을 알 수 있다.
As shown in FIG. 2, pretreatment of cells with IGF-1 inhibited the apoptosis induced by recombinant prion protein PrP (106-126), and when pretreated with IGF-1, annexin V- Protein was reduced by about 17% as compared with the case where protein PrP (106-126) alone was treated. Thus, IGF-1 can effectively prevent apoptosis induced by modified prion protein and increase cell survival rate.

실시예Example 4.  4. IGFIGF -1에 처리에 의한 -1 by treatment 세포자멸사Apoptosis 억제 효과 - Inhibitory effect - DCFHDADCFHDA 에세이 Essay

인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)들은 10μM의 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, H2-DCFDA)를 포함하는 최소필수배지에서 37℃로 30분 동안 배양하였다. 세포들을 PBS(phosphate buffer saline)로 세척하고 용해완충액(25 mM HEPES; pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT 및 프로테아제 저해제 혼합물)에서 용해시켰다. 용해된 세포들을 96-웰 플레이트의 신선한 배지로 이동시켰고 SpectraMax M2(Molecular Devices)를 이용하여 488nm의 여기 파장을 갖고 515nm에서 방출되는 형광을 측정하였다. Human neuroblastoma cell lines (SH-SY5Y) were grown at 37 ° C in a minimal essential medium containing 10 μM 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2-DCFDA) And cultured for 30 minutes. Cells were washed with phosphate buffered saline (PBS) and lysed in lysis buffer (25 mM HEPES; pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT and protease inhibitor mixture). The lysed cells were transferred to fresh media in 96-well plates and the fluorescence emitted at 515 nm was measured with an excitation wavelength of 488 nm using SpectraMax M2 (Molecular Devices).

결과는 도 3에 나타내었다. The results are shown in FIG.

도 3에 나타낸 바와 같이, 변형 프리온 단백질 PrP(106-126)의 처리는 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)을 증가시켰으며, IGF-1을 전처리한 경우, 변형 프리온 단백질 PrP(106-126)를 단독으로 처리한 경우에 비하여 활성산소종의 생성이 억제되었다. 따라서, IGF-1은 활성산소종의 생성에 의해 유발되는 세포자멸사를 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.
As shown in Fig. 3, the treatment of the modified prion protein PrP (106-126) increased the reactive oxygen species (ROS), and when IGF-1 was pretreated, the transformed prion protein PrP ) Was inhibited from the production of active oxygen species. Thus, it can be seen that IGF-1 effectively inhibits apoptosis induced by the production of reactive oxygen species.

실시예Example 5.  5. IGFIGF -1 처리에 의한 -1 treatment pAKTpAKT 증가 increase

변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 세포자멸사가 IGF-1 처리에 의하여 어떤 경로를 통해 보호되는지 확인하기 위하여, IGF-1 처리에 의한 pAKT와 pERK 발현양의 변화를 확인하였다. IGF-1을 인간 신경모세포종 세포주(SH-SY5Y)에 200ng/ml로 12시간 동안 전처리한 후 100μM의 PrP(106-126)에 24시간 동안 노출시켰다. 이 후 웨스턴 블랏팅을 통해 pAKT 와 pERK의 발현양을 확인하였다. In order to confirm the pathway of apoptosis induced by the modified prion protein, the changes of pAKT and pERK expression by IGF-1 treatment were examined. IGF-1 was pretreated with human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) at 200 ng / ml for 12 hours and exposed to 100 μM PrP (106-126) for 24 hours. The amount of pAKT and pERK expression was then confirmed by Western blotting.

결과는 도 4에 나타내었다. The results are shown in Fig.

도 4에서 나타낸 바와 같이, IGF-1 전처리에 의하여 pAKT의 발현은 증가하였으나, pERK의 발현양은 변화가 없었다. 따라서, IGF-1은 변형 프리온 단백질 PrP(106-126)에 의한 pAKT를 강화함으로써 세포자멸사를 억제함을 알 수 있었다. As shown in FIG. 4, the expression of pAKT was increased by IGF-1 pretreatment, but the amount of pERK expression was not changed. Thus, it was found that IGF-1 inhibits apoptosis by enhancing pAKT by the modified prion protein PrP (106-126).

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for inhibiting apoptosis caused by PrPsc using IGF-1 <130> 1-107 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PrP protein <400> 1 Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val 1 5 10 15 Val Gly Gly Leu Gly 20 <110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for inhibiting apoptosis caused by PrPsc using IGF-1 <130> 1-107 <160> 1 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PrP protein <400> 1 Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val   1 5 10 15 Val Gly Gly Leu Gly              20

Claims (6)

IGF-1(Insulin like growth factor-1)을 이용한, 변형 프리온 단백질(PrPsc)에 의해 유도되는 인간을 제외한 동물의 세포자멸사 억제방법.
A method for inhibiting apoptosis in an animal other than a human, which is induced by a modified prion protein (PrP sc ) using IGF-1 (insulin like growth factor-1).
제1항에 있어서, 상기 IGF-1은 변형 프리온 단백질에 의해 유발되는 활성 산소종 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 인간을 제외한 동물의 세포자멸사 억제방법.
2. The method of claim 1, wherein the IGF-1 is reduced reactive oxygen species production induced by a modified prion protein.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IGF-1은 100μg/ml 내지 300μg/ml로 처리하는 것을 특징으로 하는, 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 인간을 제외한 동물의 세포자멸사 억제방법.
3. The method according to claim 1 or 2, wherein the IGF-1 is treated with 100 μg / ml to 300 μg / ml.
제3항에 있어서, 상기 IGF-1은 10 시간 내지 15 시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는, 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 인간을 제외한 동물의 세포자멸사 억제방법.
4. The method according to claim 3, wherein the IGF-1 is treated for 10 to 15 hours.
제3항에 있어서, 상기 IGF-1은 세포에서 pAKT의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 변형 프리온 단백질에 의해 유도되는 인간을 제외한 동물의 세포자멸사 억제방법.4. The method of claim 3, wherein said IGF-1 increases the expression of pAKT in a cell. 삭제delete
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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