KR101478948B1 - 농산물에서 캠필로박터 종 균주를 검출하기 위한 선택배지 조성물 - Google Patents

농산물에서 캠필로박터 종 균주를 검출하기 위한 선택배지 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명은 농산물에서 캠필로박터 종(Campylobacter spp.) 균주를 검출하기 위한 선택배지 조성물 및 상기 선택배지 조성물을 이용하여 농산물 내 캠필로박터 종 균주를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 혈액무첨가(blood-free) 볼튼 배지에 리팜피신(rifampicin) 및 술파메톡사졸(sulfamethoxazole)을 첨가한 조성물 등에 관한 것이다. 신선 농산물의 경우 계분을 비료로 사용하여 재배되는 경우가 많아 캠필로박터 균주 오염 가능성이 높기 때문에 신선 농산물에 대한 지속적인 모니터링이 필요한 바, 본 발명에 따른 선택배지는 종래 선택배지에 비해 신선 농산물 내 캠필로박터 균주에 대한 선택성이 현저하게 우수하므로, 신선 농산물 내 캠필로박터 균주 검출을 위한 선택배지로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

농산물에서 캠필로박터 종 균주를 검출하기 위한 선택배지 조성물{SELECTIVE MEDIUM COMPOSITION FOR THE DETECTION OF CAMPYLOBACTER SPP. IN FRESH PRODUCE}
본 발명은 농산물에서 캠필로박터 종(Campylobacter spp.) 균주를 검출하기 위한 선택배지 조성물 등에 관한 것이다.
캠필로박터(Campylobacter spp.)균은 그람음성, 미호기성(microaerophilic) 간균으로 인체에 감염되어 식중독을 일으키는 병원성 세균이다. 특히, Campylobacter jejuni 와 Campylobacter coli 는 전체 캠필로박터균 감염증의 약 90%를 차지하고, 미국에서는 전체 식중독의 3위를 차지하고 있는 높은 식중독 사고의 원인균이다. 이러한 캠필로박터균에 의한 식중독 사고는 전 세계적으로 급증하고 있어 문제가 되고 있다.
식품 내 캠필로박터균 검출 시, 국내외 공인검출법에서는 증균을 하여 균수를 늘린 후, 선택배지를 사용하는 표준화된 검출법을 사용하고 있다. 일반적으로 사용되는 선택배지는 혈액이 포함된 선택배지인 Preston agar, Skirrow agar, Butzler agar, Campy-cefex agar 등이 있고, 혈액이 포함되지 않은 선택배지인 mCCDA, Karmali agar, CAT agar 등이 있다. 혈액이나 활성탄의 경우 산소독성을 제거해주는 역할을 하여 미호기성인 캠필로박터의 성장에 도움을 준다. 또한, 배지의 선택성을 증가시키기 위하여 항생제가 사용되며 주로 세파계열(caphalosporins)이 사용되고, 그 외에 다른 계열의 항생제를 같이 사용한다.
그러나 상기와 같은 종래 선택배지는 항생제가 들어감에도 불구하고, 식품 내 캠필로박터균 검출에는 한계점이 있는 것으로 알려져 있다. 신선 농산물로부터 캠필로박터균의 오염도를 분석할 때 Food and Drug Adiministration (FDA) Bacteriological Analytical Manual (BAM)에서 제시한 선택배지인 mCCDA를 사용한 결과, 캠필로박터균 외의 균이 검출되어 높은 위양성(false-positive) 결과를 나타냈다(배영민 et al ., 한국에 유통중인 신선편이 채소류의 미생물 품질 및 병원성 세균의 오염도 조사, Korean J. Food Sci. Technol., 2011, 43:161-168). 이처럼 선택배지의 구성성분인 항생제에 저항을 보이는 균일 경우 캠필로박터균 검출에 방해요소가 된다. 특히 농산물에서 일반적으로 발견되는 몇몇 상재균(Ochrobacterium sp., Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. 등)이 기존의 캠필로박터균 선택배지에서 생육하는 것으로 나타났으며, 콜로니 모양이나 색 등도 유사해서 다수의 위양성 결과를 내는 것으로 확인되었다.
소비자의 건강에 대한 관심이 증가하면서 신선 농산물과 특히 유기농으로 재배된 채소, 과일에 대한 수요가 증가하고 있다. 유기농으로 재배 시 가장 높은 비율로 사용되는 퇴비가 계분이며, 따라서 닭이나 오리 등 가금류에 주로 분포하는 캠필로박터균이 농산물에 유입되어 식중독의 원인으로 작용할 수 있다. 따라서 추후 농산물에 대한 캠필로박터균이 검출이 필요하나 기존의 개발된 배지는 모두 계육 등의 가금류에서 캠필로박터균의 분리를 목적으로 개발되어 농산물에서 적용 시 높은 위양성 결과를 도출하여 오류를 나타내는 문제점이 있다. 따라서 농산물 등의 식품에서 캠필로박터균의 검출 및 조사에 이용할 수 있는 선택성이 높은 새로운 배지의 개발이 필요한 실정이다.
종래 사용되고 있는 캠필로박터 선택배지는 계육 등의 동물성 식품에서의 캠필로박터 균주 검사 시 이용할 수 있도록 개발되어 신선 농산물에서 검출 시 높은 위양성 결과가 도출됨에 따라, 본 발명자들은 종래기술의 문제점을 극복하기 위하여 신선 농산물에 상재하는 비-캠필로박터 균주의 생육을 효과적으로 억제하여 캠필로박터 균주 선택성을 높일 수 있는 새로운 조성의 선택배지를 개발이 필요함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 혈액무첨가(blood-free) 볼튼 배지에 리팜피신(rifampicin) 및 술파메톡사졸(sulfamethoxazole)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 농산물에서 캠필로박터 종(Campylobacter spp.) 균주를 검출하기 위한 선택배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 분쇄한 농산물 시료를 상기 선택배지 조성물에 배양하는 단계를 포함하는 농산물에서 캠필로박터 종(Campylobacter spp.) 균주를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 농산물에서 캠필로박터 종(Campylobacter spp.) 균주를 검출하기 위한 선택배지 조성물로, 상기 조성물은 혈액무첨가(blood-free) 볼튼 배지에 리팜피신(rifampicin) 및 술파메톡사졸(sulfamethoxazole)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 리팜피신은 1 mg/L 내지 50 mg/L 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 술파메톡사졸은 6.25 mg/L 내지 100 mg/L 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 조성물은 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 시프로플록사신은 0.1 mg/L 내지 1mg/L 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 캠필로박터 종 균주는 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 및 캠필로박터 콜리(Campylobacter coli)일 수 있다.
또한, 본 발명은 분쇄한 농산물 시료를 상기 선택배지 조성물에 배양하는 단계를 포함하는 농산물에서 캠필로박터 종(Campylobacter spp.) 균주를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 밀폐용기에서 미호기적 환경 조건으로 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 배양은 37℃ 내지 42℃에서 24시간 내지 48 시간 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 방법은 배양된 콜로니를 API 20E kit 또는 16S rRNA 서열 분석법을 이용하여 캠필로박터 종 균주인지 동정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 선택배지는 종래 선택배지에 비해 신선 농산물 내 캠필로박터 균주에 대한 선택성이 현저하게 우수하므로, 신선 농산물 내 캠필로박터 균주 검출을 위한 선택배지로 유용하게 사용될 수 있는 특징이 있다.
신선 농산물의 경우 계분을 비료로 사용하여 재배되는 경우가 많아 캠필로박터 균주 오염 가능성이 높기 때문에 신선 농산물에 대한 지속적인 모니터링을 위해 본 발명의 선택배지를 활용할 수 있다.
도 1은 다양한 선택배지에서 자란 콜로니 모양을 관찰한 것이다(A: mCCDA 배지에서 Campylobacter jejuni ATCC 33291, B: mCCDA 배지에서 유기농 상추(organic lettuce-1)의 Ochrobactrum intermedium, C: 볼튼 한천 배지에서 양파(onion-2)의 Pseudomonas syringae, D: mCCDA 배지에서 Pseudomonas fluorescens, E: 볼튼 한천 배지에서 Pseudomonas fluorescens-2, F: mCCDA 배지에서 Acinetobacter clacoaceticus-2).
도 2는 리팜피신 및 술파메톡사졸이 첨가된 볼튼 한천 배지에서 콜로니의 모양을 관찰한 것이다(A: Campylobacter jejuni ATCC 33291, B: 마늘대의 Pseudomonas putida, C: 양파(onion-2)의 Pseudomonas syringae, D: 콩나물(sprout-2)의 Pseudomonas sp.).
본 발명은 농산물에서 캠필로박터 종(Campylobacter spp.) 균주를 검출하기 위한 새로운 선택배지 조성물을 제공하는 것을 특징으로 하며, 상기 조성물은 혈액무첨가(blood-free) 볼튼 배지에 리팜피신(rifampicin) 및 술파메톡사졸(sulfamethoxazole)을 더 포함한다.
종래 캠필로박터 선택배지는 계육 등의 동물성 식품에서 캠필로박터균을 검사할 때 이용할 수 있도록 개발되어져, 신선 농산물에서 캠필로박터균을 검사할 때 이용할 경우 높은 위양성(false-positive) 결과를 나타내는 문제점이 있다. 이는 농산물에 일반적으로 분포하는 여러 상재균(Ochrobacterium sp., Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. 등)이 종래 캠필로박터균 선택배지에서 생장할 수 있기 때문인 것으로 나타났으며, 몇몇 배지는 캠필로박터균에 대한 민감도가 매우 낮아 캠필로박터균 검출에 실패하는 경우도 관찰되었다(실시예 2 참조). 이에, 본 발명자들은 캠필로박터균 선택배지 중 볼튼(Bolton) 배지를 선정하되, 혈액은 첨가하지 않고, 리팜피신(rifampicin)과 술파메톡사졸(sulfamethoxazole)을 추가로 첨가함으로써, 비-캠필로박터균의 생장은 억제시키면서 캠필로박터균에 대한 민감성은 개선시켜 선택성이 높은 선택배지를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 농산물에서 캠필로박터 종(Campylobacter spp.) 균주를 검출하기 위하여, 리팜피신(rifampicin) 및 술파메톡사졸(sulfamethoxazole)을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액무첨가(blood-free) 볼튼 배지 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 캠필로박터 종 균주는 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 및/또는 캠필로박터 콜리(Campylobacter coli)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
볼튼 배지(Bolton broth)는 식품으로부터 캠필로박터균을 검출하기 위한 선택적인 농축 배지(enrichment broth)로서, 이 배지는 캠필로박터균을 회수하기 위하여 사용된다(배지 제조방법 등 기타 사항은 Oxoid 사 제품설명서 참조).
본 발명에 따른 선택배지의 조성의 성분 및 용량(gm/litre)은 표 6의 BRS 배지에 나타낸 바와 같다. 이때, 선택첨가제(Selective Supplement)에 열거된 항생물질들은 캠필로박터균에 대한 선택성을 최적화하는 것으로, 반코마이신(Vancomycin)은 그람양성균에 활성을 가지고, 세포페라존(Cefoperazone)은 주로 그람음성균에 활성을 가지며, 트리메소프림(Trimethoprim)은 넓은 범위의 그람양성균 및 그람음성균에 대한 활성을 가지고, 시클로헥시미드(Cycloheximide)는 효모에 활성을 가진다.
상기 선택배지 조성물에서 리팜피신은 바람직하게 1 mg/L 내지 50 mg/L 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 5 mg/L 내지 20 mg/L 농도로 포함될 수 있고, 가장 바람직하게는 10 mg/L 농도로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 술파메톡사졸은 바람직하게 6.25 mg/L 내지 100 mg/L 농도로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 25 mg/L 내지 75 mg/L 농도로 포함될 수 있고, 가장 바람직하게는 50 mg/L 농도로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는 생닭 및 신선 농산물을 혈액무첨가 볼튼 배양액에 담아 분쇄하고 증식시킨 뒤, 슈도모나스 종의 생장을 억제하는 것으로 알려진 항생제 시플로플록사신(ciprofloxacin)을 더 첨가한 배양액을 포함한 다양한 선택배지 조성물에서 재배양한 결과, 생닭 시료에서의 결과는 균주의 생장에 큰 차이가 없는 반면, 신선 농산물 시료에서는 대조군 선택배지(mCCDA)에 비해 상기 본 발명에 따른 선택배지(BRS 배지)에서 양성 샘플수가 감소하는 것으로 나타났으며, 시플로플록사신을 더 첨가한 선택배지(BRSC 배지)에서는 비-캠필로박터균(위양성캠필로박터)의 생장이 보다 저해됨을 확인하였다(실시예 7 참조).
상기로부터, 본 발명의 선택배지 조성물은 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 더 포함할 수 있으며, 시프로플록사신을 바람직하게는 0.1 mg/L 내지 1mg/L 농도로 포함시킬 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.2 mg/L 내지 0.7 mg/L 농도로 포함시킬 수 있고, 가장 바람직하게는 0.5 mg/L 농도로 포함시킬 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이에 더하여, 상기로부터 본 발명은 분쇄한 농산물 시료를 상기 선택배지 조성물에 배양하는 단계를 포함하는 농산물에서 캠필로박터 종(Campylobacter spp.) 균주를 검출하는 방법을 제공할 수 있다.
이때, 상기 배양은 미호기적 환경 조건의 밀폐용기에서, 37℃ 내지 42℃의 온도로 24시간 내지 48 시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 농산물에서 캠필로박터 종 균주를 검출하는 방법은, 배양된 콜로니를 API 20E kit 또는 16S rRNA 서열 분석법을 이용하여 캠필로박터 종 균주인지 동정하는 단계를 더 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러 본 발명에서 농산물은 유기농으로 재배된 채소 및 과일을 포함한 신선 농산물일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
균주 및 배양배지 (배양액) 조건
본 발명의 실시예는 다음과 같이 준비된 균주 및 배양 조건에서 수행되었다.
캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 8 균주(ATCC 33291, 4 human isolates, 1 beef isolate, 1 pork isolate, 1 chicken isolate), 캠필로박터 콜리(Campylobacter coli) 3 균주(chicken isolates)는 중앙대학교 및 건국대학교의 균주은행과 국립수의과학검역원으로부터 제공받았으며, 선택적 한천 분리 방법으로 신선한 위양성 (False-positive) 캠필로박터 균주 (n=49)를 얻었다. 모든 균주는 50% 글리세롤 용액에서 -80℃로 보관하였으며, 볼튼 배앵약 선택적 보충물(Bolton broth selective supplement; Oxoid, Basingstoke, U.K)을 첨가한 혈액무첨가 볼튼 배양액(blood-free Bolton broth; Oxoid)에서 배양하여 활성화시켰다. 증식 배양액은 사용 전 혐기배양기(anaerobic jar; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 내의 CampyGen gas pack (Oxoid)을 이용하여 37℃에서 48시간동안 미호기적 환경에서 배양하였다. 일부 위양성 캠필로박터 균주들은 16S rRNA 서열분석법을 이용하여 선별해냈다.
병원성 박테리아 균주(n=12; Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150, E. coli ATCC 25922, Bacillus cereus ATCC 10876, Citrobacter freundi ATCC 8090, Hafnia alvei ATCC 29927, Stapylococcus aureus ATCC 49444, Salmonella enterica ATCC 13076, Salmonella Typhimurium ATCC 19586, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692, P. aeruginosa ATCC 10145, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Cronobacter sakazakii ATCC 12868) 및 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus; ATCC 04356)는 중앙대학교 균주은행으로부터 얻었다. 비병원성인 부패 박테리아 균주(Spoilage bacteria strain; n=15; Chryseobacterium balustinum, Enterobacter spp., Pantoea agglomerans, B. pumilus, Clavibacter michiganensis, P. fluorescens, Acinetobacter calcoaceticus, Stenortophomonas maltophilia, Klebsiella pneumonia, Dickeya zeae, Pectobacterium carotovarum subsp. carotovaum Pcc21)는 신선 농산물로부터 분리하였다. 모든 균주는 50% 글리세롤 용액에서 -80℃로 보관하였으며, 사용 전 24시간 동안 37℃, TSB(tryptic soy broth)에서 배양하여 활성화시켰다.
캠필로박터 선택배지의 비교
캠필러박터 선택배지의 선택성을 알아보기 위해, 먼저 볼튼 한천(Bolton agar), 헌트 한천(Hunt agar), mCCDA, 프레스턴 한천(Preston agar)을 준비하고, 121℃에서 15분간 가압증기로 멸균한 뒤 50℃로 식혀 각각의 배지에 맞는 보충물 및/또는 혈액을 부드럽게 섞어준 다음 무균 페트리 디쉬에 부어 4종의 배지를 제조하였다. 그리고 캠필로박터 제주니 2 균주(ATCC 33291와 1 human isolate), 캠필로박터 콜리 3 균주 (chicken isolates), 및 신선 농산물로부터 분리한 위양성 캠필로박터 49 균주를 혐기배양기에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 혈액무첨가 볼튼 배양액에서 독립적으로 배양하였다. 다른 지표 균주(indicator bacteria; n=28; 15 spoilage bacteria, 12 pathogenic bacteria, 1 lactic acid bacteria)는 호기성 또는 혐기성 조건 하에 37℃로 24시간 또는 48시간동안 TSB에서 독립적으로 배양하였다. 24시간 또는 48시간 배양 후, 무균 일회용 10μl 고리를 이용하여 상기 준비한 4종의 배지에 배양된 샘플을 줄무늬로 긋고, 혐기배양기에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 배양하였다. 자라난 콜로니 중 빛나고, 매끈하고, 둥글고, 작고, 회색빛이고, 볼록한 모양의 콜로니가 양성 캠필로박터 종 균주인 것으로 판단되었다.
먼저, 캠필로박터 선택배지의 선택성을 비교한 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 모든 캠필로박터 종이 볼튼 한천 및 mCCDA에서 자란 반면 하나의 캠필로박터 제주지 균주가 프레스턴 한천에서 자랐으며 헌트 한천에서는 어떤 균주도 자라지 않았다. 49개의 위양성 캠필로박터 균주 중, 39개 균주는 mCCDA에서 자랐고, 37개 균주는 볼튼 한천에서 자랐으며, 4개의 균주는 프레스턴 한천에서 자랐고, 2개의 균주는 헌트 한천에서 자랐다. 헌트 한천 및 프레스턴 한천에서는 대부분의 위양성 캠필로박터 균주와 모든 캠필로박터 제주니 및 캠필로박터 콜리의 생장이 저해된 것으로 나타남으로써, 볼튼 한천과 mCCDA가 캠필로박터 종에 더 적합한 선택배지임을 알 수 있었다.
Strains Selective agar
Bolton agar Hunt agar mCCDA Preston agar
1 C. jejuni +++a - +++ ++
2 C. coli +++ - +++ -
3 C. coli +++ - +++ -
4 C. coli + - + -
11 C. jejuni ATCC 33291 +++ - +++ -
12 Hot pepper-1 +++ - +++ -
13 Dropwort-1 ++* - + -
14 Cucumber-1 +++ - +++ ++
15 Cucumber-2 + - ++ -
16 Garlic stalk-1 - - + -
17 Head lettuce-1 +++ - +++ -
18 Cabbage-1 ++ - ++ -
19 Sprout-1 ++ - ++ -
20 Cucumber-3 +++ - +++ -
21 Green bean sprout-1 +++ - +++ -
22 Drpowort-2 - - - -
23 Organic lettuce-1 +++ - +++ -
24 Cucumber-4 - - - -
25 Balloon flower root-2 +++ - +++ -
26 Balloon flower root-1 +++ - +++ -
27 Bean sprout-1 +++ - +++ -
28 Bean sprout-2 +++ - +++ -
29 Bean sprout-3 +++ - +++ -
30 Green bean sprout-2 - - - -
31 Green bean sprout-3 +++ - +++ -
32 Green bean sprout-4 ++ - ++ -
33 Garlic stalk-2 ++ - ++
34 Onion-1 +++ ++* +++ +
35 Onion-2 +++ - +++* -
36 Sprout-2 +++ - +++ -
37 Sprout-3 +++ - +++ -
38 Paprika ++ - ++ -
39 Red cabbage-1 - - - -
40 Red cabbage-2 +++ - +++ +
41 Cabbage-2 +++ - +++ -
42 Dropwort-2 +++ - +++ -
43 Carrot-1 - - - -
44 Korean leek-1 +++* +++* +++ +
45 Korean leek-2 +++ - +++ -
46 Chinese cabbage-1 - - - -
47 Chinese cabbage-2 + - + -
48 Chinese cabbage-3 +++ - +++ -
49 Organic sesame leaf-1 - - - -
50 Organic sesame leaf-2 +* - ++ -
51 Sesame leaf-1 ++ - ++ -
52 Sesame leaf-2 + - + -
53 Sesame leaf-3 - - - -
54 Sesame leaf-4 +++ - +++ -
55 Organic lettuce-2 +++ - +++ -
56 Organic lettuce-3 +++ - +++ -
57 Lettuce-1 - - - -
58 Lettuce-2 - - - -
59 Lettuce-3 +++ - +++ -
60 Lettuce-4 +++ - +++ -
61 Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150 - - - -
62 Escherichia coli ATCC 25922 - - - -
63 Bacillus cereus ATCC 10876 - - - -
64 Citrobacter freundii ATCC 8090 - - - -
65 Hafnia alvei ATCC 29927 - - - -
66 Staphylococcus aureus ATCC 49444 - - - -
67 Salmonella enterica ATCC 13076 - - - -
68 Salmonella Typhimurium ATCC 19586 - - - -
69 Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692 + - - +
70 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 + - - +
71 Listeria monocytogenes ATCC 19115 - - - -
72 Cronobacter sakazakii ATCC 12868 - - - +
73 Lactobacillus acidophilus ATCC 04356 - - - -
74 Chryseobacterium balustinum-2 - - - -
75 Enterobacter sp.-2 - - - -
76 Pantoea agglomerans-1 - - - -
77 Pantoea agglomerans-2 - - + -
78 Bacillus pumilus - - - -
79 Clavibacter michiganensis - - - -
80 Pseudomonas fluorescens-1 - - - -
81 Pseudomonas fluorescens-2 +++ - + -
82 Acinetobacter clacoaceticus-1 - - +++ -
83 Acinetobacter clacoaceticus-2 + - +++ -
84 Stenotrophomonas maltophilia-1 - - - -
85 Stenotrophomonas maltophilia-2 - - - -
86 Klebsiella pneumonia - - - -
87 Dickeya zeae - - - -
88 Pectobacterium carotovorum subsp. - - - -
89 carotovorum Pcc21 - - - +
a : +, positive; -, negative; ++, two positive among three experiments; +++, three positive among three experiments.
* : Colony morphology was very similar to Campylobacter spp.
또한, 선택 한천 분리 방법으로 신선 농산물로부터 분리되었으나 여전히 캠필로박터 선택배지에서 생장하는 것으로 나타난 위양성 캠필로박터 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 서열분석을 수행한 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 13개의 균주 중 5개는 아시네토박터 종(Acinetobacter spp.), 3개는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 3개는 오크로박트럼 인터미디움(Ochrobactrum intermedium), 1개는 브레분디모나스 디미누타(Brevundimonas diminuta), 1개는 미로이데스 오도라티미무스(Myroides odoratimimus)인 것으로 나타났다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 균주들의 콜로니는 캠필로박터 균주와 쉽게 구분되지 않아 위양성(false-positive) 결과를 나타냄을 알 수 있다.
Strains Selective agar 16S-sequencing
Bolton agar Hunt agar mCCDA Preston agar Identity (%)
15 Cucumber-2 +a - ++ - Brevundimonas diminuta 99
16 Garlic stalk-1 - - + - Pseudomonas putida 99
18 Cabbage-1 ++ - ++ - Acinetobacter sp. 99
21 Green bean sprout-1 +++ - +++ - Myroides odoratimimus 100
23 Organic lettuce-1 +++ - +++ - Ochrobactrum intermedium 100
31 Green bean sprout-3 +++ - +++ - Acinetobacter sp. 100
34 Onion-1 +++ ++b +++ + Ochrobactrum intermedium 100
35 Onion-2 +++ - +++b - Pseudomonas syringae 97
36 Sprout-2 +++ - +++ - Pseudomonas sp. 99
37 Sprout-3 +++ - +++ - Acinetobacter calcoaceticus 100
40 Red cabbage-2 +++ - +++ + Acinetobacter sp. 100
44 Korean leek-1 +++b +++b +++ + Ochrobactrum intermedium 100
48 Chinese cabbage-3 +++ - +++ - Acinetobacter calcoaceticus 99
a : +, positive; -, negative; ++, two positive among three experiments; +++, three positive among three experiments.
b : Colony morphology was very similar to Campylobacter spp.
또한, 28개의 지표 균주를 캠필로박터 선택배지에서 배양한 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 슈도모나스 애루지노사(P. aeruginosa) 2 균주는 볼튼 한천 및 프레스턴 한천에서 자랐고, 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescence) 2 균주는 볼튼 한천 및 mCCDA에서 자라는 것으로 나타났으며, 헌트 한천에서는 모든 실험된 균주가 생장하지 않는 것으로 나타났다. 신선 농산물로부터 분리된 부패 박테리아 균주 중 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) 2 균주는 mCCDA 및 볼튼 한천에서 자라는 것으로 나타났다.
상기 결과로부터 슈도모나스 종 콜로니의 모양이 캠필로박터 종과 유사하기 때문에 캠필로박터 검출 시 슈도모나스 종이 검출될 수 있는 것이 문제인 것을 알 수 있다.
항생제 첨가 볼튼 배지 및 mCCDA 배지의 비교
위양성 캠필로박터의 생장을 억제하기 위하여, 먼저 신선 농산물로부터 분리한 위양성 캠필로박터 균주(n=44) 및 캠필로박터 균주(n=7)를 혐기배양기에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 혈액무첨가 볼튼 배양액에서 독립적으로 배양하였다. 그리고 항생제(리팜피신, rifampicin, 10 mg/L), 폴리믹신 B(polymyxin B, 5000 IU/L 및 20000 IU/L), sodium metabisulphite (250 mg/L), sodium pyruvate (250 mg/L), ferrous sulfate (250 mg/L))가 첨가된 볼튼 한천 또는 mCCDA 위에 무균 일회용 10μl 고리를 이용하여 증식된 배양액을 줄무늬로 그은 뒤, 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 배양하였으며, 대조군으로 종래 기술에 따른 볼튼 배지 및 mCCDA를 사용하였다.
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 리팜피신 첨가 볼튼 한천에서는 캠필로박터 균주는 전혀 저해되지 않고, 36개의 위양성 캠필로박터 균주의 생장은 저해된 것으로 나타났으며, 폴리믹신 B 첨가 볼튼 한천에서는 4개의 캠필로박터 균주 및 36개의 위양성 캠필로박터 균주의 생장이 저해되는 것으로 나타났다. 또한, 다양한 항생제가 첨가된 mCCDA에서는 위양성 캠필로박터 균주의 생장이 거의 저해되지 않은 것으로 나타났다.
Straina Antibiotics
Control Rifampicin (10 mg/L) Polymyxin B (5,000 IU/L) Polymyxin B (20,000 IU/L) Sodium metabisulfite (250 mg/L) Sodium pyruvate (250 mg/L) Ferrouse sulfate (250 mg/L)
Bolton
agar		 Campy
(n = 7)		 7 7 7 3 3 7 7
Non-Campy
(n = 44)		 40 8 33 8 40 40 40
mCCDA Campy
(n = 7)		 7 7 7 7 7 7 7
Non-Campy
(n = 44)		 42 36 40 41 41 41 39
a : Campy, Campylobacter strains; Non-Campy, false-positive Campylobacter isolated from fresh produce.
상기 결과로부터 리팜피신을 함유하는 볼튼 한천(BR agar)이 어떤 항생제를 함유하는 mCCDA 보다도 캠필로박터 종에 대해 높은 선택성을 나타냄을 알 수 있다.
리팜피신이 첨가된 볼튼 한천( BR agar )의 항생제 감수성 시험
상기 실시예를 통해 BR agar가 캠필로박터 종에 대해 가장 높은 선택성을 나타냄을 확인하였으나, 그럼에도 불구하고 몇몇 위양성 캠필로박터 균주가 자라는 것으로 나타났다. 이에, 상기 위양성 박테리아 생장을 저해하기 위해 디스크 확산법(disc diffusion method)을 이용하여 시험 박테리아의 항생제 내성을 평가하였다. 먼저, 캠필로박터 균주(n=8; 5 C. jejuni, 3 C. coli) 및 리팜피신이 첨가된 볼튼 배지에서도 계속 자란 위양성 캠필로박터 균주(n=7)를 혈액무첨가 볼튼 배양액에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 배양하였다. 볼튼 배양액 내에 0.75% 박토 한천(Bacto-agar)을 첨가한 연한천을 121℃에서 15분간 가압증기로 멸균한 다음 수조에서 50℃ 로 식히고, lysed horse blood, 볼튼 보충물 및 리팜피신(rifampicin, 10 mg/L)을 첨가하여 무균 페트리 디쉬에 부었다. 그리고 100μl 배양균을 접종한 뒤 청정 실험대에서 20분간 건조시키며 굳혔다. 상기 굳은 배지 위에 항생제 디스크를 올리고 CampyGen gas pack을 이용하여 밀폐용기에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 배양하였다. 배양 후 억제대의 지름을 측정하였으며, 항생제 디스크(Sensi-Disc) 농도는 다음과 같다: 앰피실린(ampicillin; AM; 10μg), 아미카신(amikacin; AN; 30μg), 클로람페니콜(chloramphenicol; C; 30μg), 세팔로틴(cephalothin; CF; 30μg), 세포페라존(cefoperazone; CFP; 75μg), 카나마이신(kanamycin; K; 30μg), 젠타마이신(gentamicin; GM; 10μg), 토브라마이신(tobramycin; NN; 10μg), 페니실린(penicillin; P; 10IU/IE,UI), 스트렙토마이신(streptomycin; S; 10μg), 술파메톡사졸-트리메소프림(sulfamethoxazole-trimethoprim; SXT; 23.75 및 1.25μg), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline; T; 30μg), 반코마이신(vancomycin; VA; 30μg).
BR agar에서 항생제의 억제대 지름을 측정한 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 젠타마이신 및 아미카신은 모든 위양성 캠필로박터 균주의 생장을 저해하는 것으로 나타났지만 모든 캠필로박터 종도 저해하는 것으로 나타났다. 또한, 세포페라존 및 술파메톡사졸-트리메소프림은 7개의 위양성 캠필로박터 균주 중 각각 6개 및 3개 저해하는 것으로 나타났으며, 캠필로박터 종 8개 균주에 대하여 세포페라존은 2 균주를 저해했고, 술파메톡사졸-트리메소프림은 전혀 저해하지 않는 것으로 나타났다.
Strains Antibiotics
AM AN C CF CFP K GM NN P S SXT T VA
2 C. jejuni 0 3.1 3.6 0 0 2.7 3.8 2.5 0 2.8 0 1.2 0
8 C. coli 2 3.2 3.6 1 0.9 2.3 3.4 2.2 1.1 3 0 1.4 0
9 C. coli 2.2 3.2 4.4 0 0 0 3.6 2.8 0 0 0 0 0
10 C. coli 2.1 3 3.9 0 1 2.9 3.2 2 1.3 3.2 0 1.5 0
11 C. jejuni ATCC 33291 2 3.3 3.4 0 0 2.8 3.4 2.2 0.9 2.6 0 3.6 0
3 C. jejuni 0 0
4 C. jejuni 0 0
6 C. jejuni 0 0
23 O. intermedium 0 2.4 0 0 2 0 2.8 0 0 2.3 2.5 4.4 0
36 Pseudomonas sp . 0 3 2.5 0 0 3 2.8 2.4 0 0 0 0 0
16 P. putida 1.8 0
20 Non-Campylobacter 1.8 2.2
34 O. intermedium 2.6 0
35 P. syringae 1 0
38 Non-Campylobacter 1.8 3.6
상기 결과로부터 술파메톡사졸과 트리메소프림을 BR agar에 첨가할 두 번째 항생제로 선택하였다.
다양한 농도의 항생제가 첨가된 BR 한천에서의 생장 분석
캠필로박터 종에 대한 BR agar의 선택성을 증가시키기 위해, 항생제 술파메톡사졸, 트리메소프림, 또는 이들의 혼합물(술파메톡사졸-트리메소프림)의 적정 농도를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. BR agar를 기본 배양 매체로 하고, 항생제 농도는 각각 6.25mg/L, 12.5mg/L, 25mg/L, 50mg/L, 100mg/L, 500mg/L로 준비하였으며, 혼합물의 농도는 술파메톡사졸 19 : 트리메소프림 1 비율로 준비하였다. 캠필로박터 8 균주(5 C. jejuni 및 3 C. coli) 및 위양성 캠필로박터 8 균주를 혈액무첨가 볼튼 배양액에서 각각 배양하고, 배양 후 증식물을 CampyGen gas pack을 이용하여 밀폐용기에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 배양하였다. 그 다음 술파메톡사졸(BRS), 트리메소프림(BRT), 또는 이들의 혼합물(BRST)이 첨가된 각각의 BR 한천 배지 위에 증식된 배양액을 무균 일회용 10μl 고리를 이용하여 줄무늬로 긋고, 밀폐용기에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 다시 배양하였다.
그 결과, 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 술파메톡사졸 50mg/L이 첨가된 BR agar의 경우 위양성 캠필로박터 2 균주의 생장을 저해하면서도 캠필로박터 종 균주의 생장은 전혀 저해하지 않는 것으로 나타났으며, 이때, 도 2에 나타낸 바와 같이, 캠필로박터 균주와 위양성 캠필로박터 균주의 콜로니 모양은 쉽게 구분되지 않는 것을 알 수 있었다.
Stains Control Sulfamethoxazole (mg/L) Trimethoprim (mg/L) Sulfamethoxazole-Trimethoprim(mg/L)
6.25 12.5 25 50 100 500 6.25 12.5 25 50 100 500 6.25 12.5 25 50 100 500
2 C. jejuni + + + + + + - + + + + + + + + + + - -
3 C. jejuni + + + + + + - + + + + + + + + + + - -
4 C. jejuni + + + + + + - + + + + + + + + + + +
(w)		 -
6 C. jejuni + + + + + +
(w)		 - + + + + + + + + + + - -
8 C. coli + + + + + + - + + + + + + + + + + + -
9 C. coli + + + + + + - + + + + + + + + + + + -
10 C. coli + + + + + + - + + + + + + + + + + + -
11 C. jejuni ATCC 33291 + + + + + +
(w)		 - + + + + + + + + + +
(w)		 - -
16 P. putida + + + + + + ND + + + + + ND ND ND ND ND ND ND
20 Non - Campylobacter + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
(w)
23 O. intermedium + - - - - - - + + + + + - + - - +
(w)		 - -
34 O. intermedium + - - - - - - + + + + - + + + + +
(w)		 - -
35 P. syringae + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
(w)
36 Pseudomonas sp . + + + + + + - + + + + + + + + + + + +
(w)
44 O. intermedium + + + + + + + + + + + + + + + + + + +
(w)
+, growth; -, no growth; +(w), growth but weak; ND, not determined
이에 따라 술파메톡사졸 50mg/L이 첨가된 BR agar인 BRS agar를 디자인하였으며, 선택배지 조성은 하기 표 6과 같다.
볼튼(Bolton) 배지 BRS 배지
용매 멸균 증류수 1L 멸균 증류수 1L
베이스 성분 - Bolton broth 27.6 g (Oxoid)
(meat peptone 10.0 g, lactalbumin hydrolysate 5.0 g, sodium pyruvate 0.5 g, alpha-ketoglutaric acid 1.0 g, sodium metabisulphite 0.5g, sodium carbonate 0.6 g, haemin 0.01 g)
- Bacto agar 15 g (BD)		 - Bolton broth 27.6 g (Oxoid)
(meat peptone 10.0 g, lactalbumin hydrolysate 5.0 g, sodium pyruvate 0.5 g, alpha-ketoglutaric acid 1.0 g, sodium metabisulphite 0.5g, sodium carbonate 0.6 g, haemin 0.01 g)
- Bacto agar 15 g (BD)
선택첨가제 - Lysed horse blood 50 ml (Oxoid)
- Antibiotic supplement for Bolton broth, 2 vials (Oxoid)
(cefoperazone 20 mg, vancomycin 20 mg, trimethoprim 20 mg, cycloheximide 50 mg)		 - Antibiotic supplement for Bolton broth, 2 vials (Oxoid)
(cefoperazone 20 mg, vancomycin 20 mg, trimethoprim 20 mg, cycloheximide 50 mg)
- Rifampicin 10 mg (Sigma)
- Sulfamehtoxazole 50 mg (Sigma)
선택배지에 혈액 첨가가 미치는 영향 분석
혈액 첨가가 캠필로박터 종 및 위양성 캠필로박터 균주들의 생장에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 캠필로박터 8 균주(5 C. jejuni 및 3 C. coli) 및 신선 농산물로부터 분리한 위양성 캠필로박터 8 균주를 혈액무첨가 볼튼 배양액에서 배양하였다. 배양 후 증식물을 CampyGen gas pack을 이용하여 밀폐용기에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 배양한 다음, lysed horse blood(혈액)이 첨가 또는 무첨가된 mCCDA, Bolton 한천, BR 한천, BRS 한천(50mg/L 술파메톡사졸이 첨가된 BR 한천) 위에 각각 무균 일회용 10μl 고리를 이용하여 배양액을 줄무늬로 긋고, 밀폐용기에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 다시 배양하였다.
배양 결과, 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 캠필로박터 종 및 위양성 캠필로박터 균주들의 생장에 있어서 혈액 첨가 볼튼 한천은 혈액무첨가 볼튼 한천에 비해 다를 것이 없는 것으로 나타났다. 또한, 혈액첨가 BRS 한천과 비교하여 혈액무첨가 BRS 한천에서 캠필로박터 2 균주가 약하게 자라는 것으로 나타났으나 무시해도 될 정도의 차이였다.
Strain mCCDA Bolton agar Bolton agar
(-blood)		 Bolton agar+R Bolton agar+R
(-blood)		 Bolton agar+R+S Bolton agar+R+S
(-blood)
2 C. jejuni + + + + + + +
3 C. jujuni + + + + + + +
4 C. jejuni + + + + + + +
6 C. jejuni + + + + + + +
8 C. coli + + + + + + +
9 C. coli + + + + + + +
10 C. coli + + + + + + +
11 C. jejuni ATCC 33291 + + + + + + +
16 P. putida + + + + + + +
20 Non - Campylobacter + + + + + + +
23 O. intermedium + + + + + - -
34 O. intermedium + + + + + - -
35 P. syringae + + + + + + +
36 Pseudomonas sp . + + + + + + +
44 O. intermedium + + + + + + +
R, rifampicin(10mg/L); S, sulfamethoxazole(50mg/L); C, ciprofloxacin(0.5mg/L)
+, growth; -, no growth.
상기 결과는 혈액이 선택배지에서 캠필로박터의 생장에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
생닭 및 신선 농산물에서 캠필로박터 종을 검출하기 위한 선택배지의 유효성 평가
생닭(n=8; 껍질 그대로의 다리와 날개 포함) 및 신선 농산물로 채소(n=23; 로메인 상추, 유기농 로메인 상추, 깻잎, 배추, 유기농 배추, 부추, 미나리, 오이, 콩나물, 숙주나물)를 준비하여 FDA(Food and Drug Administration) BAM(Bacteriological Analytical Manual) 절차에 따라, 식품 시료들(생닭 25g, 채소 50g)을 100ml 혈액 무첨가 배양액을 함유한 무균 스토마커 봉지(stomacher bag)에 담고, 5분간 스토마킹하여 분쇄하였다. 균질화된 시료들은 CampyGen gas pack을 이용하여 밀폐용기에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 증식되었다. 무균 일회용 10μl 고리를 이용하여 증식된 배양물을 mCCDA 한천(대조군), BR 한천, BRS 한천, BRSC 한천(rifampicin, sulfamethoxazole, ciprofloxacin이 첨가된 볼튼 한천) 위에 줄무늬로 긋고, CampyGen gas pack을 이용하여 밀폐용기에서 42℃로 48시간동안 미호기적 환경으로 다시 배양하였다.
그 결과, 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, mCCDA 에서는 모든 생닭 시료 및 14개의 신선 농산물에서 콜로니가 확인되었으며, BR 한천 및 BRS 한천에서는 모든 생닭 시료에서, BR 한천 및 BRS 한천에서 신선 농산물 각각 11개 및 7개에서 콜로니가 관찰되었다.
또한, 시프로플록사신(ciprofloxacin)이 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)의 생장을 억제한다고 보고되어 있으므로 시프로플록사신의 첨가가 생장에 미치는 영향을 보기 위해 시프로플록사신을 더 첨가한 BRSC 한천에서의 생장을 실험한 결과, 8개의 생닭 시료 중 7개 시료에서 콜로리가 관찰되었고, BRS 한천에서 나타난 양성의 신선 농산물 시료 7개 중 6개에서 콜로니가 성장하는 것이 확인되었다.
mCCDA Bolton agar+R Bolton agar+R+S Bolton agar+R+S+C
Chicken (n=8) 8 8 8 7
Fresh produce (n=23) 14 11 7 6/7a
a : Seven strains were tested (only those positive on BRS agar)
R, rifampicin (10 mg/L); S, sulfamethoxazole (50 mg/L); C, ciprofloxacin(0.5 mg/L)
이와 같이, 항생체 첨가 후 선택배지에서 신선 농산물로부터 분리된 균주의 생장이 현저하게 저해되었지만 생닭 시료에서는 BRSC 한천을 제외한 어떤 배지에서도 균주의 생장이 저해되지 않는 것으로 나타났다.
상기로부터 신선 농산물에서 본 발명의 BRS 한천 선택배지가 종래 볼튼 한천 및 mCCDA 선택배지에 비해 위양성 캠필로박터의 생장을 저해하는 효과가 가장 우수하면서도 캠필로박터 종 검출에는 영향을 미치지 않고 캠필로박터 종 선택성이 높아짐을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (8)

  1. 농산물에서 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 또는 캠필로박터 콜리(Campylobacter coli) 균주를 검출하기 위한 선택배지 조성물로, 상기 조성물은 혈액무첨가(blood-free) 볼튼 배지에 리팜피신(rifampicin) 및 술파메톡사졸(sulfamethoxazole)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 리팜피신은 1 mg/L 내지 50 mg/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 술파메톡사졸은 6.25 mg/L 내지 100 mg/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 시프로플록사신(ciprofloxacin)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 시프로플록사신은 0.1 mg/L 내지 1 mg/L 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 삭제
  7. 분쇄한 농산물 시료를 제1항의 선택배지 조성물에 배양하는 단계를 포함하는 농산물에서 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 또는 캠필로박터 콜리(Campylobacter coli) 균주를 검출하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 배양은 밀폐용기에서 미호기적 환경 조건으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
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Int. J. Environ. Res., 2013 *
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