KR101476029B1

KR101476029B1 - Nanocomposite for drug delivery and its manufacturing method

Info

Publication number: KR101476029B1
Application number: KR1020130020567A
Authority: KR
Inventors: 박수영; 탕가벨루 카비사
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2013-02-26
Publication date: 2014-12-23
Also published as: KR20140106252A

Abstract

본 발명은 약물 전달용 나노 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생리적 용액 내에서 우수한 용해성과 안정성을 나타내면서도 특정 pH 하에서 약물을 선택적으로 조절하여 방출할 수 있다. 이에 따라 용해도가 낮은 약물들도 효과적으로 작용부위까지 전달하여 약물의 효과를 극대화할 수 있으며, pH에 따라 목표지점에만 약물을 운반하도록 하여 목표지점 이외에 다른 부위로 운반된 약물에 의한 부작용을 최소화할 수 있다.The present invention relates to a nanocomposite for drug delivery and a method for preparing the same, and more particularly, to a drug delivery nanocomposer which can exhibit excellent solubility and stability in a physiological solution and selectively release and regulate the drug under a specific pH. Thus, drugs with low solubility can be effectively delivered to the action site to maximize the effect of the drug, and the drug can be transported only to the target site according to the pH, thereby minimizing the adverse effects caused by drugs carried to other sites other than the target site have.

Description

TECHNICAL FIELD The present invention relates to a nanocomposite for drug delivery,

본 발명은 약물 전달용 나노 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목표지점까지 약물을 효율적으로 전달할 수 있으며, 특히 목표지점에서 선택적으로 약물을 방출하는 표적지향적 약물 전달용 나노 복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a nanocomposite for drug delivery and a method of manufacturing the nanocomposite. More particularly, the present invention relates to a nanocomposite for drug delivery, which is capable of efficiently delivering a drug to a target site, And a manufacturing method thereof.

약물전달체계(이하, "DDS"라 한다) 기술이란 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 하는 의약 기술을 말한다.The drug delivery system (hereinafter referred to as "DDS") refers to a medical technology that minimizes adverse effects of existing drugs and maximizes efficacy and efficacy to efficiently deliver necessary amounts of drugs.

최근에는 나노 기술과 결합하면서 의약계에서 새로운 부가가치를 창출하는 첨단기술의 한 분야로 자리 잡고 있으며, 미국과 일본 등 기술선진국은 지난 80년대 후반부터 약물전달체계기술 개발에 전력을 쏟아 왔다. Recently, it has become a field of advanced technology that creates new added value in medicine by combining with nanotechnology. Developed countries such as USA and Japan have been investing in the development of drug delivery system technology since the late 80s.

특히, 작용부위에 도달한 약물은 약효가 발휘되지만, 질병부위가 아닌 다른 부위로 운반된 약물은 주로 부작용의 원인이 되기 때문에 목표 지점에 선택적으로 약물을 전달할 수 있는 표적지향적 약물 전달체의 개발이 요구되고 있다.
In particular, the drug that reaches the action site demonstrates its efficacy, but drugs transported to a site other than the disease site are mainly responsible for side effects, so it is necessary to develop a target-oriented drug delivery system capable of selectively delivering drugs to the target site .

한편, 그래핀은 흑연의 한 층, 즉 흑연의 면 단층을 말하는데, 흑연에 있어서 그래핀과 그래핀 간의 결합이 미약하므로 두께가 약 4 옹스트롱으로 매우 얇은 이차원 구조를 가지는 그래핀이 존재할 수 있다. 그래핀은 2차원 구조의 탄소 나노 물질로서 많은 흥미로운 물리적, 화학적 성질을 가지고 있어서 그래핀에 관한 연구는 급격히 증가하는 추세이다. 그래핀의 특이한 복합 구조, 넓은 표면적과 생체 안정성, 낮은 가격의 장점에 의해 생물학과 생체의학 적용에서도 주목 받고 있으며, 약물 로딩과 전달과 같은 약의학 부분에 대한 적용점도 생겨났다.
On the other hand, graphene refers to one layer of graphite, that is, a surface monolayer of graphite. Since graphite has a weak bond between graphene and graphene, graphene having a very thin two-dimensional structure with a thickness of about 4 angstroms . Since graphene has many interesting physical and chemical properties as a two-dimensional carbon nanomaterial, research on graphene is rapidly increasing. Due to its unique complex structure, wide surface area, biostability and low cost, graphene has attracted attention in biology and biomedical applications as well as in medicine and medicine.

약학의 눈부신 발달로 여러 가지 고성능의 신약들이 개발되고 있으나 개발되는 많은 약물들은 낮은 용해도로 인하여 임상에서의 사용에 극히 제한을 받고 있다. 이에 그래핀의 표면에 폴리머를 그래프트시켜 효과적으로 용해도의 증가와 목표 물질과의 상호작용을 하도록 하는 연구가 있어왔다. A number of high performance new drugs have been developed due to the brilliant development of pharmacy, but many of the drugs being developed are extremely limited in clinical use due to their low solubility. There has been research to graft polymers onto the surface of graphene to effectively increase solubility and interact with the target material.

구체적으로 종래에는 설폰산과 엽산에 의한 기능성 그래핀 옥사이드(GO)에 항암제 성분을 섞어 약물로딩이 되도록 하였으며, 이는 생리적인 안정과 특별한 세포지향 능력을 지녔다. 또한, 그래핀 옥사이드(GO)에 PEG 작용기를 결합하고 항암제 약물을 로드시킨 전달체가 개시되었고, 그래핀 옥사이드(GO)표면에 키토산과 poly (N-isopropylacrylamide)에 결합시켜 약물의 로딩과 방출을 시험하기도 했다.
Specifically, conventionally, drug loading is performed by mixing an anticancer drug component with functional graphene oxide (GO) by sulfonic acid and folic acid, which has physiological stability and specific cell-directing ability. In addition, a carrier that binds a PEG functional group to graphene oxide (GO) and carries an anticancer drug loaded is disclosed, and the loading and release of drug is tested by binding chitosan and poly (N-isopropylacrylamide) to the surface of graphene oxide (GO) "

그러나 종래의 그래핀을 이용한 약물 전달체는 약물들의 낮은 용해도 문제를 해결하는 데 한계가 있었으며, 또한 목표지점에서의 선택적 약물 방출이 어려워 부작용의 원인이 될 수 있는 문제점이 있었다.
However, the conventional drug delivery system using graphene has a limit in solving the low solubility problem of drugs and has a problem that it is difficult to release selective drug at a target site, which may cause side effects.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 생리적 용액 내에서 우수한 용해성과 안정성을 나타내면서도 특정 pH 하에서 약물을 선택적으로 방출할 수 있어 목표지점 이외의 다른 부위로 운반된 약물에 의한 부작용을 최소화하고 목표지점에 보다 효율적으로 약물을 전달할 수 있는 표적 지향적 약물 전달용 나노 복합체를 제공하려는 목적이 있다.
Disclosure of Invention Technical Problem [8] Accordingly, the present invention has been made in order to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide a drug delivery system capable of selectively releasing a drug under a specific pH while exhibiting excellent solubility and stability in physiological solution, And to provide a target-oriented drug delivery nanocomposite capable of delivering drugs more efficiently to a target site.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, In order to solve the above-described problems,

고분자가 그래프팅된 그래핀 옥사이드(GO)를 포함하며, 상기 고분자가 그래프팅된 그래핀 옥사이드(GO)에 약리적 활성성분을 로딩 시 37℃, 48시간 동안 pH 7.4 이상에서 약리적 활성성분의 방출이 5% 이하이고, 37℃, 48시간 동안 pH 7 이하에서 약리적 활성성분의 방출이 30% 이상을 만족하는 약물 전달용 나노 복합체를 제공한다.
Wherein the polymer comprises grafted oxide (GO), and the release of the pharmacologically active ingredient at pH 7.4 or higher at 37 DEG C for 48 hours when the polymer is loaded with the grafted oxide grafted GO (grafted oxide) 5% or less, and the release of the pharmacologically active ingredient satisfies 30% or more at a pH of 7 or less for 48 hours at 37 占 폚.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 약물 전달용 나노 복합체는 약리적 활성성분을 로딩 시 37℃, 48시간 동안 pH 5.8 이하에서 약리적 활성성분 방출이 50% 이상일 수 있다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the pharmacologically active nanocomposite may have a pharmacologically active ingredient release of 50% or more when the pharmacologically active ingredient is loaded at 37 ° C. and 48 hours at pH 5.8 or less.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 약물 전달용 나노 복합체는 수용성일 수 있다.
According to another preferred embodiment of the present invention, the drug delivery nanocomposite may be water-soluble.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약물 전달용 나노 복합체는 pH 7.2 이하에서 제타 포텐셜이 0 mV 이상일 수 있다.
According to another preferred embodiment of the present invention, the drug delivery nanocomposite may have a zeta potential of 0 mV or higher at pH 7.2 or lower.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 그래프팅된 고분자는 폴리(2-다이에틸아미노)에틸메타아크릴레이트(Poly(2-diethylamino)ethylmethaacrylate, PDEA)일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the grafted polymer may be poly (2-diethylamino) ethylmethacrylate (PDEA).

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약물 전달용 나노 복합체는 그래핀 옥사이드(GO)와 그래프팅된 고분자의 중량비가 1 : 0.1 내지 1 : 2일 수 있다.
According to another preferred embodiment of the present invention, the weight ratio of graphene oxide (GO) and grafted polymer may be 1: 0.1 to 1: 2.

또한, 본 발명은 약물 전달용 나노 복합체에 약리적 활성성분을 로딩시킨 것을 특징으로 하는 약물이 로딩된 약물 전달용 나노 복합체를 제공한다.
Also, the present invention provides a drug-loaded nanocomposite loaded with a pharmacologically active ingredient in a drug delivery nanocomposite.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약리적 활성성분은 항암제일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the pharmacologically active ingredient may be an anticancer drug.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 약리적 활성성분은 캄토테신(camptothecin, CPT)일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the pharmacologically active ingredient may be camptothecin (CPT).

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 약물이 로딩된 약물 전달용 나노 복합체는 로딩된 약물과 나노 복합체의 중량비가 10 : 100 내지 25 : 100일 수 있다.
According to another preferred embodiment of the present invention, the drug-loaded nanocomposite loaded with the drug may have a weight ratio of loaded drug and nanocomplex of 10: 100 to 25: 100.

또한, 본 발명은 (1) 그래핀 옥사이드(GO)에 pH 변화에 따라 수축하고 팽창하는 고분자를 그래프팅시켜 나노 복합체를 제조하는 단계; (2) 상기 나노 복합체에 약리적 활성성분을 로딩하는 단계;를 포함하며, 37℃, 48시간 동안 pH 7.4 이상에서 상기 약리적 활성성분의 방출이 5% 이하이고, 37℃, 48시간 동안 pH 7 이하에서 상기 약리적 활성성분 방출이 30% 이상을 만족하는 약물 전달용 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for producing a nanocomposite comprising: (1) grafting a graphene oxide (GO) with a polymer which shrinks and expands according to pH change; (2) loading the pharmacologically active ingredient into the nanocomposite, wherein the release of the pharmacologically active ingredient is less than 5% at 37 ° C. for 48 hours at pH 7.4 or higher, and the pH is 7 or less at 37 ° C. for 48 hours Wherein the release of the pharmacologically active ingredient is 30% or more.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 그래핀 옥사이드(GO)에 그래프팅시킨 고분자는 폴리(2-다이에틸아미노)에틸메타아크릴레이트(Poly(2-diethylamino)ethylmethaacrylate, PDEA)일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the polymer grafted on the graphene oxide (GO) may be poly (2-diethylamino) ethylmethacrylate (PDEA) .

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 나노 복합체에 로딩시킨 약리적 활성성분은 항암제일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the pharmacologically active ingredient loaded on the nanocomposite may be an anticancer agent.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 나노 복합체에 로딩시킨 약리적 활성성분은 캄토테신(camptothecin, CPT)일 수 있다.
According to another preferred embodiment of the present invention, the pharmacologically active ingredient loaded on the nanocomposite may be camptothecin (CPT).

본 발명의 약물 전달용 나노 복합체는 생리적 용액 내에서 우수한 용해성과 안정성을 나타내면서도 특정 pH 하에서 약물을 선택적으로 조절하여 방출할 수 있다. 이에 따라 용해도가 낮은 약물들도 효과적으로 작용부위까지 전달하여 약물의 효과를 극대화할 수 있으며, pH에 따라 목표지점에만 약물을 운반하도록 하여 목표지점 이외에 다른 부위로 운반된 약물에 의한 부작용을 최소화할 수 있다. 특히, 주로 pH가 낮은 종양세포에 약물을 선택적으로 방출할 수 있어 항암제 전달체계로 유용하게 사용될 수 있다.
The drug delivery nanocomposite of the present invention can exhibit excellent solubility and stability in a physiological solution and selectively release and regulate the drug under a specific pH. Thus, drugs with low solubility can be effectively delivered to the action site to maximize the effect of the drug, and the drug can be transported only to the target site according to the pH, thereby minimizing the adverse effects caused by drugs carried to other sites other than the target site have. In particular, the drug can be selectively released to low-pH tumor cells, and thus can be usefully used as an anticancer drug delivery system.

도1은 pH에 따라 반응하는 고분자가 그래프팅된 그래핀 옥사이드(GO)의 도식이다.
도2는 GO-PDEA 합성 반응과정을 나타낸 것이다.
도3은 합성된 GO, GO-I, GO-PDEA의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도4는 합성된 GO, GO-I, Go-PDEA, PDEA의 H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도5는 합성된 GO, GO-I, GO-PDEA의 TGA 온도기록을 나타낸 것이다.
도6은 합성된 GO, GO-I, GO-PDEA의 XPS 결과를 나타낸 것이다.
도7은 합성된 GO-PDEA의 pH에 따른 z-평균 크기와 제타 포텐셜을 나타낸 것이다.
도8은 pH 3 내지 9 및 pH 9 내지 3의 5회 변화에 따른 GO-PDEA의 z-평균 크기 변화를 나타낸 것이다.
도9는 GO-PDEA에 CPT가 로딩된 GO-PDEA-CPT의 도식이다.
도10은 GO-PDEA, 자유 CPT, GO-PDEA-CPT의 UV-vis 흡광도 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도11은 25℃, [CPT]=1μm일 때의 자유 CPT와 GO-PDEA-CPT의 PL스펙트럼을 나타낸 것이다.
도12는 pH가 각각 9.0, 7.4, 5.5일 때(37℃) GO-PDEA-CPT로부터 방출되는 CPT 양을 나타낸 그래프이다.
도13은 N2a 암세포에 GO-PDEA와 GO-PDEA-CPT를 농도를 변화하여 처리하였을 때 세포활성도를 나타낸 그래프이다.
도14는 N2a 암세포에 GO-PDEA-CPT와 자유 CPT를 농도를 변화하여 처리하였을 때 세포활성도를 나타낸 그래프이다.
도15는 N2a 암세포에 [CPT]=10μM으로 GO-PDEA-CPT(i, iii)와 CPT(ii, iv)를 처리하였을 때 전(i, ii)과 후(iii, iv)의 공초점 광학현미경(Carl Zeiss confocal microscope (LSM 700)) 사진이다.
Figure 1 is a schematic of graphene oxide (GO) grafted with a polymer reacting according to pH.
2 shows a GO-PDEA synthesis reaction process.
3 shows FT-IR spectra of GO, GO-I and GO-PDEA synthesized.
FIG. 4 shows the H-NMR spectra of GO, GO-I, Go-PDEA and PDEA synthesized.
FIG. 5 shows TGA temperature recordings of the synthesized GO, GO-I and GO-PDEA.
6 shows XPS results of the synthesized GO, GO-I and GO-PDEA.
FIG. 7 shows the z-average size and zeta potential according to the pH of the synthesized GO-PDEA.
Figure 8 shows z-mean size changes of GO-PDEA with 5 changes of pH 3-9 and pH 9-3.
Figure 9 is a schematic of GO-PDEA-CPT with CPT loaded in GO-PDEA.
10 shows UV-vis absorbance spectra of GO-PDEA, free CPT and GO-PDEA-CPT.
11 shows PL spectra of free CPT and GO-PDEA-CPT at 25 [deg.] C, [CPT] = 1 [mu] m.
FIG. 12 is a graph showing the amount of CPT released from GO-PDEA-CPT at pH 9.0, 7.4, and 5.5 (37 ° C), respectively.
FIG. 13 is a graph showing cell activity when GO-PDEA and GO-PDEA-CPT were treated by varying the concentration in N2a cancer cells.
FIG. 14 is a graph showing cell activity when GO-PDEA-CPT and free CPT were treated by varying the concentration in N2a cancer cells.
Fig. 15 is a graph showing the effect of the confocal optical system of (i, ii) and (iii, iv) upon treatment of GO-PDEA-CPT (i, iii) and CPT (ii, iv) with [CPT] = 10 μM in N2a cancer cells. It is a photograph of a Carl Zeiss confocal microscope (LSM 700).

이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세히 설명한다.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The invention will be described in more detail with reference to the accompanying drawings.

상술한 바와 같이 종래의 그래핀을 이용한 약물 전달체는 약물들의 낮은 용해도 문제를 해결하는 데 한계가 있었으며, 또한 목표지점에서의 선택적 약물 방출이 어려워 부작용의 원인이 될 수 있는 문제점이 있었다. 더구나 우수한 수용성을 만족하면서도 동시에 pH에 따라 선택적으로 약물을 방출할 수 있는 효과를 달성하기 어려운 문제점이 있었다.
As described above, the conventional drug delivery system using graphene has limitations in solving the low solubility problem of drugs and has a problem that it is difficult to release selective drug at the target site, which may cause side effects. Moreover, there is a problem that it is difficult to achieve the effect of selectively releasing the drug depending on the pH while satisfying the excellent water solubility.

이에 본 발명에서는 고분자가 그래프팅된 그래핀 옥사이드(GO)를 포함하며, 상기 고분자가 그래프팅된 그래핀 옥사이드(GO)에 약리적 활성성분을 로딩 시 37℃, 48시간 동안 pH 7.4 이상에서 약리적 활성성분의 방출이 5% 이하이고, 37℃, 48시간 동안 pH 7 이하에서 약리적 활성성분의 방출이 30% 이상을 만족하는 약물 전달용 나노 복합체를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. In the present invention, the polymer comprises grafted oxide (GO) grafted with the polymer. When the polymer is loaded onto the grafted oxide grafted with GO, the polymer has a pharmacological activity Wherein the release of the component is 5% or less and the release of the pharmacologically active ingredient is satisfied at 30% or more at pH 7 or lower for 48 hours at 37 캜.

이를 통해 용해도가 낮은 약물들도 효과적으로 작용부위까지 전달하여 약물의 효과를 극대화할 수 있으며, 특정 pH 하의 목표지점에만 약물을 운반하도록 하여 목표지점 이외에 다른 부위로 운반된 약물에 의한 부작용을 최소화할 수 있다.
This allows drugs with low solubility to be effectively delivered to the site of action, maximizing the effectiveness of the drug and minimizing the side effects of the drug delivered to other sites beyond the target site have.

구체적으로, 본 발명의 약물 전달용 나노 복합체는 그래핀 옥사이드(GO)에 pH 변화에 따라 수축하고 팽창하는 고분자를 그래프팅시켜 pH가 7 이하인 산성 조건에서 선택적으로 약물을 방출할 수 있도록 한다. 특히, 종양세포의 경우 정상세포와 달리 주로 pH가 낮은 산성을 띠므로, 정상세포 이외에 약물을 전달하고자 하는 종양세포에만 선택적으로 약물을 방출할 수 있게 된다.
Specifically, the nanocomposite for drug delivery according to the present invention grafts a graphen oxide (GO) with a polymer shrinking and expanding according to pH change, thereby selectively releasing the drug under an acidic condition having a pH of 7 or less. In particular, the tumor cells are acidic, which is different from the normal cells, and thus the drug can be selectively released only to the tumor cells to which the drug is to be delivered in addition to the normal cells.

상기 그래핀 옥사이드(GO)는 통상적으로 알려진 합성법에 의해 합성할 수 있으며, 상기 pH 변화에 따라 수축하고 팽창하는 고분자가 그래프팅된 그래핀 옥사이드(GO)는 도1에 도시된 바와 같이 그래프팅된 고분자의 pKa를 기준으로 탈양자화 또는 양자화되면서 수축하고 팽창할 수 있다.
The graphene oxide (GO) can be synthesized by a conventionally known synthesis method. Graphen oxide (GO) grafted with a polymer which shrinks and expands according to the change in pH is grafted as shown in FIG. 1 It can be contracted and expanded while being de-quantized or quantized based on the pKa of the polymer.

본 발명에 사용될 수 있는 그래프팅하는 고분자는, 그래핀 옥사이드(GO)에 그래프팅시킨 후 약리적 활성성분을 로딩 시 37℃, 48시간 동안 pH 7.4 이상에서 약리적 활성성분의 방출이 5% 이하이고, 37℃, 48시간 동안 pH 7 이하에서 약리적 활성성분의 방출이 30% 이상을 만족하는 것이라면 특별한 제한은 없다. 나아가 그래프팅된 그래핀 옥사이드(GO)가 우수한 수용성을 나타내도록 하고, 특히 PBS(Phosphate Buffered Saline) 용액에 용해되도록 하는 고분자라면 바람직하며, 또한, pH 7.2 이하에서 제타 포텐셜이 0 mV 이상을 만족하도록 하는 고분자일 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 그래핀 옥사이드(GO)에 그래프팅시키는 고분자는 가장 바람하게는 폴리(2-다이에틸아미노)에틸메타아크릴레이트(Poly(2-diethylamino)ethylmethaacrylate, PDEA)일 수 있다.
The grafting polymer which can be used in the present invention has a release of pharmacologically active ingredient of 5% or less at pH 7.4 or higher at 37 캜 for 48 hours when grafting to graphene oxide (GO) and loading the pharmacologically active ingredient, There is no particular limitation as long as the release of the pharmacologically active ingredient satisfies 30% or more at a pH of 7 or less for 48 hours at 37 占 폚. Further, it is preferable that grafted graphene oxide (GO) exhibits excellent water solubility, and in particular, it is a polymer which is dissolved in a PBS (phosphate buffered saline) solution. Also, it is preferable that the zeta potential is 0 mV or more Or the like. The polymer grafted to graphene oxide (GO) which can be used in the present invention is most preferably poly (2-diethylamino) ethylmethacrylate (PDEA).

그래핀 옥사이드(GO)에 상기 고분자를 그래프팅하는 방법은 그래프팅되는 고분자의 종류에 따라 통상적으로 알려진 방법을 통해 그래프팅할 수 있다. 고분자가 PDEA일 경우 보다 바람직하게는 ATRP(atom transfer radical polymerization)방법으로 그래프팅시킬 수 있으며, 구체적으로 GO에 1,3-다이아미노프로페인(1,3-diaminopropane)을 처리하여 GO-NH₂를 합성하고, GO-NH₂에 BrMPBr을 처리하여 GO-ATRP 개시제(initiator)인 GO-I를 합성할 수 있다. GO-I에 CuBr, PMDETA를 1:1 내지 1:5 몰비로 넣고, DEA 모노머를 처리하여 GO-PDEA를 합성할 수 있다. 도2에는 GO에 PDEA를 그래프팅시키는 과정을 모식적으로 나타내었다.
The method of grafting the polymer to graphene oxide (GO) can be grafted through a conventionally known method depending on the type of grafted polymer. When the polymer is PDEA, grafting can be carried out by ATRP (atom transfer radical polymerization). Specifically, 1,3-diaminopropane is treated with GO to obtain GO-NH ₂ And GO-NH ₂ is treated with BrMPBr to synthesize GO-ATRP initiator GO-I. GO-PDEA can be synthesized by treating GO-I with DEB monomers at a molar ratio of 1: 1 to 1: 5 of CuBr and PMDETA. FIG. 2 schematically shows a process of grafting PDEA to GO.

본 발명의 약물 전달용 나노 복합체는 그래핀 옥사이드(GO)와 그래프팅된 고분자의 중량비가 1 : 0.1 내지 1 : 2 인 것이 바람직하다. 그래프팅된 고분자의 중량비가 상기 범위 미만일 경우 약물을 잡아주는 양이 감소하여 약물 전달 효능이 떨어질 수 있고, 상기 범위를 초과할 경우 그래핀과 약물의 구조가 비슷하여 콘쥬게이트(conjugate)되는 힘이 있는데 과량의 고분자로 의해 약물이 그래핀에 접근하는 양이 감소하여 약물의 로딩이 감소하는 문제가 있을 수 있다.
The weight ratio of graphene oxide (GO) and grafted polymer is preferably 1: 0.1 to 1: 2. If the weight ratio of the grafted polymer is less than the above range, the amount of capturing the drug may decrease to lower the drug delivery efficiency. If the weight ratio of the grafted polymer exceeds the above range, the graphene and drug structure may be similar, However, there is a problem that drug loading is reduced due to a decrease in the amount of drug approaching graphene by excess polymer.

이하에서는 그래핀 옥사이드(GO)에 PDEA가 그래프팅된 약물 전달용 나노 복합체를 중심으로 설명하나 이에 제한되는 것은 아니며, 상술한 바와 같은 조건을 만족하는 것이라면 본 발명의 범위에 해당한다.
Hereinafter, the drug delivery nanocomposite grafted with the PDEA onto graphene oxide (GO) will be mainly described, but the present invention is not limited thereto, and it falls within the scope of the present invention as long as the above conditions are satisfied.

도 7에 도시된 바와 같이 PDEA가 그래프팅된 그래핀 시트(GO-PDEA)는 pH 7에서는 Z-평균 크기가 400nm 내외를 나타내지만, pH 8에서는 약 2.6μm까지 증가하며, pH 9에서는 4μm까지 증가하는 것을 알 수 있다. 즉, pH가 7을 초과할 때에는 PDEA가 수축하여 약물이 방출되지 않다가 pH가 7 이하로 낮아질 경우 PDEA가 팽창하여 약물을 방출할 수 있다. 이러한 pH 변화에 따른 GO-PDEA의 z-평균 크기의 변화는 우수한 재현성을 보이며, GO-PDEA의 z-평균 크기의 반복 가능성은 pH 3에서 9까지, 또 9에서 3까지 5회 반복하여 변화시킨 도8에서 확인할 수 있다.
As shown in FIG. 7, the graphene sheet (GO-PDEA) grafted with PDEA showed a Z-average size of about 400 nm at pH 7, but increased to about 2.6 μm at pH 8 and up to about 4 μm at pH 9 As shown in FIG. That is, when the pH exceeds 7, the PDEA shrinks and the drug is not released. If the pH is lowered to 7 or lower, the PDEA may swell and release the drug. The z-average size change of GO-PDEA according to the pH change showed good reproducibility. The repetition probability of z-average size of GO-PDEA was changed from pH 3 to 9 and from 9 to 3 repeated 5 times 8.

또한, 도7에서 GO-PDEA의 제타 포텐셜은 pH 3에서 약 +25mV을 나타내고, pH 7에서는 +13mV까지 감소하였으며, pH가 증가할수록 제타 포텐셜은 점차 감소하여 약 pH 8.5에서 0mV를 나타내었다. 이와 같이 GO-PDEA는 pH 7.2 이하에서 양전하를 나타낼 수 있으며, 이는 전하적인 작용에 의해서 음전하를 띠는 종양 세포에 더 잘 흡착될 수 있도록 한다.
7, the zeta potential of GO-PDEA was about +25 mV at pH 3 and decreased to +13 mV at pH 7. As the pH increased, the zeta potential gradually decreased to about 0 mV at pH 8.5. Thus, GO-PDEA can exhibit positive charge at pH 7.2 or lower, which allows it to be adsorbed more negatively on tumor cells with negative charge.

한편, 본 발명은 GO에 상기 고분자를 그래프팅시킨 약물 전달용 나노 복합체에 약리적 활성성분을 로딩시킨 것을 특징으로 하는 약물이 로딩된 약물 전달용 나노 복합체를 제공한다. The present invention also provides a drug-loaded nanocomposite loaded with a pharmacologically active ingredient loaded on a drug-transferring nanocomposite grafted with the polymer.

로딩시키는 약리적 활성성분은 본 발명의 약물 전달용 나노 복합체에 로딩되고, 방출되어 작용부위에 약학적으로 활성화될 수 있는 것이라면 특별한 제한은 없으나, 보다 바람직하게는 종양세포에 작용하여 종양을 억제할 수 있는 항암제일 수 있다. 많은 항암제는 물에 녹지 않는 문제가 있었으나, 우수한 수용성을 나타내는 본 발명의 약물 전달용 나노 복합체에 로딩하여 효과적으로 전달할 수 있다. 또한, 본 발명의 약물 전달용 나노 복합체는 산성을 나타내는 종양세포에 선택적으로 약물을 방출할 수 있으므로 정상세포에 항암제가 작용하여 발생하는 부작용을 최소화하고 종양세포에만 선택적으로 작용할 수 있다. 로딩시키는 항암제는 독소루비신(doxorubicin), 캄토테신(camptothecin), 다우노르비신(daunorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel) 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 캄토테신(camptothecin, CPT)일 수 있다.
The pharmacologically active ingredient to be loaded is not particularly limited as long as it is loaded on the drug delivery nanocomposite of the present invention and released and is pharmaceutically active on the action site. May be an anticancer agent. Although many anticancer drugs have a problem of being insoluble in water, they can be loaded and effectively delivered to the drug delivery nanocomposite of the present invention exhibiting excellent water solubility. In addition, since the drug delivery nanocomposite of the present invention can selectively release a drug to an acidic tumor cell, it is possible to minimize adverse effects caused by the action of an anticancer agent on normal cells, and selectively act on tumor cells. The anticancer agent for loading may be doxorubicin, camptothecin, daunorubicin, paclitaxel and the like, and most preferably camptothecin (CPT).

상기 약물이 로딩된 약물 전달용 나노 복합체는 로딩된 약물과 나노 복합체의 중량비가 10 : 100 내지 25 : 100일 수 있다. 로딩된 약물의 중량비가 상기 범위 미만일 경우 약의 효과가 잘 나타나지 않을 수 있는 문제가 있을 수 있으며, 상기 범위를 초과할 경우 로딩할 수 있는 한계를 넘어가는 단점이 있다.
The drug-loaded nanocomposite loaded with the drug may have a weight ratio of loaded drug to nanocomplex of 10: 100 to 25: 100. If the weight ratio of the loaded drug is less than the above range, there is a problem that the effect of the drug may not be exhibited well. If the weight ratio exceeds the above range, the loading limit is exceeded.

이하에서는 GO-PDEA 약물 전달용 나노 복합체에 CPT를 로딩시킨 GO-PDEA-CPT를 중심으로 설명하나 이에 제한되는 것은 아니며, 상술한 바와 같은 조건을 만족하는 것이라면 본 발명의 범위에 해당한다.
Hereinafter, the GO-PDEA drug delivery nanocomposite will be described focusing on GO-PDEA-CPT loaded with CPT. However, the present invention is not limited thereto, and it falls within the scope of the present invention if it satisfies the above-described conditions.

도9는 캄토테신(CPT)을 로딩시킨 GO-PDEA-CPT의 도식을 나타낸 것으로, GO 시트의 아로마틱 영역과 CPT 사이의 하이드로포빅 작용과 π-π스태킹을 통해 GO-PDEA의 수용성이 CPT까지 전해질 수 있다. 따라서 물에 잘 녹지 않는 CPT라도 GO-PDEA-CPT 약물전달체계를 동해 효과적으로 작용부위에 전달할 수 있다.
FIG. 9 shows a schematic diagram of GO-PDEA-CPT loaded with camptothecin (CPT), showing that the water-solubility of the GO-PDEA through electrolyte hydrolysis and π-π stacking between the aromatic region and the CPT of the GO sheet, . Therefore, CPT, which is not soluble in water, can effectively transfer the GO-PDEA-CPT drug delivery system to the site of action.

나아가 CPT를 로딩시킨 GO-PDEA-CPT는 pH 7 이하의 산성 조건에서 CPT를 선택적으로 방출할 수 있다. 구체적으로, 37℃, 48시간 동안 pH 7.4 이상에서 약리적 활성성분 방출은 5% 이하이지만, 37℃, pH 7 이하의 산성에서는 48시간 동안 약리적 활성성분의 방출이 30% 이상을 만족한다. 더 구체적으로, 37℃, 48시간 동안 pH 5.8 이하에서 약리적 활성성분의 방출이 50% 이상을 만족할 수 있다. Furthermore, GO-PDEA-CPT loaded with CPT can selectively release CPT under acidic conditions below pH 7. Specifically, the release of the pharmacologically active ingredient is less than 5% at a pH of 7.4 or higher at 37 ° C for 48 hours, but the release of the pharmacologically active ingredient satisfies 30% or more for 48 hours at 37 ° C and an acidity below pH 7. More specifically, the release of the pharmacologically active ingredient at a pH of 5.8 or less at 37 占 폚 for 48 hours can satisfy 50% or more.

도 12는 pH에 따른 GO-PDEA-CPT의 CPT 방출정도를 나타낸 그래프로서, pH 7.4와 pH 9에서 CPT의 방출 정도는 무시할 정도이지만, pH 5.5에서는 48시간 동안의 CPT 방출이 약 60%가량에 달하는 것을 알 수 있다. 이는 낮은 pH에서 CPT 링구조의 질소가 양자화됨에 따라 CPT의 수용성이 높아질 뿐 아니라 이로 인해 GO-PDEA와 CPT 사이의 하이드로포빅 작용이 약해지고, PDEA 또한 산성에서 팽창되어 양자화된 CPT를 붙잡지 않고 방출하게 하는 결과로 볼 수 있다. 따라서, 세포 내 리소좀, 엔도솜 또는 암조직과 같이 국지적으로 pH가 감소하는 특정 부분에서 GO-PDEA-CPT는 CPT를 활발히 방출시킬 수 있다.
FIG. 12 is a graph showing the degree of CPT release of GO-PDEA-CPT according to pH. The release of CPT is negligible at pH 7.4 and pH 9, but the CPT release for 48 hours at pH 5.5 is about 60% It can be seen reaching. As the nitrogen of the CPT ring structure is quantized at low pH, not only the water solubility of CPT is increased but also the hydrophobic action between GO-PDEA and CPT is weakened and the PDEA also expands at acidic state to release quantized CPT As a result. Thus, GO-PDEA-CPT can actively release CPT in certain areas where the pH is locally decreased, such as intracellular lysosomes, endosomes or cancerous tissues.

또한, 본 발명은 상기 약물이 로딩된 약물 전달용 나노 복합체를 인체에 주입하는 방법을 제공한다. 본 발명의 약물이 로딩된 약물 전달용 나노 복합체는 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 또한, 상기 약물이 로딩된 약물 전달용 나노 복합체는 여러 가지 제형으로 제제화 할 수 있다. 제제화 할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 및 캡슐제 등이 포함되며, 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있다. 비수용성 용제와 현탁 용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
The present invention also provides a method for injecting a drug-loaded nanocomposite into a human body. Drug-loaded nanocomposites loaded with the drug of the present invention can be administered via various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or muscular. In addition, the drug-loaded nanocomposite loaded with the drug can be formulated into various formulations. In the case of formulation, it may be formulated using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants which are usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, and capsules. Examples of liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions and syrups. In addition to water and liquid paraffin diluent, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances and preservatives may be included. Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. Examples of the water-insoluble solvent and the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. As a suppository base, glycerol, gelatin and the like may be used.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples should not be construed as limiting the scope of the present invention, and should be construed to facilitate understanding of the present invention.

<< 실시예1Example 1 > > GOGO -- PDEAPDEA 의 합성Synthesis of

건조된 그라파이트(4g)를 NaNO₃(2g), H₂SO₄(92ml)과 3℃ 이하에서 섞고, KMnO₄(12g)을 1시간에 걸쳐서 천천히 넣었다. 그 후 ice bath는 제거하고 30분 정도 상온에서 교반시켰다. 증류수 200ml을 넣고 3시간 동안 더 지속하였다. 그 혼합물에 30% H₂O₂ (50 ml)를 처리하여 미반응한 KMnO₄을 제거하였다. 그 결과 금빛 노란색의 혼합물이 되고 증류수로 묽힌 HCl을 몇 차례 넣고 증류수로 중성이 될 때까지 세척하였다. 그 결과물을 다공성 여과장치(직경 50mm, 0.2 μm의 기공)로 여과를 시키고 60℃에서 진공건조 시켜 GO를 합성하였다.The dried graphite (4 g) was mixed with NaNO ₃ (2 g) and H ₂ SO ₄ (92 ml) at 3 ° C or lower, and KMnO ₄ (12 g) was slowly added over 1 hour. After that, the ice bath was removed and stirred at room temperature for about 30 minutes. 200 ml of distilled water was added and continued for 3 hours. The mixture was treated with 30% H ₂ O ₂ (50 ml) to remove unreacted KMnO ₄ . The result was a golden yellow mixture, diluted with distilled HCl several times, and washed with distilled water until neutral. The resultant was filtered with a porous filtration apparatus (pore diameter: 50 mm, 0.2 μm) and vacuum dried at 60 ° C to synthesize GO.

제조한 GO시트(1.0g)을 정제된 DMF 250ml에 넣고 24시간 초음파를 가하였다. NHS(3.42g)과 EDC.HCL(5.75g)을 DMF/GO용액에 넣고 0℃에서 2시간 교반시켰다. 1, 3-diaminopropane (3.8 ml)을 초음파 처리한 용액에 넣고 하룻밤 동안 교반시켜 아민기가 붙은 GO 시트(GO-NH₂)를 제조하였다. 상기 제조된 아민기가 붙은 GO 시트(GO-NH₂)를 여과시키고 물과 에탄올 혼합물에 세척한 다음 진공오븐에서 40℃로 건조시켰다. GO-NH₂를 250ml의 toluene에 분산시키고 10.5ml과 triethylamine과 BrMPBr (6.2ml)을 첨가하였다. 혼합물은 0℃에서 2시간 정도 다시 교반시키고, 90℃에서 하룻밤 동안 두었다. 고체 결과물을 여과시키고 톨루엔으로 세척 후 40℃ 진공오븐에서 건조시켜 GO-ATRP 개시제(initiator)인 GO-I를 제조하였다.The prepared GO sheet (1.0 g) was placed in 250 ml of refined DMF and sonicated for 24 hours. NHS (3.42 g) and EDC.HCL (5.75 g) were added to the DMF / GO solution and stirred at 0 ° C for 2 hours. 1,3-diaminopropane (3.8 ml) was added to the ultrasonic treated solution and stirred overnight to prepare a GO sheet (GO-NH ₂ ) having an amine group. The prepared GO sheet (GO-NH ₂ ) with amine groups was filtered, washed with water and ethanol mixture, and then dried in a vacuum oven at 40 ° C. GO-NH ₂ was dispersed in 250 ml of toluene, and 10.5 ml of triethylamine and BrMPBr (6.2 ml) were added. The mixture was stirred again at 0 < 0 > C for about 2 hours and kept at 90 [deg.] C overnight. The solid resultant was filtered, washed with toluene and then dried in a 40 DEG C vacuum oven to prepare GO-ATRP initiator GO-I.

CuBr 0.115mmol을 shlenk flask에 넣고 진공 건조하였다. 0.32mmol의 PMDETA와 8.9mmol의 DEA monomer(질소를 60분정도 통과시켜 가스를 제거한다)를 넣었다. CuBr을 MEA 모노머에 완전히 녹이고 진공 건조된 0.2g의 상기 GO-I혼합물을 넣고 질소 기류 하에 교반시키며 60℃에서 하루 동안 반응시켰다. 처음 결과물은 구리촉매의 제거를 위해 ethylenediamine tetraacetic acid 수용액에 세척을 하고 THF에 녹여서 원심분리를 통해 GO에 붙어있지 않은 고분자를 제거하여 GO-PDEA를 제조하였으며, 제조된 GO-PDEA 고체 분말을 진공 건조하여 사용하였다.
0.115 mmol of CuBr was placed in a shlenk flask and vacuum dried. 0.32 mmol of PMDETA and 8.9 mmol of DEA monomer (nitrogen was passed through for about 60 minutes to remove the gas). CuBr was completely dissolved in the MEA monomer and 0.2 g of the vacuum-dried GO-I mixture was added thereto, followed by stirring at 60 DEG C for one day under stirring in a nitrogen stream. The GO-PDEA was prepared by vacuum-drying the GO-PDEA solid powder by washing it with an aqueous solution of ethylenediamine tetraacetic acid to remove the copper catalyst, and dissolving it in THF to remove the polymer not attached to the GO by centrifugation. Respectively.

<< 실시예2Example 2 > > CPTCPT 로딩loading

Phosphate Buffer Saline(PBS, pH-7.4)하의 0.5mg/ml GO-PDEA 용액 5ml와 DMSO 용매 하 8.6mM의 0.5ml CPT 용액을 상온에서 밤새도록 stirring시켜 섞어주었다. 로딩되지 않은 CPT 는 3000rpm으로 흰색 고체물질로 분리 침전시켜 제거하였다. 그 후에 작은 양의 자유 CPT 와 DMSO는 PBS 에 3일간 투석하여 제거하였다. CPT 가 로딩된 GO-PDEA (GO-PDEA-CPT) 는 어두운 곳에서 4℃로 보관하였다.
5 ml of 0.5 mg / ml GO-PDEA solution in phosphate buffered saline (PBS, pH-7.4) and 0.5 ml of CPT solution of 8.6 mM in DMSO solvent were mixed at room temperature overnight. The unloaded CPT was removed by segregation with a white solid material at 3000 rpm. A small amount of free CPT and DMSO was then removed by dialysis against PBS for 3 days. The CP-loaded GO-PDEA (GO-PDEA-CPT) was stored at 4 째 C in the dark.

<< 실험예1Experimental Example 1 > 제조된 > Manufactured GOGO -- PDEAPDEA 의 증명Proof of

실시예1에 따라 제조된 GO-PDEA는 FT-IR(Jasco FT/IR-620 FT-IR spectrometer), H-NMR(400 MHz Bruker spectrometer), TGA(TGA-DSC EVO, France), XPS(ULVAC-PHI Quertera SXM)를 수행하였다. 그 결과를 도2 내지 5에 나타내었으며, 이를 통해 GO에 PDEA가 성공적으로 그래프팅되었음을 증명하였다.
The GO-PDEA prepared according to Example 1 was analyzed by FT-IR (Jasco FT / IR-620 FT-IR spectrometer), 1 H-NMR (400 MHz Bruker spectrometer), TGA -PHI Quertera SXM). The results are shown in Figures 2 to 5, which demonstrated that the PDEA was successfully grafted to the GO.

<< 실험예2Experimental Example 2 > > CPTCPT 로딩 확인 실험 Loading verification experiment

CPT가 GO-PDEA에 성공적으로 로딩되었는지 확인하기 위해 UV-vis(Jasco V-650)와 PL스펙트럼(FP-6500)(370nm)을 측정하였으며, 그 결과를 도 10, 도11에 나타내었다.
UV-vis (Jasco V-650) and PL spectra (FP-6500) (370 nm) were measured to confirm whether CPT was successfully loaded into the GO-PDEA. The results are shown in FIGS. 10 and 11.

도 10에 도시된 바와 같이, GO-PDEA-CPT의 흡광 스펙트럼 상에 CPT peak(370nm)가 겹쳐진 모습을 보이므로 CPT가 성공적으로 로딩된 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 10, the CPT peak (370 nm) is superimposed on the absorption spectrum of the GO-PDEA-CPT, indicating that the CPT has been successfully loaded.

또한, 도 11은 같은 농도의 CPT를 가지는 GO-PDEA-CPT와 자유 CPT의 PL스펙트럼으로, 자유 CPT에 비하여 GO-PDEA-CPT가 CPT의 높은 정도의 소광 현상을 보이고, 이는 CPT가 GO 시트 상 부근에 있다는 것을 암시한다. 그러므로 GO 시트의 아로마틱 영역과 CPT 사이의 하이드로포빅 작용 및 π-π스태킹에 의해서 CPT가 GO-PDEA 상에 자연적으로 비공유 결합하는 것을 알 수 있다.
FIG. 11 shows PL spectra of GO-PDEA-CPT and free CPT having the same concentration of CPT. GO-PDEA-CPT exhibits a quenching phenomenon with a high degree of CPT as compared to free CPT, It implies that it is in the vicinity. Therefore, it can be seen that the CPT is naturally covalently bonded on the GO-PDEA by the hydrofobic action between the aromatic region of the GO sheet and CPT and by pi-pi stacking.

<< 실험예3Experimental Example 3 > > GOGO -- PDEAPDEA -- CPTCPT 의 of pHpH 에 따른 In accordance CPTCPT 방출 실험 Emission experiment

2ml의 GO-PDEA-CPT용액을, pH 5.5(acetate buffer), pH 7.4(phosphate buffer), pH 9.0(carbonate buffer)의 15ml 버퍼용액을 채운 세 가지의 투석 튜브(MWCO = 5 kDa, Sigma-Aldrich)에 채워 넣고 밀폐시킨 후 37℃에서 3일간 두어서 조사했다.2 ml of GO-PDEA-CPT solution was added to three dialysis tubes (MWCO = 5 kDa, Sigma-Aldrich) filled with 15 ml buffer solution of pH 5.5 (acetate buffer), pH 7.4 ), Sealed, and placed at 37 DEG C for 3 days.

투석물 2ml은 시간 간격을 두고 다른 바이엘에 분리하였으며 같은 양의 다른 버퍼용액으로 대체하였다. CPT의 방출은 370nm파장에서의 흡수로 측정되었다. 모든 측정은 3배수로 관찰하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
2 ml of dialysate was separated into different biles at intervals of time and replaced with the same amount of different buffer solution. The emission of CPT was measured by absorbance at 370 nm wavelength. All measurements were observed in triplicate and the results are shown in FIG.

<< 실험예4Experimental Example 4 > > N2aN2a 세포에 작용 시 세포활성도 실험Cell activity assay

ATCC(the American Type Culture Collect)에서 얻은 N2a 뇌 암세포는 10% FBS가 공급되는 DMEM 배지에서 5%의 CO₂ 하, 37℃에서 배양되었다. 세포는 trypsin/EDTA 0.25%로 처리했고, 5분간 1200rpm에서 원심분리를 통해서 모았다. 그 후에 혈구계수기를 이용하여 단일 세포 현탁액의 세포의 숫자를 세었다. 각 샘플 별로 1.0 × 10⁵ 의 세포를 넣었고 24시간 동안 배양하였다. 세포의 숫자 증가를 위해 CCK-8이 사용되었다. DMEM, FBS, CCK-8은 Sigma Aldrich에서 구입하였다.The N2a brain cancer cells obtained from the ATCC (the American Type Culture Collection) were cultured at 37 ° C in DMEM medium supplemented with 10% FBS at 5% CO ₂ . Cells were treated with 0.25% trypsin / EDTA and collected by centrifugation at 1200 rpm for 5 minutes. Subsequently, the number of cells of a single cell suspension was counted using a hemocyte counter. 1.0 × 10 ⁵ cells were added to each sample and cultured for 24 hours. CCK-8 was used to increase the number of cells. DMEM, FBS, and CCK-8 were purchased from Sigma Aldrich.

N2a세포에 CPT(DMSO에 녹이고 PBS로 묽힘), GO-PDEA, GO-PDEA-CPT 100 μl 를 적정농도로 주사하였고 24시간 동안 기다렸다. 그 후에 50 μl의 CCK-8을 포함한 10%의 FBS 500 μl 가 있는 DMEM 미디엄으로 다시 바꾸었다. 비수용성 포르마잔을 형성하기 위해 세포는 37℃에서 1~2시간 배양되었다. 100 μl 의 포르마잔은 각 샘플로부터 96-well plate에 추가되었다. microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)을 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포의 활성도는 Atest/Acontrol 100 %로 계산하였고 Atest, Acontrol는 컴퍼지트와 함께 측정하고 컴퍼지트의 값을 제거하는 방식으로 조정하였다. 세포 활성도에 대한 결과는 도 13와 도 14에 나타내었다.
N2a cells were injected with 100 μl of CPT (dissolved in DMSO and diluted with PBS), GO-PDEA and GO-PDEA-CPT at an appropriate concentration and waited for 24 hours. Then the medium was replaced with DMEM medium containing 500 μl of 10% FBS containing 50 μl of CCK-8. Cells were incubated at 37 ° C for 1-2 hours to form water-insoluble formazan. 100 μl of formazan was added from each sample to a 96-well plate. Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.). Cell activity was calculated as Atest / Acontrol 100%. Atest and Acontrol were measured with a com- pite, Respectively. The results of cell activity are shown in FIG. 13 and FIG.

도 13에 도시된 바와 같이, GO-PDEA를 처리했을 때 N2a세포의 활성도는 20% 미만 줄어들은 반면, GO-PDEA-CPT를 처리한 경우는 농도가 100mg/L일 때 70%가량까지 줄어든 것을 확인할 수 있다. GO-PDEA를 100mg/L의 높은 농도로 처리했을 때도 N2a 암세포가 높은 활성도를 보이는 것으로 보아 GO-PDEA는 N2a 암세포에 대해 독성을 보이지 않으며, GO-PDEA-CPT를 처리했을 때 CPT가 방출되어 N2a 암세포에 작용한 것을 알 수 있다. As shown in FIG. 13, when GO-PDEA was treated, the activity of N2a cells was reduced by less than 20%, whereas when GO-PDEA-CPT was treated, the concentration was reduced to about 70% when the concentration was 100 mg / L Can be confirmed. When GO-PDEA was treated at a high concentration of 100 mg / L, N2a cancer cells showed high activity, indicating that GO-PDEA was not toxic to N2a cancer cells. When GO-PDEA-CPT was treated, CPT was released and N2a It can be seen that it acts on cancer cells.

또한, 도 14에서 자유 CPT를 처리한 경우보다 GO-PDEA-CPT를 처리한 경우 세포활성도가 더욱 낮게 나타났으며, 그 차이는 농도가 증가할수록 커졌다. 이는 자유 CPT보다 수용성이 우수한 GO-PDEA-CPT가 종양세포에 더 효과적으로 작용하여 독성을 나타낸 것으로 볼 수 있다. In addition, in FIG. 14, the cell activity was lower when GO-PDEA-CPT was treated than when free CPT was treated, and the difference was larger as the concentration increased. This suggests that GO-PDEA-CPT, which has better water solubility than free CPT, was more effective in tumor cells and showed toxicity.

도15는 10μM 농도의 CPT에서 GO-PDEA-CPT와 자유 CPT를 처리한 N2a 암세포의 현미경 사진으로, GO-PDEA-CPT와 자유 CPT를 처리한 두 경우 모두 N2a세포의 숫자가 감소하였지만, 자유 CPT를 처리한 경우에 비하여 GO-PDEA-CPT를 처리한 경우가 N2a세포의 숫자가 더 많이 감소하였다.
FIG. 15 is a micrograph of N2a cancer cells treated with GO-PDEA-CPT and free CPT at a concentration of 10 μM. In both cases of treatment with GO-PDEA-CPT and free CPT, the number of N2a cells decreased, , The number of N2a cells was decreased in the case of treatment with GO-PDEA-CPT.

Claims

(GO) grafted with poly (2-diethylamino) ethylmethacrylate (PDEA), wherein the poly (2-diethylamino) ethyl methacrylate
The weight ratio of graphene oxide (GO) and grafted poly (2-diethylamino) ethyl methacrylate is 1: 0.1 to 1: 2,
When camptothecin (CPT) is loaded on the nanocomposite, the release of camptothecin is 5% or less at pH 7.4 or higher at 37 DEG C for 48 hours,
The release of camptothecin at a pH of 7 or less at 37 DEG C for 48 hours satisfies 30% or more,
The release of camptothecin is 50% or higher at pH 5.8 or lower for 48 hours at 37 DEG C,
wherein the zeta potential is 0 mV or higher at pH 7.2 or lower.

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The method according to claim 1,
Wherein the drug delivery nanocomposite is water-soluble.

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The method according to claim 1,
Wherein the drug-loaded nanocomposite loaded with the drug has a weight ratio of loaded drug to nanocomplex of 10: 100 to 25: 100.

(1) grafting poly (2-diethylamino) ethyl methacrylate to graphene oxide (GO) at a weight ratio of 1: 0.1 to 1: 2 to prepare a nanocomposite;
(2) loading the nanocomposite with camptothecin,
The release of camptothecin is not more than 5% at a pH of not less than 7.4 for 48 hours at 37 DEG C,
The release of camptothecin is 30% or more at pH 7 or less for 48 hours at 37 占 폚,
Wherein the release of camptothecin is at least 50% at a pH of 5.8 or less for 48 hours at 37 占 폚.

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