KR101463303B1 - 혈청 아밀로이드 ａ 생성 저해제 또는 포밀펩타이드 수용체 ２ 활성 조절제를 포함하는 거품세포 형성 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈청 아밀로이드 A 억제제 또는 포밀펩타이드 수용체 2 활성 조절제를 포함하는 거품세포 형성 억제용 약학적 조성물 및 이를 이용하여 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 이용하여 거품세포 형성을 효과적으로 억제할 수 있다. 이 때 백일해 독소 민감형 G 단백질 의존적 신호 전달 경로에 영향을 주지 않아 부작용을 최소화시킬 수 있다. 거품세포 형성은 죽상동맥경화증의 병인론에서 결정적인 단계에 해당한다. 따라서 본 발명의 조성물은 죽상동맥경화증을 비롯한 거품세포 형성과 관련된 질병들을 치료 및 예방하는데 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

혈청 아밀로이드 Ａ 생성 저해제 또는 포밀펩타이드 수용체 ２ 활성 조절제를 포함하는 거품세포 형성 억제용 약학적 조성물{Composition inhibiting form cell formation comprising serum amyloid A synthesis inhibitors or formyl peptide receptor 2 activity modulators}

본 발명은 혈청 아밀로이드 A 억제제 또는 포밀펩타이드 수용체 2 활성 조절제를 포함하는 거품세포 형성 억제용 약학적 조성물 및 이를 이용하여 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

죽상동맥경화증(atheroscleorsis)은 주로 혈관의 가장 안쪽을 덮고 있는 내막(endothelium)에 콜레스테롤이 침착하고 내피세포의 증식이 일어난 결과 ‘죽종(atheroma)’이 형성되는 혈관질환을 말한다. 죽종 내부는 죽처럼 묽어지고 그 주변 부위는 단단한 섬유성 막인 ‘경화반’으로 둘러싸이게 되는데, 경화반이 불안정하게 되면 파열되어 혈관 내에 혈전(thrombus; 피떡)이 생긴다. 또한 죽종 안으로 출혈이 일어나는 경우 혈관 내부의 지름이 급격하게 좁아지거나 혈관이 아예 막히게 되고, 그 결과 말초로의 혈액순환에 장애가 생긴다.

죽상동맥경화증은 만성적인 염증성 질병으로서, 단핵구/대식세포, 평활근세포 등의 염증과 관련된 세포들이 발병에 관여하는 것으로 보고되어 있다. 순환 단핵구는 케모카인(C-C 모티프) 리간드 2(chemokine (C-C motif) ligand, CCL2)에 반응하여 혈관 내막 부위로 이주하며, 그곳에서 대식세포 콜로니 자극 인자에 의해 자극을 받아 대식세포로 분화된다. 대식세포가 변형된 저밀도 지단백(modified Low Density Lipoprotein)을 포식하면 거품세포(foam cell)를 형성한다. 거품세포는 다양한 성장인자 및 TNF-α 등 전염증성 매개 인자들을 생산한다. 이러한 염증 매개 인자들은 평활근세포의 증식을 유도하여 플라그(plaque)를 형성하도록 하며, 이는 죽상동맥경화증으로 이어진다.

TLR2, TLR4, TLR9 등 몇몇 Toll-like receptors(TLRs)가 거품세포 생성에 관여하며, TLR 리간드인 Pam3c, LPS, CpG 등이 독립적으로 대식세포가 거품세포가 되도록 자극할 수 있다는 사실이 보고된 바 있다. 그러나 TLR을 타겟으로 하는 치료제의 경우 부작용으로 면역반응을 유발할 우려가 있다는 단점이 있다.

대식세포가 포식하는 변형된 LDL의 형태로는 산화된 LDL(oxidized LDL, oxLDL)이나 집락을 이룬 LDL(aggregated LDL) 등이 있다. 이 때 lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1(LOX-1), CD36, SR-A 등 몇몇 스캐빈저 수용체가 핵심적인 역할을 한다. 이들 중, LOX-1은 oxLDL 포식에 있어서 주된 스캐빈저 수용체이며, LOX-1 발현은 몇몇 염증 신호에 의해서 상향 조절된다(Liang M, Zhang P, Fu J. Up-regulation of LOX-1 expression by TNF-alpha promotes trans-endothelial migration of MDA-MB-231 breast cancer cells. Cancer Lett . 2007; 258:31-37.). LPS 등 TLR에 특이적인 리간드로 대식세포를 자극하면 LOX-1 발현이 유도된다.

혈청 아밀로이드 A(serum amyloid A, SAA)는 염증반응의 주된 급성기 단백질로서, 감염 또는 손상이 있는 경우에 혈중으로 방출된다. SAA는 인터루킨(IL)-1β 또는 TNF-α 등 몇몇 전염증성 사이토카인이 간세포를 자극하면 방출되며(Jensen LE, Whitehead AS. Regulation of serum amyloid A protein expression during the acute-phase response. Biochem J. 1988; 334:489-503.), 순환 SAA 수치는 급성 염증기 반응이 있을 경우에 평상시보다 약 1000배 상승한다. SAA는 사이토카인의 성질을 가지는 동시에 면역 조절 기능도 한다. SAA는 류마티즘에서 활액세포(rheumatoid synoviocyte), 장 내피세포, 단핵구, 호중구 등 여러 종류의 세포들에서 전염증성 사이토카인 및 케모카인 생산을 유도한다. FPR2, TLR2, TLR4, P2X7 등 다양한 세포 표면 수용체가 SAA에 대한 수용체로서 작용한다.

순환 SAA 수치는 죽상동맥경화증 환자에 있어서 유의성 있게 상승하는 경향을 보이는데, 이것이 죽상동맥경화증의 근본적 원인인 심혈관 질병으로 인한 결과인지, 아니면 SAA가 죽상 동맥경화증 발병을 촉진시키는 원인인지는 정확히 밝혀져 있지 않다.

본 발명자들은 부작용을 유발하지 않으면서도 죽상 동맥경화증을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제에 대해 연구하던 중, SAA가 FPR2 의존적 신호전달 경로를 통해 거품세포 형성을 직접적으로 유발한다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 혈청 아밀로이드 A 생성 저해제 또는 포밀펩타이드 수용체 2 활성 조절제를 포함하는 거품세포 형성 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이 조성물을 투여하여 죽상동맥경화증을 예방 또는 치료할 수 있다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 혈청 아밀로이드 A(Serum amyloid A, SAA)생성 저해제를 포함하는 거품세포(foam cell) 형성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 혈청 아밀로이드 A와 고밀도 지단백(High Density Lipoprotein, HDL)의 포합(conjugation)을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 포밀펩타이드 수용체 2(Formyl Peptide Receptor 2, FPR2)에 작용하는 리간드를 포함하는 거품세포 형성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 포밀펩타이드 수용체 2 리간드는 포밀펩타이드 수용체 2 차단제(blocker), 포밀펩타이드 수용체 2 길항제(antagonist), 또는 포밀펩타이드 수용체 2 활성 조절제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 포밀펩타이드 수용체 2 길항제는 WRW⁴인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 포밀펩타이드 수용체 2의 mRNA에 대한 안티센스 RNA(antisense RNA), siRNA(small interfering RNA), amiRNA(artificial micro RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 이들을 생성할 수 있는 RNA로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA를 포함하는, 거품세포 형성 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 백일해 독소 민감형 G 단백질 의존적 신호전달 경로(Pertussis toxin sensitive G protein-dependent signaling pathway)에 영향을 주지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 JNK(c-Jun N-terminal kinases) 의 발현 또는 활성화를 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 NF-κB(nuclear factor kappa B)의 발현을 증가시키고, LOX-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물을 개체에 투여하여 거품세포 형성을 억제할 수 있고, 죽상동맥경화증(atherosclerosis)을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 개체란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 약제학적 유효량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러 번에 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적 수용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 다양한 약제학적 제형으로 제조될 수 있다. 그러나 제제의 형태에는 제한이 없다.

본 발명의 조성물은 혈청 아밀로이드 A 생성 저해제 또는 포밀펩타이드 수용체 2 활성 조절제를 포함하여 거품세포 형성을 효과적으로 억제할 수 있다. 이 때 백일해 독소 민감형 G 단백질 의존적 신호 전달 경로에 영향을 주지 않아 부작용을 최소화시킬 수 있다. 거품세포 형성은 죽상동맥경화증의 병인론에서 결정적인 단계에 해당한다. 따라서 본 발명의 조성물은 죽상동맥경화증을 비롯한 거품세포 형성과 관련된 질병들을 치료 및 예방하는데 중요하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 SAA, LPS로 자극시에 거품세포 형성이 증가함을 보여주는 현미경 사진이다.
도 2는 SAA로 자극시 오일 레드 오에 염색된 세포의 수가 증가했음을 보여주는 그래프이다.
도 3은 SAA로 자극시 오일 레드 오에 염색된 세포의 수가 증가했음을 보여주는 그래프이며, polymyxin B를 사용하여 실험을 수행하였다.
도 4는 SAA자극 1시간 후 LOX-1 mRNA 발현이 크게 증가되었고, 자극 3시간 후에 LOX-1 단백질 생산이 크게 증가되었음을 보여주는 도이다.
도 5는 Raw264.7세포에 SAA를 처리한 경우 NF-κB 의존적 루시퍼라제 활성이 크게 증가되었음을 보여주는 도이다.
도 6은 Raw264.7세포를 NF-κB 결합부위에 대한 double stranded decoy oligonucleotide(ds decoy ODN)로 형질감염시킨 경우, scrambled NF-κB decoy ODN을 형질감염시켰을 때에 비해 SAA에 의해 유도된 LOX-1 발현이 크게 저해되었음을 보여주는 도이다.
도 7은 WT, TLR2 KO, 또는 TLR4 mutant(C3He/J) 마우스로부터 채취한 골수 유래 대식세포를, LDL 존재 하에 LPS(TLR4 agonist), Pam3CSK4 (TLR2 agonist), 또는 SAA로 자극한 경우 거품세포 형성을 관찰한 도이다.
도 8은 Raw264.7 세포를 FPR2 antagonist로 처리한 경우의 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 mFPR2 siRNA를 형질감염시킨 경우, Raw264.7 세포에서 FPR2 발현 수치가 크게 감소되었고, SAA에 의해 매개된 거품세포 형성이 저해됨을 나타낸 도이다.
도 10은 Raw264.7 세포에 SAA를 처리한 후 ERK, p38 MAPK, JNK의 인산화가 일어나는 시간을 관찰한 도이다.
도 11은 Raw264.7 세포를 PD98059, SB203580, 또는 SP600125 처리하여 배양한 후 SAA를 처리한 경우, 각 MAPK 저해제의 효과를 나타낸 도이다.
도 12는 Raw264.7 세포를 PTX와 함께 전배양한 후 SAA로 자극시 거품세포 형성에 미치는 효과를 확인한 도이다.
도 13은 Raw264.7 세포를 PTX와 함께 전배양하고 SAA로 자극한 후, 항-phospho-ERK, 항-phospho-38 MAPK, 항-phospho-JNK 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행하여 kinase의 인산화를 확인한 도이다.
도 14는 Raw264.7세포를 FPR2 antagonist WRW⁴와 함께 15분 동안 전배양한 후 SAA를 처리한 경우, SAA에 의해 유도된 LOX-1 발현이 저해됨을 나타낸 도이다.
도 15는 mFPR2 siRNA를 사용하여 mFPR2를 녹다운시킨 경우에 SAA 자극에 의해 유도된 LOX-1 발현이 저해됨을 나타낸 도이다.
도 16은 Raw264.7 세포를 PTX로 전배양한 경우에, SAA에 의해 유도된 LOX-1 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 17은 JNK 저해제인 SP600125가 SAA에 의해 유도되는 LOX-1 발현에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 18은 Raw264.7 세포를 SAA, HDL을 포함하는 apoA-I(apo HDL), SAA를 포함하는 HDL(SAA-HDL)로 각각 자극한 경우 거품세포 형성을 관찰해 비교한 도이다.
도 19는 Raw264.7 세포를 SAA, HDL을 포함하는 apoA-I(apo HDL), SAA를 포함하는 HDL로 자극한 후 웨스턴 블로팅으로 LOX-1 발현을 측정하여 비교한 도이다.
도 20은 죽상동맥경화증 환자와 건강한 사람의 PBMC에서 RT-PCR을 통해 얻은 FPR1, FPR2, FPR3, actin 수치를 나타내는 도이다.
도 21은 죽상동맥경화증 환자의 경동맥 플라그 및 정상 비장동맥에서 FPR2의 발현을 확인한 도이다.

실험에 사용한 재료의 구입처는 다음과 같다.

재조합 인간 SAA(product#300-13, E. coli에서 제조, 내독소 함량 < 0.1 ng/μg)는 Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA)로부터 구입하였다. 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS)과 DMEM 배지는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입하였다. NaLDL, LPS, Pam3CSK4은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. PTX, PD98059, SB203580, SP600125은 Calbiochem (San Diego, CA, USA)로부터 구입하였다. 모든 phosphor-MAPK에 대한 항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)로부터 구입하였고, 항-LOX1 항체는 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다. HRP에 포합된 항 토끼 IgG 항체 및 항 마우스 IgG 항체는 Kirkegaard & Perry (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였고, HRP에 포합된 항 염소 IgG 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.

실험 결과는 평균 ± SE로 나타내었다. 개인 처치와 각각의 대조 값과 비교하기 위해 Student’t-test를 수행하였다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 골수 유래 대식세포의 배양 및 분리

Raw264.7 세포를 열로 불활성화시킨 소태아혈청을 10% 첨가한 DMEM 배지에서 표준 배양 조건(습조건, 95% 공기, 5% CO₂, 37℃)하에 배양하였다.

5-8주령의 야생형마우스(WT C57BL/6), TLR2 KO 마우스(C57BL/6 기반), 또는 TLR4 변이 마우스(C3H/HeJ) 의 대퇴골과 경골을 차가운 PBS로 세척하여 골수 세포들을 분리하였다. 분리된 세포들에 포함된 적혈구를 용해시키고, 골수의 조혈모세포(bone marrow progenitor cell)을 10% FBS를 첨가한 α-MEM에서 100mm 세포배양접시에 배양하였다. 다음날 현탁시킨 세포를 채취하여 PBS로 세척하였다. 채취된 세포를 30ng/ml M-CSF를 첨가한 FBS를 10% 첨가한 α-MEM 배지에서 표준 배양 조건하에 3일간 배양하였다. 부착되지 않은 세포들을 제거하고, 10% FBS를 첨가한 α-MEM 배지에 30ng/ml의 M-CSF를 추가한 배지에서 2-3일간 배양하였다.

실시예 2. SAA 가 거품세포 형성을 유발하는지 여부 확인

2-1. SAA 에 의한 거품세포 형성 관찰

실시예 1에서 얻은 Raw264.7 세포와 골수 유래 대식세포(1X10⁴)를 96 well plate에 분주하여 밤새 배양하였다. 세포들을 LDL(50μg/ml)에 비히클(vehicle), SAA, 또는 LPS를 첨가한 조성물로 24시간 동안 자극했다. PBS로 세포들을 세척한 후에 10분동안 상온에서 4% 포름알데히드에 고정시켰다. 증류수로 3회 세척한 후에, 고정된 세포들을 오일 레드-오 용액으로 20분간 염색했다. 염색된 세포들은 광현미경으로 검출하여 전체 세포 수와 거품세포의 수를 계산하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였고, 양성 대조군으로, LPS와 LDL를 처리하였다. 결과는 mean ± SE로 나타내었다. 도면에서 *p < 0.05, **p < 0.01. ns: not significant를 의미한다.

도 1은 SAA, LPS로 자극시에 거품세포 형성이 증가함을 보여주는 현미경 사진이다. NT는 no treatment를 나타낸다. 도 2는 SAA로 자극시 오일 레도 오에 염색된 세포의 수가 증가했음을 보여주는 그래프이다. 0.1μM 농도의 SAA 처치시에 오일 레드 오에 염색된 세포 수가 크게 증가하였다.

2-2. polymyxin B 처리

재조합 SAA를 Escherichia coli로부터 제조했기 때문에, LPS에 의한 오염이 실험 결과에 영향을 줄 것을 방지하기 위해 강력한 LPS 억제제인 polymyxin B를 사용하여 실험을 수행하였다. polymyxin B가 외재적으로 첨가되었을 수 있는 LPS에 의한 거품세포 형성을 억제했기 때문에, SAA에 의한 거품세포 형성 효과는 영향을 받지 않았다(도 3)

실시예 3. SAA 가 LOX -1의 발현을 증가시키는지 여부를 확인

SAA가 lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1 (LOX-1) 와 MAPKs를 발현, 활성화 시키는지 여부를 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

3-1. SAA 자극 후 LOX -1 mRNA 량 측정

Raw264.7 세포(1 X 10⁶)를 SAA로 자극하였다. 총 RNA를 Trizol 용매(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 분리하였고, 총 RNA 1μg을 Bioneer Reverse Transcriptase System의 cDNA 템플릿으로 사용하였다. 이 때 사용한 프라이머의 서열은 다음과 같다.

LOX-1: sense, 5′-AGGTCCTTGTCCACAAGACTGG-3′(서열번호 1)

antisense, 5′-ACGCCCCTGGTCTTAAAGAATTG-3′(서열번호 2)

actin: sense, 5′-TTCTTTGCAGCTCCTTCGTTGCCG-3′(서열번호 3)

antisense, 5′-TGGATGGCTACGTACATGGCTGGG-3′(서열번호 4)

hFPR1: sense, 5′-CTCCAGTTGGACTAGCCACA-3′(서열번호 5)

antisense, 5′-CCATCACCCAGGGCCCAATG-3′(서열번호 6)

hFPR2: sense, 5′-CTGCTGGTGCTGCTGGCAAG-3′(서열번호 7)

antisense, 5′-AATATCCCTGACCCCATCCTCA-3′(서열번호 8)

hFPR3: sense, 5′-GCCAAGGTCTTTCTGATCC-3′(서열번호 9)

antisense, 5′-GGTCTGGGCTGAGTCAGGGA-3′(서열번호 10)

cDNA를 사용하여 각각 94℃(변성, 30초), 55-65℃(풀림, 30초), 72℃(연장, 30초)로 이루어지는 한 싸이클을 35회 수행하였다. 이렇게 해서 얻은 PCR 산물은 1.5 agarose 젤에 전기영동하고 ethidium bromide 염색으로 관찰하였다.

3-2. SAA 자극 후 LOX -1 단백질량 측정

Raw 264.7 세포들을 SAA로 수회 자극하였다. 그 후 세포들을 용해 버퍼(20mM HEPES[pH7.2], 10% 글리세롤, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 50mM NaF, 1mM Na3VO4, 10μg/ml aprotinin, 1mM PMSF)로 용해시켰다. 계면활성제에 용해되지 않는 물질들은 12,000x g, 4℃에서 10분간 원심분리를 통해 펠렛화시켰다. 그리고 용해된 상등액을 취해 즉시 웨스턴 블로팅을 실시하였다. 단백질을 10% SDS-polyacrylamide 겔에 분리시키고 nitrocellose 막으로 블로팅하였다. 이어서 그 막을 1:5000으로 희석한 goat anti-rabbit IgG 항체 및 horseradish peroxidase와 함께 배양시키고, 형성된 항원- 항체 복합체를 증강된 chemiluminescence로 확인하였다.

SAA자극 1시간 후 LOX-1 mRNA 발현이 크게 증가되었고, 자극 3시간 후에 LOX-1 단백질 생산이 크게 증가되었다(도 4).

3-3. SAA 자극에 의해 LOX -1 발현이 유도될 때 NF -κB가 활성화 되는지 여부 확인

기존의 논문에 LPS에 의해 LOX-1 발현이 NF-κB 활성화에 의한 신호전달에 의존한다고 보고되어 있기 때문에, SAA에 의해 LOX-1 발현이 유도될 때에도 NF-κB 활성화가 일어나는지 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

(1) 루시퍼라제 어세이

NF-κB 리포터 플라스미드는 Clontech(Palo Alto, CA, USA)로부터 구입하였다. Raw264.7 세포들에 2μg의 NF-κB 리포터 플라스미드를 Lipofectamine 방법(Invitrogen)을 사용하여 형질감염(transfection)시켰다. 형질감염 후에, 1μM의 SAA로 세포들을 24시간 동안 자극시켰고, 그 후 용해 버퍼로 용해시켰다. 세포 용해물 5μl를 25μl의 루시퍼라제 활성 어세이 용매와 함께 혼합하였고, Luminoskan(Labsystems)를 사용하여 발광을 5초간 측정하였다. 실험은 3회 반복하여 수행되었으며, 결과는 평균±SE 값으로 나타내었다. ***는 p<0.001을 의미한다.

NF-κB 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 형질감염시킨 세포에 SAA를 처리하자, NF-κB 의존적 루시퍼라제 활성이 크게 증가되었다(도 5).

(2) NF -κB 결합부위에 대한 decoy ODN 감염

NF-κB 결합부위에 대한 phophorothionate 이중쇄 decoy ODN의 서열은 다음과 같다.

5′-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3′(서열번호 11)

3′-GGAACTTCCCTAAAGGGAGG-5′(서열번호 12)

scrambled NF-κB ODN 의 서열은 다음과 같다.

5′-TTGCCGTACCTGACTTAGCC-3′(서열번호 13)

3′-AACGGCATGGACTGAATCGG-5′(서열번호 14)

ODN을 온도를 80℃에서 25℃로 낮추면서 2시간 동안 단쇄로 풀었다(annealing). 세포들(3 x 10⁵ )을 24-well plate에 분주하여 밤새 배양하였다. 세포들에 lipofectamine 2000 용매를 사용하여 NF-κB decoy ODN과 scrambled NF-κB ODN 0.2 μg씩을 형질감염시켰다.

Raw264.7세포를 NF-κB 결합부위에 대한 double stranded decoy oligonucleotide(ds decoy ODN)로 형질감염시킨 경우, scrambled NF-κB decoy ODN을 형질감염시켰을 때에 비해 SAA에 의해 유도된 LOX-1 발현이 크게 저해되었다(도 6). 이를 통해 SAA에 의해 유도된 LOX-1 발현에 있어 NF-κB 활성화가 필수적임을 알 수 있었다.

실시예 4. SAA 에 의한 거품세포 형성이 FPR2 의존적인지 여부 확인

4-1. SAA 에 의한 죽상동맥경화증의 발병과 관련이 있는 수용체 확인

SAA가 TLR2, TLR4, FPR2를 비롯한 다수의 세포 표면 수용체들에 작용하므로, 그 중 어떤 수용체가 SAA에 의해 유도되는 거품세포 형성에 관여하는지 조사하기 위해 하기의 실험을 수행하였다. 실험은 3회 반복하였으며, 결과는 평균±SE 값으로 나타내었다. *p는 <0.05, **p는 <0.01, ***는 p<0.001을 의미한다.

(1) WT , TLR2 KO , 또는 TLR4 mutant ( C3He /J) 마우스에서 채취한 골수 유래 대식세포에서의 실험

SAA에 의해 유도되는 거품 세포 형성에 TLR2 또는 TLR4의 역할을 시험하기 위해서, 골수 유래 대식세포를 WT, TLR2 KO, 또는 TLR4 mutant(C3He/J) 마우스로부터 채취하였고, LDL 존재 하에 LPS(TLR4 agonist), Pam3CSK4 (TLR2 agonist), 또는 SAA로 24시간 동안 자극하였다. 오일 레드 오에 염색된 모든 세포들의 수를 계수하였다. 그 결과, LPS에 의해 거품세포 형성이 유도되었으며, Pam3CSK4이 TLR4 mutant 마우스 또는 TLR2 KO 마우스로부터 유래된 대식세포에서 각각 감소하였고, WT 마우스에서는 감소하지 않았다(도 7). 이 경우, SAA에 의해 유도된 거품세포 형성은 TLR2 녹아웃(KO) 마우스, TLR4 mutant 마우스로부터 얻은 대식세포에서는 영향을 받지 않았다.

(2) Raw264 .7 세포를 FPR2 antagonist 로 처리한 경우의 효과

Raw264.7 세포를 0, 10, 30, 60μM의 WRW⁴로 각각 전처리한 후, LDL 존재 하에 SAA로 24시간 동안 처리하였다^.. FPR2 antagonist WRW⁴는 SAA에 의해 유도된 Raw264.7세포의 거품세포 형성을 농도 의존적으로 감소시켰다(도 8).

이 결과로부터 FPR2가 SAA에 의해 유도되는 거품세포 형성에 관여한다는 것을 알 수 있었다.

4-2. SAA 에 의한 죽상동맥경화증의 발병시, FPR2 의 역할 확인

SAA에 의해 유도된 거품세포 형성에 있어 FPR2의 역할을 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

Raw264.7 세포에 FPR2 siRNA(Invitrogen)를 최종 농도가 1μM이 되도록 하여 형질감염시키고, 대조군 세포에는 루시퍼라제 siRNA만을 형질감염시켰다. 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 용매로 사용하였다. 세포들을 형질 감염 혼합물과 함께 무혈청 배지에서 6시간 동안 배양하고, 배지를 10% FBS를 포함하는 DMEM으로 교체한 후 48시간 동안 배양하였다.

mFPR2 siRNA를 형질감염시킨 경우, Raw264.7 세포에서 FPR2 발현 수치가 크게 감소되었고, SAA에 의해 매개된 거품세포 형성이 저해되었다(도 9). 반면에 LPS에 의해 거품세포 형성이 유도되는 경우 mFPR2 녹다운에 영향을 받지 않았다. 이는 SAA가 거품세포 형성을 유발할 때 신호 전달이 FPR2를 통해 이루어진다는 것을 의미한다.

실시예 5. SAA 에 의해 유도된 거품세포 형성이 PTX 의존적인지 여부 확인

SAA가 FPR2에 결합한 후에 일어나는 세포내 신호 전달에 대해 밝히고자 하기의 실험을 수행하였다.

5-1. SAA 에 의해 거품세포 형성이 유도될 때, 각각의 MAPK 의 작용을 확인

ERK, p38 MAPK, JNK 등 MAPK들은 다양한 세포에서 세포외 신호를 핵으로 전달하는 역할을 한다.

(1) 각 MAPK 의 발현 시간 관찰

Raw264.7 세포를 1μM의 SAA로 처리한 후 각 MAPK의 발현을 관찰하였다. SAA는 ERK, p38 MAPK, JNK의 인산화를 크게 증가시키는데, ERK 인산화는 초기에(2-5분), p38 MAPK와 JNK는 10~30분의 시간 경과 후에 유도된다는 차이가 있다(도 10).

(2) 각 MAPK 에 대한 저해제 처리

SAA에 의해 거품세포 형성이 유도될 때, 각각의 MAPK의 작용을 확인하기 위해서, Raw264.7 세포를 PD98059(선택적인 MEK 저해제) 50μM로 60분 동안, SB203580(선택적인 p38 MAPK 저해제)20μM로 15분 동안, 또는 SP600125(선택적인 JNK 저해제) 20μM로 15분 동안 처리하여 배양하였다. 그 후 SAA를 처리하였다. SAA에 의해 유도된 거품세포 형성은 SP600125에 의해 크게 저해되었으나, PD98059 또는 SB203580에 의해서는 저해되지 않았다. 이는 JNK가 SAA에 의해 유도된 거품세포 형성에 필수적이라는 것을 의미한다(도 11).

5-2. PTX - sensitive Gαi 단백질이 SAA 에 의해 유도된 거품세포 형성에 관여하는지 여부 확인

WKYMVm 및 MMK-1과 같은 FPR2 리간드는 Gαi heterotrimeric G 단백질을 통한 신호 전달에 의해 유도된다. 더 나아가 백일해 독소(PTX) 민감성 G-단백질은 화학주성 이동 등 SAA 수용체에 의해 유도된 세포 반응을 유도한다.

따라서, PTX-sensitive Gαi 단백질이 SAA에 의해 유도된 거품세포 형성에 관여하고 있는지 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였으며, 결과는 ±SE로 나타내었다. **은 p<0.01, ***은 p<0.001을 의미한다.

(1) PTX - sensitive G- protein 이 SAA 에 의해 유도된 거품세포 형성에 미치는 영향 확인

Raw264.7 세포를 100ng/ml의 PTX와 함께 또는 PTX 없이 24시간 동안 전배양한 후, LDL 또는 oxLDL 존재 하에 SAA 또는 LPS로 24시간 동안 자극하였다. 오일 레드 오로 세포를 염색한 후, 염색된 세포들을 계수하였다. PTX는 SAA에 의해 유도된 거품세포 형성에 영향을 미치지 않았다(도 12). 이는 SAA에 의한 FPR2를 통한 거품세포 형성은 Gαi-protein에 독립적인 경로로 일어남을 의미한다.

(2) PTX - sensitive G- protein 이 SAA 에 의해 유도되는 MAPK 인산화에 미치는 영향

Raw264.7 세포를 100ng/ml의 PTX와 함께 또는 PTX 없이 24시간 동안 전배양한 후, 1μM의 SAA로 24시간 동안 자극하였다. 그 후 항-phospho-ERK, 항-phospho-p38 MAPK, 항-phospho-JNK 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 수행하여 kinase의 인산화를 확인하였다.

PTX는 SAA에 의해 유도되는 ERK와 p38 MAPK의 인산화를 완전히 차단하였다. 그러나 SAA에 의해 유도된 JNK 인산화는 PTX에 의해 영향을 받지 않았다(도 13). 이로부터 JNK 인산화가 SAA에 의해 유도된 거품세포 형성에 중요하며, PTX-insensitive G protein에 의해 조절된다는 것을 알 수 있다.

실시예 6. SAA 에 의해 유도된 LOX -1 발현이 PTX - insensitive FPR2 에 의해 매개되는지 여부 확인

실시예 4 및 5에서 SAA에 의해 유도된 거품세포 형성은 FPR2 의존적이고 JNK에 의해 매개되는 PTX-insensitive 신호전달 경로에 의해 일어난다는 것을 알았기 때문에, 우리는 SAA에 의해 유도된 LOX-1 발현도 마찬가지 경로로 일어나는지 확인하고자 하였다.

6-1. FPR2 antagonist WRW ⁴ 가 SAA 에 의해 유도된 LOX -1 발현에 미치는 영향 확인

Raw264.7세포를 FPR2 antagonist WRW⁴와 함께 15분 동안 전배양한 후 SAA를 처리한 경우, SAA에 의해 유도된 LOX-1 발현이 크게 저해되었다(도 14). mFPR2 siRNA를 사용하여 mFPR2를 녹다운시킨 경우에도 역시 6시간 동안의 SAA 자극에 의해 유도된 LOX-1 발현이 크게 저해되었다(도 15).

이 결과는 FPR2가 대식세포에서 SAA에 의해 유도된 LOX-1 발현을 매개함을 의미한다.

6-2. PTX 가 SAA 에 의해 유도된 LOX1 발현에 미치는 영향 확인

Raw264.7 세포를 100ng/ml의 PTX와 함께 또는 PTX 없이 24시간 동안 전배양한 후, SAA 로 6시간 동안 자극하였다. Raw264.7 세포를 PTX로 전배양한 경우에, SAA에 의해 유도된 LOX-1 발현이 영향을 받지 않았다(도 16). 이로부터 SAA가 PTX-sensitive G-protein에 의한 신호 전달 경로와 다른 경로로 거품 세포 형성을 유도하고 LOX-1 발현을 유도함이 명백하다.

6-3. JNK 저해제가 SAA 에 의해 유도된 LOX -1 발현에 미치는 영향 확인

Raw264.7 세포들을 0, 0.1, 1, 4, 10μM의 SP600125로 각각 처리한 후, SAA로 6시간 동안 자극하였다.

JNK 저해제인 SP600125는 SAA에 의해 유도되는 LOX-1 발현을 농도 의존적으로 저해함을 확인하였다(도 17).

실시예 6-1~6-3의 결과를 종합할 때, SAA가 FPR2에 결합한 후 PTX-insensitive 신호전달이 일어나고 JNK 활성화가 일어나게 되는 경로가, SAA에 의해 유도되는 LOX-1 발현과 거품세포 형성에 필수적임을 알 수 있다.

실시예 7. reconstituted HDL 및 HDL 로 포합된 SAA 가 거품세포 형성에 미치는 영향 확인

실제 죽상동맥경화증 발병시에는 SAA 가 HDL에 포합(conjugation)된다는 논문 보고가 있으므로(Abbas A, Fadel PJ, Wang Z, Arbique D, Jialal I, Vongpatanasin W. Contrasting effects of oral versus transdermal estrogen on serum amyloid A (SAA) and high-density lipoprotein-SAA in postmenopausal women. Arterioscler Thromb Vasc Biol.2004;24:e164-e167.), SAA-HDL(HDL conjugated SAA)도 거품세포 형성을 자극하는지 실험하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 실시하였고, 결과는 ±SE 값으로 나타내었다. ***는 p<0.001을 의미한다.

7-1. reconstituted HDL 및 HDL 로 포합된 SAA 의 합성

pET30 발현시스템(Novagen, Madison, WI, USA) 및 기존 논문(Cho KH, Jonas A. A key point mutation (V156E) affects the structure and functions of human apolipoprotein A-1. J Biol Chem. 2000;275:26821-26827.)에서 보고된 대로, 사람 아포지단백 A-I(apoA-I)를 Ni^{2 +} -nitrilotracetic acid 칼럼 크로마토그래피를 이용해 발현시키고 정제하였다. POPC:콜레스테롤:apoA-I:소디움 콜레이트를 몰비를95:5:1:150로 하여 소디움 콜레이트 투석하였고, Discoidal reconstituted HDL을 정제된 apoA-I(최소 95% 순도)와 함께 얻었다. POPC: 콜레스테롤: apoA-I: SAA:

소디움 콜레이트를 몰비를 95: 5: 1: 1: 150로 해서 소디움 콜레이트 투석하였고, HDL-SAA를 apoA-I, SAA와 함께 얻었다.

시판되는 테스트 키트(BioWhittaker, Walkersville, MD, USA)를 사용하여 내독소량을 정량했을 때, 모든 종류의 HDL은 비슷한 수준의 낮은 잔류 내독소 수치를 보였다(3.1.3 EU/mL).

7-2. reconstituted SAA 및 SAA - HDL 이 거품세포 형성에 미치는 영향

(1) 거품세포 형성 확인

Raw264.7 세포를 SAA, HDL을 포함하는 apoA-I(apo HDL), SAA를 포함하는 HDL(SAA-HDL)로 각각 24시간 동안 자극하였다. 오일 레드 오로 세포를 염색한 후 계수하였다. SAA와 HDL-conjugated SAA가 모두 거품세포 형성을 유도했으나, apo-HDL 단독으로는 거품세포 형성을 자극하지 않았고, SAA-HDL이 40% 덜 효과적이었다(도 18).

(2) LOX -1 발현 확인

Raw264.7 세포를 SAA, HDL을 포함하는 apoA-I(apo HDL), SAA를 포함하는 HDL로 각각 6시간 동안 자극하였다. 그 후 웨스턴 블로팅으로 LOX-1 발현을 측정하였다.

마찬가지로, HDL 단독으로는 LOX-1 발현을 자극하지 않았고, SAA-HDL은 LOX-1 발현을 자극했으나, SAA의 50%의 효과를 나타내었다(도 19).

이 결과는 SAA가 죽상동맥경화증에서 HDL의 보호적 작용을 방해한다는 것을 암시한다. HDL은 ATP-binding cassette transporter 1 (ABCA1)의 발현을 증가시킴으로써 대식세포로부터 콜레스테롤이 방출되는 것을 조절하여 거품세포 형성을 억제하는 기능을 한다. SAA가 HDL의 apo-lipoprotein이기 때문에 고농도의 SAA는 자연적으로 SAA-conjugated HDL로 전환될 수 있으므로, HDL의 거품세포 형성 억제 기능을 방해하는 동시에 SAA-HDL 자체로 거품세포 형성을 증가시키는 작용을 하는 것이다.

실시예 8. 죽상동맥경화증 환자에서 FPR2 발현 증가 확인

죽상동맥경화증 환자에서 FPR2 발현 증가 여부를 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.

8-1. 말초혈액 단핵구( peripheral blood mononuclear cells , PBMCs )에서의 FPR2 발현 증가 확인

42명의 환자와 24명의 건강한 사람으로부터 PBMC 샘플을 채취하였다. 세포를 분리한 후, FPR1, FPR2, FPR3, actin에 특이적인 프라이머로 RT-PCR을 수행하였다. FPR2 mRNA수치는 건강한 사람에 비해 동백경화 환자의 PBMC에서 크게 증가했다. FPR1 mRNA 수치는 두 그룹에서 유사하게 나타났으나, 동맥경화환자의 샘플에서 미약한, 그러나 유의성 있는 FPR3 mRNA 수치의 증가가 나타났다(도 20). FPR의 mRNA 발현 수치는 β-actin에 의해 정상화되었다. N은 normal PBMC, P는 죽상동맥경화증 환자의 PBMC를 나타낸다. *는 p<0.05, ***은 p<0.001을 의미한다.

8-2. 경동맥 혈전 및 플라그에서의 FPR2 발현 증가 확인

영남대 의대 병원에서 경동맥 절제수술(carotid endarterectomy)을 한 환자들로부터 죽상동맥경화 플라그를 채취하였다. 샘플 채취시 환자의 동의를 받았고, Institutional Review Board (IRB number: PCR-10-166)의 승인을 받았다.

5-μm의 플라그 절편을 상온에 밤새 배양한 후, 60°C에서 30분 동안 배양하고, xylene으로 포매 처리한 후 희석 농도를 다양하게 한 알코올로 재수화시켰다. Streptavidin-biotin immunohistochemistry (VectaStain, ABC System; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 제조자가 지시한 대로 항-인간 FPR2 항체(1:50 dilution, sigma)를 사용하여 수행하였다. 대조군(정상 인간 비장) 슬라이드는 1차 항체 희석액, 1% (v/v) BSA 용액과 함께 배양하였다. 각 슬라이드를 에오신으로 대조염색한 후, 탈수시키고, 커버슬립을 덮었다.

정상 비장동맥 또는 동맥경화가 일어난 경동맥 주변의 정상 구역과 비교할 때, 동맥경화 환자의 경동맥에서 얻은 플라그나 혈전에서 FPR2의 발현이 크게 증가했다(도 21). B는 original magnifications, X16 및 X40은 죽상동맥경화증 환자의 경동맥, X200은 비장동맥의 경우를 나타낸다. 데이터는 그룹당 5개의 개별적인 샘플들의 대푯값이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Composition inhibiting form cell formation comprising serum amyloid A synthesis inhibitors or formyl peptide receptor 2 activity modulators <130> PB12-10797 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aggtccttgt ccacaagact gg 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acgcccctgg tcttaaagaa ttg 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttctttgcag ctccttcgtt gccg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tggatggcta cgtacatggc tggg 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctccagttgg actagccaca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ccatcaccca gggcccaatg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctgctggtgc tgctggcaag 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aatatccctg accccatcct ca 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gccaaggtct ttctgatcc 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggtctgggct gagtcaggga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ccttgaaggg atttccctcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggagggaaat cccttcaagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttgccgtacc tgacttagcc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggctaagtca ggtacggcaa 20

Claims (12)

1. 혈청 아밀로이드 A(Serum amyloid A, SAA) 생성 저해제로서, 포밀펩타이드 수용체 2 길항제(formyl peptide receptor 2 antagonist)인 WRW⁴를 포함하는, 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 혈청 아밀로이드 A 생성 저해제로서, 포밀펩타이드 수용체 2의 mRNA에 대한 siRNA를 포함하는, 죽상동맥경화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 조성물은 혈청 아밀로이드 A와 고밀도 지단백(high Density Lipoprotein, HDL)의 포합(Conjugation)을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 조성물은 백일해 독소 민감형 G 단백질 의존적 신호전달 경로(Pertussis toxin sensitive G protein-dependent signaling pathway)에 영향을 주지 않는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 조성물은 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 조성물은 NF-B(nuclea factor kappa B)의 발현을 증가시키고, LOX-1(lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 조성물은 거품세포(foam cell)의 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
8. 제 1항 또는 제 2항의 조성물을 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 죽상동맥경화증 예방 또는 치료방법.
   
9. 제 8항에 있어서,
   상기 죽상동맥경화증의 예방 또는 치료는 거품세포 형성억제에 의한 것임을 특징으로 하는, 방법.
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