KR101464656B1 - 발효산물 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 발효산물의 제조방법 - Google Patents

발효산물 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 발효산물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 발효산물 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 발효산물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장내세균의 유전체수준에서 선별한 호흡, 전자전달, 산화환원반응에 관여하는 유전자들이 결실된 젖산, 숙신산, 에탄올 등의 발효산물 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 혐기조건하에서 배양하여 발효산물을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 미생물의 산화환원경로 및 조절에 관여하는 유전자가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 발효산물의 생성은 현저히 줄어들고, 젖산, 숙신산 또는 에탄올을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물을 배양하여 고수율로 젖산, 숙신산 또는 에탄올을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다.

Description

발효산물 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 발효산물의 제조방법 {Varient Microorganism Having Metabolites Producing Ability and Method for Preparing Metabolites Using the Same}

본 발명은 발효산물 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용한 발효산물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장내세균의 유전체수준에서 선별한 호흡, 전자전달, 산화환원반응 등에 관여하는 유전자들이 결실된 젖산, 숙신산, 에탄올 등의 발효산물 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 혐기조건하에서 배양하여 발효산물을 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근 기후변화 등 환경문제가 대두되고 석유자원의 고갈이 예상됨에 따라, 대부분의 화학물질을 화학공정을 대체하는 바이오기술을 통하여 생산하고자 하며 관련기술의 개발에 대한 요구가 증대되고 있다. 그리고 고가의 석유 가격 때문에 미생물대사와 생물공정에 의한 화학물질 생산이 점차 석유화학공정에 대한 가격 경쟁력을 갖추어 가고 있다. 따라서 환경, 에너지 문제를 동시에 해결할 수 있는 미생물 균주의 개발 및 발효기술 개발에 대한 수요가 매우 높아지고 있다. 여러 가지 생화학물질 중에서 젖산 (lactic acid)는 생분해성 플라스틱인 PLA (polylactic acid)의 단량체, 식품첨가제, 의약품의 전구물질 등으로 다양하게 이용할 수 있으며, 이에 대한 관심이 증가하는 추세이다.

젖산에 대한 생물학적 생산에 활용되는 미생물은 Lactobacillus 속, Lactococcus 속 등의 유산균 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 45, 307, 1996; Enzyme Microb. Technol., 26, 87, 2000; 대한민국 특허출원 10-2003-0090204), Rhizopus 속의 사상균(Appl. Biochem. Biotechnol., 51, 57, 1995; J. Biosci. Bioeng., 97, 19, 2004), Saccharomyces 속 등의 효모(Appl. Environ. Microbiol., 71, 2789, 2005) 및 대장균이 보고되어 있다. 유산균의 경우 젖산의 D-와 L-form이 뒤섞여 생산되어 광학 순도가 낮은 것, 사상균은 글리세롤, 에탄올 등의 부산물이 많이 생성되고, 효모는 에탄올이 부산물로 많이 발생하고, 낮은 대당수율이 단점이다.

대장균에서 젖산의 생산은 알코올 탈수소화효소 (adhE)와 포스포트랜스 아세틸라아제 (pta) 유전자의 결실 변이주가 젖산을 생성한다는 보고가 있다 (J. Bacteriol. 171. 3650). 그리고, 포스포트랜스 아세틸라아제 (pta) 유전자 및 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 (ppc) 유전자의 결실 돌연변이 균주를 이용하는 방법(Appl. Environ. Microbiol., 65, 1384, 1999); 대한민국특허 출원번호 1994-0004034), 피루베이트 포르메이트-리아제 (pfl), 푸마레이트 환원효소 (frdABCD) 유전자, 알코올 탈수소화효소 (adhE), 아세테이드 키나제 (ack) 유전자를 결실시킨 돌연변이를 이용하는 방법(Appl. Environ. Microbiol., 69, 399, 2003)이 알려져 있다. 또한, Ubiquinone 생합성 유전자의 변이 미생물이 젖산을 축적한다는 것이 알려져 있다 (J Bacteriol., 182, 5139, 2000). 또한 대장균의 전사조절인자인 fnr과 2개 인자 반응조절자(Two-component response regulator)인 arcBA의 유전자 결실로 인해 젖산생산량이 증가한다는 보고가 있으며 (Biochemical Engineering J. 42, 229-236, 2008), 이들 유전자의 단일 결실 및 복수 결실 돌연변이 균주의 탄소대사 흐름을 분석하여 젖산생산량이 증가함이 알려져 있다 (Metabolic engineering 8, 619-627, 2006). 지금까지 대장균에서 젖산 생산에 관한 방법은 상기의 알려진 유전자들의 결실 돌연변이주를 이용하고 발효공정을 개선하는 것이 대부분이다.

현재 새로운 차세대 염기서열 분석기술을 통한 미생물 유전체 정보의 급격한 확대와 오믹스 기술의 발달로 미생물의 생리 및 대사를 시스템 수준에서 연구할 수 있는 기술기반이 마련되고 있지만, 아직까지 미생물의 유전자의 기능과 상호작용 기작에 대해서는 알려지지 않은 부분이 많다. 미생물의 발효과정에서 생성되는 유기산이나 에탄올은 호흡(respiration)의 결과물이다. 호흡은 전자전달과 전자재배치를 동반하고, 이 과정은 세포내의 산화환원의 균형을 유지하면서 수행되는데, 이 과정에서 중요한 역할을 하는 것이 산화환원효소들이다. 산화환원효소는 미생물의 유전체에 많은 숫자가 존재하는데, 그것들이 어떻게 연결되어 있는지에 대한 네트워크(network)는 알려져 있지 않은 부분이 많다.

본 발명은 미지의 호흡계 산화환원의 균형을 조절하는 효소 유전자가 산화환원균형 (redox balance)의 조절을 통해 탄소대사흐름을 제어할 수 있다는 것을 확인하고, 탄소대사 흐름중에 젖산, 숙신산 또는 에탄올 생성에 중요한 역할을 하는 유전자를 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 젖산, 숙신산 또는 에탄올을 생산하는 균주를 개발하기 위하여 노력한 결과, 산화환원 효소 및 조절 유전자 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 변이 미생물을 제조하고, 이를 배양한 결과, 젖산, 숙신산 또는 에탄올을 고수율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 유전체수준에서 호흡, 전자전달, 산화환원반응에 관여하는 472개 유전자들의 각각의 결실 돌연변이 균주의 혐기발효를 통해서 산화환원 균형을 재구성하고, 이를 통해 탄소대사흐름을 제어할 수 있는 유전자를 선별하고, 다른 유기산 생성은 현저히 줄어들지만, 젖산, 숙신산 또는 에탄올을 과량 생산하는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 변이 미생물을 배양하여 젖산, 숙신산 또는 에탄올을 고수율로 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미생물의 산화환원효소 유전자중 아미노산 및 핵산 생합성 대사경로에 관여하는 이노신-5-인산 탈수소효소(inosine-5-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(guaB), 포스포글리세레이트 탈수소효소(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(serA) 다이하이드로오로테이트 탈수소효소(dihydroorotate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(pyrD)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 미생물에서, 미생물의 산화환원효소 유전자중 아미노산 및 핵산 생합성 대사경로에 관여하는 이노신-5-인산 탈수소효소(inosine-5-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(guaB), 포스포글리세레이트 탈수소효소(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(serA) 다이하이드로오로테이트 탈수소효소(dihydroorotate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(pyrD)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 배양하여 젖산을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 젖산을 회수하는 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 미생물의 산화환원경로 및 조절에 관여하는 유전자중 세미알데히드 탈수소효소(predicted semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(usg), 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase H)를 코딩하는 유전자(fodH), 글라이세롤-3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(glpC), 6-포스포글루콘산 탈수소효소(6-phosphogluconate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gnd), L-아이도네이트-5-탈수소효소(L-idonate-5-dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(idnD), 수소화효소 G(hydrogenase G)를 코딩하는 유전자(hyfG), 산화환원효소 추정단백질(predicted oxidoreductase)를 코딩하는 유전자(ybdH), 피롤린-5-카르복실산 환원효소(pyrroline-5-carboxylate reductase)를 코딩하는 유전자(proC), 수소화효소 C(hydrogenase C)를 코딩하는 유전자(hyfC), 포스포글리콜산 포스파타아제(phosphoglycolate phosphatase)를 코딩하는 유전자(gph) 및 다이하이드로리포일 숙신기 전이효소(dihydrolipoyl transsuccinylase)를 코딩하는 유전자(sucB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 숙신산 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 미생물에서, 미생물의 산화환원경로 및 조절에 관여하는 유전자중 세미알데히드 탈수소효소(predicted semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(usg), 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase H)를 코딩하는 유전자(fodH), 글라이세롤-3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(glpC), 6-포스포글루콘산 탈수소효소(6-phosphogluconate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gnd), L-아이도네이트-5-탈수소효소(L-idonate-5-dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(idnD), 수소화효소 G(hydrogenase G)를 코딩하는 유전자(hyfG), 산화환원효소 추정단백질(predicted oxidoreductase)를 코딩하는 유전자(ybdH), 피롤린-5-카르복실산 환원효소(pyrroline-5-carboxylate reductase)를 코딩하는 유전자(proC), 수소화효소 C(hydrogenase C)를 코딩하는 유전자(hyfC), 포스포글리콜산 포스파타아제(phosphoglycolate phosphatase)를 코딩하는 유전자(gph) 및 다이하이드로리포일 숙신기 전이효소(dihydrolipoyl transsuccinylase)를 코딩하는 유전자(sucB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 숙신산 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 배양하여 숙신산을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 숙신산을 회수하는 것을 특징으로 하는 숙신산의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 미생물의 산화환원경로 및 조절에 관여하는 유전자중 3-아이소프로필말산 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(leuB), 티오레독신(Thioredoxin)을 코딩하는 유전자(trxA), 피루브산 탈수소효소 복합체 전사조절인자(Pyruvate dehydrogenase complex transcriptional regulator)를 코딩하는 유전자(pdhR), 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase H)를 코딩하는 유전자(fdnH) 및 NADH-유비퀴논 산화환원효소 복합체 ABCEFGHIJKLN(NADH-ubiquinone oxidoreductase complex)를 코딩하는 유전자(nuoABCEFGHIJKLN)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 에탄올 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 미생물에서 산화환원경로 및 조절에 관여하는 유전자중 3-아이소프로필말산 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(leuB), 티오레독신(Thioredoxin)을 코딩하는 유전자(trxA), 피루브산 탈수소효소 복합체 전사조절인자(Pyruvate dehydrogenase complex transcriptional regulator)를 코딩하는 유전자(pdhR), 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase H)를 코딩하는 유전자(fdnH) 및 NADH-유비퀴논 산화환원효소 복합체 ABCEFGHIJKLN(NADH-ubiquinone oxidoreductase complex)를 코딩하는 유전자(nuoABCEFGHIJKLN)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 에탄올 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 변이 미생물을 배양하여 에탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 에탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 미생물의 산화환원경로 및 조절에 관여하는 유전자가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 발효산물의 생성은 현저히 줄고, 젖산, 숙신산 또는 에탄올을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물을 배양하여 고수율로 젖산, 숙신산 또는 에탄올을 제조하는 방법을 제공하는 효과가 있다.

특히, 혐기적 조건에서 젖산을 과량 생산하는 변이 미생물은 PLA (polylactic acid)와 같은 바이오플라스틱을 생산하는 균주 등으로 적용할 수 있으며, 혐기적 조건에서 숙신산을 과량 생산하는 변이 미생물은 바이오플라스틱을 생산하는 균주 등으로 적용할 수 있고, 혐기적 조건에서 에탄올을 과량 생산하는 변이 미생물은 바이오 연료를 생산하는 균주 등으로 적용할 수 있다.

도 1은 호흡계 조절을 통한 대사흐름제어를 위한 단일 유전자 결실 변이 미생물 선별과정을 나타낸 것이다.
도 2는 431개의 단일 유전자 결실 변이 미생물의 성장과 발효산물 생성량을 나타낸 것이다.
도 3은 선별된 단일 유전자가 결실된 젖산 과잉생산 변이 미생물의 발효 산물 분석한 것을 나타낸 것이다.
도 4 및 5는 단일과 복수의 유전자 결실 변이 미생물의 젖산 생산량 및 젖산 생산성을 나타낸 것이다.

본 발명에서 "약화"란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.

본 발명에서 '결실'이란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.

본 발명은 목적하는 발효산물의 생성능을 향상시키기 위하여, 미생물의 유전체 수준에서 선별한 호흡, 전자전달, 산화환원반응에 관여하는 유전자들을 결실시켜 변이 미생물을 제조하는 새로운 시스템대사공학기술에 관한 것이다. 즉, 경쟁적인 대사경로의 차단 및 직접적으로 연관된 대사회로의 증폭을 통하여 대사흐름을 제어하는 기존의 대사공학기술과 달리, 젖산, 숙신산, 에탄올 등을 생성하는 탄소대사경로에 직접적으로 관여하지 않는 대사경로의 효소 및 전사조절 유전자를 결실시켜 젖산, 숙신산, 에탄올 등의 발효산물의 생성능이 증가된 변이 미생물을 제조하는 기술이다.

도 1은 호흡계 조절을 통한 대사흐름제어를 위한 단일 유전자 결실 변이 미생물 선별과정을 나타낸 것이다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에서는 미생물의 호흡계 및 산화환원 관련 유전자의 단일유전자 결실 변이 미생물을 혐기조건에서 배양한 후, 균주의 성장과 최종발효산물의 분석을 통하여 각 변이 미생물의 혐기대사와 에너지대사와의 연관관계를 분석하였다.

분석을 위한 유전자는 dehydrogenase, reductase, oxidase, oxygenase, NAD, quino, cytochrome, anaerobic, redox의 9개의 중심어로 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ 에서 검색하여, 총 472개를 선정하였다. 선정된 유전자의 단일 결실 돌연변이는 각 유전자가 kanamycin 내성 유전자로 치환되어 있는 KEIO collection에서 입수하였다.

전체 472개의 단일 유전자 결실 변이 미생물을 각각 항생제가 포함된 배지에 도말하고, 이를 혐기 배양시키면서 균주의 성장과 발효산물의 생성량을 분석한 결과, 미생물의 산화환원효소 유전자중 아미노산 및 핵산 생합성 대사경로에 관여하는 이노신-5-인산 탈수소효소(inosine-5-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(guaB), 포스포글리세레이트 탈수소효소(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(serA), 다이하이드로오로테이트 탈수소효소(dihydroorotate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(pyrD), 푸마르산-질산 환원효소전사 조절인자(Fumarate nitrate reductase transcriptional regulator)를 코딩하는 유전자(fnr), 호기호흡조절 반응조절인자(aerobic respiration control response regulator)를 코딩하는 유전자(arcA) 호기호흡조절 센서 인산화효소(aerobic respiration control sensor kinase)를 코딩하는 유전자(arcB) 가 각각 결실되었을 때, 혐기발효의 결과 젖산 생산이 증가하는 반면, 다른 발효산물의 생성은 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 미생물의 산화환원효소 유전자중 아미노산 및 핵산 생합성 대사경로에 관여하는 이노신-5-인산 탈수소효소(inosine-5-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(guaB), 포스포글리세레이트 탈수소효소(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(serA) 다이하이드로오로테이트 탈수소효소(dihydroorotate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(pyrD)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 변이 미생물은 또한, 푸마르산-질산 환원효소전사 조절인자(Fumarate nitrate reductase transcriptional regulator)를 코딩하는 유전자(fnr), 호기호흡조절 반응조절인자(aerobic respiration control response regulator)를 코딩하는 유전자(arcA) 호기호흡조절 센서 인산화효소(aerobic respiration control sensor kinase)를 코딩하는 유전자(arcB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 각 유전자의 결실은 P1 transduction 방법을 통한 상동성 재조합을 이용하여 유전자를 치환하여 불활성화시키는 방법을 사용하였으나, 해당 유전자에 의해 코딩되는 효소가 생성되지 못하도록 해당 유전자를 변형 또는 제거시킬 수 있는 유전자 조작 방법이라면 제한없이 사용할 수 있다.

발명에서, 상기 미생물은 장내 세균이면 제한없이 사용할 수 있으며, 상기 장내 세균은 대장균 속 (Escherichia sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 예시니아 속(Yersinia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 크렙시앨라 속(Klebsiella sp.), 프로테우스 속(Proteus sp.) 등을 예시할 수 있고, 더욱 상세하게 상기 대장균 속은 대장균 BW25113 (Escherichia coli BW25113) 등을 예시할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 변이 미생물은 혐기적 조건에서 다른 발효물질은 현저하게 낮게 생성하면서 젖산을 고농도로 생성하는 특성을 갖는다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물을 배양하여 젖산을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 젖산을 회수하는 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 변이 미생물의 배양 및 젖산의 수득 과정은 종래 발효공정에서 통상적으로 알려진 배양방법(회분식 배양, 유가식 배양) 및 젖산의 분리 및 정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 배양에 사용되는 배지는 특별히 제한되지 않으나, 초기 포도당 농도가 바람직하게는 8~20 g/L이고, 가장 바람직하게는 9 g/L이며, 배양은 35~45℃, 바람직하게는 35~39℃, 가장 바람직하게는 37℃의 온도와, 6.0~7.5, 바람직하게는 6.3~6.7, 가장 바람직하게는 6.5의 초기 pH 조건하에서 수행될 수 있다.또한, 상기 배양은 혐기적 조건에서 수행하는 것이 바람직한데, 혐기적 조건은 질소를 배양기의 head space에 공급하고, Na2S를 첨가하여 용존산소를 제거함으로써 형성할 수 있다. 상기 배양기는 특별한 제한은 없으나 serum bottle를 예시할 수 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명은 또한 미생물에서, 미생물의 산화환원경로 및 조절에 관여하는 유전자중 세미알데히드 탈수소효소(predicted semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(usg), 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase H)를 코딩하는 유전자(fodH), 글라이세롤-3-인산 탈수소효소(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(glpC), 6-포스포글루콘산 탈수소효소(6-phosphogluconate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(gnd), L-아이도네이트-5-탈수소효소(L-idonate-5-dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(idnD), 수소화효소 G(hydrogenase G)를 코딩하는 유전자(hyfG), 산화환원효소 추정단백질(predicted oxidoreductase)를 코딩하는 유전자(ybdH), 피롤린-5-카르복실산 환원효소(pyrroline-5-carboxylate reductase)를 코딩하는 유전자(proC), 수소화효소 C(hydrogenase C)를 코딩하는 유전자(hyfC), 포스포글리콜산 포스파타아제(phosphoglycolate phosphatase)를 코딩하는 유전자(gph) 및 다이하이드로리포일 숙신기 전이효소(dihydrolipoyl transsuccinylase)를 코딩하는 유전자를 코딩하는 유전자(sucB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킬 경우 변이 미생물의 숙신산 생성능이 증가하는 것을 확인하였다.

본 발명은 또한, 미생물에서, 미생물의 산화환원경로 및 조절에 관여하는 유전자중 3-아이소프로필말산 탈수소효소(3-isopropylmalate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(leuB), 티오레독신(Thioredoxin)을 코딩하는 유전자(trxA), 피루브산 탈수소효소 복합체 전사조절인자(Pyruvate dehydrogenase complex transcriptional regulator)를 코딩하는 유전자(pdhR), 포름산 탈수소효소(formate dehydrogenase H)를 코딩하는 유전자(fdnH) 및 NADH-유비퀴논 산화환원효소 복합체 ABCEFGHIJKLN(NADH-ubiquinone oxidoreductase complex)를 코딩하는 유전자(nuoABCEFGHIJKLN)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킬 경우 변이 미생물의 에탄올 생성능이 증가하는 것을 확인하였다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법 만을 예시하였으나, 유장(whey), CSL(corn steep liguor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양(continuous culture) 등 다양한 방법을 사용한 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 단일유전자 결실 돌연변이 균주의 혐기발효와 유기산 분석

미생물의 호흡계 및 산화환원 관련 유전자의 단일유전자 결실 돌연변이 균주를 혐기조건에서 배양한 후, 균주의 성장과 최종발효산물의 분석을 통하여 각 돌연변이 균주의 혐기대사와 에너지대사와의 연관관계를 분석하였다.

분석을 위한 유전자는 dehydrogenase, reductase, oxidase, oxygenase, NAD, quino, cytochrome, anaerobic, redox의 9개의 중심어로 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ 에서 검색하여, 총 472개를 선정하였다. 선정된 유전자의 단일 결실 돌연변이는 각 유전자가 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자로 치환되어 있는 KEIO collection에서 입수하였다(도 1).

총 472개의 단일유전자 결실 변이 미생물을 각각 kanamycin(25μg/㎖)이 포함된 LB 고체배지에 도말하고, 성장한 단일 콜로니를 LB 액체배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 12시간 전배양 하였다. 상기 배양액을 발효배지 (glucose, 9g (final 50 mM); yeast extract, 5g; NaHCO3, 10g; NaH2PO4ㅇH2O, 8.5g; K2HPO4, 15.5g per liter (pH7.0).) 100㎖이 들어있는 125 ㎖ 크기의 serum bottle에 1ml 접종하고, Na2S가 1 mM 되도록 첨가하여 밀봉한 후, 상층부를 질소가스로 충전하여 serum bottle 내의 산소를 제거하고 37℃에서 24시간 배양하였다.

균주의 성장과 최종발효산물의 분석을 위하여 혐기배양한 각 균주의 배양액에서 5㎖을 취하였으며, 이 중 1㎖을 PBS에 1:10으로 희석하고 OD600 값을 측정하여 균주의 성장을 분석하였다. 남아 있는 배양액 4㎖은 5000rpm에서 5분간 원심분리하고 0.2㎖ 나일론 필터를 사용하여 배양액을 여과하고 이 여과액 1㎖을 HPLC 분석에 이용하였다. 유기산(포도당, 숙신산, 젖산, 개미산, 아세트산 및 에탄올)의 분석은 Aminex HPX-87H Column(Bio-rad)을 사용하였으며, 이동상으로는 0.1N H2SO4 용액을 사용하였다.

젖산, 숙신산, 에탄올 등의 유용 발효산물을 과량 생산하는 변이 미생물을 선별하기 위하여 선정된 472개의 단일 유전자 결실 변이 미생물의 성장과 최종발효산물의 생성량을 분석하고, 이 중 탄소대사와 직접적으로 관련된 41개의 돌연변이 미생물을 제외한 431개의 단일 유전자 결실 돌연변이 균주의 최종발효산물은 도 2에 나타내었다.

431개의 단일 유전자 결실 돌연변이 최종발효산물의 생성량을 통계처리를 한 후에, 단일 유전자 결실로 인해 각각의 발효산물의 생성량이 크게 늘어나거나 감소하는 경우를 정리하여 하기 표 1에 나타내었다. 이 결과로, 세포내의 혐기적 호흡조건에서 산화환원 균형을 재구성하고, 이를 통해 탄소대사흐름을 제어할 수 있는 유전자를 선별하고, 젖산, 숙신산 에탄올 등의 여러 가지 발효물질의 생성을 제어하는 유전자 정보를 얻을 수 있다.

발효산물 숙신산(mM) 젖산(mM) 개미산(mM) 초산(mM) 에탄올(mM) 야생형생성량 10.05 13.95 61.00 37.00 34.91 평균±표준편차* 8.12 ± 0.95 13.20 ± 2.84 76.86 ± 5.18 39.37 ± 1.84 30.64 ± 2.18 결실로 인한 발효산물량을감소시키는 유전자 fnr, arcA, zwf, pdxH, ygiR, ssuD, aroE,
nuoABCEFGHIJKLN
xdhB fnr, guaB, serA, arcB, oxyR, glcE, leuB, lldD, trxA, soxS fnr, guaB, serA, arcB, pyrD, oxyR fnr
결실로 인한 발효산물량을 증가시키는 유전자 usg, fodH, glpC, gnd, idnD, hyfG, ybdH, proC, hyfC, gph, sucB fnr, arcA, guaB, serA, arcB, pyrD usg, gph, hyfG, ybdH gnd
leuB, trxA, pdhR, fdnH,
nuoABCEFGHIJKLN
* 평균과 표준편차는 산화환원에 관련된 472개의 단일유전자 결실 변이 균주의 각 발효산물의 농도로 계산되었음.
결실로 인한 각 발효산물의 생산이 평균값에서 표준편차 대비 2.5배 증가하거나 감소하는 효과를 나타내는 유전자를 나타냄.

상기 표 1로부터, fnr, arcB, arcA, serA, pyrD, guaB 유전자가 각각 결실되었을 때, 혐기발효의 결과 젖산 생산이 증가하고, 상대적으로 다른 발효산물의 생성은 감소함을 확인하였다(도 3).

또한, usg, fodH, glpC, gnd, idnD, hyfG, ybdH, proC, hyfC, gph, sucB 유전자가 각각 결실되었을 때, 혐기발효의 결과 숙신산 생산이 증가하고, 상대적으로 다른 발효산물의 생성은 감소함을 확인하였고, leuB, trxA, pdhR, fdnH, nuoABCEFGHIJKLN 유전자가 각각 결실되었을 때, 혐기발효의 결과 에탄올 생산이 증가하고, 상대적으로 다른 발효산물의 생성은 감소함을 확인하였다

실시예 2: P1 transduction을 이용한 단일 유전자 결실 변이 미생물 제작 및 젖산 생성량 증가 확인

젖산 과량생산 변이 미생물로 선별된 각 단일 유전자의 혐기적 발효특성이 선별된 유전자의 결실에 의한 영향인지를 정확히 확인하기 위하여 선별된 각각의 fnr, arcA, arcB, serA, pyrD, guaB 단일 유전자 결실을 P1 transduction을 통하여 야생형 수용균주인 BW25113 (CGSC7636, The Coli Genetic Stock Center, Yale University)과 MG1655(ATCC700926, American Type Culture Collection)에 각각 도입하였고, 이를 혐기 배양하여 최종발효산물의 유기산을 분석하여 야생형 균주와 비교한 결과, 이 균주에서 젖산 생산이 증가하는 것이 각 유전자 결실로 인한 결과임을 확인할 수 있었다.

KEIO collection에서 얻은 유전자 결실변이 균주 MG1655 야생형에 변이를 도입한 경우 BW25113 야생형에 변이를 도입한 경우 야생형 12.87* 15.73# 12.00* guaB - 38.23 24.37 20.32 pyrD - 28.99 28.41 27.74 serA - 28.94 32.34 32.82 fnr - 38.65 32.96 34.69 arcB - 30.11 29.67 29.16 arcA - 27.71 21.66 27.08 도입균주에 각 유전자를 도입한 후 젖산생산량(mM)을 비교한 것임.
*야생형은 BW25113균주임.
#야생형은 MG1655균주임.

P1 transduction은 아래와 같이 수행하였다. 먼저 각 단일 유전자(fnr, arcB, arcA, serA, pyrD guaB)가 kanamycin 내성 유전자로 치환되어 있는 돌연변이 균주를 KEIO collection에서 입수하여 kanamycin이 25u㎍/㎖로 포함된 LB 고체배지에 도말하고, 자란 단일 콜로니를 0.01M MgSO4, 0.005M CaCl2를 포함한 LB 액체배지 25㎖에 접종하여 37℃에서 OD600가 0.4가 될 때까지 배양하고, P1 박테리오파지를 250㎕를 접종하여 각 돌연변이 균주를 용해시키기 위하여, 37℃에서 4시간 더 배양하였다. 배양 후 500㎕의 클로로포름을 섞어 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 용해된 세포 침전물을 제외한 상등액을 취하고, 이는 돌연변이 균주가 용해되면서 각 단일 결실 유전자형을 P1 박테리오파지에 증식되어 있는 P1 Lysate로 사용하였다.

제조된 P1 lysate를 감염시켜 유전자 결실을 도입시킬 야생형 수용균주[BW25113 (CGSC7636, The Coli Genetic Stock Center, Yale University) 및 MG1655(ATCC700926, American Type Culture Collection)]는 0.01M MgSO4, 0.005M CaCl2를 포함한 LB 액체배지에 접종하여 배양한 후 5000rpm에서 원심분리하여 배지는 제거하고, 세포침전물을 0.01M MgSO4, 0.005M CaCl2를 포함한 LB 액체배지 1㎖로 현탁시켰다.

준비된 결실유전자 P1 lysate와 유전자 결실을 도입시킬 수용균주를 100㎕씩 섞은 후, 37℃에서 20분 배양하고 1M Na+·Citrate·2H2O을 100㎕를 가하여 잘 섞어 25ug/ml 의 kanamycin이 포함된 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 배양함으로써, kanamycin 내성으로 치환된 각 유전자 결실 부분이 도입된 균주를 제조하였다.

실시예 3: 복수의 유전자 결실 변이 미생물의 제작

선별된 fnr, arcB, arcA, serA, pyrD, guaB 유전자의 복수의 결실이 젖산 생산량의 증가에 도움이 되는지를 확인하기 위해, 각 단일 유전자들의 결실 유전자형을 다른 결실 돌연변이 균주로 도입한 복수유전자 결실 돌연변이를 P1 lysate를 통한 형질도입으로 제작하였다. 이때 각 단일 결실 유전자형을 P1 lysate로 만드는 과정은 실시예 2에서 기술한 것과 동일하며, 유전자 결실을 도입시킬 수용균주를 만드는 과정은 다음과 같다. 각 단일 결실 유전자 돌연변이 균주에 pCP20(CGSC7629, The Coli Genetic Stock Center, Yale University)를 형질전환시켜 ampicillin이 50㎍/㎖ 포함된 LB 고체배지에 도말하여 상동성재조합을 유도하여 kanamycin 내성 유전자를 결실시킨 수용균주를 제작하였다. 이 수용균주는 각 단일 유전자 결실은 갖고 있지만 kanamycin 내성은 가지지 않으며, 이 수용균주에 각 P1 lysate를 통한 형질도입으로 다른 단일 결실 유전자형을 도입시켜 복수 유전자 결실 돌연변이 균주를 제작하였다.

실시예 1의 단일 유전자 결실 변이 미생물 및 실시예 3의 복수 유전자 결실 변이 미생물의 젖산 생산량 및 젖산 생산성을 도 4 및 도 5 그리고 하기 표 3에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 복수의 유전자 결실 변이 미생물의 젖산 생산량 및 생산성은 단일 결실 변이 미생물에 비하여 대체로 증가하였다. 특히, fnr과 arcB 동시 결실 변이 미생물은 젖산 생산량이 62.5 mM에 이르렀으며, 이는 야생형 대비 4.8배 증가한 것이다(도 4). 또한 pyrD와 fnr 동시 결실 변이 미생물은 생산성을 비교하면 야생형 대비 10.6배 증가하였다(도 5).

따라서 유전체수준의 단일 유전자 결실 변이 미생물로부터 탐색하여, 결실로 인한 젖산 생산량을 향상시키는 유전자들은 단일 결실뿐 아니라 복수의 결실이 되었을 경우에도 젖산 생산량이 증가함을 확인하였다.

젖산생산량
(mM)
젖산생산성
(mM/OD600)
젖산생산량
(g/L)
대당수율
(젖산(g)/포도당(g)
BW25113 12.16 (1.0) 3.08 (1.0) 1.09 (1.0) 0.12 guaB - 36.65 (3.0) 15.66 (5.1) 3.30 (3.0) 0.37 pyrD - 27.36 (2.3) 13.16 (4.3) 2.46 (2.3) 0.27 serA - 25.75 (2.1) 7.85 (2.6) 2.32 (2.1) 0.26 fnr - 34.83 (2.9) 7.91 (2.6) 3.13 (2.9) 0.35 arcB - 25.68 (2.1) 6.33 (2.1) 2.31 (2.1) 0.26 arcA - 33.54 (2.8) 12.96 (4.2) 3.02 (2.8) 0.34 guaB - , serA - 38.07 (3.1) 20.51 (6.7) 3.43 (3.1) 0.38 guaB - , pyrD - 41.58 (3.4) 19.03 (6.2) 3.74 (3.4) 0.42 pyrD - , serA - 29.58 (2.4) 12.61 (4.1) 2.66 (2.4) 0.30 serA - , fnr - 40.82 (3.4) 17.72 (5.8) 3.67 (3.4) 0.41 serA - , arcA - 34.11 (2.8) 10.80 (3.5) 3.07 (2.8) 0.34 pyrD - , fnr - 53.49 (4.4) 32.75 (10.6) 4.81 (4.4) 0.53 pyrD - , arcA - 34.56 (2.8) 17.31 (5.6) 3.11 (2.8) 0.35 fnr - , arcA - 58.65 (4.8) 14.65 (4.8) 5.28 (4.8) 0.59 fnr - , arcB - 62.47 (5.1) 16.33 (5.3) 5.62 (5.1) 0.62 괄호안은 야생형 균주 대비 증가량을 나타낸 것임.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (26)

  1. 미생물의 산화환원효소 유전자중 아미노산 및 핵산 생합성 대사경로에 관여하는 이노신-5-인산 탈수소효소(inosine-5-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(guaB), 포스포글리세레이트 탈수소효소(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(serA) 다이하이드로오로테이트 탈수소효소(dihydroorotate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(pyrD)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 푸마르산-질산 환원효소전사 조절인자(Fumarate nitrate reductase transcriptional regulator)를 코딩하는 유전자(fnr), 호기호흡조절 반응조절인자(aerobic respiration control response regulator)를 코딩하는 유전자(arcA) 호기호흡조절 센서 인산화효소(aerobic respiration control sensor kinase)를 코딩하는 유전자(arcB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 추가로 약화 또는 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 장내 세균인 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 장내 세균은 대장균 속 (Escherichia sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 예시니아 속(Yersinia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 크렙시앨라 속(Klebsiella sp.), 및 프로테우스 속(Proteus sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물.
  5. 미생물에서, 미생물의 산화환원효소 유전자중 아미노산 및 핵산 생합성 대사경로에 관여하는 이노신-5-인산 탈수소효소(inosine-5-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(guaB), 포스포글리세레이트 탈수소효소(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(serA) 및 다이하이드로오로테이트 탈수소효소(dihydroorotate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자(pyrD)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 푸마르산-질산 환원효소전사 조절인자(Fumarate nitrate reductase transcriptional regulator)를 코딩하는 유전자(fnr), 호기호흡조절 반응조절인자(aerobic respiration control response regulator)를 코딩하는 유전자(arcA) 및 호기호흡조절 센서 인산화효소(aerobic respiration control sensor kinase)를 코딩하는 유전자(arcB)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 약화 또는 결실시키는 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 미생물은 장내 세균인 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 장내 세균은 대장균 속 (Escherichia sp.), 살모넬라 속 (Salmonella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 예시니아 속(Yersinia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 크렙시앨라 속(Klebsiella sp.), 및 프로테우스 속(Proteus sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 젖산 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항의 변이 미생물을 배양하여 젖산을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 젖산을 회수하는 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배양은 35~45℃의 온도, 6.0~7.5의 pH, 질소 또는 질소를 포함하는 공기가 공급된 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 젖산의 제조방법.
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