KR101458764B1 - 수검초 추출물 및 알파 아사론을 포함하는 인지 기능 개선 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수검초 추출물 및 알파 아사론을 포함하는 인지 기능 개선 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 수검초 추출물 및 그 분획물인 알파 아사론이 뇌 내 지질과산화물의 축적을 억제하며 신경 전달 체계에 있어서 중요한 역할을 수행하는 아세틸콜린에스터라아제의 활성을 저하시키는 특성을 이용하여 인지 기능 장애 또는 치매 등의 신경 변성 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 수검초 추출물 및 알파 아사론을 포함하는 인지 기능 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

수검초 추출물 및 알파 아사론을 포함하는 인지 기능 개선 및 치료용 조성물 {A Composition comprising the Extract of Acorus gramineus Root and α-Asarone for Preventing and Treating Cognitive Impairment}

본 발명은 수검초 추출물 및 알파 아사론(α-Asarone)을 포함하는 인지 기능 개선 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 수검초 추출물 및 그 분획물인 알파 아사론이 뇌 내 지질과산화물의 축적을 억제하고, 항산화 효능을 가지며 신경 전달 체계에 있어서 중요한 역할을 수행하는 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase, AChE)의 활성을 저하시키는 특성을 이용하여 인지 기능 장애 또는 치매 등의 신경 변성 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 수검초 추출물 및 알파 아사론을 포함하는 인지 기능 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 인지 기능 장애(Cognitive impairment)는 뇌질환, 뇌상해, 중독, 노령화 등으로 인한 정신적, 행동적 장애 및 내분비 이상(Endocrine disorder), 대사 영양적 이상(Metabolic or Nutritional abnormalities), 약물 등으로 인한 정신 질환을 포괄하는 것으로서, 증상의 정도에 따라 일시적 단기 기억 장애에 해당하는 건망증(Anmesia) 뿐만 아니라 전반적인 지남력과 판단력 장애를 유발하는 인지 기능 장애(증) 및 치매(Dementia)에서도 나타나는 뇌질환의 일종이다.

심각한 수준의 알츠하이머 질환(Alzhimer's disease)으로 진행되기 전단계인 가벼운 인지 기능 장애(Mildcognitive impairment, MCI)는 최근 기억의 상실과 함께 학습능력, 집중력, 사고력의 저하 및 언어능력 저하 등의 증상을 포함하는데, MCI 환자의 80 % 이상이 10년 이내에 알츠하이머 질환으로 발전하며 이는 65세 이상의 건강한 인구의 1 % 만이 알츠하이머 질환에 걸리는 것에 비해 훨씬 높은 수치이다.

즉, 인지 기능 장애는 노화에 따른 퇴행성 기억 저하(Age-associated memory impairment, AAMI)와는 구별되며 발병 기전 및 경과 특성상 알츠하이머 치매와 밀접한 연관 관계를 갖는 질환으로서, 동일한 나이와 유사한 교육 수준의 집단에 비해 현저한 기억력 및 인지기능 저하를 나타낸다.

알츠하이머 치매 환자는 전체 치매 환자의 70 % 이상을 차지하며, 발병 원인은 완전히 규명되지 않았으나 최근까지 진행된 연구 결과에 따르면 신경섬유성 엉킴(Neurofibrillary tangles) 및 신경염성 플라크(Plaques)의 축적으로 나타나는 콜린성 신경의 쇠퇴가 주요 원인으로 추정된다.

다양한 인자, 예를 들어 흥분독성(Excitotoxicity), 산화적 스트레스, 성장인자 쇠퇴(Growth factor withdrawal), 사이토카인 또는 독성물질(Toxin) 등이 뇌신경계 질환으로 발전하는 신경 세포 손상을 야기할 수 있다.

대부분의 신경 세포 손상은 이온자극성(Ionotropic) 또는 대사자극성(Metabotropic) 글루타메이트(Glutamate) 수용체의 과 자극에서 기인하는 것으로 추정된다.

글루타메이트는 뇌에서 밀리몰 수준으로 발견되며, 뇌에서 N-메틸-D-아스파르테이트(Nmethyl-D-aspartate, NMDA) 수용체 및 비-NMDA 수용체에 작용하여 중추 흥분성 신경전달(Central excitatory neurotransmission)에 있어서 중요한 역할을 한다.

글루타메이트와 같은 흥분성 아미노산은 신경 존속(Neuronal survival), 시냅토제네시스(Synaptogenesis), 신경 유연성(Neuronal plasticity), 학습(Learning), 기억 과정에 관여한다.

그러나 글루타메이트는 또한 급성 및 만성이라는 두 가지의 명확히 구분되는 기전에 의해 중추 신경계에서 신경성 세포 손실을 야기하는 것으로 알려져 있다.

예를 들어, 글루타메이트 신경전달 물질계에 있어서의 이상(Abnormalities)은 발작, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 허혈 및 척수 외상(Ischemia and spinal cord trauma) 등의 신경계 질환에 관여될 수 있다.

최근 노인성 치매 및 파킨슨 질환이 퇴행성 중추신경계 질환으로 인정되고 그 환자의 수가 날로 증가함에 따라 커다란 사회적 문제로 대두되면서 이의 예방이나 개선, 치료에 대한 중요성이 새롭게 부각되고 있다.

알츠하이머 질환 환자는 콜린성, 아드레날린성, GABA성 및 글루타메이트성 신경 등 거의 모든 신경에 이상이 초래되나, 특히 콜린성 신경의 손실이 가장 심각한 것으로 알려져 있으며, 이에 따라 콜린성 신경의 이상을 회복시키거나 개선시키는 방향으로 치료제 개발이 활발히 이루어지고 있다.

예를 들어, 실험 대상 동물에 스코폴라민(Scopolamine)을 투여하여 콜린성 신경계에 이상을 유발시켜 알츠하이머 질환과 유사한 상태를 인위적으로 조작할 수 있는 방법이 알려지면서 인지 능력 개선 및 알츠하이머 질환의 치료제 개발이 진일보하게 되었다(Flood, J. and Cherkin, A. Scopolamine effects on memory retention in mice, Behav. Neural. Biol. 45:169-184(1986)).

스코폴라민을 투여하면 콜린성 신경 기능의 퇴행과 기억력 상실증이 나타나는 것은 물론, 습득력, 즉각적인 대응법, 활동기억(working memory)에 결함이 나타난다(Smith, 1988; Giacobini, E. and Cuadra, G.(1994)).

이러한 증상은 콜린성 신경의 효능제인 아레콜린(Arecoline) 및 옥소트레모린(Oxotremorine)이나 아세틸콜린의 분해를 억제시킴으로써 세포 내의 아세틸콜린의 농도를 유지시키는 아세틸콜린에스테라제 저해제인 타크린(Tacrine) 등의 투여에 의하여 완화되었다.

다만, 타크린이 임상에서 일부 사용되고 있기는 하나 간독성, 짧은 반감기 및 낮은 생체 내 이용률 등의 문제가 제기되고 있어 새로운 대체 약물을 찾기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

이에 본 발명자들은 새로운 뇌 기능 및 인지 기능 개선 활성을 갖는 물질을 찾기 위하여 검색하던 중 수검초 추출물 및 그의 분획물 알파 아사론이 유의성 있는 뇌 기능 및 인지 기능 개선 활성을 갖고 있음을 in vitro 실험계와 스코폴라민을 이용한 마우스 시스템을 이용하여 확인하였다.

종래 본 발명에 따른 수검초 추출물 및 알파 아사론이 기억력 개선 효과를 나타냄으로써, 결국 인지 기능 장애 관련 질환의 예방 및 치료 효과를 나타냄에 대해서는 개시되거나 암시된 바 없다.

인지 기능 장애 치료를 위한 기술 중 하나로서, 한국등록특허 제10-0861730호 '연자육 추출물을 함유하는 인지 기능 장애 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물'은, 연자육 추출물을 유효성분으로 하여 인지 기능 장애를 완화하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 상술한 바와 같이 한국등록특허 제10-0861730호 역시 수검초 추출물 또는 그 분획물인 알파 아사론을 인지 기능 장애의 예방 또는 치료에 적용하는 기술은 아니었다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 상기 문제점을 극복하기 위한 것으로서, 수검초 추출물 및 그 분획물인 알파 아사론이 뇌 내 지질과산화물의 축적을 억제하고 항산화 효능을 가지며 신경 전달 체계에 있어서 중요한 역할을 수행하는 아세틸콜린에스터라아제의 활성을 저하시키는 특성을 이용하여 인지 기능 개선용 건강 기능 식품 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하며, 이에 대응하는 수검초 추출물 추출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 수검초 추출물을 포함하는 인지 기능 개선 및 치료용 조성물에 관한 것이며, 상기 수검초 추출물의 분획물인 알파 아사론(α-Asarone)을 포함할 수 있고, 적절한 담체, 희석제, 부형제를 더 포함할 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 인지 기능 개선 및 치료용 조성물은 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase, AChE) 활성 억제 기능을 포함하며, 항산화 효능을 가지며, 뇌 내 지질 과산화물 축적 억제 기능을 포함하는 것을 특징으로 한다.

아울러, 본 발명은 이러한 조성물을 함유하는 인지 기능 개선 및 치료용 건강 기능 식품과, 약제학적 조성물을 포함한다.

한편, 본 발명은 인지 기능 개선 및 치료용 수검초 추출물 추출 방법에 관한 것으로, (A) 수검초를 건조하고 건조한 수검초에 극성 용매를 혼합하는 단계; (B) 수검초와 극성 용매를 혼합한 혼합물로부터 수검초 추출액을 추출한 후 여과하고 농축 및 건조하여 수검초 추출물을 수득하는 단계; 및 (C) 수득한 수검초 추출물을 현탁시키고 용매 분리 방법을 사용하여 분획함으로써 수검초 분획물을 획득하는 단계;를 포함한다.

본 발명에 따르면, 인지 기능 개선 또는 치매 등의 신경 변성 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 수검초 추출물 및 그 분획물인 알파 아사론을 포함하는 인지 기능 개선 및 치료용 조성물, 건강 기능 식품, 약제학적 조성물을 제공하며, 이에 대응하는 수검초 추출물 추출 방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 수검초 추출물의 활성산소 제거 효능을 나타내는 그래프.
도 2는 수검초 추출물의 AChE 활성 저해 효능을 나타내는 그래프.
도 3는 알파 아사론의 수동 회피 실험 효능을 나타내는 그래프.
도 4은 알파 아사론의 Y-미로 실험 효능을 나타내는 그래프.
도 5는 마우스의 뇌 조직에서 AChE 활성에 대한 알파 아사론의 효능을 나타내는 그래프.
도 6는 마우스의 뇌 조직에서 MDA와 SOD level에 대한 알파 아사론의 효능을 나타내는 그래프.

본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 할 것이다.

또한, 본 발명에 관련된 공지 기능 및 그 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는, 그 구체적인 설명을 생략하였음에 유의해야 할 것이다.

본 발명은, 수검초 추출물을 포함하는 인지 기능 개선용 건강 기능 식품 및 치료용 조성물을 제공하며, 건강 기능 식품의 경우에는 액제, 정제, 환제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되고, 수검초 추출물의 분획물인 알파 아사론(α-Asarone)을 포함하며, 약제학적으로 허용되는 적절한 담체, 희석제, 부형제를 포함한다.

본 발명에 따른 인지 기능 개선 및 치료용 조성물은 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase, AChE) 활성 억제 기능과 함께, 항산화 효능을 가지며, 뇌 내 지질 과산화물 축적 억제 기능을 가진다.

아울러, 본 발명은 이러한 조성물을 함유하는 인지 기능 개선 및 치료용 건강 기능 식품과, 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 1회 복용량 당 수검초 추출물의 중량은 100 mg 내지 5000 mg인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물의 1회 복용량 당 수검초 추출물의 중량이 100 mg 내지 500 mg으로서, 정제로 제조되는 경우, 1 내지 20정/회로 하여 아침, 낮, 저녁의 1일 3회, 식전에 복용하는 것이 바람직하다.

1포당 수검초 추출물의 중량이 500 mg 내지 5000 mg인 과립으로서 제조되는 경우, 1 내지 4포/회로 하여 아침, 낮, 저녁의 1일 3회, 식전에 복용하는 것이 바람직하다.

1 ml 제제 당 수검초 추출물의 중량이 0.3 mg 내지 300 mg인 액제로서 제조되는 경우, 20 내지 500 ml/ 회로 하여 아침, 낮, 저녁의 1일 3회, 식전에 복용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 수검초 추출물을 포함하는 약제학적 조성물의 유효 용량은 환자의 성별, 나이, 체중, 또는 질환의 정도 등에 따라 차이가 있을 수 있으나, 수검초 내 알파 아사론의 유효함량은 1~1,000 mg/kg이고 바람직하게는 10 내지 500 mg/kg 이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 수검초 추출물 및 그 분획물인 알파 아사론의 추출 방법에 관해 상세히 설명한다.

먼저, 수검초를 건조 및 세정한다.

구체적으로, 수검초의 뿌리 부분을 20 ℃ 내지 25 ℃의 온도를 유지하면서 7일간 완전 건조하였으며 일정한 크기로 절단하여 세정하였고, 결론적으로는 건조된 수검초 500 g을 수득하였다.

다음으로, 세정한 수검초에 열수 또는 극성 용매를 혼합한다.

이때, 수검초와 혼합하는 열수 또는 극성 용매의 중량은 수검초의 중량 대비 1 내지 10배 중량이며, 바람직하게는 3 내지 5배 중량이고, 극성 용매로는 메탄올, 에탄올, 아세톤, 핵산 또는 이들의 혼합 용매를 사용하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, 세정한 수검초 500 g에 80 % 에탄올 수용액 2 L를 혼합하였다.

다음으로, 수검초와 열수 또는 극성 용매를 혼합한 혼합물로부터 수검초 추출액을 추출한 후 여과하고 진공 농축(50 ℃ 내지 55 ℃) 및 동결 건조함으로써 본 발명에 따른 수검초 추출물을 수득한다.

이때, 수검초 추출액 추출 방법으로는 환류 추출 방법 또는 초음파 추출 방법을 채택하는 것이 바람직하다.

또한, 극성 용매를 이용하여 수검초 추출액을 추출하는 경우 3일 내지 7일간 침적 추출하거나 2시간 내지 10시간 동안 가온 추출하는 것이 바람직하다.

구체적으로는, 수검초 추출물을 농축 및 건조하였을 때 평균 수득률은 10 % 이상이었다.

그리고, 수득한 수검초 추출물을 증류수에 현탁시키고 용매 분리 방법을 사용하여 극성에 따라 순차적으로 분획함으로써 알파 아사론을 포함하는 수검초 분획물을 획득하였다.

본 발명을 실험 예에 의해 더욱 상세히 설명하기 전에, 후술하는 실험 예들에 있어서 사용시약, 실험동물, 실험에 사용한 동물 그룹과 약물 투여 방식, 통계 분석 방법은 다음과 같다.

사용시약

Electric eel acetylcholinesterase, Acetyl thiocholine iodide(ATCI), 5, 5-dithiobis(2-nitrobenzioc) acid(DTNB), Scopolamine hydrochloride, α-asarone, Tacrine hydrochloride hydrate(THA),

Methylcellulose는 미국의 Sigma 사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며, Tween80은 미국의 Calbiochem 사(Gibbstown, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다.

실험동물

중앙실험 동물회사(Central Lab Animal facility, 한국)로부터 ICR계 마우스를 구입(수컷, 8주령, 25~30 g)하여 실험에 사용하였다.

실험에 사용된 동물들은 건국대학교 실험동물 사육실에서 일정한 광량 조건(12/12 h light and dark cycle; 12시간은 밝고 12시간은 어두운 주기)과 온도 조건(23±1도)에서 케이지 당 4마리씩 사육되었으며, 2주 동안 실험실 환경에 적응된 후 행동 실험에 사용되었다.

모든 실험적인 절차는 NIH Guide care 지침(NIH Publication No. 85-23, 1985, revised 1996)과 건국대학교 실험동물 위원회의 동물 시험 지침에 따라 수행되었다.

실험에 사용한 동물 그룹과 약물 투여 방식

마우스는 8마리씩 6개의 그룹(1. vehicle, 2. scopolamine 2 mg/kg, 3. α-asarone 3 mg/kg, 4. α-asarone 10 mg/kg, 5. α-asarone 30 mg/kg, 6. THA 10 mg/kg)으로 나누어진 후 실험에 투입되었다.

각각의 α-asarone은 1 %의 Tween 80이 포함된 0.5 %의 Methycellulose 용액으로 용해하여 준비하였으며, 스코폴라민은 생리적 식염수로, 타크린(THA)은 3차 증류수에 녹여 사용하였다.

vehicle 그룹을 제외한 모든 마우스는 수동 회피 실험을 시작하기 5분 전에 그리고 Y-maze 실험으로부터 30분 전에 scopolamine hydrochloride(2 mg/kg, i.p.)을 처리하였으며, 각각의 α-asarone 용량은 scopolamine 처리 전 15일 동안 마우스에 투여하였다.

통계 분석 방법

모든 실험 데이터는 Graph pad prism(version 5.01 (USA)) 프로그램에 의해 분석되었으며, mean ± SEM로 명시하였고, Tuckey Multiple comparison test에 따라 One Way ANOVA를 통해 분석되었다.

약물 투여 처리 각각의 효능은 표준 마우스, 스코폴라민, α-asarone, 스코폴라민 처리군과 비교하였으며, 유의성은 p<0.05을 기준으로 하였다.

이하, 본 발명을 다음의 실험 예들에 의해 더욱 상세히 설명한다.

실험 예 1 - 아세틸콜린에스터라제 ( AChE ) 활성 측정

본 실험은 Ellman 법(Ellman G.L, Courtney K.D, Andres V.J, Featherstone R.M. A new and rapid colormetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol.7:88-95 (1961))에 기초하였으며, ATCI는 반응의 기질로서, DTNB는 AChE 활성의 측정을 위해 사용되었다.

0.1 M sodium phosphate buffer(pH 8.0) 150 μl, 10 μl test compound 용액, 그리고 20 μl 효소 용액(0.1 units/ml)을 혼합하여 교반한 후, 25도에서 15분 동안 경과시키고, 10 mM 농도의 DTNB 10 μl와 14 mM 농도의 ATCI 10 μl을 첨가하여 반응을 시작시켰다.

ATCI 가수분해는 DNTB와 thiocholine의 반응에 의하여 형성된 5-thio-2-nitrobenzoate anion forme 형성을 통해 측정하였는데, 구체적으로 10분 경과 후 410 nm 파장에서 흡광도를 측정하였고, THA는 대조군(positive control)으로 사용하였다.

실험 예 2 - 수동 회피 실험을 통한 학습 능력 효과 측정

수동 회피 행동을 위한 훈련 및 시험을 위해서는 두 개의 동일한 명/암 정방형 상자를 가진 미국 GEMINI 사(San Diego Instruments, San Diego, CA, USA)의 수동 회피 실험 시스템(Active and passive avoidance system)을 사용하였다.

이러한 장치는 명 챔버(밝은 방)과 암 챔버(어두운 방)을 가지고 있으며, 컴퓨터로 조절되는 문에 의해 구분된다.

마우스를 밝은 방에 넣은 후 빛을 주어 어두운 방으로 가게 한 후 전류를 통하게 하여 마우스가 이를 기억하게 하였다. 즉, 마우스가 어두운 방으로 들어가면 문이 자동으로 닫히고 5초간 0.5 mA의 전기적 발 쇼크(Electrical foot shock)를 준다.

이때, 밝은 방에서 어두운 방으로 회피하는데 걸리는 시간 TLT(Transfer latency time)을 컴퓨터를 통해 기록, 저장하였으며, 전기적 쇼크 및 문의 개폐는 부착된 장치 시스템에 의해 조절되었다.

마우스가 180초 동안 밝은 방에 머물 경우, 마우스가 1회 훈련 시도 후 수동 회피 훈련을 기억하는 것으로 하여, 수동 회피 실험 결과를 분석하였다.

실험 예 3 - Y-미로실험 (Y- maze test )

Y-미로실험의 장치는 3개의 가지(각 가지를 A, B, C로 정함)로 구성되어 있으며 각 가지(arm)의 통로 길이는 40 cm, 폭은 12 cm, 높이는 30 cm이고 세 개의 가지가 인접한 가지와 접하는 각도는 120도이고 모든 실험 장치는 검은색의 polyvinyl plastic으로 구성되어 있다.

미로의 한쪽 가지에 마우스를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 마우스가 들어간 가지를 기록하였는데, 마우스가 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하며, 갔던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다.

이때, 세 개의 다른 가지에 차례로 들어간 경우 1점(실제 변경, actual alternation)씩 부여하며, 변경 행동력(Alternation behavior)은 다음과 같이 계산된다.

변경 행동력 (%) = 실제변경 (actual alternation) / 최고변경 (총 입장횟수 - 2; total number of arm entries) X 100

실험 예 4 - 마우스 뇌 조직 적출( Tissue acquisition )

정상 마우스와 시료 처리군의 마우스에 스코폴라민을 30분, α-asarone/THA를 60분 처리한 후 희생시켜 마우스의 뇌를 적출하였다.

그 후 마우스의 뇌로부터 조심스럽게 해마(Hippocampus)와 대뇌피질 (Cerebral cortex) 부분을 분리하여 MDA level, AChE 활성, SOD 활성 등을 측정하였다.

실험 예 5 - 지질 과산화 측정( Malondialdehyde Assays )

Lipid peroxidation의 산물인 Malondialdehyde(MDA) level 측정을 위해서는 Western blot(OxiselectTMMDAImmunoblotkit,CellBiolabs,SanDiego,USA)을 이용하였다.

각각의 뇌 조직의 전체 단백질은 10 % RIPA 완충용액으로부터 [1 PBS, 1 % NP-40, 0.5 % sodium deoxycholate, 0.1 % SDS, protease inhibitor cock-tail]를 이용하여 추출하였다.

단백질 농도는 Bio-Rad 사(Hercules, CA, USA)의 DC protein assay를 통해 측정하였다.

단백질 20 μl/ml을 10 % sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels 전기영동 수행 후 PVDF membrane에 옮기고 이 membrane을 0.1 % Tween-20과 5 % dry Skim milk가 포함된 TBS로 1시간 동안 block시키며, 1차 항체인 anti-MDA을 이용하여 분석하였다.

1차 항체 anti-MDA는 1:1000으로 희석시켜 사용하였고, 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies, 1:1000)는 1시간 동안 반응시켰다.

이미지 분석 장치(Luminescent Image Analyzer, LAS-3000, Fuji, Japan)를 이용하여 항체 특이적 신호를 분석하였다.

실험 예 6 - 아세틸콜린에스터라제와 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제의 활성 측 정

10 % w/v 0.1 M Phosphate buffer를 이용하여 뇌 조직 균질 추출물을 준비하였다.

AChE 활성은 제조 회사에서 Biochain kit(CA, USA)로 제시한 화학비색계의 측정법을 이용하여 분석하였다.

항산화 효소 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(SOD)로는 Dojindo Molecular Technology kit(Maryland,USA)를 사용하였다.

실험 결과

1. 아세틸콜린에스터라아제 ( AChE ) 활성 측정 결과

신경 전달 물질 중의 하나인 아세틸콜린(Acetylcholine)은 시냅스와 시냅스 사이의 신경 전달에 관계하는 가장 중요한 물질로 알려져 있으며, 아세틸콜린에스터라아제(AChE)는 아세틸콜린을 아세테이트와 콜린으로 가수분해하는 효소로써 인지 기능 개선제 및 치매 질환 치료제로 사용되는 약품들의 표적 물질이며, 알츠하이머 질병 환자의 뇌에서 이 효소의 수준이 감소하는 것으로 알려져 있다.

상술한 바와 같이 본 발명자들은 인지 기능과 긴밀한 연관성을 가지는 아세틸콜린에스터라아제(AChE) 활성을 수검초 추출물을 이용하여 in vitro 실험계에서, 알파 아사론은 마우스 뇌 조직을 사용하여 측정하였다.

도 2를 참조하면 수검초 추출물은 Ellman 법을 이용한 실험을 통하여 AchE 억제 활성이 있으며 아세틸콜린에스터라아제의 분해를 억제함을 확인하였고, 도 5a 및 도 5b를 참조하면, 동물모델에서도 동일하게 효과를 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 수검초 추출물의 활성산소 제거 효능을 확인하기 위하여, ESR 스펙트로미터를 이용하여 자유라디칼 소거 효능(Free radical scavenging activity)을 측정하였다.

1-1. DPPH 라디칼 소거 효능 측정

본 발명에서 DPPH 라디칼 소거 효능 측정을 위한 방법으로는, 난조 등의 문헌(Nanjo, F., Goto, K., Seto, R., Suzuki, M., Sakai, M., Hara, Y., Free radical biology and medicine 21; 895-902. 1996.)에 기술된 방법을 사용하였다.

구체적으로, 각기 다른 함량으로 조제된 수검초 추출물 60 ul에 DPPH 60 ul (60 uM, in methanol solution)을 투입한 후 10초간 혼합하고, 100 ul 테플론 모세관으로 이동시켜 2분 후 ESR 스펙트로미터로 측정하였다.

도 1a에 나타낸 바와 같이, 수검초 추출물의 농도에 의존적으로 hydroxyl radical 소거 효능을 확인하였으며, IC₅₀은 0.589 ± 0.042 mg/ml이었다.

1-2. 퍼옥시 라디칼 ( Peroxy radical ) 소거 효능 측정

APPH는 알킬 라디칼 형으로 분해되며, 알킬 라디칼과 산소(O₂)의 반응으로 지질 과산화(Lipid peroxidation)를 유도한다.

APPH를 37 ℃에서 30분간 배양하면 4-PBON/자유 라디칼의 알킬 라디칼 스핀 생성물이 발생된다.

본 발명에서는 각기 다른 함량의 수검초 추출물과 10 mM APPH, 10 mM 4-POBN을 혼합한 PBS(pH 7.4) 반응물을 37 water bath에 30분간 incubation하고 100 ul 테플론 모세관으로 이동시켜 ESR 스펙트로미터(JEOL, Tokyo, Japan)로 측정하였다.

도 1b에 도시한 바와 같이, 그 결과, 수검초 추출물의 농도에 따라 alkyl radical 소거 효능을 확인하였으며, IC₅₀은 0.521 ± 0.071 mg/ml이었다.

도 1a 및 도 1b에서, 수검초 추출물은 1-100 μg/ml의 농도로 사용하였고 타크린은 대조군(positive control)으로 사용하였다(**p<0.01, ***p<0.001 vs. Vehicle group).

상술한 바와 같이, 실험 데이터는 Graph pad prism v5.01 software를 이용해 Tuckey Multiple comparison test를 따라 one-way ANOVA를 사용하여 mean ± S.E.M.(n = 3)로 나타내었다.

2. 수동 회피 행동 실험 결과

도 3a 및 도 3b를 참조하면, 수동 회피 행동 실험에서 밝은 방(명 챔버)에서 어두운 방(암 챔버)으로 이동을 회피하는데 걸리는 시간 TLT(Transfer latency time)는 대조군에서 첫 번째 시도(14.6±2.3)에 비해 두 번째 시도(213.5±26.9)에서 현저하게 증가하였다.

그러나 스코폴라민(Scopolamine) 처리군은 첫 번째 시도(18.6±4.4)에 비해 두 번째 시도(21.05±4.01)에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다.

15일 동안 α-asarone을 전 처리(3, 10 and 30 mg/kg, p.o.)한 그룹에서는 첫 번째 시험의 TLT(29.4±7.3), (23.7±4.3) and (29.6±15.5)와 비교하여 두 번째 시험에서 TLT가 현저하게 증가(112.72±50.17), (157.52±39.42), (176.68±21.92)하였다.

10, 30 mg/kg 농도에서는 스코폴라민 처리 그룹에 비해 현저한 증가를 보였는데, 이는 첫 번째 시도의 TLT은 중요한 의미를 주지 않음을 의미한다.

현재 임상에서 사용되는 아세틸콜린에스테라제 저해제인 타크린(tacrine) 등의 투여 타크린(THA)이 대조군(Positive control)으로서 사용되었다.

도 3a는 α-asarone의 구조를 나타낸 것이며, 도 3b는 스코폴라민을 이용한 수동 회피 실험에서의 α-asarone의 효능을 나타낸 것으로서, 상술한 바와 같이 Graph pad prism v5.01 software를 이용해 Tuckey Multiple comparison test를 따라 one-way ANOVA를 사용하여 mean ± S.E.M.(n = 8)로서 나타내었다.

3. Y-미로실험 (Y- maze test ) 결과

도 4a 및 도 4b를 참조하면, Y-미로 실험 장치를 이용한 변경 행동력(Alternation behavior) 실험에서는 스코폴라민(2 mg/kg, i.p) 처리 30분 후 변경 행동력이 유의성 있게 감소하였다.

spontaneous alternation assessed는 적응 후 30분 테스트에서 percentage alternation가 감소하였으며, α-asarone을 전 처리(3, 10 and 30 mg/kg, p.o.)한 마우스 그룹에서는 변경 행동력 감소가 개선되었다.

각 그룹의 마우스의 총 입장횟수(Total arm entry)는 차이를 보이지 않았다.

도 4a는 총 입장횟수(Total Arm entry)를 나타낸 것이며, 도 4b는 변경 행동력(Percentage alternation)을 나타낸 것으로서, 타크린(10 mg/kg)은 대조군(Positive control)으로 사용하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. 스코폴라민 group. ###p<0.001 vs. vehicle group).

상술한 바와 같이, 각 데이터는 Graph pad prism v5.01 software를 이용해 Tuckey Multiple comparison test를 따라 one-way ANOVA를 사용하여 mean ± S.E.M.(n = 8)로서 나타내었다.

4. 마우스 뇌 조직 적출( Tissue acquisition ) 결과

상술한 바와 같이, 정상 마우스와 시료 처리군의 마우스를 스코폴라민 30분, α-asarone과 타크린(THA) 60분 처리한 후 희생시켜 뇌를 적출하고 해마(Hippocampus)와 대뇌 피질(Cerebral cortex) 부분을 분리하여 AChE 활성을 측정한 결과, 도 5a 및 도 5b에 도시한 바와 같이, 스코폴라민 처리군은 vehicle 그룹에 비해 대뇌 피질(CC)에서 AChE의 활성이 16 %, 해마(Hippo)에서는 32 % 증가하였다.

반면 α-asarone 전 처리 그룹에서는 α-asarone(3, 10, 30 mg/kg) 처리에서 대뇌 피질에서는 AChE 활성을 각각 17 %, 37 %, 31 %만큼 감소시켰으며 해마에서는 AChE 활성을 20 %, 33 %, 34 %만큼 감소시켰다.

타크린(THA)은 AChE 활성을 대뇌 피질에서 33 %, 해마에서 4 % 억제시켰다.

도 5a는 대뇌 피질(CC)에 대한 것이며, 도 5b는 해마에 대한 것으로서, AChE는 IU/L로 나타내었고, 타크린(10 mg/kg)은 대조군(Positive control)으로 사용하였다(**p<0.01, ***p<0.001 vs. 스코폴라민 group. ###p<0.001 vs. vehicle group).

상술한 바와 같이, 각 데이터는 Graph pad prism v5.01 software를 이용해 Tuckey Multiple comparison test를 따라 one-way ANOVA를 사용하여 mean ± S.E.M.(n = 4)로서 나타내었다.

5. 지질 과산화 측정( Malondialdehyde Assays ) 결과

지질 과산화는 생체외적인 요인뿐만 아니라 내적인 요인에 의해 생성된 산소 자유라디칼이 관여함으로써 야기되며 뇌는 산화적 반응이 쉬운 다중 불포화지방산의 함량이 높고, 체내산소 소모량이 다른 장기에 비하여 많아 산화적 손상을 받기 쉬운 것으로 보고되고 있으며, 이로 인한 지질 과산화물의 축적은 세포기능 이상을 야기하며 중추신경계의 기능을 퇴화시키는 것으로 알려져 있다.

증가하는 Malondialdehyde(MDA) level은 in vivo 상태에서 Lipid peroxidation의 중요한 지표이며 스코폴라민의 처리는 대뇌 피질과 해마 두 군데의 MDA level을 증가시켰다.

도 6a 및 도 6b를 참조하면, α-asarone의 전 처리는 뇌의 두 군데 조직 모두에서 일어난 스코폴라민 유도 MDA 발현 증가를 억제시켰다.

대뇌 피질(CC)에서 α-asarone(10 mg/kg)은 MDA level의 증가를 억제시켰고, 해마에서는 α-asarone 농도 의존적으로 MDA를 억제시켰으며, THA는 대뇌 피질과 해마 모두에서 MDA를 완화시켰다.

도 6a 및 도 6b는 각각 β-actin에 대한 MDA의 밴드 선명도 대뇌피질(CC)과 해마(Hippo)에 관한 것이며, SOD 활성은 control의 %로서 나타내었고 CC(open box)와 Hippo(closed box)에서는 THA(10 mg/kg)를 Positive control로서 사용하였다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. 스코폴라민 group. # # #p<0.001 vs. vehicle group).

상술한 바와 같이, 각 데이터는 Graph pad prism v5.01 software를 이용해 Tuckey Multiple comparison test를 따라 one-way ANOVA를 사용하여 mean ± S.E.M.(n = 4)로서 나타내었다.

6. 아세틸콜린에스터라제와 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제의 활성 측정 결과

도 6c를 참조하면, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제의 활성(SOD)은 대조군에 비해 스코폴라민 처리군은 뇌의 대뇌 피질과 해마부분에서 현저한 SOD 활성 증가를 보였다.

α-asarone(30 mg/kg) 처리 그룹에서는 대뇌 피질과 해마 조직 두 군데 모두 증가된 SOD 활성을 현저하게 감소시켰으며, 타크린(THA)은 해마의 SOD 활성을 현저하게 완화시켰다.

이상으로 본 발명의 기술적 사상을 예시하기 위한 바람직한 실시 예와 관련하여 설명하고 도시하였지만, 본 발명은 이와 같이 도시되고 설명된 그대로의 구성 및 작용에만 국한되는 것이 아니며, 기술적 사상의 범주를 일탈함이 없이 본 발명에 대해 다수의 변경 및 수정 가능함을 당업자들은 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 그러한 모든 적절한 변경 및 수정과 균등물들도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주하여야 할 것이다.

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10. 아세틸콜린에스터라아제 활성을 억제하여 건망증 개선에 효과가 있는 건망증 개선용 수검초 추출물 추출 방법에 있어서,
    (A) 수검초의 뿌리를 20℃ 내지 25℃에서 7일간 건조시킨 후 절단하여 세정하고, 상기 건조 및 세정한 수검초에 극성 용매를 혼합하는 단계;
    (B) 수검초와 극성 용매를 혼합한 혼합물로부터 수검초 추출액을 추출한 후 여과하고, 진공 농축 및 동결 건조하여 수검초 추출물을 수득하는 단계; 및
    (C) 수득한 수검초 추출물을 증류수에 현탁시키고 용매 분리 방법을 사용하여 극성에 따라 순차적으로 분획함으로써 알파 아사론(α-Asarone)을 포함하는 수검초 분획물을 획득하는 단계;를 포함하되,
    상기 (A) 단계에서 건조 및 세정한 수검초와 혼합하는 극성 용매의 중량은 수검초의 중량 대비 3배 내지 5배 중량이며, 극성 용매는 에탄올 및 증류수의 혼합 한 농도 80%의 에탄올 수용액인 것을 특징으로 하며,
    상기 (B) 단계에서 수검초 추출액을 추출하는 방법으로는 3일 내지 7일간의 침적 추출 방법을 채택하며, 진공 농축은 50℃ 내지 55℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 건망증 개선용 수검초 추출물 추출 방법.
    
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