KR101472088B1

KR101472088B1 - 시냅스 소낭 막 융합 억제제의 스크리닝 방법 및 이를 위한 조성물

Info

Publication number: KR101472088B1
Application number: KR1020120076170A
Authority: KR
Inventors: 전영수; 고영준; 이미리암
Original assignee: 광주과학기술원
Priority date: 2012-07-12
Filing date: 2012-07-12
Publication date: 2014-12-16
Also published as: KR20140008846A

Abstract

본 발명은 시냅스 소낭(synaptic vesicle)과 시냅스 전막(presynaptic membrane) 사이의 막 융합 억제제의 스크리닝 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 시냅스 SNARE 단백질 활성의 억제물질, 신경전달물질의 방출 조절제, 보톡스의 개량 및 보톡스 대체 물질의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

시냅스 소낭 막 융합 억제제의 스크리닝 방법 및 이를 위한 조성물{Method for screening inhibitors for synaptic vesicle membrane fusion and Composition therefor}

본 발명은 시냅스 소낭(synaptic vesicle)과 시냅스 전막(presynaptic membrane) 사이의 막 융합 억제제의 스크리닝 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다.

시냅스 소낭(synaptic vesicle)은 아세틸콜린 등의 신경전달물질을 포함하며, 이를 신경세포막으로 이동시켜주는 역할을 하는 세포내 구조체이다. 신경전달은 신경세포와 신경세포의 접점인 시냅스에서 일어나는데, 신경세포 내에서의 신경전달 신호는 전기신호에 의해 매개되고, 이러한 전기신호가 시냅스 부근에 이르러 세포 내로의 칼슘의 유입을 유도하면 시냅스 소낭과 신경세포막간의 막 융합이 일어나게 되어 시냅스 소낭 내의 신경전달물질이 시냅스 내로 분비된다. 이렇게 분비된 신경전달물질은 인접한 신경세포에서 발현된 수용체에 의해 인지됨으로써 신경전달이 다른 신경세포로 이루어지게 된다(Sudhof, The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27:509(2004)).

시냅스 소낭 막 융합 과정은 신경전달을 직접적으로 매개하는 매우 중요한 세포내 과정으로서, 다양한 신경현상의 근간이 된다. 따라서, 이러한 신경전달 과정에 문제가 발생하면, 다양한 형태의 신경 및 뇌질환이 발병하게 된다.

신경전달물질의 배출은 신경전달물질을 함유하는 신경말단에 위치하는 시냅스 소낭과 시냅스 전막(presynaptic membrane)이 융합된 후 두 경계 간의 통로가 형성됨에 의해 발생된다. 소포 단백질 VAMP(synaptobrevin)과 원형질막 결합단백질인 신택신(Syntaxin) 1A와 스냅-25(SNAP-25)로 이루어진 3종의 단백질 복합체인 SNARE(Soluble NSF Attachment Protein Receptor) 단백질이 시냅스 소낭과 시냅스 전막의 융합에 근원적인 힘을 제공한다. 여기서 시냅스 소낭과 시냅스 전막간의 막 융합에 의해 신경전달물질 배출 통로가 열리는 것은, 표적 막(target membrane)에 부착되어 있는 신택신1A 단백질과 SNAP-25 단백질 2종의 복합체인 t-SNARE와 소포(vesicle)에 부착되어 있는 v-SNARE의 작용에 따른 결과이다. 상기 막 융합 시에는 지질이중층(lipid bilayer)의 재배열이 일어나게 된다. 생체막들은 서로 강하게 밀어내므로 이들 막은 자발적으로 융합되지 않고 외부에서 강한 힘이 주어져 막들간의 반발력을 극복하여야 하는데, 이러한 힘을 제공하는 것이 SNARE 단백질인 것으로 알려져 있다. 이와 같이 SNARE 복합체의 형성은 신경전달물질의 배출을 포함하는 세포외 배출작용(exocytosis)의 핵심 현상이다.

현재 피부 주름개선 및 통증치료를 목적으로 보톡스라 불리는 보툴리눔 톡신이 널리 사용되고 있다. 보톡스는 신경과 근육질환 및 주름 제거 등에 사용하는 미국 제약회사 엘러간(Allergan Inc.)의 근육 수축 주사제의 상표명으로, 보툴리눔 톡신(botulinum toxin)을 정제하여 만든다. 보툴리눔 톡신은 주로 상한 통조림에서 생기는 클로스트리디움 보툴리눔(clostridium botulinum)이라는 박테리아가 만든 독소이다. 보톡스를 근육에 주사하면 근육을 움직이게 하는 신경전달물질을 막아 근육 움직임을 일정기간 완화시킨다. 보다 자세한 작용 기작은 보툴리눔 톡신이 신경근 접합부위(neuromuscular junction)에서 작용하는데 신경전달 경로에 관여하는 SNARE 복합체(SNARE complex) 형성을 방해하여 아세틸콜린의 분비를 차단함으로써 이완성 마비(flaccid paralysis)를 일으켜 그 효과를 나타낸다.

보톡스의 무한한 시장성 및 활용범위 등을 고려할 때 저독성의 고효능 보톡스 단백질 개발 및 보톡스 대체 물질 개발이 시급하나, 이를 위한 효율적인 평가 방법이 매우 제한적인 실정이다. 기존의 평가법은 배양된 신경세포를 이용하여 시냅스 소낭 막 융합의 결과로 야기되는 신경전달물질의 분비 정도를 측정하는 방법과 시냅스 SNARE를 리포좀에 도입한 프로티오리포좀(proteoliposome) 간의 인 비트로 융합(in vitro fusion)을 측정하는 방법이 주로 이용되었다(Weber et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92:759(1998)).

그러나, 신경세포를 이용하는 경우 인 비보 상황과 가장 유사한 장점이 있으나, 평가하고자 하는 대상 물질의 타겟이 매우 모호하다는 치명적인 단점이 있다. 또한, 프로티오리포좀 융합을 이용한 방법은 타겟(리포좀에 존재하는 시냅스 SNARE)이 분명하고 모든 실험조건을 조절할 수 있는 장점이 있으나, 시냅스 SNARE 단백질의 분리 및 정제가 쉽지 않고, 분리정제한 단백질의 순도 및 활성에 따라 실험의 결과가 일정하지 않으며, 비용이 많이 들고, 전체적인 실험의 재현성이 떨어지며, 가장 인위적인 조건에서 실험이 수행된다는 단점이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 기존의 시냅스 소낭 막 융합 측정법의 단점을 보완하는 동시에 측정의 용이성, 재현성, 경제성 및 고속 대량 스크리닝(High Throughput Screening)에 최적화된 시냅스 소낭 막 융합 조절물질의 스크리닝 시스템(assay)을 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 시냅스 v-SNARE 단백질 및 시냅스 t-SNARE 단백질을 각각 발현하도록 조작된 효모로부터 분리된 2종의 액포에서 상기 SNARE 단백질간의 SNARE 복합체 형성에 의하여 액포막 융합이 일어남을 확인함으로써, 생체 내에서 일어나는 시냅스 SNARE에 의한 시냅스 소낭 막 융합을 인 비트로에서 재현할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 시냅스 소낭(synaptic vesicle)과 시냅스 전막(presynaptic membrane) 사이의 막 융합 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 시냅스 소낭(synaptic vesicle)과 시냅스 전막(presynaptic membrane) 사이의 막 융합 억제제 스크리닝용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시냅스 소낭(synaptic vesicle)과 시냅스 전막(presynaptic membrane) 사이의 막 융합 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 포유동물의 시냅스 v-SNARE 단백질(synaptic vesicle-SNARE)이 발현된 하나 이상의 제1액포 및 포유동물의 시냅스 t-SNARE 단백질(synaptic target-SNARE)이 발현된 하나 이상의 제2액포를 얻는 단계로서, 상기 제1액포 및 제2액포는 상기 v-SNARE 단백질과 t-SNARE 단백질간의 SNARE 복합체(SNARE complex) 형성에 의해서만 액포막을 서로 융합할 수 있으며;

(b) 상기 제1액포, 제2액포 또는 상기 제1액포와 제2액포에 시험물질을 처리하는 단계; 및

(c) 상기 시험물질이 처리된 액포들간의 막 융합 여부를 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 액포들간의 막 융합을 저해시키면 시냅스 소낭과 시냅스 전막 사이의 막 융합에 대한 억제제로 판단한다.

본 발명의 시냅스 소낭과 시냅스 전막 사이의 막 융합 억제제의 스크리닝 방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a) : 제1액포 및 제2액포의 수득

본 발명의 단계 (a)에서는 포유동물의 시냅스 v-SNARE 단백질이 발현된 하나 이상의 제1액포, 및 포유동물의 시냅스 t-SNARE 단백질이 발현된 하나 이상의 제2액포를 얻는다.

본 명세서에서 용어, "시냅스 소낭(synaptic vesicle)"은 화학시냅스에서 신경종말 중에 무수히 존재하는 지름 약 40-100 nm의 소포를 의미한다. 운동신경종말의 시냅스 소낭은 대개 구상이고, 교감신경종말 시냅스 소낭은 지름 약100 nm로 노르아드레날린을 포함하며 짙게 염색되는 심(芯)을 갖는 시냅스 소낭(dense core vesicle)이 혼재한다. 중추신경계에서는 이 2가지 형 외에 회전타원체상 시냅스소낭을 포함하는 신경종말도 관찰된다. 시냅스 소낭 내에는 신경전달물질이 고농도로 함유되어 있으며, 신경종말의 흥분에 의해 내용물이 시냅스 간극으로 방출되어 시냅스 전달이 이루어진다.

본 명세서에서 용어, "시냅스 전막(presynaptic membrane)"은 한 뉴런의 축삭돌기 말단과 다음 뉴런의 수상돌기 사이의 연접 부위를 시냅스라고 하는데, 시냅스 전막은 신경전달물질을 방출하는 뉴런의 축삭돌기 말단의 막을 의미한다. 시냅스 소낭과 시냅스 전막이 융합된 후 두 경계 간의 통로가 형성됨에 따라 신경전달물질의 배출이 이루어진다.

본 명세서에서 용어, "시냅스 v-SNARE 단백질(synaptic vesicle-SNARE)"은 뉴런의 축색돌기 말단에 위치하는 시냅스 소낭에 부착되어 있는 SNARE 단백질을 의미한다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 시냅스 v-SNARE 단백질은 시냅토브레빈(Synaptobrevin)이다.

바람직하게는, 상기 시냅토브레빈은 시냅토브레빈 1(Synaptobrevin 1) 또는 시냅토브레빈 2(Synaptobrevin 2)이며, 보다 바람직하게는 시냅토브레빈 2이다.

본 명세서에서 용어, "시냅스 t-SNARE 단백질(synaptic target-SNARE)"은 상기 시냅스 v-SNARE 단백질과 SNARE 복합체(SNARE complex)를 형성하는 단백질을 의미한다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 시냅스 t-SNARE 단백질은 신택신(Syntaxin) 및 스냅-25(Synaptosomal-associated protein 25)이다.

바람직하게는, 상기 신택신은 신택신1A, 신택신1B, 신택신2, 신택신3, 신택신4, 신택신5, 신택신6, 신택신7, 신택신8, 신택신10, 신택신11, 신택신12, 신택신16, 신택신17, 신택신18 및 신택신19로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 신택신1A이다.

본 발명의 보다 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 시냅스 v-SNARE 단백질은 시냅토브레빈 2이고, 시냅스 t-SNARE 단백질은 신택신1A 및 스냅-25이다.

도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명의 제1액포 및 제2액포는 상기 v-SNARE 단백질과 t-SNARE 단백질간의 SNARE 복합체(SNARE complex) 형성에 의해서만 액포막을 서로 융합할 수 있다는 것에 특징이 있다. 이러한 특징으로 인하여, 본 발명에서는 시험물질 처리에 따라 제1액포 및 제2액포간의 막 융합이 저해되면 상기 시험물질을 SNARE 복합체 형성을 저해(방해)하는 물질로 판단할 수 있다. 이러한 물질은 보톡스 대체 물질로 사용할 수 있다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 제1액포와 제2액포간의 막 융합은 일반적인 액포막의 융합이 아니라, 액포에서 발현된 시냅스 v-SNARE 단백질과 t-SNARE 단백질간의 SNARE 복합체 형성에 의한 막 융합이다. 이와 같이, 본 발명자들은 시냅스 소낭의 신경전달물질의 배출과 관련된, 인 비보에서 일어나는 시냅스 소낭과 시냅스 전막 사이의 막 융합을 인 비트로 액포 모델에서 최초로 재현하였다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 SNARE 복합체 형성에 의한 액포막 융합은 시냅토브레빈 2의 세포질 도메인(cytoplasmic domain)에 의해 억제된다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 제1액포 및 제2액포는 액포막 융합-매개 단백질(vacuole membrane fusion-mediating protein)을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 결실된 효모로부터 얻을 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 제1액포 및 제2액포는 상기 v-SNARE 단백질과 t-SNARE 단백질간의 SNARE 복합체 형성에 의해서만 액포막을 서로 융합할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "액포막 융합-매개 단백질"은 액포와 액포가 서로의 막을 융합하기 위하여 요구되는 단백질로서, 특정 단백질의 미발현 또는 불활성화에 따라 액포막 융합이 저해되면, 상기 특정 단백질을 액포막 융합-매개 단백질로 판단한다.

바람직하게는, 상기 액포막 융합-매개 단백질은 NSF 단백질(N-ethylmaleimide sensitive fusion protein), 효모 SNARE 단백질(SNARE protein), SNARE 호모로그 단백질(SNARE homologous protein), SM 단백질(SEC1/Munc18 protein) 및 Rab 단백질을 포함한다.

보다 바람직하게는, 상기 NSF 단백질은 Sec18p 이고, 상기 효모 SNARE 단백질은 Vam3p, Vam7p, Nyv1p, Vti1p, 및 Ykt6p로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 SNARE 호모로그 단백질은 Snc1p 또는 Snc2p 이고, 상기 SM 단백질은 Vps33p 이며, 상기 Rab 단백질은 Ypt7p이다.

본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 제1액포 및 제2액포는 액포막 융합-매개 단백질에 대한 항체 처리에 의하여, 상기 v-SNARE 단백질과 t-SNARE 단백질간의 SNARE 복합체 형성에 의해서만 액포막을 서로 융합할 수 있다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 포유동물은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이를 포함하며, 바람직하게는 래트, 원숭이, 마우스, 개 또는 인간이고, 보다 바람직하게는 래트 또는 인간이며, 보다 더 바람직하게는 인간이다.

본 명세서에서 용어, "액포"는 세포벽, 세포 함유물과 마찬가지로 후형질에 속하는 막으로 싸인 거대한 세포소기관을 의미한다. 후형질은 원형질에서 2차적으로 생긴 물질을 말한다. 액포는 Thioploca, Beggiatoa 및 Thiomargarita 속에 속하는 박테리아, 진균, 식물세포 및 동물세포에 존재하며, 저장 세포기관 역할을 한다. 효모의 액포는 아미노산을 저장하고 독성을 분해하는 역할을 한다. 또한, 효모의 액포는 그 형태를 신속하게 변화할 수 있는 동적인 구조를 갖고 있다. 액포는 세포 pH의 항상성, 이온의 농도, 삼투압 조절, 폴리포스페이트 및 아미노산의 저장 및 소화과정에 관여한다. 스트론튬(Sr²⁺), 코발트(Co²⁺) 및 리드Ⅱ(Pd²⁺)와 같은 독성 이온은 액포로 이동되어 분해된다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 액포는 식물, 진균 또는 박테리아(예컨대, Thioploca, Beggiatoa 및 Thiomargarita)로부터 분리된 액포일 수 있으며, 바람직하게는 진균으로부터 분리된 액포이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 액포는 효모로부터 분리된 액포이다.

본 발명에서, 상기 효모는 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 스포로보로마이세스(Sporobolomyces), 토루로프시스(Torulopsis), 트리코스포론(Trichosporon), 윅커하미아(Wickerhamia), 아쉬바이아(Ashbya), 블라스토마이세스(Blastomyces), 캔디다(Candida), 사이테로마이세스(Citeromyces), 크레브로테슘(Crebrothecium), 크립토코커스(Cryptococcus), 드바리오마이세스(Debaryomyces), 에노마이코프시스(Endomycopsis), 지오트리컴(Geotrichum), 한세눌라(Hansenula), 클로엑케라(Kloeckera), 리포마이세스(Lipomyces), 피키아(Pichia), 로도스포리듐(Rhodosporidium) 또는 로도토룰라(Rhodotorula) 속(genus)에 속하는 효모가 바람직하며, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 속에 속하는 효모이고, 보다 더 바람직하게는 사카로마이세스 세레비시애이다.

단계 (b): 시험물질의 처리

본 발명의 단계 (b)에서는 본 발명의 액포에 시험물질을 처리한다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 시험물질은 (i) 제1액포, (ii)제2액포, 또는 (iii) 제1액포와 제2액포 모두에 처리할 수 있다. 본 발명에서, 예컨대 포유동물의 시냅스 v-SNARE 단백질이 발현된 제1액포에만 시험물질을 처리한 후, 제1액포와 제2액포간의 막 융합 여부를 분석함으로써 상기 시험물질이 v-SNARE 단백질의 기능을 저해할 수 있는지를 분석할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어, "시험물질"은 본 발명의 제1액포와 제2액포간의 액포막 융합에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 미지의 물질을 의미한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 시험물질은 천연 화학물, 합성 화합물, 단일 화합물, 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물), 포유동물의 분비물, 항체 또는 펩타이드를 포함한다. 시험물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(UK), Comgenex(USA), Brandon Associates(USA), Microsource(USA) 및 Sigma-Aldrich(USA)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(USA) 및 MycoSearch(USA)에서 상업적으로 구입 가능하다.

시험물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.

본 명세서에서 용어, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하며, 통상적으로 아미노산 잔기 4-40개를 포함한다.

본 명세서에서 용어, "천연 추출물"은 천연물의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 과실 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하며, 천연 추출물은 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 헥산 (i) 디에틸에테르를 추출 용매로 하여 얻을 수 있다.

단계 (c): 액포막 융합 여부의 분석

본 발명의 단계 (c)에서는 시험물질이 처리된 상기 액포들간의 막 융합 여부를 분석한다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 시험물질의 처리에 의하여 액포들간의 막 융합이 저해되면, 상기 시험물질을 시냅스 소낭과 시냅스 전막 사이의 막 융합에 대한 억제제로 판단한다. 또한, 본 발명에서는 상기 억제제로 판단된 시험물질을 시냅스 소낭의 엑소사이토시스(exocytosis)를 저해하는 물질, 또는 시냅스 소낭의 신경전달물질의 방출을 저해하는 물질로 판단할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "저해"는 (i) 시험물질 처리에 의하여 액포간의 막 융합이 전혀 일어나지 않는 경우(액포막 융합의 억제) 뿐만 아니라, (ii) 복수의 제1액포 및 제2액포에 시험물질을 처리하고 이들간의 막 융합 여부를 분석한 결과, 이들 다수의 액포들 중 일부에서만 액포막 융합이 일어난 경우, 및 (iii) 복수의 제1액포 및 제2액포에 시험물질을 처리하기 전의 액포막이 융합되는 비율에 비하여 시험물질 처리 후의 액포막이 융합되는 비율이 감소한(액포막 융합율의 감소) 경우도 포함한다.

본 발명에서, 상기 액포들간의 막 융합 여부의 분석은 당업계에 공지된 다양한 방법, 도구 및 장치 등을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 액포들간의 막 융합 여부의 분석은 이에 의하여 제한되는 것은 아니나, 현미경 또는 효소에 의한 발색반응을 이용하여 측정할 수 있다.

바람직하게는, 액포들간의 막 융합 여부의 분석은 효소에 의한 발색반응을 이용하여 측정할 수 있으며, 보다 바람직하게는 단백질 분해효소에 의하여 활성화되는 알카라인 포스파타아제를 이용하여 측정할 수 있다. 예컨대, PEP4 단백질 분해효소는 포함하나 이에 의하여 활성화되는 알카라인 포스파타아제(PHO8 탈인산화효소, pro-alkaline phosphatase)를 포함하지 않는 제1액포, 및 PEP4 단백질 분해효소에 의해 활성화되는 불활성의 PHO8 탈인산화효소는 포함하나 PEP4 단백질 분해효소를 포함하지 않는 제2액포를 이용하여, PEP4 단백질 분해효소에 의하여 활성화된 PHO8 탈인산화효소가 무색의 p-NPP를 노란색의 p-NP로 탈인산화 시키는 과정에서의 발색반응을 통하여 측정할 수 있다. 상기 제1액포 및 제2액포간의 막 융합이 일어나면 액포 내부의 물질이 섞이게 되고, 이에 따라 제1액포에 존재하던 PEP4 단백질 분해효소가 제2액포에 존재하던 불활성화 상태의 PHO8 탈인산화효소를 활성화시켜, PHO8 탈인산화효소에 의한 무색의 p-NPP의 탈인산화 과정에서 나타나는 색변화를 관찰함으로써 액포막 융합 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명에 의해 스크리닝된 시험물질은 통증 감소, 다한증의 치료 등의 의학용도, 또는 주름 개선 등의 미용용도로 사용될 수 있다. 또한, 상기 스크리닝된 시험물질은 보톡스 대체 물질로서 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 시냅스 소낭(synaptic vesicle)과 시냅스 전막(presynaptic membrane) 사이의 막 융합 억제제 스크리닝용 조성물을 제공한다:

(1) 포유동물의 시냅스 v-SNARE 단백질(synaptic vesicle-SNARE)을 발현하는 제1효모, 또는 이로부터 분리된 하나 이상의 제1액포; 및

(2) 포유동물의 시냅스 t-SNARE 단백질(synaptic target-SNARE)을 발현하는 제2효모, 또는 이로부터 분리된 하나 이상의 제2액포, 여기서 상기 제1액포 및 제2액포는 상기 v-SNARE 단백질과 t-SNARE 단백질간의 SNARE 복합체(SNARE complex) 형성에 의해서만 액포막을 서로 융합할 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 제1액포 및 제2액포를 포함하기 때문에, 이 둘 사이의 공통된 내용(액포, 효모, 시냅스 SNARE 단백질 등)은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 효모는 상기 액포막 융합-매개 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드가 결실된 효모이다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 제1효모는 PEP4 단백질 분해효소를 발현하나 상기 PEP4 단백질 분해효소에 의해 활성화되는 알카라인 포스파타아제는 발현하지 않으며, 본 발명의 제2효모는 불활성화 상태의 알카라인 포스파타아제를 발현하나 상기 불활성화 상태의 알카라인 포스파타아제를 활성화 시키는 PEP4 단백질 분해효소는 발현하지 않는 효모이다.

본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 제1액포는 PEP4 단백질 분해효소를 포함하나 상기 PEP4 단백질 분해효소에 의해 활성화되는 알카라인 포스파타아제는 포함하지 않으며, 본 발명의 제2액포는 상기 불활성화 상태의 알카라인 포스파타아제를 포함하나 상기 불활성화 상태의 알카라인 포스파타아제를 활성화 시키는 PEP4 단백질 분해효소는 포함하지 않는 효모이다.

바람직하게는, 상기 알카라인 포스파타아제는 PHO8 포스파타아제이다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 상기 제1효모(제1액포) 및 제2효모(제2액포)가 별도의 용기에 담겨져 있는 키트 형태일 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(1) 본 발명은 액포를 이용한 시냅스 소낭과 시냅스 전막 사이의 막 융합 억제제의 스크리닝 방법, 및 이를 위한 조성물을 제공한다.

(2) 사람 신경세포의 배양이나 리포좀의 합성이 요구되는 종래의 방법과 달리, 본 발명은 효모 등의 액포를 이용함으로써 저비용으로 실시할 수 있다.

(3) 종래의 합성 리포좀을 이용하는 방법은 리포좀에 포함되는 단백질의 순도 및 활성에 따라 실험결과가 일정하지 않으나, 본 발명은 유전학적으로 조작한 효모로부터 매번 동일한 액포를 분리하여 사용하기 때문에 실험결과의 재현성을 확보할 수 있다.

(4) 본 발명은 발색반응에 기반한 측정법으로서 고속 대량 스크리닝(High Throughput Screening)에 용이하게 적용할 수 있다.

(5) 따라서, 본 발명은 시냅스 SNARE 단백질 활성의 억제물질, 신경전달물질의 방출 억제제, 보톡스의 개량 및 대체 물질의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 시냅스 v-SNARE 단백질 및 시냅스 t-SNARE 단백질에 의한 효모 액포막 융합과정을 보이는 모식도이다.
도 2는 효모 액포막에서 시냅스 SNARE 단백질이 발현되었음을 보여주는 면역블랏팅 결과이다.
도 3은 시냅스 SNARE 단백질의 발현에 따른 효모 액포막의 융합 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 효모이 액포막 융합을 위하여 Syb2 및 Stx1A/SNAP-25 SNARE 단백질이 필요함을 보여주는 그래프이다.
도 5는 각종 막 융합 억제제를 처리하여, 정상적인 액포막 융합(파란색 막대)과 시냅스 SNARE(빨강색 막대)에 의하여 매개된 막 융합이 차이가 있음을 보여주는 그래프이다.
도 3 내지 5에서, α-Sec18 : Sec18에 대한 항체 처리시의 결과, α-Vam3 : Vam3에 대한 항체 처리시의 결과, Syb2-CD : Syb2의 세포질 도메인 처리시의 결과, MED : 지질에 붙는 단백질 도메인 처리시의 결과, α-Vps33 : Vps33에 대한 항체 처리시의 결과, α-Ypt7 : Ypt7에 대한 항체 처리시의 결과, GDI/Gyp : Rab 단백질인 Ypt7p를 액포막으로부터 분리시켜 그 기능을 억제하는 GDI/Gyp 처리시의 결과를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

시냅스 SNARE 단백질-코딩 유전자의 클로닝

시냅스 SNARE 단백질을 코딩하는 유전자(Syntaxin 1A, Synaptobrevin 2 및 SNAP-25)를 RT-PCR에 의하여 래트 뇌세포주 PC-12(한국세포주은행)로부터 클로닝 하였다. 간략히 설명하면, 신택신 1A(Syntaxin 1A, Stx1A) 또는 시냅토브레빈 2(Synaptobrevin 2, Syb2)를 하기 표 1의 프라이머를 사용하여 PC-12 세포주로부터 얻은 cDNA로부터 PCR 증폭하고, 효모 발현 플라스미드 벡터 pYJ406(Jun and Wickner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:13010-5(2007))의 EcoRI/SacII 부위로 클로닝 하였다. 마찬가지로, SNAP-25를 pYJ408의 EcoRI/SacII로 클로닝 하였다.

래트 시냅스 SNARE 단백질을 발현하는 효모 균주의 제작

ADH1(alcohol dehydrogenase 1) 프로모터의 조절하에서 Stx1A 및 SNAP-25를 발현하는 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 제조하기 위하여, pYJ406-Stx1A 및 pYJ408-SNAP-25 플라스미드 벡터를 BsaBI 제한효소로 처리한 다음 DKY6281 nyv1△ 효모 균주(Nichols et al., Nature. 387:199-202(1997))에 도입하여, DKY6281 nyv1△-Stx1A-SNAP-25 균주를 제조하였다. 또한, BJ3505 nyv1△ snc2△ 효모 균주(BJ3505 nyv1△ 효모 균주의 SNC2 유전자를 hygromycin 항생제 유전자 카세트를 이용, homologous recombination을 통해 제거하여 제작)를 BsaBI 제한효소로 처리한 pYJ406-Syb2 플라스미드 벡터로 형질전환 하여 BJ3505 nyv1△ snc2△-Syb2 균주를 제조하였다.

효모 액포에서 시냅스 SNARE 단백질의 발현

DKY6281 nyv1△-Stx1A-SNAP-25 및 BJ3505 nyv1△ snc2△-Syb2 균주가 Stx1A/SNAP-25 또는 Syb2를 발현하는지 여부를 확인하기 위하여, 효모 세포를 유리 비드로 볼텍싱하여 SDS-샘플 버퍼에서 용해시키고 용해물을 SDS-PAGE로 분리하였다. 시냅스 SNARE 단백질의 발현은 면역블랏팅으로 분석하였다. 또한, 발현된 시냅스 SNARE 단백질이 효모 액포에 위치하는지 여부를 확인하기 위하여, 표준 효모 액포 제조 프로토콜에 따라 효모 균주로부터 액포를 분리하고, 시냅스 SNARE 단백질의 발현을 면역블랏팅으로 분석하였다. 분리한 액포로부터 준비한 단백질 혼합용액을 12% 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동으로 단백질을 크기에 따라 분리하고, 이를 니트로셀룰로오스 막에 부착 시킨 후 5% 스킴 밀크로 도포하였다. 1차 항체인 Stx1A 항체(Santa Cruz Biotechnology, sc12736), SNAP25 항체(Abcam, ab5666), Syb2 항체(Abcam, ab3347)를 처리하여 해당 단백질에 결합하게 하고, 여기에 Stx1A 항체에 대한 2차 항체인 Horseradish peroxidase가 부착된 생쥐 IgG 항체(Jackson, 115-035-003), SNAP25 항체와 Syb2 항체에 대한 2차 항체인 Horseradish peroxidase가 부착된 토끼 IgG 항체(Jackson, 111-035-003)를 결합시킨 후 peroxidase에 의해 분해되면 발광하는 기질을 넣어주어 X-ray 필름에 감광된 단백질 밴드를 관찰하였다.

효모 액포에서 발현된 시냅스 SNARE 단백질에 의하여 매개된 막 융합의 확인

DKY6281 nyv1△-Stx1A-SNAP-25 및 BJ3505 nyv1△ snc2△-Syb2 균주로부터 분리한 액포를 사용하여 인 비트로 융합 실험을 수행하였다. DKY6281 nyv1△-Stx1A-SNAP-25의 액포(3 μg) 및 BJ3505 nyv1△ snc2△-Syb2의 액포(3 μg)을 혼합하고 융합 반응버퍼(125 mM KCl, 10 mM PIPES(pH 6.8), 200 mM sorbitol, 5 mM MgCl₂, 3.3 μg/㎖ Pbi2p(IB2) 및 10 μM Coenzyme A)에 첨가하였다. 상기 혼합물을 27℃에서 90분 동안 두었다. 융합 여부를 정량적으로 측정하기 위하여 액포를 트리톤 X-100에서 용해하고 ALP의 기질인 pNPP와 혼합하였다. pNPP에서 pNP로의 탈인산화를 측정하여 ALP의 활성을 측정하였다. pNPP로부터 pNP로 전환되는 양을 OD₄₀₀에서 비색법으로 측정하였다.

실험결과

효모 액포에서 시냅스 SNARE 단백질의 발현 확인

BJ3505 nyv1△ snc2△, BJ3505 nyv1△ snc2△ Syb2, DKY6281 nyv1△, 및 DKY6281 nyv1△ Stx1A SNAP25 효모 균주에서 각각의 액포를 분리 및 정제하여 각각의 액포에 시냅스 SNARE 단백질이 발현하였는지 여부를 면역블랏팅으로 확인하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 시냅스 SNARE 유전자를 도입한 효모 균주에서 분리한 액포에서만 시냅스 SNARE-특이적 단백질 밴드가 관찰되었다. 이러한 결과는, 시냅스 SNARE 단백질이 성공적으로 효모 액포막에서 발현되고 있음을 보여준다(도 2).

시냅스 SNARE 단백질의 발현에 따른 효모 액포막 융합 확인

시냅스 SNARE 단백질의 발현에 따른 효모 액포막의 융합 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 파란색 막대는 시냅스 SNARE를 발현하지 않는 효모 모균주에서 분리한 액포에 대한 결과이다. 이들 효모 모균주로부터 분리한 액포에서는 막 융합이 관찰되지 않았다(도 3의 27℃ 부분). 이는 액포간의 막 융합을 매개하는 필수 유전자인 NYV1을 제거하였기 때문이다. SNC2는 시냅토브레빈과 높은 유사성을 보이는 효모 SNARE 단백질로서 Stx1A 및 SNAP25와의 결합이 가능할 수도 있기 때문에 본 실험에서는 이를 제거한 액포를 이용하였다.

도 3의 빨강색 및 녹색 막대는 시냅스 SNARE가 한 쪽의 액포에만 존재하는 경우의 결과이다. 이 경우에도 액포간 막 융합을 관찰할 수 없었다.

도 3의 자주색 막대는 한쪽 액포에는 Stx1A 및 SNAP-25가, 다른 한쪽의 액포에는 Syb2가 발현되는 경우의 결과이다. 오로지 이 경우에서만 액포간 막 융합이 관찰되었다. 그러나, 여기에서 보이는 막 융합의 신호는 통상적인 액포간 막 융합의 결과가 아니다. 그 이유는 막 융합이 액포막 융합을 억제하는 두 종의 억제인자에 의해 영향을 받지 않기 때문이다. 즉, 본 결과에서 나타난 막 융합은 스냅스 SNARE 단백질간의 상호작용에 의한 결과인 것이다. 이 막 융합은 본 실험에서 두 가지 조건에서 억제되었다. 첫 째는 Syb2의 세포질 도메인(cytoplasmic domain, Syb2-CD)에 의한 억제이다. Syb2-CD는 액포에 존재하는 Syb2와 경쟁적으로 Stx1A/SNAP-25와 결합하기 때문에, Syb2-CD가 과량 존재하면 액포상의 Syb2가 막 융합 파트너상의 Stx1A/SNAP-25와 상호작용하기가 어렵게 되어 막 융합이 억제된다. MED는 지질에 붙는 단백질 도메인으로 일반적인 막 융합 억제물질이다. 따라서, 시냅스 SNARE 단백질에 의한 막 융합도 MED에 의해 억제되었다.

이러한 결과는, 효모의 액포에 시냅스 SNARE 단백질을 성공적으로 발현시키는 것으로, 시냅스 SNARE 단백질에 의한 시냅스 소낭 막 융합을 인 비트로에서 재현하는 데 성공하였음을 의미한다(도 3).

액포막 융합을 위하여 3종의 시냅스 SNARE 단백질이 요구된다.

이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다. 파란색 막대는 Syb2를 발현하는 액포와 Stx1A만을 발현하는 액포간의 막 융합이 일어나지 않음을 보여준다. 빨강색 막대는 Syb2를 발현하는 액포와 SNAP-25만을 발현하는 액포간의 막 융합이 일어나지 않음을 보여준다. 녹색 막대는 실제 생리조건에서와 마찬가지로, Syb2를 발현하는 액포와 Stx1A/SNAP-25를 동시에 발현하는 액포를 혼합하였을 때에만 액포막 융합이 일어남을 나타낸다. 이렇게 관찰된 액포막 융합은 시냅스 소낭 막 융합 특이적 억제자(Syb2-CD) 또는 일반적인 막 융합 억제자(MED)에 의해서만 막 융합이 억제되었다. 이러한 결과는, 시냅스 액포막 융합(Synaptic vesicle fusion)이 Syb2와 Stx1A/SNAP-25가 트랜스(trans) 상태로 결합하였을 때만 일어남을 의미한다(도 4).

관찰된 시냅스 SNARE 단백질-매개된 액포막 융합은 효모 액포간의 일반적인 막 융합과 차이가 있다.

도 5는 각종 막 융합 억제제를 처리하여, 정상적인 액포막 융합(파란색 막대)과 시냅스 SNARE(빨강색 막대)에 의하여 매개된 막 융합이 차이가 있음을 보여준다. 도 5에 나타난 바와 같이, 이들 둘의 막 융합은 서로 다른 억제제에 대하여 서로 다른 영향을 받는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는, 이들 둘의 막 융합이 서로간에 완전히 다른 막 융합 과정임을 의미한다. 시냅스 SNARE에 의한 막 융합 과정은 액포막 융합 억제제에 의해서는 전혀 영향을 받지 않았으며, 일반적인 지질 억제제(MED) 및 시냅스 액포막 융합 특이적 억제제(Syb2-CD)에 의해서만 억제되었다.

정상적인 효모의 액포막 융합은 다양한 단백질 조절자에 의해 매개되는데, 주요 단백질로는 NSF(Sec18p), SNARE(Vam3p, Nyv1p, Vti1p, Vam7p), SM 단백질(Vps33p), Rab 단백질(Ypt7p) 등이 있다. 도 5에 나타난 바와 같이, 정상적인 효모의 액포막 융합은 상기와 같은 단백질이 필수적이다. 즉, 해당 단백질 억제제(특이적 항체)를 처리하였을 때, 액포막 융합이 현저히 억제된다(α-Sec18은 Sec18p에 대한 항체를 의미함). GDI/Gyp은 Rab 단백질인 Ypt7p를 액포막으로부터 분리시켜 그 기능을 억제한다. 하지만, 이러한 액포막 융합 억제제에 의해서 시냅스 SNARE 단백질에 의한 액포막 융합은 전혀 영향을 받지 않았다. 즉, 여기서 관찰하는 막 융합은 액포막 융합이 아니라, 액포막에 도입된 시냅스 SNARE 단백질에 의한 전혀 새로운 막 융합 반응인 것이다.

이를 뒷받침하는 증거로, 시냅스 SNARE 단백질에 의한 막 융합은 Syb2-CD(정상 액포막 융합에는 영향을 주지 않는)에 의해서 억제되었다. 이러한 결과는, 본 실시예에서 관찰된 액포막 융합이 Syb2-Stx1/SNAP-25간의 SNARE 복합체 형성에 의한 막 융합임을 입증하는 것이다(도 5).

추가 논의

효모의 액포막에 시냅스 소낭 막 융합을 매개하는 SNARE 단백질을 성공적으로 발현시킨 후, 시냅스 SNARE를 발현하는 액포를 분리하고, 이를 이용하여 인 비트로에서 시냅스에서 일어나는 시냅스 SNARE에 의한 막 융합 과정을 재현해 내었다. 이러한 인 비트로 시냅스 액포막 융합 검정법은 시냅스 SNARE 단백질에 의한 막 융합 과정의 분자기전을 연구하기 위한 매우 중요한 도구로서 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 시냅스 소낭 막 융합을 매개하는 SNARE 단백질을 분해하여 신경전달을 억제하는 독소인 보톡스의 대체 물질 발굴을 위한 고속 대량 스크리닝 시스템으로 이용될 수 있다. 최근 통증치료 및 미용치료를 위한 보톡스 시장의 성장세를 감안할 때, 저비용 고성능 보톡스 대체 물질 발굴에 본 발명이 유용하게 활용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Gwangju Institute of Science and Technology <120> Method for screening inhibitors for synaptic vesicle membrane fusion and Composition therefor <130> PN120224 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' EcoRI-Stx1A primer <400> 1 gtcgaattca tgaaggaccg aacccaggag 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' SacII-Stx1A primer <400> 2 gtcccgcggc tatccaaaga tgcccccgat 30 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' EcoRI-SNAP-25 primer <400> 3 gtcgaattca tggccgaaga cgcagacatg 30 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' SacII-SNAP-25 primer <400> 4 gtcccgcggc acttaaccac ttcccagcat c 31 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' EcoRI-Syb2 primer <400> 5 gtcgaattca tgtcggctac cgctgccacc gtcccgcct 39 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' SacII-Syb2 primer <400> 6 gtcccgcggc tcctcgggga tttaagtgct g 31

Claims

다음의 단계를 포함하는 시냅스 소낭(synaptic vesicle)과 시냅스 전막(presynaptic membrane) 사이의 막 융합 억제제의 스크리닝 방법:
(a) 포유동물로부터 분리된 세포로부터 얻은 시냅스 v-SNARE 단백질(synaptic vesicle-SNARE)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환되고, nyv1과 snc2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 결실된 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)로부터 시냅스 v-SNARE 단백질인 시냅토브레빈(Synaptobrevin)이 발현된 하나 이상의 제1효모 액포를 얻고, 포유동물로부터 분리된 세포로부터 얻은 시냅스 t-SNARE 단백질(synaptic target-SNARE)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환되고, nyv1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 결실된 사카로마이세스 세레비시애로부터 시냅스 t-SNARE 단백질인 신택신(Syntaxin)과 스냅-25(Synaptosomal-associated protein 25)가 발현된 하나 이상의 제2효모 액포를 얻는 단계로서, 상기 제1효모 액포 및 제2효모 액포는 상기 v-SNARE 단백질과 t-SNARE 단백질간의 SNARE 복합체(SNARE complex) 형성에 의해서만 액포막을 서로 융합할 수 있으며;
(b) 상기 제1효모 액포, 제2효모 액포 또는 상기 제1효모 액포와 제2효모 액포에 시험물질을 처리하는 단계; 및
(c) 상기 시험물질이 처리된 액포들간의 막 융합 여부를 분석하는 단계로서, 상기 시험물질이 상기 액포들간의 막 융합을 저해시키면 시냅스 소낭과 시냅스 전막 사이의 막 융합에 대한 억제제로 판단한다.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 시냅토브레빈은 시냅토브레빈 1(Synaptobrevin 1) 또는 시냅토브레빈 2(Synaptobrevin 2)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 신택신은 신택신1A, 신택신1B, 신택신2, 신택신3, 신택신4, 신택신5, 신택신6, 신택신7, 신택신8, 신택신10, 신택신11, 신택신12, 신택신16, 신택신17, 신택신18 및 신택신19로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
삭제
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 SNARE 복합체 형성에 의한 액포막 융합은 시냅토브레빈 2의 세포질 도메인(cytoplasmic domain)에 의해 억제되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 포유동물은 인간, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 또는 고양이인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
다음을 포함하는 시냅스 소낭(synaptic vesicle)과 시냅스 전막(presynaptic membrane) 사이의 막 융합 억제제 스크리닝용 조성물:
(1) 포유동물의 시냅스 v-SNARE 단백질(synaptic vesicle-SNARE)인 시냅토브레빈(Synaptobrevin)을 발현하고, nyv1과 snc2를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 결실된 제1효모, 또는 이로부터 분리된 하나 이상의 제1액포; 및
(2) 포유동물의 시냅스 t-SNARE 단백질(synaptic target-SNARE)인 신택신(Syntaxin)과 스냅-25(Synaptosomal-associated protein 25)를 발현하고, nyv1을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 결실된 제2효모, 또는 이로부터 분리된 하나 이상의 제2액포, 여기서 상기 제1효모 및 제2효모는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)이고, 상기 제1액포 및 제2액포는 상기 v-SNARE 단백질과 t-SNARE 단백질간의 SNARE 복합체(SNARE complex) 형성에 의해서만 액포막을 서로 융합할 수 있다.
삭제
제 13 항에 있어서, 상기 제1효모는 PEP4 단백질 분해효소를 발현하나 상기 PEP4 단백질 분해효소에 의해 활성화되는 알카라인 포스파타아제는 발현하지 않으며, 상기 제2효모는 불활성화 상태의 알카라인 포스파타아제를 발현하나 상기 불활성화 상태의 알카라인 포스파타아제를 활성화 시키는 PEP4 단백질 분해효소는 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.