KR101461426B1 - Screening method of pesticidal materials - Google Patents

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KR101461426B1
KR101461426B1 KR1020130102331A KR20130102331A KR101461426B1 KR 101461426 B1 KR101461426 B1 KR 101461426B1 KR 1020130102331 A KR1020130102331 A KR 1020130102331A KR 20130102331 A KR20130102331 A KR 20130102331A KR 101461426 B1 KR101461426 B1 KR 101461426B1
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윤봉준
나준호
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a method for screening pesticides. By using the screening method of the present invention, natural substances similar to allatostatin which restrict the synthesis of juvenile hormone expressed in insects can be found; thus, the method can be used as an agricultural pesticide to hinder the normal growth of pests. Moreover, allatostatin and the receptor thereof exist specifically in insect species, thereby being expected to have no effects on mammals including humans, and thus, are suitable for the development of an eco-friendly agricultural pesticide.

Description

살충 물질을 스크리닝 하는 방법{Screening method of pesticidal materials} Screening method of pesticidal materials [

본 발명은 살충 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for screening insecticidal material.

농작물을 가해하는 병해충 및 잡초는 종류가 많고 가해하는 특성이 서로 다르기 때문에 다양한 종류의 농약이 있어야 하고, 같은 농약을 연용하면 병해충이 농약에 대한 저항성을 가지므로 한가지 병해충을 방제하기 위해서도 여러 종류의 농약이 필요하다. 또한, 농민들이 사용하기 편리하고 농작물의 생육 시기나 재배 방법에 적합한 형태의 약제가 필요한데, 농약의 종류가 너무 많아지는 것을 방지하기 위해 정부에서는 해충 방제 효과가 우수하고 안전한 농약만을 선정, 등록하고 있으며 효과가 감소하거나 위해성이 있는 농약에 대하여는 생산을 금지하고 있다.Since pests and weeds, which have a large number of kinds and different weeds, are required to have a wide variety of pesticides, pesticides resistant to pesticides have a resistance to pesticides. Therefore, various kinds of pesticides Is required. In addition, it is necessary for the farmers to use the medicines that are easy to use and suitable for the growing season and cultivation methods of the crops. To prevent the kinds of pesticides from becoming too large, the government selects and registers safe pesticides with excellent pest control effect Production is prohibited for pesticides with reduced effectiveness or risk.

국내에 분포하는 병해충과 잡초의 수는 5,850종(병 2,771, 해충 2,618, 잡초 461)으로 이들 중 농작물을 가해하는 병해충 및 잡초의 종류는 4,010종이며 농산물의 수입 자유화 등으로 외국으로부터의 병해충의 유입이 증가해 그 종류는 더 많아질 것으로 예상되고 있다.The number of pests and weeds distributed in Korea is 5,850 (2,771), pests (2,618) and weeds (461). Among them, 4,010 kinds of pests and weeds are added to the crops and the importation of pests from foreign countries And the number is expected to increase.

한편, 한국 과학 기술평가원(KISTEP)은 10년 뒤 한국 경제를 이끌 10대 유망 기술에 친환경 천연물 농약 부분 선정하였고, 21세기에 들어오면서 우리나라를 포함한 OECD 국가에서는 합성 농약과 합성 비료의 사용량을 줄이고자 하는 정책을 펼치고 있다. OECD국가의 경우, 합성 농약의 생산량을 40% 가량 감축하는 규제 정책을 시행하고 있다.Meanwhile, the KISTEP selected 10 eco-friendly natural pesticides as the 10 most promising technologies to lead the Korean economy 10 years later. In the 21st century, OECD countries including Korea reduced the use of synthetic pesticides and synthetic fertilizers Which has been in operation since then. OECD countries are implementing regulatory policies that cut synthetic pesticide production by 40%.

따라서, 미생물을 이용한 농약, 식물 등에서 추출한 천연 물질을 이용해 농약으로 이용하고 있는 실정이다.Therefore, the present invention utilizes natural substances extracted from pesticides and plants using microorganisms as pesticides.

한편, 대한민국 공개특허 제 1990-0015871호에는 나비목 알라토스타틴 뉴로펩티드의 분리와 특성화에 관한 것으로 집합 해충 폴리펩티드로부터 유리된 LAS-유형 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 기술이 공개되어 있으나, 알라토스타틴 수용체(Allatostatin receptor:AlstR) 단백질을 이용하여 알라토스타틴과 동일 작용을 하는 어고니스트를 찾는 스크리닝 방법에 대한 기술은 기재되어 있지 않다. Korean Patent Laid-Open Publication No. 1990-0015871 discloses a technique relating to the isolation and characterization of the parasitoidal allostatin neuropeptide, which discloses a polypeptide having LAS-type activity liberated from an aggregate insecticidal polypeptide. However, There is no description of a screening method for finding an agonist having the same action as allatostatin receptor: AlstR) protein.

대한민국 공개특허 제 1990-0015871호Korean Patent Publication No. 1990-0015871

본 발명의 목적은 친환경적인 살충 제재 개발을 통해 인체 및 환경에 미치는 유해 효과를 최소화 할 수 있는 차세대 농약의 개발을 위하여, 알라토스타틴 어고니스트를 이용하여 살충 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a method for screening an insecticide using an allostatin agonist in order to develop a next generation pesticide capable of minimizing harmful effects on the human body and the environment through development of an environmentally friendly insecticide.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,According to an aspect of the present invention,

a) 알라토스타틴 수용체(Allatostatin receptor:AlstR) 단백질, 형광 단백질 및 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함하는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조하는 단계;a) preparing an adeno-associated virus vector comprising an allatostatin receptor (AlstR) protein, a fluorescent protein and an internal ribosome entry site (IRES);

b) 알라토스타틴 수용체 단백질을 포함하지 않고, 형광 단백질 및 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함하는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조하는 단계;b) producing an adeno-associated virus vector comprising a fluorescent protein and an internal ribosome entry site (IRES) without the allatostatin receptor protein;

c) 상기 a) 및 b)단계에서 제조된 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 각각을 바이러스로 팩키징(packaging)하는 단계;c) packaging each of the adeno-associated virus vectors prepared in steps a) and b) with a virus;

d) 상기 c)단계에서 제조된 바이러스 각각을 GIRK채널(G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel)을 발현시킬 수 있는 동물 세포 군에서 선택되는 1종에 도입시키는 단계;d) introducing each of the viruses prepared in the step c) into one species selected from the group of animal cells capable of expressing a GIRK channel (G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel);

e) 상기 d)단계의 동물 세포에 도입시키기 위한 GIRK채널을 포함하는 플라스미드를 제작하고, 칼슘포스페이트 트렌스펙션(CaHPO4 Transfection)방법을 이용해 GIRK채널을 포함하는 플라스미드를 각각의 세포에 도입시켜 GIRK 채널을 과발현시켜주는 단계; 및e) preparing a plasmid containing a GIRK channel for introduction into animal cells in step d), and introducing a plasmid containing a GIRK channel into each cell using calcium phosphate transfection (CaHPO 4 Transfection) ; And

f) 살충 후보 물질 및 전압 민감성 염료를 상기 e)단계에서 GIRK채널을 포함하는 바이러스가 도입된 동물 세포 각각에 첨가한 후, 세포 내 세포막 전위 차이에 따른 형광 변화를 모니터링하여, 알라토스타틴 수용체가 발현된 동물 세포와 알라토스타틴 수용체가 발현되지 않은 동물 세포의 형광 측정을 통해 살충 후보 물질 중 알라토스타틴 어고니스트로 작용하는 물질을 찾는 단계를 포함하는 살충 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.f) insecticidal candidate substances and voltage sensitive dyes are added to each of the animal cells into which viruses containing the GIRK channel have been introduced in step e), and fluorescence changes according to the difference in intracellular cell membrane potentials are monitored to determine whether the allatostatin receptor A method for screening an insecticidal substance comprising a step of detecting a substance acting as an allostatin agonist in the insecticidal candidate substance through fluorescence measurement of the animal cell in which the expressed animal cell and the alatostatin receptor are not expressed.

본 발명의 알라토스타틴 어고니스트를 이용한 살충 물질의 스크리닝 방법을 이용하면 곤충에게서 발현되는 유충호르몬 합성을 억제하는 알라토스타틴과 유사한 천연 물질을 찾아냄으로써, 해충의 정상적 발달을 저해하는 농약으로 이용할 수 있는 장점이 있고, 알라토스타틴 및 그 수용체는 곤충계에 특이적으로 존재하므로 인간을 비롯한 포유 동물에 미치는 영향이 없을 것으로 기대되어 친환경적인 농약제재 개발에 적합하다. 또한, 알라토스타틴 시스템은 곤충계에 광범위하게 존재하므로, 다양한 해충에 작용하는 농약의 개발에 유용한 목표 물질이 된다.By using the method for screening insecticidal substances using the allostatin agonist of the present invention, it is possible to find a natural substance similar to alatostatin, which inhibits the synthesis of larval hormone expressed in insects, so that it can be used as an agricultural chemical which hinders the normal development of insect pests And allastastin and its receptor are specific to the insect system. Therefore, it is expected to have no effect on mammals including humans, and is suitable for development of environmentally friendly pesticide formulation. In addition, the allostatin system exists extensively in insect systems, and thus becomes a target substance useful for development of pesticides acting on various insects.

본 발명의 알라토스타틴 어고니스트를 이용한 살충 물질의 스크리닝 방법을 이용하여 다양한 화합물 라이브러리와 천연물 라이브러리를 신속하고 정확하게 스크리닝하여 살충 후보 물질을 탐색할 수 있는 장점이 있다. The screening method for insecticides using the allostatin agonist of the present invention can be used to rapidly and accurately screen various compound libraries and natural product libraries to search for insecticidal candidate substances.

도 1은 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus: AAV) Helper-Free System 을 이용해서 원하는 유전자를 세포에 도입하는 AAV system vector를 나타낸 것으로, (a)는 AlstR­IRES­mCherry를 포함하는 벡터이고, (b)는 (a)에 대한 컨트롤로 IRES­mCherry를 포함하는 벡터를 나타낸 것이다.
도 2는 알라토스타틴 수용체가 발현되지 않은 세포를 이용하여 세포의 형광 변화를 측정한 것을 나타내는 그래프이다.
도 3(a)의 AlstR-IRES-mCherry 그래프는 세포에 AAV system을 통해 알라토스타틴 수용체가 발현된 세포에서 알라토스타틴 작용의 시간에 따른 형광 변화를 측정한 것을 나타내었고, (b)의 IRES-mCherry 그래프는 AlstR-IRES-mCherry 의 control 세포로 알라토스타틴 수용체를 제외한 세포의 발현을 확인하기 위해 형광 변화를 측정한 것을 나타내었고, (c)의 (AlstR-IRES-mCherry)-(IRES-mCherry) 그래프는 알라토스타틴 수용체 단백질 유무에 따라 알라토스타틴이 발현된 세포와 발현되지 않은 세포간의 형광 변화의 편차를 비교해 세포 내에서 알라토스타틴의 작용을 확인한 것을 나타내었다.
도 4(a)의 AlstR-IRES-mCherry(AAV)+GIRK1,GIRK2 그래프는 세포에 AAV system을 통해 알라토스타틴 수용체가 발현된 세포에 GIRK1,GIRK2를 포함하는 플라스미드를 트렌스펙션해서 알라토스타틴 작용의 시간에 따른 형광 변화를 측정한 것을 나타내었고, (b)의 IRES-mCherry(AAV)+GIRK1,GIRK2 그래프는 AlstR-IRES-mCherry 의 control 세포로 알라토스타틴 수용체를 제외한 세포의 발현을 확인하기 위해 GIRK1,GIRK2를 포함하는 플라스미드를 트렌스펙션해서 형광 변화를 측정한 것을 나타내었고, (c)의 (AlstR-IRES-mCherry)-(IRES-mCherry)+GIRK1,GIRK2 그래프는 GIRK1,GIRK2를 포함하는 플라스미드를 트렌스펙션함에 따른 알라토스타틴 수용체 단백질 유무에 따라 알라토스타틴이 발현된 세포와 발현되지 않은 세포간의 형광 변화의 편차를 비교해 세포 내에서 알라토스타틴의 작용을 확인한 것을 나타내었다.
도 5는 본 발명의 실시예에서 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조를 위한 근간이 되는 벡터를 나타낸 것으로, (A)는 pAAV-sh-mCherry 벡터이고, (B)는 pAlstR-IRES-GFP 벡터를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예에서 GIRK2-IRES-GIRK1벡터(a)를 제조를 위한 근간이 되는 벡터를 나타낸 것으로, (b)는 GIRK2 openbiosystem벡터, (c)는 GIRK1 openbiosystem 벡터를 나타내었다.1 shows an AAV system vector that introduces a desired gene into cells using an adeno-associated virus (AAV) helper-free system, wherein (a) is a vector containing AlstRIRESmCherry, (b) Is a vector containing the IRESmCherry as a control for (a).
FIG. 2 is a graph showing changes in fluorescence of cells using cells in which the alatostatin receptor is not expressed. FIG.
The AlstR-IRES-mCherry graph of FIG. 3 (a) shows the change in fluorescence of the allatostatin action in cells expressing the allatostatin receptor through the AAV system in the cells, and the IRES (AlstR-IRES-mCherry) - (IRES-mCherry) was used as a control cell of AlstR-IRES-mCherry to determine the expression of cells except the allatostatin receptor. mCherry) graph shows that the activity of alatostatin in cells was confirmed by comparing the deviation of fluorescence changes between cells expressing allastatin and non-expressed cells according to presence or absence of allatostatin receptor protein.
The AlstR-IRES-mCherry (AAV) + GIRK1 and GIRK2 graphs of FIG. 4 (a) show that the plasmids containing GIRK1 and GIRK2 were transfected into cells expressing the allatostatin receptor via the AAV system in the cells, The IRES-mCherry (AAV) + GIRK1 and GIRK2 graphs of (b) show the expression of cells except the allatostatin receptor in control cells of AlstR-IRES-mCherry (IRES-mCherry) - (IRES-mCherry) + GIRK1 of (c), and the GIRK2 graph shows the fluorescence intensity of GIRK1 and GIRK2 It was shown that the activity of alatostatin in the cells was confirmed by comparing the deviation of fluorescence change between the cells expressing allatostatin and the cells not expressing according to presence or absence of the allatostatin receptor protein upon transfection of the plasmid.
FIG. 5 is a vector showing a base for preparing an adeno-associated virus vector according to an embodiment of the present invention, wherein (A) is a pAAV-sh-mCherry vector, (B) IRES-GFP vector.
FIG. 6 shows a vector used as a basis for preparing the GIRK2-IRES-GIRK1 vector (a) in the embodiment of the present invention, in which (b) the GIRK2 openbiosystem vector and (c) the GIRK1 openbiosystem vector.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조하기 위해, 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus: AAV) Helper-Free system을 이용한 것이다. The present invention utilizes an adeno-associated virus (AAV) helper-free system to produce an adeno-associated virus vector.

본 발명은,According to the present invention,

a) 알라토스타틴 수용체(Allatostatin receptor:AlstR) 단백질, 형광 단백질 및 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함하는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조하는 단계;a) preparing an adeno-associated virus vector comprising an allatostatin receptor (AlstR) protein, a fluorescent protein and an internal ribosome entry site (IRES);

b) 알라토스타틴 수용체 단백질을 포함하지 않고, 형광 단백질 및 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함하는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조하는 단계;b) producing an adeno-associated virus vector comprising a fluorescent protein and an internal ribosome entry site (IRES) without the allatostatin receptor protein;

c) 상기 a) 및 b)단계에서 제조된 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 각각을 바이러스로 팩키징(packaging)하는 단계;c) packaging each of the adeno-associated virus vectors prepared in steps a) and b) with a virus;

d) 상기 c)단계에서 제조된 바이러스 각각을 GIRK채널(G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel)을 발현시킬 수 있는 동물 세포 군에서 선택되는 1종에 도입시키는 단계;d) introducing each of the viruses prepared in the step c) into one species selected from the group of animal cells capable of expressing a GIRK channel (G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel);

e) 상기 d)단계의 동물 세포에 도입시키기 위한 GIRK채널을 포함하는 플라스미드를 제작하고, 칼슘포스페이트 트렌스펙션(CaHPO4 Transfection)방법을 이용해 GIRK채널을 포함하는 플라스미드를 각각의 세포에 도입시켜 GIRK 채널을 과발현시켜주는 단계; 및e) preparing a plasmid containing a GIRK channel for introduction into animal cells in step d), and introducing a plasmid containing a GIRK channel into each cell using calcium phosphate transfection (CaHPO 4 Transfection) ; And

f) 살충 후보 물질 및 전압 민감성 염료를 상기 e)단계에서 GIRK채널을 포함하는 바이러스가 도입된 동물 세포 각각에 첨가한 후, 세포 내 세포막 전위 차이에 따른 형광 변화를 모니터링하여, 알라토스타틴 수용체가 발현된 동물 세포와 알라토스타틴 수용체가 발현되지 않은 동물 세포의 형광 측정을 통해 살충 후보 물질 중 알라토스타틴 어고니스트로 작용하는 물질을 찾는 단계를 포함하는 살충 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.f) insecticidal candidate substances and voltage sensitive dyes are added to each of the animal cells into which viruses containing the GIRK channel have been introduced in step e), and fluorescence changes according to the difference in intracellular cell membrane potentials are monitored to determine whether the allatostatin receptor A method for screening an insecticidal substance comprising a step of detecting a substance acting as an allostatin agonist among the insecticidal candidate substances through fluorescence measurement of the animal cell in which the expressed animal cell and the allatostatin receptor are not expressed.

알라토스타틴(allatostatin)이란, 곤충류 내분비 기관인 알라타체(corpora allata)로부터 생산되는 유충 호르몬(juvenile hormone)의 합성을 억제하는 기능을 가진 신경 펩티드로, 유충 호르몬은 널리 알려진 바와 같이 곤충의 여러 생리 작용을 직접적으로 조절하는 중요한 호르몬이며, 특히 상기 호르몬의 생성이 암컷에 있어서는 배란에 필수적인 역할을 하여 살충 또는 해충 개체 조절(pest control)에 있어서 주요한 타겟 분자로 여겨지고 있다. 따라서 이를 직접적으로 조절하는 것으로 잘 알려진 알라토스타틴 역시 매우 살충 가능성이 높은 타겟 분자로 제안되고 있다.Allatostatin is a neuropeptide with the function of inhibiting the synthesis of juvenile hormone produced from corpora allata, an insect endocrine organs. As is well known, larval hormones are known as various physiological functions of insects And in particular, the production of the hormone plays an essential role in ovulation in females, and is regarded as a major target molecule in pest control or pest control. Therefore, alatostatin, which is known to directly regulate it, has also been proposed as a highly potent insecticidal target molecule.

아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus: AAV) Helper-Free system 이란 아데노-연관 바이러스를 이용하여 원하는 유전자를 세포에 주입시켜 발현하는 시스템으로 바이러스를 만드는 벡터에 원하는 형질의 유전자를 도입시켜 바이러스를 제작하고, 이 바이러스를 세포에 감염시켜주면 유전자가 발현해 원하는 단백질을 생성하게 하는 시스템이다.Adeno-associated virus (AAV) Helper-free system is a system that injects a desired gene into a cell using an adeno-associated virus and introduces the gene of the desired trait into the vector that makes the virus. If the virus is infected into a cell, the gene is expressed and a desired protein is generated.

아데노-연관 바이러스는 replication-deficient parvovirus로 좋은 infection 효율을 위해서 helper adenovirus 또는 herpes virus와 동시에 infection되었다. 본 발명에서 사용되는 AAV Helper-Free system은 helper virus의 사용 없이 infection이 가능한 human adeno-associated virus-2(AAV-2)를 만드는 시스템이다.Adeno-associated viruses are replication-deficient parvoviruses that are co-infected with helper adenovirus or herpes viruses for good infection efficiency. The AAV helper-free system used in the present invention is a system for producing human adeno-associated virus-2 (AAV-2) capable of infection without using helper virus.

AAV Helper-Free system에 의해 adenvirus 의 유전자가 세포에 트렌스펙션되어 발현된다. 시스템 하에서 대부분의 adenvirus 의 유전자는 플라스미드 pHelper와 human AAV-2 vector DNA 가 함께 세포에 트렌스펙션되어 감염성 AAV particle들을 생성한다. 이 때, 사용되는 세포는 HEK293 에서 유도된 세포로 AAV-293 세포를 이용한다.The adenvirus gene is transfected into the cell by the AAV Helper-Free system. Under most of the adenovirus genes, plasmid pHelper and human AAV-2 vector DNA are transfected into cells together to produce infectious AAV particles. At this time, the cells used are HEK293-derived cells using AAV-293 cells.

바이러스 생성시 human AAV-2 vector DNA의 중간에 삽입된 특정 유전자들은 바이러스가 숙주 세포에 감염될 때, 숙주 세포에서 발현되게 만든다.Specific genes inserted in the middle of the human AAV-2 vector DNA at the time of virus generation are expressed in the host cell when the virus is infected to the host cell.

상기 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus: AAV) Helper-Free system 은 아데노-연관 바이러스의 특징을 이용해 알라토스타틴 수용체의 발현을 높게 해주고, 바이러스의 감염이 신속하고 지속 가능하도록 사용 할 수 있는 장점이 있다. 또한, 알라토스타틴 수용체가 발현된 세포주(cell line)를 이용할 필요 없이 기본 세포주에 알라토스타틴 수용체를 간단한 방법으로 발현시킴으로써, 세포의 유지 및 이동을 최소화하는 장점이 있다.The Adeno-associated virus (AAV) helper-free system enhances the expression of alatostatin receptor by using the characteristics of adeno-associated virus and can be used to rapidly and continuously infect the virus . In addition, it is advantageous to minimize the maintenance and migration of cells by expressing the alatostatin receptor in a basic cell line in a simple manner without using the cell line expressing the alatostatin receptor.

본 발명의 a)단계에서는 알라토스타틴 수용체(AlstR)를 상기 시스템에 1차로 발현시키고 알라토스타틴 수용체의 발현의 유무를 확인하기 위해 형광 단백질을 발현시켜 확인하였다. 다양한 형광 단백질 중 본 발명에서 사용하는 전압 민감성 염료(Voltage sensitive dye)와 형광 파장의 범위가 겹치지 않는 mCherry 형광 단백질을 발현시켰다. 또한, 알라토스타틴 수용체와 mCherry 두 단백질이 접합되어 발현 할 경우, 발생할 수 있는 간섭을 방지하기 위해 내부 리보솜 유입 부위(Internal Ribosome Entry Site: IRES)를 이용해 두 유전자를 벡터 내에서 각각 발현시켰다. 따라서,알라토스타틴 수용체(Allatostatin receptor:AlstR) 단백질, mCherry 단백질 및 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함하는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조하였다.In step a) of the present invention, a fluorescent protein was expressed and expressed in order to first express the alatostatin receptor (AlstR) in the system and confirm the expression of the allastatin receptor. Among the various fluorescent proteins, mCherry fluorescent protein which does not overlap the range of the fluorescent wavelength with the voltage sensitive dye used in the present invention was expressed. In addition, when both the alatostatin receptor and the mCherry protein are expressed, the two genes are expressed in the vector using an internal ribosome entry site (IRES) to prevent possible interference. Thus, an adeno-associated virus vector containing the allatostatin receptor (AlstR) protein, the mCherry protein and the internal ribosome entry site (IRES) was prepared.

본 발명의 b)단계에서는 알라토스타틴 수용체를 포함하지 않는 대조군으로mCherry 단백질 및 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함하는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조하여 각각의 벡터를 발현시켰다. 상기 Negative control을 이용해 알라토스타틴 수용체를 포함하지 않는 테스트도 진행함으로써 이를 이용해 False positive를 판별해 알라토스타틴 수용체를 포함하는 positive control 만 있는 경우 보다 더 정확한 스크리닝이 가능하도록 하였다. 따라서, 상기의 알라토스타틴 수용체 포함 유무에 차이가 있는 바이러스 벡터가 발현된 세포들에서 형광의 변화를 비교해 원하는 살충 후보 물질의 스크리닝을 더욱 정확하게 하는 효과가 있다.In step b) of the present invention, an adeno-associated virus vector containing an mCherry protein and an internal ribosome entry site (IRES) was prepared as a control group not containing the allatostatin receptor and each vector was expressed . Tests that do not include allatostatin receptors have also been conducted using the negative control to identify false positives and enable more accurate screening than positive controls containing allatostatin receptors alone. Therefore, comparing the changes in fluorescence in cells expressing viral vectors having or without the alatostatin receptor, screening of a desired insecticide candidate material is more accurate.

도 1은 상기의 방법으로 제조된, 아데노-연관 바이러스 Helper-Free System 을 이용해서 원하는 유전자를 세포에 도입하는 AAV system vector를 나타낸 것으로, (a)는 AlstR­IRES­mCherry를 포함하는 벡터이고, (b)는 (a)에 대한 컨트롤로 IRES­mCherry를 포함하는 벡터를 나타내었다.FIG. 1 shows an AAV system vector prepared by the above method and introducing a desired gene into cells using an adeno-associated virus Helper-Free System, wherein (a) is a vector containing AlstRIRESmCherry, (b) (a) shows the vector containing the IRES mCherry.

본 발명의 c)단계는 상기 a) 및 b)단계에서 제조된 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 각각을 바이러스로 팩키징(packaging)하는 단계로, 상기 벡터 각각이 세포에 발현하면 아데노-연관 바이러스가 생성되어 HEK293T에 팩키징 하게 되는 시스템이다. 본 팩키징(packaging) 단계는 하기의 실시예에서 자세히 설명하도록 한다.The step c) of the present invention is a step of packaging each of the adeno-associated virus vectors prepared in steps a) and b) with a virus, wherein when the vectors are expressed in cells, adeno- Associated virus is generated and packaged in HEK293T. The packaging step will be described in detail in the following examples.

본 발명의 d)단계는 상기 c)단계에서 제조된 바이러스 각각을 GIRK채널(G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel)을 발현하는 동물 세포 군에서 선택되는 1종에 도입시키는 단계로, 알라토스타틴 수용체(Allatostatin receptor:AlstR) 단백질 유무에 따른 세포 내 세포막 전위 차이를 나타나게 하는 것은 GIRK채널(G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel)이다. 제조된 바이러스 각각을 GIRK 채널을 발현하는 동물 세포 군에서 선택되는 1종에 도입시켜 세포 내에서 알라토스타틴 수용체의 발현이 가능하게 제조하였다. 상기 동물 세포는 예를 들어, HEK 293T cell, HEK 293 cell, NIH3T3 cell 및 Neuro2a cell로 이루어진 군에서 선택되는 1종일 수 있으며, HEK 293T cell 인 것이 바람직하다.The step d) of the present invention is a step of introducing each of the viruses prepared in the step c) into one species selected from a group of animal cells expressing a GIRK channel (G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel) The GIRK channel (G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel) is responsible for the difference in intracellular cell membrane potential with or without the receptor (Allatostatin receptor: AlstR). Each of the prepared viruses was introduced into one species selected from the group of animal cells expressing the GIRK channel, so that the expression of the allatostatin receptor was made possible in the cells. The animal cell may be one selected from the group consisting of, for example, HEK 293T cell, HEK 293 cell, NIH 3T3 cell and Neuro2a cell, and is preferably HEK 293T cell.

더욱 상세하게는, 곤충에 특이적으로 존재하는 알라토스타틴 수용체(Allatostatin Receptor:AlstR)를 동물 세포에서 발현시켜서, 상기 수용체가 알라토스타틴과 반응하게되면 GIRK채널이 작동하여 칼륨 이온(K+)이 세포막 바깥으로 나가게 되고 이로 인해 막전위가 변화하여 과분극이 발생하게 된다. 도 2는 알라토스타틴 수용체가 발현되지 않은 세포를 이용하여 세포의 형광 변화를 측정한 그래프인 control test로, GIRK채널의 발현을 확인하기 위해 칼륨 이온(K+)과 카르바콜(carbachol)을 이용하는데 고농도의 칼륨 이온에 의해 세포 내로 칼륨 이온(K+)이 유입되고 막전위가 변화하며 탈분극이 일어나 형광이 강해지는 현상을 관찰할 수 있다. 카르바콜(carbachol)은 아세틸콜린(acetylcholine)의 유도체로써 아세틸콜린 수용체를 활성화시키고 이로 인해 세포의 Gi신호 전달이 작동하게 하는 역할을 하는데, 이는 GIRK채널을 활성화시켜 채널을 열어주고 세포 내의 칼륨 이온(K+)을 세포 밖으로 나가게 함으로써, 세포 내 칼륨 이온(K+)의 농도는 낮아지게 되고, 막전위의 탈분극이 일어나며 형광이 감소하게 되는 현상을 관찰 할 수 있다.More specifically, when an allatostatin receptor (AlstR), which is specifically present in an insect, is expressed in an animal cell and the receptor reacts with alastostatin, the GIRK channel is activated to generate potassium ion (K + ), And the membrane potential is changed by this, resulting in hyperpolarization. FIG. 2 is a graph showing the change in fluorescence of cells using cells expressing no alatostatin receptor. In a control test, potassium ion (K + ) and carbachol were used to confirm the expression of GIRK channel The potassium ion (K + ) is introduced into the cell by a high concentration of potassium ions, and the membrane potential is changed, so that depolarization occurs and the fluorescence becomes strong. Carbachol, a derivative of acetylcholine, activates the acetylcholine receptor and thereby activates the Gi signaling of the cell, which activates the GIRK channel to open the channel and release potassium ions K + ) is released from the cell, the concentration of potassium ion (K + ) in the cell becomes low, depolarization of the membrane potential occurs, and fluorescence decreases.

본 발명의 e)단계는 상기 d)단계의 동물 세포에 도입시키기 위한 GIRK채널을 포함하는 플라스미드를 제작하고, 칼슘포스페이트 트렌스펙션(CaHPO4 Transfection)방법을 이용해 GIRK채널을 포함하는 플라스미드를 각각의 세포에 도입시켜 GIRK 채널을 과발현시켜주는 단계로, 보다 구체적으로, GIRK 채널을 갖는 세포에서 알라토스타틴 수용체를 반응시킬 경우 더욱 강력한 형광 변화 효과를 확인하기 위해서 GIRK채널을 세포에 도입시켜 과발현시키는 과정을 추가로 도입하였다. 이를 이용하여 더욱 증가된 칼륨 이온(K+)의 농도 변화 관측이 가능하도록 하였다. GIRK 채널은 알라토스타틴 수용체가 알라토스타틴에 의해 반응할 때 세포 내 세포막 전위 차이가 변화하는 채널로, 상기 GIRK 채널은 GIRK1, GIRK2, GIRK3 및 GIRK4 의 4가지 종류가 있고, 이중 알라토스타틴 수용체(AlstR)가 영향을 미치는 채널은 GIRK1, GIRK2로 알려져 있다. 따라서, 상기 GIRK 채널은 GIRK1, GIRK2, GIRK3 및 GIRK4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상 인 것이 바람직하고, GIRK1, GIRK2를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 또 인간, 마우스 등 다양한 동물에 존재하는 GIRK 채널 중 마우스의 GIRK 채널이 가장 특이적 반응을 수행하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 바이러스에 의한 알라토스타틴의 효과를 강화시키기 위해서 GIRK1 및 GIRK2 채널을 과발현시켜 반응하는 단계를 추가로 도입하였다.In step e) of the present invention, a plasmid containing a GIRK channel for introduction into animal cells in step d) is prepared, and a plasmid containing a GIRK channel is transformed into each cell using calcium phosphate transfection (CaHPO 4 Transfection) To overexpress the GIRK channel. More specifically, in order to confirm a strong fluorescence change effect when the allotastatin receptor is reacted with cells having a GIRK channel, a step of overexpressing the GIRK channel into cells Were introduced. We can observe the change of concentration of potassium ion (K + ) by using this. The GIRK channel is a channel in which the intracellular membrane potential difference is changed when the alatostatin receptor is reacted by alastostatin. The GIRK channel has four types of GIRK1, GIRK2, GIRK3 and GIRK4, and the allatostatin receptor (AlstR) are known as GIRK1 and GIRK2. Therefore, the GIRK channel is preferably at least one selected from the group consisting of GIRK1, GIRK2, GIRK3, and GIRK4, and more preferably includes GIRK1 and GIRK2. It is also known that the GIRK channel of the mouse among the GIRK channels existing in various animals such as human and mouse performs the most specific reaction. In the present invention, a step of overexpressing GIRK1 and GIRK2 channels to further enhance the effect of virus-induced alastostatin is further introduced.

본 발명의 f)단계에서는 알라토스타틴 어고니스트를 이용한 살충 물질의 스크리닝 방법에서 천연물 살충 후보 물질들의 어고니스트(agonist)로서의 가능성을 판단하는데 있어서 기준이 되는 척도는 막 전위 변화로, 상기 막 전위 변화는 전압 민감성 염료(Voltage sensitive dye)의 형광 발현으로 탐지 가능하다. 전압 민감성 염료로는 느린-반응 전압-민감성 탐침(slow-response potential-sensitive probe)의 특성을 갖는 비스-(1,3-디부틸바비튜릭 에시드)트리메틴 옥소놀(Bis-(1,3-Dibutylbarbituric Acid)Trimethine Oxonol:DiBAC4(3)), 비스-(1,3- 디에틸티오바비튜릭 에시드)트리메틴 옥소놀(Bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid)trimethine oxonol:DiSBAC2(3)) 및 비스-(1,3-디부틸바비튜릭 에시드)펜타메틴 옥소놀(Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)pentamethine oxonol:DiBAC4(5))로 이루어진 군에서 선택된 1종을 사용할 수 있고, 바람직하게는 비스-(1,3-디부틸바비튜릭 에시드)트리메틴 옥소놀(Bis-(1,3-Dibutylbarbituric Acid)Trimethine Oxonol:DiBAC4(3))을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 전압 민감성 염료는 세포에 들어가 세포 내 단백질(intracellular protein), 세포막(membrane) 등에 결합하여 형광을 강화시키는 특징이 있다. 탈분극이 강화되면 세포 내로 상기 염료의 유입이 일어나며 형광이 증가하게 되고, 반면 과분극시에는 형광 감소가 나타나게 되는데, 이러한 특징들은 GIRK채널(G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel)의 발현을 확인하는데 용이하게 사용될 수 있다.In the step (f) of the present invention, the criterion which is a standard for judging the possibility as an agonist of the natural substance insecticide candidate substances in the screening method of the insecticidal substance using the allostatin agonist is the membrane potential change, Can be detected by fluorescence expression of voltage sensitive dyes. Voltage-sensitive dyes include bis- (1,3-dibutylbarbituric acid) trimethinoxolol (Bis- (1,3- dibutylbipuronic acid)) having the properties of a slow-response potential- Dibutylbarbituric Acid) Trimethine Oxonol: DiBAC4 (3), Bis- (1,3-diethylthiobarbituric acid) trimethine oxonol: DiSBAC2 (3) One selected from the group consisting of bis- (1,3-dibutylbarbituric acid esters) and bis- (1,3- dibutylbarbituric acid) pentamethine oxonol: DiBAC4 (5) (1,3- Dibutylbarbituric Acid) Trimethine Oxonol: DiBAC4 (3)) may be used, but the present invention is not limited thereto. The voltage-sensitive dyes enter the cells and bind to intracellular proteins, membranes, etc. to enhance fluorescence. When the depolarization is enhanced, the dye is introduced into the cell and the fluorescence increases. On the other hand, fluorescence decreases when the depolarization occurs. These characteristics are easily confirmed by the expression of the GIRK channel (G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel) Lt; / RTI >

본 발명은 알라토스타틴 수용체 단백질 유무에 따른 세포 내 세포막 전위 차이를 모니터링을 위해 형광 영상화 플레이트 판독기(Fluorescence Imaging Plate Reader: FLIPR) 장치를 사용하는데, 상기 형광 영상화 플레이트 판독기란 Microplate Reader 또는 Plate Reader로 microwell plate에 샘플을 넣어 생물, 화학, 물리적 변화를 측정하는 장치로 형광의 변화를 측정 가능하게 한다. 본 발명의 실시예에서는 형광 변화를 측정하기 위하여 Zenyth 3100 (Microplate Multimode Detector)을 사용하고 microwell plate는 96 well plate를 사용하여 많은 종류의 물질을 테스트하도록 하였다.The present invention uses a fluorescence imaging plate reader (FLIPR) device for monitoring the difference in intracellular cell membrane potential with or without the alatostatin receptor protein. The fluorescence imaging plate reader is a microplate reader or a plate reader, A sample is placed on the plate to measure changes in fluorescence with a device that measures biological, chemical, and physical changes. In the present invention, Zenyth 3100 (Microplate Multimode Detector) was used to measure fluorescence change and a microwave plate was used to test many kinds of materials using a 96-well plate.

본 발명에서는 세포에 바이러스 벡터를 이용하여 알라토스타틴 수용체를 발현시킴으로써, 알라토스타틴 단백질을 처리해줄 때의 막 전위의 변화를 확인할 수 있다.In the present invention, by expressing an allostatin receptor using a viral vector in a cell, the change in membrane potential when the allastatin protein is treated can be confirmed.

본 발명의 도 3의 (a)AlstR-IRES-mCherry 그래프는 세포에 AAV system을 통해 알라토스타틴 수용체가 발현된 세포에서 알라토스타틴 작용의 시간에 따른 형광 변화를 측정한 것을 나타내었고, (b)IRES-mCherry 그래프는 AlstR-IRES-mCherry 의 control 세포로 알라토스타틴 수용체를 제외한 세포의 발현을 확인하기 위해 형광 변화를 측정한 것을 나타내었고, (c)(AlstR-IRES-mCherry)-(IRES-mCherry) 그래프는 알라토스타틴 수용체 단백질 유무에 따라 알라토스타틴이 발현된 세포와 발현되지 않은 세포간의 형광 변화의 편차를 비교해 세포 내에서 알라토스타틴의 작용을 확인한 것을 나타내었다.The AlstR-IRES-mCherry graph of FIG. 3 (a) of the present invention shows that fluorescence changes of allatostatin action in the cells expressing the allatostatin receptor through the AAV system in the cells were measured with time (b ) IRES-mCherry graph shows the change of fluorescence in the control cells of AlstR-IRES-mCherry except the allatostatin receptor. (C) (AlstR-IRES-mCherry) - (IRES -mCherry) graph shows that the activity of alatostatin in cells was confirmed by comparing the variation of fluorescence between the cells expressing allastatin and the cells not expressing according to presence or absence of allatostatin receptor protein.

또한, 본 발명의 도 4의 (a)AlstR-IRES-mCherry(AAV)+GIRK1,GIRK2 그래프는 세포에 AAV system을 통해 알라토스타틴 수용체가 발현된 세포에 GIRK1,GIRK2를 포함하는 플라스미드를 트렌스펙션해서 알라토스타틴 작용의 시간에 따른 형광 변화를 측정한 것을 나타내었고, (b)IRES-mCherry(AAV)+GIRK1,GIRK2 그래프는 AlstR-IRES-mCherry 의 control 세포로 알라토스타틴 수용체를 제외한 세포의 발현을 확인하기 위해 GIRK1,GIRK2를 포함하는 플라스미드를 트렌스펙션해서 형광 변화를 측정한 것을 나타내었고, (c)(AlstR-IRES-mCherry)-(IRES-mCherry)+GIRK1,GIRK2 그래프는 GIRK1,GIRK2를 포함하는 플라스미드를 트렌스펙션함에 따른 알라토스타틴 수용체 단백질 유무에 따라 알라토스타틴이 발현된 세포와 발현되지 않은 세포간의 형광 변화의 편차를 비교해 세포 내에서 알라토스타틴의 작용을 확인한 것을 나타내었다.In addition, the graph of (a) AlstR-IRES-mCherry (AAV) + GIRK1 and GIRK2 of the present invention shows that the plasmid containing GIRK1 and GIRK2 is transfected into cells expressing the allatostatin receptor via the AAV system, (B) IRES-mCherry (AAV) + GIRK1 and GIRK2 graphs are the control cells of AlstR-IRES-mCherry, showing that the cells except for the allatostatin receptor (IRES-mCherry) - (IRES-mCherry) + GIRK1, and the GIRK2 graph shows that the GIRK1, GIRK2, and GIRK2 genes were transfected with plasmids containing GIRK1 and GIRK2 The expression of allatostatin in cells was compared with the difference in fluorescence change between the cells expressing allastatin and the cells not expressing according to the presence or absence of allatostatin receptor protein upon transfection of the plasmid containing the plasmid Served.

본 발명의 살충 물질을 스크리닝하는 방법을 이용하면 알라토스타틴 수용체가 포함되어서 발현된 세포의 형광 변화와 알라토스타틴 수용체를 포함하지 않아 이 단백질이 발현되지 않은 세포의 형광 변화의 차이를 비교하여 원하는 살충 후보 물질이 알라토스타틴과 유사한 작용을 하는지 확인할 수 있다.When the insecticidal substance screening method of the present invention is used, the fluorescence changes of the cells expressing the allatostatin receptor and the fluorescence changes of the cells not containing the allatostatin receptor and not expressing the protein are compared It can be confirmed whether the insecticide candidate substance has an action similar to that of alatostatin.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These embodiments are only for illustrating the present invention, and thus the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.

(1) (One) 아데노Adeno -연관 바이러스(- Associated virus ( adenoadeno -- associatedassociated virusvirus ) 벡터를 제조) Manufacture of vector

아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 하기의 방법으로 제조하였다.An adeno-associated virus vector was prepared by the following method.

도 5는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조를 위한 근간이 되는 벡터를 나타낸 것으로, (A)는 pAAV-sh-mCherry 벡터이고, (B)는 pAlstR-IRES-GFP 벡터를 나타내었다. (A)에서 sh가 있는 부분을 제거해주고 (B)의 AlstR, IRES를 사용하였다.FIG. 5 shows a vector that serves as a basis for preparing an adeno-associated virus vector, wherein (A) is a pAAV-sh-mCherry vector and (B) represents a pAlstR-IRES-GFP vector . (A), and AlstR and IRES of (B) were used.

pAAVpAAV -- AlstRAlstR -- IRESIRES -- mCherrymCherry 제조 Produce

A 는 vector, B의 AlstR-IRES는 insert부위를 나타낸다.A is a vector, and AlstR-IRES of B represents an insert site.

A(pAAV-sh-mCherry)의 제조 과정은 NEB buffer2 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, NheI enzyme (NEB, cat# R0131S) 5ul, Autoclaved DW(오토클레이브된 3차 증류수, ADW) 30ul를 넣어준 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. 그 후, Klenow (NEB, cat# M0210S)를 처리해서 enzyme cut 부위를 blunt end로 바꾸어 주었다. 상기 혼합물에 2ul dNTP와 1ul의 Klenow를 처리하고 상온에서 1시간 처리 후 75℃에서 20분간 heat inactivation을 하였다. XbaI (NEB, cat# R0145S)을 5ul 추가로 넣어주고 37℃ 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation 해주어 활성을 억제하였다. 다음으로, Vector의 self ligation을 억제하는 CIP(NEB, cat# M0290S) 2.5ul를 처리하고 37℃ 1시간 동안 처리하였다.5 μl of NEB buffer, 5 μl of BSA buffer, 5 μl of DNA (1 μg / μl), 5 μl of NheI enzyme (NEB, cat # R0131S), Autoclaved DW (autoclaved tertiary distilled water, ADW ), And the enzyme was cut at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes, followed by heat inactivation at 65 ° C for 20 minutes to inhibit the activity. After that, Klenow (NEB, cat # M0210S) was treated to change the enzyme cut site to blunt end. The mixture was treated with 2 ul dNTP and 1 ul Klenow, treated at room temperature for 1 hour, and heat inactivated at 75 ° C for 20 minutes. After addition of 5 ul of XbaI (NEB, cat # R0145S), the enzyme was cut at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes, followed by heat inactivation at 65 ° C for 20 minutes to inhibit the activity. Next, 2.5 μl of CIP (NEB, cat # M0290S) inhibiting the self ligation of the vector was treated and treated at 37 ° C for 1 hour.

B(pAlstR-IRES-GFP)의 제조 과정은NEB buffer2 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, NheI 5ul, ADW 30ul 를 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. 그 후, SmaI (NEB, cat# R0141S) 5ul 추가해 넣어주고 37℃ 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation 해주어 활성을 억제시켰다.5 μl of NEB buffer, 5 μl of BSA buffer, 5 μg of DNA (1 μg / μl), 5 μl of NheI and 30 μl of ADW were added to the wells and the enzyme was cut at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes. Heat inactivation for 20 minutes at < RTI ID = 0.0 > 0 C < / RTI > After that, 5 ul of SmaI (NEB, cat # R0141S) was added, enzyme cut was performed at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes, and heat inactivation was performed at 65 ° C for 20 minutes to inhibit the activity.

A의 blunt end 부위와 B의 SmaI에 의해 생긴 blunt end 부위가 ligation되고, A의 XbaI 부위와 B의 NheI 부위가 ligation되었다. A, B를 gel extraction을 실시하였는데, 각각 A는 약 6Kb 사이즈의 DNA, B는 약 1.9Kb 사이즈의 DNA를 이용하였다. 그 후, A와 B의 농도와 분자 크기를 계산해 ligation하였다. 구체적으로는 Vector와 Insert DNA를 비율에 맞게 넣어주고 T4 DNA ligase (NEB cat# M0202S) 1ul 와 10Xligase buffer 2ul를 넣어주고 총 20ul가 되도록 하였다. 상온에서 16시간 이상 ligation을 하였다.The blunt end region of A and the blunt end region of SmaI of B were ligated and the XbaI site of A and the NheI site of B were ligated. A and B were used for gel extraction. A DNA of about 6 Kb in size and DNA of about 1.9 Kb in size B were used. After that, concentrations and molecular sizes of A and B were calculated and ligation was performed. Specifically, 1 μl of T4 DNA ligase (NEB cat # M0202S) and 2 μl of 10 × ligase buffer were added to the vector and the insert DNA at a ratio. Ligation at room temperature for more than 16 hours.

pAAVpAAV -- IRESIRES -- mCherrymCherry 제조 Produce

A 는 vector, B의 IRES는 insert 부위를 나타낸다.A is a vector, and IRES of B represents an insert site.

A(pAAV-sh-mCherry)의 제조 과정은 NEB buffer4 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, XbaI enzyme 5ul, ADW 30ul를 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. 그 후, Klenow를 처리해서 enzyme cut 부위를 blunt end로 바꾸어 주었다. 상기 혼합물에 2ul dNTP와 1ul의 Klenow를 처리하고 상온에서 1시간 처리 후 75℃에서 20분간 heat inactivation을 하였다. 그 다음으로, Phenol extraction과정을 통해 DNA만 추출한 후, NEB buffer2 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, NheI enzyme 5ul, ADW 30ul를 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. Vector의 self ligation을 억제하는 CIP 2.5ul를 처리하고 37℃ 1시간 처리하였다.A (pAAV-sh-mCherry) was prepared by adding 5 μl of NEB buffer, 5 μl of BSA buffer, 5 μg of DNA (1 μg / μl), 5 μl of XbaI enzyme and 30 μl of ADW followed by enzyme cut at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes The activity was inhibited by heat inactivation at 65 ° C for 20 minutes. After that, Klenow was treated to convert the enzyme cut to a blunt end. The mixture was treated with 2 ul dNTP and 1 ul Klenow, treated at room temperature for 1 hour, and heat inactivated at 75 ° C for 20 minutes. Next, 5 μl of NEB buffer, 5 μl of BSA buffer, 5 μg of DNA (1 μg / μl), 5 μl of NheI enzyme and 30 μl of ADW were added to each well and the enzyme cuts were performed at 37 ° C. for 1 hour and 30 minutes. After heat inactivation at 65 ° C for 20 minutes, the activity was inhibited. 2.5 μl of CIP inhibiting self ligation of the vector was treated and treated at 37 ° C for 1 hour.

B(pAlstR-IRES-GFP)의 제조 과정은, NEB buffer EcoRI 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, EcoRI (NEB cat# R0101S) 5ul, ADW 30ul를 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. 그 후, Klenow를 처리해서 enzyme cut 부위를 blunt end로 바꾸어 주었다. 상기 혼합물에 2ul dNTP와 1ul의 Klenow를 처리하고 상온에서 1시간 처리 후 75℃에서 20분간 heat inactivation하였다. 그 다음으로, Phenol extraction과정을 통해 DNA만 추출한 후, NEB buffer4 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, XbaI enzyme 5ul, ADW 30ul를 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다.5 μl of NEB buffer, 5 μl of BSA buffer, 5 μl of DNA (1 μg / μl), 5 μl of EcoRI (NEB cat # R0101S) and 30 μl of ADW were added to the wells. After enzyme-cut for 30 min, the activity was inhibited by heat inactivation at 65 ° C for 20 min. After that, Klenow was treated to convert the enzyme cut to a blunt end. The mixture was treated with 2 ul dNTP and 1 ul Klenow, treated at room temperature for 1 hour, and heat inactivated at 75 ° C for 20 minutes. Next, 5 μl of NEB buffer, 5 μl of BSA buffer, 5 μg of DNA (1 μg / μl), 5 μl of XbaI enzyme and 30 μl of ADW were added to the sample, and enzyme cuts were performed at 37 ° C. for 1 hour and 30 minutes. After heat inactivation at 65 ° C for 20 minutes, the activity was inhibited.

A의 blunt end 부위와 B의 blunt end 부위가 ligation되고, A의 NheI 부위와 B의 XbaI 부위가 ligation되었다. A, B를 gel extraction 을 실시하였는데, 각각 A는 약 6Kb 사이즈의 DNA, B는 약 0.6Kb 사이즈의 DNA를 이용하였다. 그 후, A와 B의 농도와 분자 크기를 계산해 ligation해주었다. Vector와 Insert DNA를 비율에 맞게 넣어주고 T4 DNA ligase 1ul 와 10Xligase buffer 2ul를 넣어주고 총 20ul가 되게 하였다. 상온에서 16시간 이상 ligation을 하였다.The blunt end region of A and the blunt end region of B were ligation, and the NheI site of A and the XbaI site of B were ligated. A and B were used for gel extraction. A DNA of about 6 Kb in size and DNA of about 0.6 Kb in size B were used. Then, concentrations and molecular sizes of A and B were calculated and ligation was performed. The vector and insert DNA were added in the ratio and 1ul of T4 DNA ligase and 2ul of 10Xligase buffer were added to make a total of 20ul. Ligation at room temperature for more than 16 hours.

바이러스가 정상적으로 제작되어 세포에 들어갔는지 확인하기 위해서 형광 단백질을 이용하는데, 본 실시예에서는 여러 종류의 형광 단백질 중 mCherry단백질을 이용하였다. 전압 민감성 염료로 사용된 비스-(1,3-디부틸바비튜릭 에시드)트리메틴 옥소놀(Bis-(1,3-Dibutylbarbituric Acid)Trimethine Oxonol)(DiBAC4(3))의 형광 여기(excitation) 파장은 490nm, 방출(emission) 파장은 516nm으로, 이들 파장에 대한 간섭을 최소화하기 위해 형광 단백질 중 mCherry(excitation 587nm, emisiion 610nm) 단백질을 이용하였다. 또한, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site: IRES)를 이용해 알라토스타틴 수용체와 mCherry단백질이 독립적으로 발현될 수 있도록 해주어 알라토스타틴 수용체에 미칠 수 있는 다른 영향을 최소화하도록 하였다.In order to confirm whether viruses are normally produced and enter the cells, fluorescent proteins are used. In this embodiment, mCherry proteins among various kinds of fluorescent proteins were used. (1,3- dibutylbarbituric acid) Trimethine Oxonol (DiBAC 4 (3)) used as a voltage sensitive dye, and the fluorescence excitation of bis- (1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol MCherry (excitation 587 nm, emisiion 610 nm) protein was used as a fluorescent protein to minimize the interference to these wavelengths, with a wavelength of 490 nm and an emission wavelength of 516 nm. In addition, using the internal ribosome entry site (IRES), the alatostatin receptor and mCherry protein can be independently expressed, minimizing other effects on the allatostatin receptor.

(2) (2) 아데노Adeno -연관 바이러스(- Associated virus ( adenoadeno -- associatedassociated virusvirus ) 벡터를 바이러스로 팩키징() Packing the vector as a virus ( packagingpackaging ))

하기의 벡터가 세포에 발현하면 아데노-연관 바이러스가 생성되어 HEK293T에 팩키징 하는 시스템이다.When the following vectors are expressed in cells, adeno-associated virus is generated and packaged in HEK293T.

바이러스 제작 과정(Virus production process ( 팩키징Packing 과정) process)

플라스미드 및 세포는 AAV Helper-Free system(Agilent, cat#240071)에 존재하였다. AAV-293 세포를 100-mm tissue culture plate에서 배양하였는데, 이 때, 세포는 plate 당 약 5*10E5 ~ 2*10E6씩 뿌려주고 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 배양하였다. 약 2~3일 후, 세포가 70-80%의 confluency를 가지게 되면 플라스미드 트렌스펙션을 한다. pAAV 발현 플라스미드(제작된 벡터 pAAV-AlstR-IRES-mCherry 또는 pAAV-IRES-mCherry), pAAV-RC, pHelper 세 가지 플라스미드를 1ug/ul의 농도로 TE buffer, PH 7.5 에 준비하여 동시에 세포에 트렌스펙션 시켜주었다. 상기 세 종류의 플라스미드를 10ul씩 15ml 코니칼 튜브에 넣어주고, 1ml의 0,3M CaCl2를 추가해 부드럽게 섞어주었다. 섞어준 용액을 2XHBS 1ml에 한방울 씩 떨어뜨려 준 후 부드럽게 섞어주었다. 상기 용액 2.03ml을 2~3일 동안 길러준 상기 세포에 방울 방울 떨어뜨려 트렌스펙션 시켜주고 37℃ 인큐베이터에서 다시 넣어주었다. 6시간이 지난 후, 미디어를 새 미디어로 교체해 주었다. 그 후, 66 ~ 72시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 더 세포를 길러 바이러스가 생성되게 해주었다. 다음으로, 37℃ water bath(워터 베스)와 dry ice-ethanol bath(드라이 아이스-에탄올 베스)를 준비하였고, 트렌스펙션시킨 세포의 미디어와 세포를 긁어 모아 15ml 코니칼 튜브에 넣어주어 잘 밀봉하였다. 상기 튜브를 드라이아이스-에탄올 베스에 10분간 넣어주어 내부의 세포와 미디어를 얼려주는데, 10분 이내로 얼지 않으면 완전히 얼 때까지 기다렸다. 그 후, 완전히 언 튜브를 워터 베스에 넣어주고 10분간 녹여주는데, 10분 이내로 녹지 않으면 완전히 녹을 때까지 기다리고, 완전히 녹은 튜브를 가볍게 볼텍싱 해주었다. 상기 과정을 총 4번 반복해 세포를 분해해서 내부의 바이러스를 추출하였고, 상기 과정 후 나오는 세포 잔여물들을 상온, 10,000g, 10분간 센트리 퓨즈를 돌려 가라앉히고, 위에 남은 용액들은 40% PEG(poly(ethylene glycol))용액과 섞어 10% PEG용액을 만들어 주었는데, 즉, 40% PEG 1: 바이러스용액 3의 비율로 섞어 주었고, 섞어준 용액은 2일간 4℃에서 보관해 주었다. 2일 후 생성된 바이러스의 농축을 위하여 3,000rpm 30분 4℃로 센트리 퓨즈를 돌려주었고, 그 후 위의 용액은 제거해주고 아래 남은 잔여물들을 ice-DPBS에 1ml에 녹여준 후 29,000rpm 2시간 4℃ 에서 센트리 퓨즈를 돌려주었다. 그 후, 상층의 용액은 제거해주고 아래 남은 잔여물들을 ice-DPBS 100ul 에 녹여주면 여기에 바이러스가 녹아 있게 되고, 이 바이러스를 HEK293T 세포에 인펙션 시켜주었다.
Plasmids and cells were present in the AAV Helper-Free system (Agilent, cat # 240071). AAV-293 cells were cultured in a 100-mm tissue culture plate, in which cells were seeded at about 5 × 10E5 to 2 × 10E6 per plate and incubated at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. Approximately 2 to 3 days later, when the cells have a confluency of 70-80%, they undergo plasmid transfection. Three plasmids of pAAV expression plasmid (prepared vector pAAV-AlstR-IRES-mCherry or pAAV-IRES-mCherry), pAAV-RC and pHelper were prepared in TE buffer and pH 7.5 at a concentration of 1 ug / . The three kinds of plasmids were put into a 15 ml conical tube in an amount of 10 ul, and 1 ml of 0,3 M CaCl 2 was added and gently mixed. The mixed solution was added dropwise to 1 ml of 2XHBS and mixed gently. 2.03 ml of the solution was dropped on the cells grown for 2-3 days to allow for transfection, and the cells were put back in an incubator at 37 ° C. After six hours, I replaced the media with new media. The cells were then grown in a 37 ° C incubator for 66-72 hours to allow virus production. Next, a 37 ° C water bath and a dry ice-ethanol bath were prepared, and the media and cells of the transfected cells were scraped together and sealed in a 15 ml conical tube. The tube was placed in a dry ice-ethanol bath for 10 minutes to freeze the cells and media inside. If not frozen within 10 minutes, wait until it was completely frozen. After that, completely put the untube into water bath and dissolve for 10 minutes. If it does not dissolve within 10 minutes, wait until it is completely dissolved, and vigorously vortex the completely melted tube. The above procedures were repeated 4 times to dissociate the cells to extract the virus inside. The remaining cells were then centrifuged for 10 minutes at room temperature, 10,000 g for 10 minutes, and the remaining solutions were washed with 40% PEG (ethylene glycol) solution to make a 10% PEG solution. That is, 40% PEG 1: virus solution 3 was mixed at a ratio of 3, and the mixed solution was stored at 4 ° C for 2 days. After 2 days, the concentrate was centrifuged at 3,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. Then, the supernatant was removed and the remaining supernatant was dissolved in 1 ml of ice-DPBS. I returned the Sentry fuse. Then, the upper layer solution was removed, and the remaining residues were dissolved in 100 μl of ice-DPBS. The virus was dissolved therein, and the virus was infected with HEK293T cells.

(3) (3) 팩키징Packing (( packagingpackaging )된 바이러스를 인간세포에 도입) ≪ / RTI > virus into human cells

인간의 신장세포인 HEK 293T cell을 96 black well plate(SPL, Cat#-SP30296)에 1*104개/well(각 well 100uL)씩 깔아주고 하루 동안 37℃의 5% CO2incubator에서 배양하였다.Human kidney cells HEK 293T cells were plated in 96 wells (SPL, Cat # -SP30296) at 1 × 104 cells / well (100 μL per well) and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for one day.

하루 동안 배양한 세포는 약 50% ~ 60%의 컨플루언트(confluent)를 가지는데 만약 충분하게 자라지 않으면 추가로 배양하였다. 충분히 자란 세포를 가진 well에서 미디어를 제거해 준 후, 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus: AAV) Helper-Free system을 이용하여 제조한 알라토스타틴 수용체를 가진 바이러스를 미디어와 섞어 well에 각각 100ul씩 처리하였다. 이 때, 알라토스타틴 수용체를 포함하지 않는 control 바이러스도 동일하게 처리하였다. 바이러스를 처리하고 16~24시간 후, GIRK채널을 포함하는 플라스미드의 트랜스펙션을 하기의 방법으로 실시하였다.Cells cultured for one day have about 50% to 60% confluent, and if not fully grown they are further cultured. After removing the media from the well-grown cells, the virus with the alatostatin receptor produced by the Adeno-associated virus (AAV) helper-free system was mixed with the media and 100 ul each Respectively. At this time, control viruses not containing the allatostatin receptor were treated in the same manner. Transfection of the plasmid containing the GIRK channel was performed in the following manner after 16 to 24 hours of treatment of the virus.

(4) (4) GIRK1GIRK1 , , GIRK2GIRK2 채널의  Of the channel HEKHEK cellcell 도입을 위한 플라스미드 제작 Plasmid preparation for introduction

GIRK2GIRK2 -- IRESIRES -- GIRK1GIRK1 제작 making

GIRK2-IRES-GIRK1 플라스미드를 하기의 방법으로 제조하였다.The GIRK2-IRES-GIRK1 plasmid was prepared by the following method.

도 6은 GIRK2-IRES-GIRK1벡터(a)를 제조를 위한 근간이 되는 벡터를 나타낸 것으로, (b)는 GIRK2 openbiosystem벡터, (c)는 GIRK1 openbiosystem 벡터를 나타내었다. 도5(b)의 pAlstR-IRES-GFP 벡터에서 AlstR이 있는 부분을 제거해주고 도6(b)의 GIRK2 부분을, 도5(b)의 GFP 부분을 제거해주고, 도6(c)의 GIRK1 부분을 삽입하여, GIRK2-IRES-GIRK1 벡터(도6(a))를 완성하였다.FIG. 6 shows the vector used as a basis for preparing the GIRK2-IRES-GIRK1 vector (a), (b) the GIRK2 openbiosystem vector, and (c) the GIRK1 openbiosystem vector. The GIRK2 portion of FIG. 6 (b) is removed by removing the GI portion of the pAlstR-IRES-GFP vector of FIG. 5 (b) and the GIRK1 portion of FIG. 6 (c) Was inserted to complete the GIRK2-IRES-GIRK1 vector (Fig. 6 (a)).

임의로 A는 pAlstR-IRES-GFP를 나타내고, B는 GIRK2 openbiosystem벡터, C는 GIRK1 openbiosystem로 나타내었다. 즉, A 는 vector로 B의 INSERT부위를 먼저 클로닝해 주고, C의 INSERT 부위를 클로닝하여 완성하였다.Optionally A represents pAlstR-IRES-GFP, B is the GIRK2 openbiosystem vector, and C is the GIRK1 openbiosystem. In other words, A was cloned by first cloning B INSERT site as a vector and cloning INSERT site of C.

A(pAlstR-IRES-GFP)의 제조 과정은 다음과 같다. NEB buffer3 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, MluI (NEB, cat# R0198S) 5ul, ADW 30ul를 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 80℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. 그 후, SmaI (NEB, cat# R0141S) 5ul 추가로 넣어주고 37℃ 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation 해주어 활성을 억제시켰다. 그 후 Klenow(NEB, cat# M0210S)를 처리해서 enzyme cut 부위를 blunt end로 바꾸어 주었다. 상기 혼합물에 2ul dNTP와 1ul의 Klenow(NEB, cat# M0210S)를 처리하고 상온에서 1시간 처리해 주었다. 이 후 DNA cleanup과정을 통해 DNA만 추출하였다. 추출한 DNA를 이용하여 NEB buffer2 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, NheI enzyme 5ul, ADW 30ul를 넣어준 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. 그 후 Klenow(NEB, cat# M0210S)를 처리해서 enzyme cut 부위를 blunt end로 바꾸어 주었다. 상기 혼합물에 2ul dNTP와 1ul의 Klenow를 처리하고 상온에서 1시간 처리해 준 후, 75℃에서 20분간 heat inactivation 해주어 활성을 억제시켰다. Vector의 self ligation을 억제하는 CIP(NEB, cat# M0290S) 2.5ul를 처리하고 37℃ 1시간 동안 처리하였다.A (pAlstR-IRES-GFP) was prepared as follows. 5 μl of NEB buffer, 5 μl of BSA buffer, 5 μl of DNA (1 μg / μl), 5 μl of MluI (NEB, cat # R0198S) and 30 μl of ADW were added and the enzyme was cut at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes. Inactivation inhibited the activity. Subsequently, 5 ul of SmaI (NEB, cat # R0141S) was added, and enzyme cut was performed at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes, followed by heat inactivation at 65 ° C for 20 minutes to inhibit the activity. After that, Klenow (NEB, cat # M0210S) was treated to change the enzyme cut site to blunt end. The mixture was treated with 2ul dNTP and 1ul Klenow (NEB, cat # M0210S) and treated at room temperature for 1 hour. DNA was then extracted through a DNA cleanup procedure. After 5 μl of NEB buffer, 5 μl of BSA buffer, 5 μg of DNA (1 μg / μl), 5 μl of NheI enzyme and 30 μl of ADW were added to the extracted DNA, enzyme cut was performed at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes, Inactivation inhibited the activity. After that, Klenow (NEB, cat # M0210S) was treated to change the enzyme cut site to blunt end. The mixture was treated with 2 ul dNTP and 1 ul Klenow, treated at room temperature for 1 hour, and then heat-inactivated at 75 ° C for 20 minutes to inhibit the activity. 2.5 L of CIP (NEB, cat # M0290S) inhibiting the self ligation of the vector was treated and treated at 37 DEG C for 1 hour.

B의 제조 과정은 NEB buffer4 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, SacII enzyme(NEB, cat# R0157S) 5ul, Autoclaved DW(오토클레이브된 3차 증류수, ADW) 30ul를 넣어준 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. 그 후, Klenow(exo)(NEB, cat# M0212S)를 처리해서 enzyme cut 부위를 blunt end로 바꾸어 주었다. 상기 혼합물에 2ul dNTP와 1ul의 Klenow를 처리하고 상온에서 1시간 처리 한 후, 75℃에서 20분간 heat inactivation을 하였다. BlpI enzyme(NEB, cat# R0585S)을 5ul 추가로 넣어주고 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut을 해준 후, Klenow를 처리해서 enzyme cut 부위를 blunt end로 바꾸어 주었다. 상기 혼합물에 2ul dNTP와 1ul의 Klenow를 처리하고 상온에서 1시간 처리해 주었다.B was prepared by adding 5 ul of NEB buffer, 5 ul of BSA buffer, 5 ug of DNA (1 ug / ul), 5 ul of SacII enzyme (NEB, cat # R0157S) and 30 ul of Autoclaved DW (autoclaved third distilled water, ADW) After enzyme-cut at 37 ° C for 1 hour 30 minutes, heat inactivation was inhibited at 65 ° C for 20 minutes. After that, Klenow (exo) (NEB, cat # M0212S) was treated to change the enzyme cut site to blunt end. The mixture was treated with 2 ul dNTP and 1 ul Klenow, treated at room temperature for 1 hour, and then heat inactivated at 75 ° C for 20 minutes. After addition of 5 ul of BlpI enzyme (NEB, cat # R0585S), enzyme cut was performed at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes, and Klenow was used to change enzyme cut site to blunt end. The mixture was treated with 2 ul dNTP and 1 ul Klenow and treated at room temperature for 1 hour.

A의 blunt end 부위와 B의 blunt end 부위가 ligation되었다. A, B를 gel extraction을 실시하였는데, 각각 A는 약 6.7Kb 사이즈의 DNA, B는 약 1.6Kb 사이즈의 DNA를 이용하였다. 그 후, A와 B의 농도와 분자 크기를 계산해 ligation하였다. 구체적으로는 Vector와 Insert DNA를 비율에 맞게 넣어주고 T4 DNA ligase(NEB cat# M0202S) 1ul 와 10Xligase buffer 2ul를 넣어주고, 총 20ul가 되도록 하였다. 상온에서 16시간 이상 ligation을 하였다.A blunt end site and B blunt end site were ligated. A and B were used for gel extraction. A DNA of about 6.7 Kb in size and DNA of about 1.6 Kb in size B were used. After that, concentrations and molecular sizes of A and B were calculated and ligation was performed. Specifically, 1 μl of T4 DNA ligase (NEB cat # M0202S) and 2 μl of 10 × ligase buffer were added to the vector and the insert DNA. Ligation at room temperature for more than 16 hours.

상기 과정을 통해 1차적으로 GIRK2-IRES-GFP 벡터를 제작하였고, 여기서 GFP를 제거해 준 후, GIRK1 openbiosystem 벡터의 GIRK1 부위를 삽입해 주었다.The GIRK2-IRES-GFP vector was first prepared by the above procedure. After removal of GFP, the GIRK1 region of the GIRK1 openbiosystem vector was inserted.

GIRK2-IRES-GFP의 DNA에서 벡터를 제작하는 과정은, NEB buffer4 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, XbaI(NEB, cat# R0145S) 5ul, ADW 30ul 를 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. 이 후 DNA cleanup 과정을 통해 DNA만 추출해준다. 그 후, NEB buffer3 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, NotI (NEB, cat# R0189S) 5ul, ADW 30ul 를 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. Vector의 self ligation을 억제하는 CIP(NEB, cat# M0290S) 2.5ul를 처리하고 37℃ 1시간 동안 처리하였다.5 μl of NEB buffer, 5 μl of BSA buffer, 5 μl of DNA (1 μg / μl), 5 μl of XbaI (NEB, cat # R0145S) and 30 μl of ADW were added to the vector in the GIRK2-IRES- The enzyme was cut for 1 hour 30 minutes and heat inactivation was inhibited at 65 ° C for 20 minutes. After that, DNA is extracted through DNA cleanup process. After that, 5 ul of NEB buffer, 5 ul of BSA buffer, 5 ug of DNA (1 ug / ul), 5 ul of NotI (NEB, cat # R0189S) and 30 ul of ADW were added and enzyme cut was performed at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes. The activity was inhibited by heat inactivation for 20 minutes. 2.5 L of CIP (NEB, cat # M0290S) inhibiting the self ligation of the vector was treated and treated at 37 DEG C for 1 hour.

C의 제조 과정은 NEB buffer4 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, XbaI(NEB, cat# R0145S) 5ul, ADW 30ul 를 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다. 이 후 DNA cleanup 과정을 통해 DNA만 추출하였다. 그 후, NEB buffer3 5ul, BSA buffer 5ul, DNA(1ug/ul) 5ug, NotI(NEB, cat# R0189S) 5ul, ADW 30ul를 넣어준 후 37℃에서 1시간 30분 동안 enzyme cut 해준 후 65℃에서 20분간 heat inactivation시켜 활성을 억제하였다.C was prepared by adding 5 μl of NEB buffer, 5 μl of BSA buffer, 5 μg of DNA (1 μg / μl), 5 μl of XbaI (NEB, cat # R0145S) and 30 μl of ADW, followed by enzyme cut at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes. Heat inactivation for 20 minutes at < RTI ID = 0.0 > 0 C < / RTI > DNA was then extracted through a DNA cleanup procedure. After that, 5 ul of NEB buffer, 5 ul of BSA buffer, 5 ug of DNA (1 ug / ul), 5 ul of NotI (NEB, cat # R0189S) and 30 ul of ADW were added and enzyme cut was performed at 37 ° C for 1 hour and 30 minutes. The activity was inhibited by heat inactivation for 20 minutes.

각각의 XbaI enzyme cut 부위와 NotI enzyme cut 부위가 ligation되었다. A, B를 gel extraction을 실시하였는데, 각각 A는 약 7.6Kb 사이즈의 DNA, B는 약 1.7Kb 사이즈의 DNA를 이용하였다. 그 후, A와 B의 농도와 분자 크기를 계산해 ligation하였다. 구체적으로는 Vector와 Insert DNA를 비율에 맞게 넣어주고 T4 DNA ligase(NEB cat# M0202S)1ul와 10Xligase buffer 2ul를 넣어주고 총 20ul가 되도록 하였다. 상온에서 16시간 이상 ligation을 하였다.Each XbaI enzyme cut site and NotI enzyme cut site were ligated. A and B were used for gel extraction. A DNA of about 7.6 Kb in size and DNA of about 1.7 Kb in size B were used. After that, concentrations and molecular sizes of A and B were calculated and ligation was performed. Specifically, 1 μl of T4 DNA ligase (NEB cat # M0 2 O 2 S) and 2 μl of 10 × ligase buffer were added to the vector and the insert DNA in the ratio, so that the total amount was 20 μl. Ligation at room temperature for more than 16 hours.

(5) (5) 칼슘포스페이트Calcium phosphate 트렌스펙션(CaHPOTransfection (CaHPO 4 4 Transfection)방법을Transfection 이용한 플라스미드의  Of the plasmid used 트랜스펙션Transfection

플라스미드 트랜스펙션은 칼슘포스페이트 트렌스펙션(CaHPO4 Transfection)을 이용해서 진행하였다.Plasmid transfection was carried out using calcium phosphate transfection (CaHPO4 Transfection).

0.3M CaCl2와 2XHBS를 이용해 트랜스펙션한 후, 96well plate 의 1well당 기준으로 총 10ul중 0.3M CaCl2는 8.7ul 트랜스펙션 할 DNA(GIRK2-IRES-GIRK1) 0.5ug나머지 DW로 용량을 맞춰주고 HBS(2X) 10ul 와 섞어준 후, 총 20ul를 well에 처리하였다.0.3M CaCl after transfection with the second and 2XHBS, a total of 10ul of 0.3M CaCl 2 to each of the reference 1well 96well plate is 8.7ul the transfected DNA (GIRK2-IRES-GIRK1) with 0.5ug remaining capacity DW to design After mixing with 10ul HBS (2X), 20ul was added to the wells.

플라스미드를 처리하기 전에 well에 있던 미디어는 바이러스를 제거하기 위해, 새로운 미디어로 갈아준 후 20ul를 처리하였다.Before the plasmid treatment, the media in the wells were replaced with fresh media to remove the virus and then treated with 20 ul.

4 내지 8시간 후 트랜스펙션을 위해 처리해 준 용액의 영향을 나타내지 않기 위하여, 미디어를 제거하고 새로운 미디어로 갈아주고, 약 48시간 후 형광을 측정하였다.To avoid the effect of the solution treated for transfection 4 to 8 hours later, the media was removed and replaced with fresh media and fluorescence was measured after about 48 hours.

(6) (6) 형광의 측정Measurement of fluorescence

알라토스타틴 수용체(Allatostatin receptor:AlstR) 단백질 유무에 따른 세포 내 세포막 전위 차이를 모니터링하여, 알라토스타틴 수용체가 발현된 세포와 알라토스타틴 수용체가 발현되지 않은 세포의 형광 차이를 확인하였다. 세포 내 세포막 전위 차이 변화에 따라 형광이 변화하고, 상기와 같은 형광의 변화를 형광 영상화 플레이트 판독기(Fluorescence Imaging Plate Reader: FLIPR)인 Zenyth 3100(microplate Multimode Detector)을 이용하여 하기의 방법으로 측정하였다.The differences in intracellular cell membrane potential with or without the allatostatin receptor (AlstR) protein were monitored to confirm the difference in fluorescence between the cells expressing the allatostatin receptor and the cells not expressing the allatostatin receptor. Fluorescence was changed according to the change in intracellular membrane potential difference, and the change in fluorescence was measured by the following method using a Zenyth 3100 (microplate multimode detector), which is a fluorescence imaging plate reader (FLIPR).

상기 실시예의 결과, 팩키징(packaging)된 바이러스를 인간세포에 도입하여 배양한지48 시간 후에 충분히 바이러스가 발현되면 형광을 측정하기 위한 준비로, 먼저 well 에 세포 잔여물이 존재하면 형광 측정에 방해가 될 수 있으므로, 세포 잔여물을 제거하기 위해 DiBAC4(3)를 녹이지 않은 타이로드 용액(Tyrode’s solution)을 이용해 세척하였다. 각 well에 미디어를 제거해 주고 타이로드 용액 100ul를 넣어 주고 다시 제거하는 작업을 2회 반복하였다. 그 후, 타이로드 용액에 미리 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide:DMSO)에 녹여준 DiBAC4(3)을 녹여서 5uM DiBAC용액을 제조하여 well당 180uL 씩 처리한 후 한 시간 동안 37℃에서 5% CO2incubator에서 배양하였다.As a result of the above example, when the packaged virus is introduced into human cells and the virus is sufficiently expressed 48 hours after the incubation, the preparation for measurement of fluorescence, if there is a cell residue in the well, To remove cell debris, DiBAC 4 (3) was washed with a non-dissolved Tyrode's solution. The media was removed from each well and 100 ul of tie-rod solution was added and then removed again. Then, 5 uM DiBAC solution was prepared by dissolving DiBAC 4 (3) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) in advance in the tie-rod solution, treated with 180 μL per well, and incubated for 1 hour at 37 ° C. in 5% CO 2 incubator.

한 시간 후 측정하고자 하는 물질을 5uM DiBAC solution에 녹여주고 각 well 당 20uL씩 추가로 첨가하면서, 시간에 따른 형광의 변화를 Zenyth 3100을 이용해 측정하였다. 형광은 3분 간격으로 측정하였고, 초기에는 아무것도 처리하지 않고 형광을 측정해서 상기 장비와 well이 측정을 위해 최적화 되었는지 확인하기 위해, control well의 형광 값 변화를 기준으로 삼고 다른 물질들의 측정 값과 차이를 비교하였다. 더욱 자세하게는, control well을 0을 기준으로 하여, 다른 물질을 넣어준 well을 control과 비교해 형광의 증가 감소를 측정하였다.After one hour, the material to be measured was dissolved in 5 uM DiBAC solution and added with 20 uL per well. The change of fluorescence with time was measured using Zenyth 3100. Fluorescence was measured at 3-minute intervals. Fluorescence was measured initially without any treatment, and the fluorescence values of the control wells were used as a reference to determine whether the instrument and well were optimized for the measurement. Were compared. More specifically, increase and decrease of fluorescence were measured by comparing control wells with controls in which other substances were added, with reference to 0 as a reference.

그 후, 측정 물질을 20ul씩 추가하면서, 형광의 세기를 측정하였다. 이 때 형광의 차이 비교는 측정 물질을 처리해 준 값과 이후의 변화 값 간의 차이를 비교하였다. 이는 well에 완충액(buffer)의 양이 늘어나게 되면, 형광의 절대값도 변화하기 때문이다.Then, the intensity of the fluorescence was measured while adding the measurement substance in an amount of 20 ul each. At this time, the fluorescence difference was compared between the difference between the treated value and the subsequent change value. This is because when the amount of buffer is increased in the well, the absolute value of fluorescence also changes.

알라토스타틴 수용체가 포함되어서 발현된 세포의 형광 변화와 알라토스타틴 수용체를 포함하지 않아 이 단백질이 발현되지 않은 세포의 형광 변화의 차이를 비교하여 원하는 타겟 물질이 알라토스타틴과 유사한 작용을 했는지 확인하였다. 구체적으로는, 타겟 물질과 알라토스타틴을 동시에 테스트할 때, 동일하게 작용하는 경우를 기준으로 하였다. 알라토스타틴을 처리하고 10분 이상의 시간이 지난 후 변화를 보면 도 3의 (a), (b), (c)의 그래프에서 알라토스타틴을 적용 시켜준 결과, 알라토스타틴 수용체의 유무에 따라 모두 증가하거나 감소하는 결과를 나타내었으나, 이로 인한 확실한 효과를 증명하기 어려웠다.We compared the changes in fluorescence of cells expressing the alatostatin receptor and the changes in fluorescence of cells not containing the alatostatin receptor and not expressing the protein to confirm whether the desired target substance had an action similar to that of alatostatin Respectively. Concretely, when the target substance and allastatin were simultaneously tested, the same test was performed. When alastostatin was treated and after 10 minutes or more, the changes were observed in the graphs of FIGS. 3 (a), 3 (b), and 3 (c) All of which showed an increase or decrease, but it was difficult to prove the definite effect.

반면 GIRK채널을 도입시켜준 도 4의 (a), (b), (c)의 그래프는 도 3과는 다른 양상을 나타내었다. 즉, AlstR-IRES-mCherry 를 이용한 세포의 실험에서는 알라토스타틴이 약 -5 내지 -2% 정도의 변화를 일으켰고, IRES-mCherry 를 이용한 세포의 실험은 알라토스타틴이 0 ~ +3% 변화를 일으키는 결과를 나타내었다. 따라서, 상기 두 실험 간의 형광 변화의 차이는 AlstR-IRES-mCherry의 경우에 -8 내지 -2% 정도의 형광 변화의 차이를 일으키는 결과를 나타내었다.
On the other hand, the graphs of FIGS. 4 (a), 4 (b) and 4 (c) introducing the GIRK channel are different from those of FIG. In other words, alastostatin showed a change of about -5 to -2% in the cell test using AlstR-IRES-mCherry, and the experiment using IRES-mCherry showed that the alastostatin changed 0 to + 3% . Therefore, the difference in fluorescence change between the two experiments resulted in a difference of fluorescence change of about -8 to -2% in the case of AlstR-IRES-mCherry.

Claims (5)

a) 알라토스타틴 수용체(Allatostatin receptor:AlstR) 단백질, 형광 단백질 및 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함하는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조하는 단계;
b) 알라토스타틴 수용체 단백질을 포함하지 않고, 형광 단백질 및 내부 리보솜 유입 부위(IRES)를 포함하는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터를 제조하는 단계;
c) 상기 a) 및 b)단계에서 제조된 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 각각을 바이러스로 팩키징(packaging)하는 단계;
d) 상기 c)단계에서 제조된 바이러스 각각을 GIRK채널(G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel)을 발현시킬 수 있는 동물 세포 군에서 선택되는 1종에 도입시키는 단계;
e) 상기 d)단계의 동물 세포에 도입시키기 위한 GIRK채널을 포함하는 플라스미드를 제작하고, 칼슘포스페이트 트렌스펙션(CaHPO4 Transfection)방법을 이용해 GIRK채널을 포함하는 플라스미드를 각각의 세포에 도입시켜 GIRK 채널을 과발현시켜주는 단계; 및
f) 살충 후보 물질 및 전압 민감성 염료를 상기 e)단계에서 GIRK채널을 포함하는 바이러스가 도입된 동물 세포 각각에 첨가한 후, 세포 내 세포막 전위 차이에 따른 형광 변화를 모니터링하여, 알라토스타틴 수용체가 발현된 동물 세포와 알라토스타틴 수용체가 발현되지 않은 동물 세포의 형광 측정을 통해 살충 후보 물질 중 알라토스타틴 어고니스트로 작용하는 물질을 찾는 단계를 포함하는 살충 물질을 스크리닝하는 방법.a) preparing an adeno-associated virus vector comprising an allatostatin receptor (AlstR) protein, a fluorescent protein and an internal ribosome entry site (IRES);
b) producing an adeno-associated virus vector comprising a fluorescent protein and an internal ribosome entry site (IRES) without the allatostatin receptor protein;
c) packaging each of the adeno-associated virus vectors prepared in steps a) and b) with a virus;
d) introducing each of the viruses prepared in the step c) into one species selected from the group of animal cells capable of expressing a GIRK channel (G protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel);
e) preparing a plasmid containing a GIRK channel for introduction into animal cells in step d), and introducing a plasmid containing a GIRK channel into each cell using calcium phosphate transfection (CaHPO 4 Transfection) ; And
f) insecticidal candidate substances and voltage sensitive dyes are added to each of the animal cells into which viruses containing the GIRK channel have been introduced in step e), and fluorescence changes according to the difference in intracellular cell membrane potentials are monitored to determine whether the allatostatin receptor A method for screening an insecticidal substance comprising the step of detecting a substance acting as an allostatin agonist in a pesticide candidate substance by measuring fluorescence of an animal cell in which the expressed animal cell and the alatostatin receptor are not expressed. 청구항 1에 있어서, 상기 형광 단백질은 mCherry 단백질인 것을 특징으로 하는, 살충 물질을 스크리닝하는 방법.The method according to claim 1, wherein the fluorescent protein is an mCherry protein. 청구항 1에 있어서, 상기 GIRK 채널을 발현하는 동물 세포는 HEK 293T cell, HEK 293 cell, NIH3T3 cell 및 Neuro2a cell로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는, 살충 물질을 스크리닝하는 방법.[Claim 4] The method according to claim 1, wherein the animal cell expressing the GIRK channel is one selected from the group consisting of HEK 293T cell, HEK 293 cell, NIH3T3 cell, and Neuro2a cell. 청구항 1에 있어서, 상기 GIRK 채널은 GIRK1, GIRK2, GIRK3 및 GIRK4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 살충 물질을 스크리닝하는 방법.The method according to claim 1, wherein the GIRK channel is at least one selected from the group consisting of GIRK1, GIRK2, GIRK3, and GIRK4. 청구항 1에 있어서, 상기 전압 민감성 염료는 비스-(1,3-디부틸바비튜릭 에시드)트리메틴 옥소놀(Bis-(1,3-Dibutylbarbituric Acid)Trimethine Oxonol:DiBAC4(3)), 비스-(1,3-디에틸티오바비튜릭 에시드) 트리메틴 옥소놀(Bis-(1,3-diethylthiobarbituric acid)trimethine oxonol:DiSBAC2(3)) 및 비스-(1,3-디부틸바비튜릭 에시드)펜타메틴 옥소놀(Bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)pentamethine oxonol:DiBAC4(5))로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는, 살충 물질을 스크리닝하는 방법.
The method of claim 1, wherein the voltage sensitive dye is selected from the group consisting of bis- (1,3-dibutylbarbituric acid) bis- (1,3-Dibutylbarbituric acid) Trimethine Oxonol (DiBAC4 (1,3-diethylthiobarbituric acid) trimethine oxonol (DiSBAC2 (3)) and bis- (1,3-dibutylbarbituric acid) pentamethine Wherein the insecticidal compound is one selected from the group consisting of bis- (1,3- dibutylbarbituric acid) pentamethine oxonol: DiBAC4 (5).
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