KR101451852B1 - Vector including the codon-optimized dna cassette for producing secretory recombinant dodecamer trail - Google Patents
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Abstract
본 발명은 분비 신호 서열의 연결, 12량체 형성 도메인의 연결, TRAIL을 포함한 DNA 카세트의 코돈최적화로 특징지어지는 새로운 TRAIL 생산을 위한 DNA 카세트 및 이를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 생산된 분비형 재조합 12량체 TRAIL 단백질과 상기 벡터를 이용하여 제조한 분비형 재조합 12량체 TRAIL 단백질을 생산하는 아데노바이러스에 관한 것이며, 상기 단백질 및 아데노바이러스는 항암 조성물로 제공할 수 있다.The present invention relates to DNA cassettes for the production of new TRAIL characterized by the linkage of secretory signal sequences, the linkage of the 12-mer forming domains, and the codon optimization of DNA cassettes containing TRAIL, and vectors containing the same. The present invention also relates to an adenovirus producing the secretory recombinant 12-mer TRAIL protein produced using the vector and the secretory recombinant 12-mer TRAIL protein prepared using the vector, wherein the protein and the adenovirus are anti-cancer Composition.
Description
본 발명은 분비 신호 서열의 연결, 12량체 형성 도메인의 연결, TRAIL을 포함한 DNA 카세트의 코돈최적화로 특징지어지는 새로운 TRAIL 생산을 위한 DNA 카세트 및 이를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 또한, 상기 벡터를 이용하여 생산된 분비형 재조합 12량체 TRAIL 단백질과 상기 벡터를 이용하여 제조한 분비형 재조합 12량체 TRAIL 단백질을 생산하는 재조합 아데노바이러스에 관한 것이며, 상기 재조합 12량체 TRAIL 단백질 및 아데노바이러스는 항암 조성물로 제공한다.The present invention relates to DNA cassettes for the production of new TRAIL characterized by the linkage of secretory signal sequences, the linkage of the 12-mer forming domains, and the codon optimization of DNA cassettes containing TRAIL, and vectors containing the same. The present invention also relates to a recombinant adenovirus producing the secreted recombinant 12-mer TRAIL protein produced by using the vector and the secretory recombinant 12-mer TRAIL protein prepared using the vector, wherein the recombinant 12-mer TRAIL protein and adenovirus Are provided as anticancer compositions.
TNF (tumor necrosis factor) family 단백질은 면역제어와 염증 반응에 핵심적 조절자 역할을 담당한다. 현재까지 20개 단백질이 알려져 있는 TNF family 단백질군에는 TNF-α, TNF-β, LT-β, 4-1BBL, OX40L, CD27L, CD30L, CD40L, FasL (Apo-IL), 그리고 TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand, Apo-2L) 등이 이에 속한다. 이중 TRAIL은 선택적으로 암세포의 사멸을 유도할 수 있다는 특징이 알려져 왔다 (Wiley et al., Immunity,3(6):673-682, 1995). 실제 TRAIL은 일반 세포에 대해서는 무해하면서, 다양한 암 세포주에 대해서만 독성을 유도한다는 특징 들이 밝혀졌다 (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest.,104:155-162, 1999; Walczak et al., Nat. Med.,5:157-163, 1999). 이러한 일반 세포에 무해한 특성은 일반 세포의 표면에만 존재하는 유인 수용체 1, 2 (DcR1, DcR2)의 기능 때문이다 (Sheridan et al., Science,277:81 8-821, 1997). DcR1, DcR2는 TRAIL과 결합이 가능하지만, 세포내 신호 전달 부분이 결여되어 있어서 일반 세포들은 TRAIL에 의한 세포 사멸 유도가 일어나지 않게 된다. 이러한 TRAIL의 선택적인 암세포 사멸 유도 특징은 암치료의 획기적인 매개체로 주목을 받고 있다.The TNF (tumor necrosis factor) family of proteins play a key regulator of immune regulation and inflammatory response. To date, 20 proteins have been identified in the TNF family of proteins including TNF-α, TNF-β, LT-β, 4-1BBL, OX40L, CD27L, CD30L, CD40L, FasL inducing ligand, Apo-2L). TRAIL has been shown to selectively induce the death of cancer cells (Wiley et al., Immunity, 3 (6): 673-682, 1995). Indeed, TRAIL has been shown to be toxic to normal cells, but to induce toxicity only in a variety of cancer cell lines (Ashkenazi et al., J. Clin. Invest., 104: 155-162, 1999; Walczak et al., Nat Med., 5: 157-163, 1999). These non-harmful properties are due to the function of
이러한 TRAIL을 항암제로 사용하기 위해 쉽게 생각해 볼 수 있는 것이 TRAIL 단백질 (rTRAIL)을 이용하는 것이다. 하지만 rTRAIL을 이용하는 데는 기술적, 경제적 문제점이 있다. 충분한 양으로 고품질의 안전한 rTRAIL을 생산하는 것은 기술적으로 힘들며, 설사 생산한다 하더라도 비용이 많이 든다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 유전자 치료를 근간으로 하는 방법이 연구되었다. 유전자 치료 기법은 세포 밖에서 rTRAIL을 따로 생산할 필요가 없고, 생체 내에서 스스로 TRAIL을 만들어 냄으로써 경제성이나 안전성 면에서도 우수한 장점이 있다. 또한 단백질보다 오래 지속된다는 이점이 있으며, 특정 조직 특이하게 전달 가능해서 생체 내 전반적인 확산으로 인한 부작용의 위험도 덜 수 있다.The TRAIL protein (rTRAIL) can be easily conceived to use this TRAIL as an anticancer agent. However, there are technical and economic problems in using rTRAIL. Producing high quality, safe rTRAIL in sufficient quantities is technically challenging and even costly to produce. To overcome these problems, a method based on gene therapy has been studied. The gene therapy technique does not require the production of rTRAIL separately from the outside of the cell, and it is advantageous in terms of economy and safety by producing TRAIL by itself in vivo. It also has the advantage of lasting longer than the protein, and is capable of delivering a specific tissue specificity, thus reducing the risk of side effects due to overall in vivo spread.
TRAIL의 유전자 치료를 위해서 TRAIL 수용체 DR4, DR5와 반응하는 TRAIL의 세포외부 부분(아미노산 114-281)을 이용한 연구가 진행되었다. 일반적으로 TNF superfamily는 세포막에 위치해 단일 3량체(Homotrimer)의 형태로 다른 세포의 막에 존재하는 TNF 수용체에 결합함으로써 신호를 전달한다. 하지만 TNF superfamily 의 세포외부 부분만을 암호화하는 벡터에 의해 발현되는 수용성 TNF superfamily는 불안정한 형태의 단일 3량체를 이루며, 결과적으로 미비한 생물학적 효과를 보인다. 이런 문제를 극복하기 위해 TNF superfamily를 안정한 형태로 다량체화 하는 방법이 고안되었다. 그 예가 바로 항체의 Fc 부분을 이용한 2량체화, CD8의 세포외부 부분을 이용한 2량체화, 이소류신지퍼(Isoleucine zipper motif)를 이용한 3량체화이다. 이와 관련하여 대표적인 TNF superfamily인 CD40L의 안정성 및 생물학적 활성이 재조합 DNA 기술 및 항체의 Fc 부분을 이용한 2량체화 (Fanslow et al., J.Immunol. 136: 4099, 1986), CD8의 세포외부 부분을 이용한 2량체화 (Hollenbaugh et al., EMBO J. 11: 4313, 1992), 이소류신지퍼(Isoleucine zipper motif)를 이용한 3량체화 (Morris et al., J. Biol. Chem. 274: 418, 1999)에 의해 향상된다는 사실이 보고 된 바 있다. 하지만 비록 단일 3량체가 다량체화 부분의 연결에 의해 안정화 되었을지라도, 한 분자 단위로 존재하는 수용성 단일 3량체의 TNF superfamily는 세포막에 위치하는 막단백질 형태의 TRAIL의 생물학적 효과를 완벽히 재현할 수 없다. 이는 세포막에 위치하는 TNF superfamily는 여러 개의 단일 3량체가 동시에 결합, 작용해 보다 빠르고 강한 신호를 유발하기 때문이다. 이와 같은 맥락에서 3량체 이상의 다량체화를 위해 12량체 형성 도메인을 이용하는 방법이 고안되었다. 12량체 형성 도메인인 SPD(surfactant protein D)를 이용한 TNF superfamily의 12량체화는 이들의 생물학적 효과를 증진 시킨다고 알려져 있으며 (미국 특허공개 제2005-0158831호), 실제로 SPD 핵산서열을 CD40L의 핵산서열과 재조합 DNA 기술로 연결했을때 12량체 형태의 CD40L가 만들어 지고 이는 3량체 형 태의 CD40L 보다 우수한 생물학적 효과를 유도한다고 밝혀졌다 (Haswell et al., Eur. J. Immunol. 31: 3094, 2001). 하지만 상기 특허의 경우 SPD의 효과는 CD40L에 국한되어 있으며, SPD에 의한 12량체화가 TRAIL에도 동일하게 작용하는지에 관하여는 어떠한 것도 개시되어 있지 않았다.For gene therapy of TRAIL, studies were carried out using the extracellular portion of TRAIL (amino acids 114-281), which reacts with TRAIL receptors DR4 and DR5. In general, the TNF superfamily is located on the cell membrane and delivers signals by binding to TNF receptors present in the membrane of other cells in the form of a single trimer (homotrimer). However, the water-soluble TNF superfamily expressed by a vector that encodes only the extracellular portion of the TNF superfamily forms an unstable single trimer, resulting in a poor biological effect. In order to overcome this problem, a method of massiming a TNF superfamily into a stable form has been devised. Examples are dimerization using the Fc portion of the antibody, dimerization using the extracellular portion of CD8, and dimerization using the isoleucine zipper motif. In this regard, the stability and biological activity of the representative TNF superfamily, CD40L, is demonstrated by recombinant DNA technology and dimerization using the Fc portion of the antibody (Fanslow et al., J. Immunol . 136: 4099, 1986) (Morris et al., J. Biol. Chem . 274: 418, 1999) using an isoleucine zipper motif (Hollenbaugh et al., EMBO J. 11: 4313, . The results of this study are summarized as follows. However, even though single trimer is stabilized by the linkage of the massif part, the soluble single trimer of TNF superfamily present in one molecular unit can not completely reproduce the biological effect of TRAIL in the membrane protein form located in the cell membrane. This is because the TNF superfamily located in the cell membrane binds and acts on several single trimer molecules simultaneously, resulting in a faster and stronger signal. In this context, a method of using a 12-mer formation domain for devising a trimer or higher polymerisation has been devised. 12-merization of TNF superfamily using SPD (surfactant protein D), which is a 12-mer formation domain, is known to promote their biological effects (U.S. Patent Publication No. 2005-0158831). In fact, SPD nucleic acid sequences are known to be related to CD40L When coupled with recombinant DNA technology, it was shown that a 12-mer form of CD40L was produced, leading to better biological effects than trimerized CD40L (Haswell et al., Eur. J. Immunol . 31: 3094, 2001). However, in the case of the above patent, the effect of SPD is limited to CD40L, and nothing has been disclosed about whether 12-methylation by SPD works the same in TRAIL.
한편, 코돈 최적화는 DNA의 발현률을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 코돈최적화는 숙주세포에서 발현 빈도가 높은 코돈으로 염기를 치환하는 것으로, 숙주 내에서 DNA가 단백질로 전사(transcription) 및 번역(translation)될 때 아미노산을 지령하는 코돈 사이에 숙주에 따라 선호도가 높은 코돈이 존재하는데, 이들 선호도가 높은 코돈으로 치환함으로써 그 핵산이 암호화하는 아미노산 또는 단백질의 발현 효율을 증가시키는 것을 말한다. 실제로 유전자 치료제 또는 백신 개발에 있어서 항원의 핵산 서열의 코돈 최적화는 항원의 세포내 발현률을 증가시킴으로써 항원성을 극대화할 수 있다고 알려져 있다.On the other hand, codon optimization is known to increase the expression of DNA. The codon optimization is a substitution of a base with a codon having a high frequency of expression in the host cell. When the DNA is transcribed and transcribed into a protein in the host, a codon having a high preference Quot; means that the expression efficiency of the amino acid or protein encoded by the nucleic acid is increased by replacing the codon with the higher preference. In fact, in the development of a gene therapy agent or a vaccine, optimization of the codon of the nucleic acid sequence of the antigen is known to maximize the antigenicity by increasing the intracellular expression rate of the antigen.
이에 본 발명자는 TRAIL을 이용한 보다 효율적인 항암 유전자 치료제를 개발하기 위하여, 세포외부 분비를 증진시키는 분비 신호 서열의 연결, 12량체를 형성하는 도메인의 연결, TRAIL을 포함한 이들 DNA 카세트의 코돈최적화의 방법을 모두 적용함으로써, 항암 효과가 월등히 향상된 TRAIL을 발현하는 최적화된 재조합 아데노바이러스를 생산하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 사용된 분비 신호 서열은 코돈 최적화된 tPA(tissue plasminogen activation) 신호 서열이며, 기존의 분비 신호 서열 보다 우수한 분비 유도성을 가진다. 본 발명에 사용된 12량체 형성 도메인은 네 개의 3량체가 연결된 형태로서, 12량체를 형성할 수 있는 코 돈 최적화된 SPD(surfactant protein D) 서열로 야생형 SPD 서열 보다 향상된 성능을 가진다. 본 발명에 사용된 TRAIL 핵산서열은 코돈 최적화된 TRAIL 세포외부 부분 핵산서열로 기존에 사용된 야생형의 TRAIL 세포외부 부분 핵산서열에 비해 월등히 향상된 발현률과 세포사멸 유도 능력을 가진다. 결론적으로 상기 3가지 구성으로 특성 지어지는, 분비형 12량체 TRAIL을 발현하는 코돈최적화된 재조합 아데노바이러스는 기존의 TRAIL 재조합 아데노바이러스에 비해 보다 향상된 암세포 살상 능력을 보인다. 이는, 코돈최적화에 의한 TRAIL을 포함한 DNA 카세트의 번역(translation) 증가와 tPA 분비 신호 서열의 연결에 의한 분비 유도의 결과 TRAIL 발현이 증가되었기 때문이며, 또한 SPD 도메인 연결에 의한 12량체 TRAIL의 안정화된 구조 형성 및 강한 세포사멸 신호전달이 이루어졌기 때문이며, 이러한 특징은 기존의 발명과 구성 및 성능 면에서 차별화된다.Therefore, in order to develop a more efficient anticancer gene therapeutic agent using TRAIL, the inventors of the present invention have found that a method of linking secretory signal sequences promoting extracellular secretion, linking domains forming a 12-mer, and codon optimization of these DNA cassettes including TRAIL The present inventors have produced an optimized recombinant adenovirus that expresses TRAIL with greatly improved anticancer effect. Thus, the present invention has been completed. The secretory signal sequence used in the present invention is a codon-optimized tissue plasminogen activation (tPA) signal sequence and has secretory inducibility superior to that of the conventional secretory signal sequence. The 12-mer formation domain used in the present invention is a corton-optimized SPD (surfactant protein D) sequence capable of forming a 12-mer structure in which four trimer is connected, and has an improved performance over the wild-type SPD sequence. The TRAIL nucleic acid sequence used in the present invention is a codon-optimized outer partial nucleic acid sequence of a TRAIL cell, and has a remarkably improved expression ratio and apoptosis inducing ability as compared to wild-type TRAIL outer nucleic acid sequence used in the prior art. In conclusion, the codon-optimized recombinant adenovirus expressing the secreted 12-mer TRAIL, which is characterized by the above-mentioned three constitutions, shows a better cancer cell killing ability than the conventional TRAIL recombinant adenovirus. This is because TRAIL expression was increased as a result of the increase in translation of DNA cassette including TRAIL by codon optimization and the induction of secretion by the linkage of tPA secretory signal sequence and the stabilized structure of 12-mer TRAIL by SPD domain linkage Formation and strong cell death signaling, and these characteristics are differentiated from the conventional invention, composition and performance.
기술적 과제Technical Challenge
본 발명의 하나의 목적은 (i) 분비 신호 서열(secretion signal sequence)을 암호화하는 핵산서열, (ii) 12량체 형성 도메인(dodecamer-forming domain)을 암호화하는 핵산서열 및 (iii) TRAIL을 암호화하는 핵산서열을 포함하고, 상기 핵산 서열들이 세포 내에서 고수준으로 발현할 수 있도록 코돈이 최적화된, 분비형 재조합 12량체 TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand) 단백질 생산을 위한 DNA 카세트를 제공하기 위함이다.One object of the present invention is to provide a nucleic acid sequence encoding a polypeptide comprising (i) a nucleic acid sequence encoding a secretion signal sequence, (ii) a nucleic acid sequence encoding a dodecamer-forming domain, and (iii) The present invention provides a DNA cassette for producing secretory recombinant 12-TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) protein, which contains a nucleic acid sequence and the codon is optimized so that the nucleic acid sequences can be expressed at a high level in a cell.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 DNA 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하기 위함이다.It is still another object of the present invention to provide a recombinant expression vector comprising the DNA cassette.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 생산된 재조합 12량체 TRAIL 단백질을 제공하기 위함이다.Another object of the present invention is to provide a recombinant 12-mer TRAIL protein produced using the vector.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 제조한 재조합 12량체 TRAIL 단백질을 생산하는 아데노바이러스를 제공하기 위함이다.It is still another object of the present invention to provide an adenovirus producing the recombinant 12-mer TRAIL protein produced using the vector.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 벡터, 상기 벡터를 이용하여 생산된 재조합 12량체 TRAIL 단백질, 및 상기 벡터를 이용하여 생산된 아데노바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 항암 조성물을 제공하기 위함이다.Yet another object of the present invention is to provide an anticancer composition comprising any one selected from the group consisting of the vector, the recombinant 12-mer TRAIL protein produced using the vector, and the adenovirus produced using the vector to be.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 벡터 또는 상기 벡터를 이용하여 생산된 아데노바이러스를 포함하는 항암 활성을 가지는 백신 조성물을 제공하기 위함이다.It is still another object of the present invention to provide a vaccine composition having anticancer activity comprising the vector or the adenovirus produced using the vector.
도 1은 분비 신호 서열(tPA), 12량체(dodecamer) 형성 도메인 (SPD) 및 코돈 최적화된 TRAIL (114-281)로 구성된 분비형 재조합 12량체 TRAIL 단백질을 생산하는 벡터의 개략도이다.Figure 1 is a schematic diagram of a vector producing secretory recombinant 12-mer TRAIL protein consisting of secretory signal sequence (tPA), dodecamer forming domain (SPD) and codon optimized TRAIL (114-281).
도 2는 tPA 분비 신호 서열, SPD 12량체 형성 도메인, TRAIL(114-281)을 발현하는 핵산의 야생형과 코돈 최적화된 형태를 상호 비교한 그림이다.Figure 2 compares the wild-type and codon-optimized forms of the tPA secretory signal sequence, the SPD-12 dimer formation domain, and the nucleic acid expressing TRAIL (114-281).
도 3는 제조한 아데노바이러스 (rAd/tdTRAIL co)에 의해 발현된 12량체 TRAIL 단백질을 웨스턴 블랏 방법을 이용해서 확인한 그림이다.FIG. 3 is a graph showing the 12-mer TRAIL protein expressed by the adenovirus (rAd / tdTRAIL co ) produced by Western blotting.
도 4는 12량체 TRAIL을 발현하는 아데노바이러스 (rAd/tdTRAIL co)의 암세포 살상능력을 사람 뇌종양세포 (U-87MG), 사람 흑색종세포 (A375), 사람 자궁암세포 (Hela)에서 측정한 결과이다.4 shows the results of measuring the ability of adenovirus (rAd / tdTRAIL co ) expressing the 12-mer TRAIL to kill cancer cells in human brain tumor cells (U-87MG), human melanoma cells (A375) and human uterine cancer cells (Hela) .
발명의 실시를 위한 최선의 형태Best Mode for Carrying Out the Invention
하나의 양태로서, 본 발명은 (i) 분비 신호 서열(secretion signal sequence)을 암호화하는 핵산서열, (ii) 12량체 형성 도메인(dodecamer-forming domain)을 암호화하는 핵산서열 및 (iii) TRAIL을 암호화하는 핵산서열을 포함하고, 상기 핵산서열들이 세포 내에서 고수준으로 발현할 수 있도록 코돈 최적화된, 분비형 재조합 12량체 TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand) 단백질 생산을 위한 DNA 카세트에 관한 것이다.(Ii) a nucleic acid sequence encoding a dodecamer-forming domain; and (iii) a nucleic acid sequence encoding a TRAIL encoding sequence. To a DNA cassette for producing a secreted recombinant 12-TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand) protein which is codon-optimized so that the nucleic acid sequences can be expressed at a high level in a cell.
본 발명에서 용어, "재조합 12량체 TRAIL 단백질"이란 합성된 TRAIL이 결합하여 12량체(dodecamer)의 구조를 가지는 TRAIL 단백질을 말하며, 본 발명의 12량체 TRAIL 단백질은 단량체 또는 삼량체 구조의 TRAIL보다 증가된 선택적인 암세포 사멸 유도 활성을 보인다. 본 발명에 있어서, TRAIL 단백질을 12량체 형태로 제조하기 위하여 12량체 형성 도메인(dodecamer-forming domain)을 암호화하는 핵산이 TRAIL 단백질을 암호화하는 핵산의 5'-상부에 위치하도록 하였다.The term "recombinant 12-mer TRAIL protein" as used herein refers to a TRAIL protein having the structure of a dodecamer with the synthesized TRAIL bound thereto, and the 12-mer TRAIL protein of the present invention has an increased Lt; RTI ID = 0.0 > cancer-inducing < / RTI > In the present invention, in order to prepare the TRAIL protein in the form of a 12-mer, the nucleic acid encoding the dodecamer-forming domain is located at the 5'-upper portion of the nucleic acid encoding the TRAIL protein.
본 발명의 TRAIL 단백질은 전체 서열 또는 TRAIL 수용체 DR4 또는 DR5와 반응하는 활성을 가진다면 TRAIL 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 일부 서열을 이용할 수 있다. 바람직하게는 TRAIL의 전체 핵산 서열에서 TRAIL의 114 내지 281의 핵산서열에 해당하는 서열을 이용할 수 있다. 상기 TRAIL 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 당해 분야의 통상의 지식을 가지는 자가 Genebank (GeneID: 8743, Pitti. R. M. et al., J. Biol. Chem. 271: 12687, 1996)로부터 용이하게 정보를 입수하여, 용이하게 제조할 수 있다.The TRAIL protein of the present invention may use a partial sequence of the nucleic acid sequence encoding the TRAIL protein if it has an activity to react with the whole sequence or the TRAIL receptor DR4 or DR5. Preferably, sequences corresponding to nucleic acid sequences 114 to 281 of TRAIL can be used in the entire nucleic acid sequence of TRAIL. The nucleic acid sequence encoding the TRAIL protein can be readily obtained from Genebank (GeneID: 8743, Pitti, RM et al., J. Biol. Chem . 271: 12687, 1996) , And can be easily produced.
또한 본 발명의 TRAIL 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 야생형과 동일한 서열을 그대로 사용할 수 있으나, 바람직하게는 포유류, 특히 인간 세포 내에서 TRAIL 단백질의 발현 빈도가 증가하도록 TRAIL 단백질의 유전자 코돈을 최적화한 서열을 사용한다. 상기 "유전자 코돈을 최적화한 서열" 또는 본 발명에서 사용된 용어 "코돈 최적화"는 포유류, 특히 인간 세포 내에서 목적 물질(예를 들어, 본 발명의 TRAIL 단백질 등)의 발현량이 증가하도록 목적 물질을 암호화하고 있는 아미노산 코돈 중 일부 아미노산 코돈을 치환하는 것을 말한다. 이러한 아미노산 코돈의 일부 치환은 당업자에 의하여 다양한 조합 및 응용이 가능할 것이다. 본 발명에서는, TRAIL 단백질의 아미노산 코돈, 구체적으로 알라닌(Ala: A), 아르기닌(Arg: R), 아스파라긴(Asn: N), 아스파테이트(Asp: D), 시스테인(Cys: C), 글루타민(Gln: Q), 글루타메이트(Clu: E), 글리신(Gly: G), 히스티딘(His: H), 이소류신(Ile: I), 류신(Leu: L), 라이신(Lys: K), 페닐알라닌(Phe: F), 프롤린(Pro: P), 세린(Ser: S), 쓰레오닌(Thr: T), 발린(Val: V) 및 타이로신(Tyr: Y)을 암호화하는 하나 이상의 유전자 코돈을 인간 세포에서 높은 빈도로 인지되는 유전자 코돈으로 치환한다. 본 발명의 구체적인 실시에서는, TRAIL의 114 내지 281에 해당하는 야생형 핵산서열을 코돈 최적화하였고, 이를 서열번호 3으로 나타내었으며, 야생형과 코돈 최적화된 핵산서열을 도2에 상호 비교하였다. 종래 유전자 치료제에 사용된 TRAIL의 세포외부 부분의 핵산서열이 모두 야생형인 경우와 비교하여 본 발명의 코돈 최적화 된 TRAIL을 유전자 치료에 이용할 경우 TRAIL의 세포사멸 유도 효과가 보다 향상될 것이다.In addition, the nucleic acid sequence encoding the TRAIL protein of the present invention can use the same sequence as that of the wild type, but it is preferable to use a sequence which optimizes the gene codon of the TRAIL protein so as to increase the expression frequency of the TRAIL protein in the mammal, use. As used herein, the term " optimized gene codon "or the term" codon optimization ", as used in the present invention, refers to optimization of a target substance to increase the expression amount of a target substance (for example, TRAIL protein of the present invention) Refers to substitution of some amino acid codons among the amino acid codons that are being encoded. Some substitutions of such amino acid codons may be made by a person skilled in the art in various combinations and applications. In the present invention, the amino acid codon of TRAIL protein, specifically alanine (Ala: A), arginine (Arg: R), asparagine (Asn: N), aspartate (Asp: D), cysteine (Cys: C), glutamine Gln: Q, Glu: E, Gly: G, Hist: H, Ile: One or more gene codons coding for a proline (Pro: P), a serine (Ser: S), a threonine (Thr: T), a valine (Val: V) and a tyrosine And the gene codon is recognized as a high frequency in the present invention. In a specific embodiment of the present invention, the wild-type nucleic acid sequence corresponding to 114 to 281 of TRAIL was codon-optimized, represented by SEQ ID NO: 3, and the wild type and codon-optimized nucleic acid sequences were compared with each other in FIG. The use of the codon-optimized TRAIL of the present invention for gene therapy as compared with the case where all the nucleic acid sequences of the extracellular part of TRAIL used in the conventional gene therapy agent are wild type, will further enhance the induction effect of TRAIL.
상기 TRAIL 단백질을 안정한 형태로 다량체화하여 TRAIL 단백질의 항암 효과를 향상시키기 위하여, 본 발명은 상기 TRAIL 단백질이 3량체가 아닌 12량체를 형성하도록 한다. 이를 위하여 본 발명에서는 12량체 형성 도메인(dodecamer-forming domain)을 이용하였으며, 상기 12량체 형성 도메인을 암호화하는 핵산서열이 TRAIL 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 5'-상부에 위치하도록 하였다. 상기 12량체 형성 도메인은 바람직하게는 SPD(surfactant protein D)를 사용한다.In order to mass-convert the TRAIL protein into a stable form and improve the anticancer effect of the TRAIL protein, the present invention allows the TRAIL protein to form a trimer which is not a trimer. For this purpose, a dodecamer-forming domain was used in the present invention, and the nucleic acid sequence encoding the 12-mer forming domain was located at the 5'-upper position of the nucleic acid sequence encoding the TRAIL protein. The above-mentioned 12-mer-forming domain preferably uses SPD (surfactant protein D).
본 발명의 12량체 형성 도메인은 핵산 서열의 유전자 코돈이 포유류, 특히 인간 세포에서 발현 빈도가 높은 유전자 코돈으로 최적화된 것을 특징으로 한다. 즉, 12량체 형성 도메인의 아미노산 코돈, 구체적으로 알라닌(Ala: A), 아르기닌(Arg: R), 아스파라긴(Asn: N), 아스파테이트(Asp: D), 시스테인(Cys: C), 글루타민(Gln: Q), 글루타메이트(Clu: E), 글리신(Gly: G), 히스티딘(His: H), 이소류신(Ile: I), 류신(Leu: L), 라이신(Lys: K), 페닐알라닌(Phe: F), 프롤린(Pro: P), 세린(Ser: S), 쓰레오닌(Thr: T), 발린(Val: V) 및 타이로신(Tyr: Y)을 암호화하는 하나 이상의 유전자 코돈을 인간 세포에서 높은 빈도로 인지되는 유전자 코돈으로 치환할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시에서는, SPD(surfactant protein D)를 암호화하는 핵산 서열에서 78번 내지 314번을 코돈 최적화하였으며, 이를 서열번호 2로 나타내었으며, 야생형과 코돈 최적화된 핵산서열을 도2에서 상호 비교하였다. 따라서, 상기 코돈 최적화된 SPD는 야생형 SPD보다 우수한 발현 정도를 나타낸다.The 12-mer forming domain of the present invention is characterized in that the gene codon of the nucleic acid sequence is optimized to a gene codon highly expressed in mammals, especially human cells. Specifically, the amino acid codon of the 12-mer forming domain, specifically alanine (Ala: A), arginine (Arg: R), asparagine (Asn: N), aspartate (Asp: D), cysteine (Cys: C), glutamine Gln: Q, Glu: E, Gly: G, Hist: H, Ile: One or more gene codons coding for a proline (Pro: P), a serine (Ser: S), a threonine (Thr: T), a valine (Val: V) and a tyrosine The gene codons can be replaced with a gene codon recognized at a high frequency. In a specific embodiment of the present invention, the nucleotide sequence encoding SPD (surfactant protein D) is codon-optimized from No. 78 to No. 314, which is represented by SEQ ID NO: 2, and the wild type and codon- Respectively. Thus, the codon-optimized SPD exhibits better expression than the wild-type SPD.
또한, 본 발명은 상기 TRAIL 단백질을 세포외부로 분비될 수 있도록 안내자 역할을 하는 분비 신호 서열(secretion signal sequence)를 사용한다. TRAIL 단백질은 세포막에 위치하는 단백질이기 때문에 자체적인 분비 신호 서열을 가지고 있지 않으며, TRAIL 세포 외부 부분은 분비 신호 서열에 의해 세포외부로 분비 가능하며 TRAIL 단백질에 의한 세포사멸 신호를 유도하는 것으로 알려져 있다(대한민국 특허출원 제2000-0038441호). 따라서, 본 발명의 12량체 구조의 TRAIL 단백질을 세포 외부로 분비하여 항암 효과를 증대시키기 위하여 분비 신호 서열을 사용하며, 이 분비 신호 서열을 상기 12량체 형성 도메인을 암호화하는 핵산의 5'-상부에 위치하도록 한다. 상기 분비 신호 서열은 tPA, HSV, gDs, SEC2, SEC(CV) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 tPA를 사용한다. 본 발명의 구체적 실시에서 사용된 tPA 분비 신호 서열은 우수한 분비 유도성을 가지는 분비 신호 서열로서, 종래 결핵 DNA 백신 개발에 있어서 tPA 신호 서열을 결핵 항원과 연결하였을 때 결핵항원의 세포외부로의 분비가 증가되고 궁극적으로는 항원 특이적인 체액성 면역 반응 뿐만 아니라 세포성 면역 반응이 증가되었다는 보고가 있다 (Li et al., Infection and Immunity, 67: 4780, 1999). 따라서, 본 발명의 tPA 분비 신호 서열은 본 발명의 TRAIL 단백질을 세포외부로 보다 우수하게 분비할 수 있으며, 이에 본 발명의 궁극적인 목적인 항암 효과를 향상시킬 수 있다.In addition, the present invention uses a secretion signal sequence that serves as a guide to secrete the TRAIL protein outside the cell. Since the TRAIL protein is a protein located in the cell membrane, it does not have its own secretory signal sequence, and the outer part of the TRAIL cell is secreted outside the cell by the secretory signal sequence, and it is known to induce a cell death signal by the TRAIL protein ( Korean Patent Application No. 2000-0038441). Therefore, the secretory signal sequence is used to secrete the TRAIL protein of the present invention into the extracellular space and increase the anticancer effect, and the secretory signal sequence is inserted into the 5'-upper part of the nucleic acid encoding the 12- . The secretory signal sequence may be tPA, HSV, gDs, SEC2, SEC (CV) or the like, preferably tPA. The tPA secretion signal sequence used in the concrete embodiment of the present invention is a secretory signal sequence having excellent secretion induction. In the development of a conventional tuberculosis DNA vaccine, when the tPA signal sequence is linked to a tuberculous antigen, (Li et al., Infection and Immunity , 67: 4780, 1999). In addition, there is a report that the immune response is increased and ultimately the antigen-specific humoral immune response as well as the cellular immune response are increased. Accordingly, the tPA secretion signal sequence of the present invention can secrete the TRAIL protein of the present invention more excellently to the outside of the cell, thereby improving the anticancer effect, which is the ultimate aim of the present invention.
본 발명의 분비 신호 서열은 포유류, 특히 인간 세포에서 발현 빈도가 높은 유전자 코돈으로 최적화된 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 분비 신호 서열의 아미노산 코돈, 구체적으로 알라닌(Ala: A), 아르기닌(Arg: R), 아스파라긴(Asn: N), 아스파테이트(Asp: D), 시스테인(Cys: C), 글루타민(Gln: Q), 글루타메이트(Clu: E), 글리신(Gly: G), 히스티딘(His: H), 이소류신(Ile: I), 류신(Leu: L), 라이신(Lys: K), 페닐알라닌(Phe: F), 프롤린(Pro: P), 세린(Ser: S), 쓰레오닌(Thr: T), 발린(Val: V) 및 타이로신(Tyr: Y)을 암호화하는 하나 이상의 유전자 코돈을 인간 세포에서 높은 빈도로 인지되는 유전자 코돈으로 치환한다. 본 발명의 구체적인 실시에서는, tPA(tissue plasminogen activator)를 암호화하는 핵산 서열에서 1번 내지 23번을 코돈 최적화하였으며, 이를 서열번호 1로 나타내었으며, 야생형과 코돈 최적화된 핵산서열을 도2에 상호 비교하였다. 따라서, 상기 코돈 최적화된 tPA는 야생형 tPA보다 우수한 분비 유도성을 가진다.The secretory signal sequence of the present invention is characterized by being optimized to a gene codon with a high expression frequency in mammals, particularly human cells. Specifically, the amino acid codon of the secretory signal sequence, specifically, alanine (Ala: A), arginine (Arg: R), asparagine (Asn: N), aspartate (Asp: D), cysteine (Cys: C), glutamine Gln: Q, Glu: E, Gly: G, Hist: H, Ile: One or more gene codons coding for a proline (Pro: P), a serine (Ser: S), a threonine (Thr: T), a valine (Val: V) and a tyrosine And the gene codon is recognized as a high frequency in the present invention. In a specific embodiment of the present invention, the nucleic acid sequence coding for tPA (tissue plasminogen activator) is codon-optimized from 1 to 23, which is represented by SEQ ID NO: 1, and the wild type and codon optimized nucleic acid sequences are compared with each other Respectively. Thus, the codon-optimized tPA has better secretory induction than wild-type tPA.
상기한 바와 같이, 본 발명은 코돈 최적화된 분비 신호 서열, 코돈 최적화된 12량체 형성 도메인 및 코돈 최적화된 TRAIL을 포함하는 DNA 카세트에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 코돈 최적화된 분비 신호 서열은 서열번호 1의 핵산 서열을 가지고 있으며, 상기 코돈 최적화된 12량체 형성 도메인은 서열번호 2의 핵산 서열을 가지고 있으며, 상기 코돈 최적화된 TRAIL는 서열번호 3의 핵산 서열을 가지고 있으며, 이의 배열을 도 1에 도시하였다.As described above, the present invention relates to a DNA cassette comprising a codon-optimized secretory signal sequence, a codon-optimized 12-mer forming domain, and a codon-optimized TRAIL. Specifically, the codon-optimized secretory signal sequence has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the codon-optimized 12-mer forming domain has the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and the codon- And the sequence thereof is shown in Fig.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 DNA 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.In another aspect, the invention relates to a recombinant expression vector comprising said DNA cassette.
본 발명의 벡터는 숙주세포에서 목적 단백질, 즉 분비형 재조합 12량체 TRAIL 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물(상기 DNA 카세트)이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적 조절요소를 포함한다.The vector of the present invention comprises a requisite regulatory element operably linked to the expression of a gene insert (said DNA cassette) as a recombinant vector capable of expressing a desired protein, i.e., a secreted recombinant 12-mer TRAIL protein in a host cell.
본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 암호화하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트를 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.As used herein, the term "operably linked" refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a desired protein to perform a general function. The operative linkage with the recombinant vector can be produced using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and linkage are made using enzymes generally known in the art. The vector includes expression control elements such as promoter, operator, initiation codon, termination codon, polyadenylation signal and enhancer. The initiation codon and termination codon are generally considered to be part of the nucleotide sequence encoding the immunogenic target protein and must be operative in the subject when the gene construct is administered and in the coding sequence and in frame.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 바이러스 벡터, 보다 바람직하게는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스 벡터는 다양한 세포에 유전자 전달 효율이 우수한 벡터로, 암 환자의 유전자 치료에 가장 흔하게 사용되는 벡터 중의 하나이다. 본 발명에 사용된 재조합 아데노바이러스는 타입 5이고 복제에 필수 요소인 E1A 유전자가 결여된 복제 불능의 아데노바이러스이다.The vector of the present invention includes, but is not limited to, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, and a viral vector, and is preferably a viral vector, more preferably an adenoviral vector. The adenovirus vector is a vector with high gene transfer efficiency to various cells and is one of the most commonly used vectors for gene therapy of cancer patients. The recombinant adenovirus used in the present invention is a type 5 and non-replicable adenovirus lacking the E1A gene essential for replication.
상기한 바와 같이 TRAIL을 암호화하는 핵산의 유전자 코돈을 인간 세포에서 발현 효율이 높은 유전자 코돈으로 치환하고 분비 신호 서열(tPA), 12량체 형성 도메인 (SPD)과 결합시켜 분비형의 12량체 재조합 TRAIL을 발현하는 벡터를 제조하고 이를 이용하여 생산된 아데노바이러스를 세포에 처리 시 기존의 TRAIL을 발현하는 아데노바이러스에 비해 우수한 항암 효과를 유발한다는 것을 밝혔다. 특히, 종래 알려진 분비 신호 서열, 삼량체를 유도하는 류신 지퍼 서열 및 인간 TRAIL(114-281)로 이루어진 재조합 아데노바이러스(rAd/stTRAIL)의 암세포 사멸 유도 효과와 본 발명의 아데노바이러스(rAd/tdTRAIL co)의 암세포 사멸 유도 효과를 비교한 결과에서도, 본 발명의 아데노바이러스의 암세포 사멸 유도 효과가 5 내지 15배 정도 우수하였다. 따라서, 본 발명의 DNA 카세트를 포함하는 벡터는 종래의 항암 치료제보다 항암 치료에 효과적으로 사용할 수 있음을 알 수 있다.As described above, the TRAIL-encoding nucleic acid gene codon was replaced with a gene codon having high expression efficiency in human cells, and the secretory signal sequence (tPA) and the 12-mer formation domain (SPD) And that the adenovirus produced by the vector is superior to the existing TRAIL-expressing adenovirus when treated with the adenovirus. In particular, the effect of inducing cancer cell death of a recombinant adenovirus (rAd / stTRAIL) comprising a conventionally known secretory signal sequence, a leucine zipper sequence inducing a trimer and human TRAIL (114-281) and the adenovirus (rAd / tdTRAIL co ), The adenovirus inducing effect of the present invention of the present invention was about 5 to 15 times better than that of the adenovirus of the present invention. Therefore, it can be seen that the vector containing the DNA cassette of the present invention can be effectively used for chemotherapy than the conventional anticancer therapeutic agent.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 제조한 재조합 12량체 TRAIL 단백질을 생산하는 아데노바이러스에 관한 것이다.In another embodiment, the present invention relates to an adenovirus producing a recombinant 12-mer TRAIL protein produced using the vector.
아데노바이러스는 상기 벡터를 패키징 세포에 전달하고 이를 배양하고 패키징 세포로부터 생성된 재조합 아데노바이러스를 수확하는 방법으로 아데노바이러스의 생성이 가능하다.Adenovirus is capable of producing adenovirus by transferring the vector to a packaging cell, culturing it, and harvesting the recombinant adenovirus produced from the packaging cell.
상기의 아데노바이러스는 유도성 프로모터를 이용해서 특정 물질에 의해 발현을 조절할 수 있는 유도성 아데노바이러스를 포함한다. 상기 유도성 프로모터는 CMV-Tet10이며 테트라사이클린(tetracyclin)에 의해 발현이 유도된다. 테트라사이클린을 이용한 유도성 시스템은 생체 내에서 가장 광범위하게 사용되고 있으려 우려할 만한 부작용이 없으며 경제성 측면에서도 우수하다.The above adenoviruses include inducible adenoviruses that can regulate expression by specific substances using an inducible promoter. The inducible promoter is CMV-Tet10 and its expression is induced by tetracyclin. The inductive system using tetracycline is the most widely used in vivo and has no side effects to worry about, and is excellent in terms of economy.
상기의 (i) 분비형 재조합 12량체 TRAIL 단백질을 생산하는 벡터, (ii) 상기 벡터를 이용하여 생산된 재조합 12량체 TRAIL 단백질, 및 (iii) 상기 벡터를 이용 하여 제조한 재조합 12량체 TRAIL 단백질을 생산하는 아데노바이러스는 항암 조성물로 제공될 수 있다.(Ii) a recombinant 12-mer TRAIL protein produced using the vector, and (iii) a recombinant 12-mer TRAIL protein produced using the vector, The resulting adenovirus may be provided in a chemotherapeutic composition.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼, 주사제 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있다. 약제학적 수용가능한 담체는 임의 모든 용매, 분산 매체, 피복제, 항균 및 항곰팡이제, 등장액, 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 활성 물질에 대한 이와 같은 매체 및 물질은 공지되어 있다.The compositions of the present invention include pharmaceutically acceptable carriers and may be prepared in various formulations such as tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, injections, and the like. Pharmaceutically acceptable carriers include any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic solutions, absorption delaying agents and the like. Such media and materials for pharmaceutically active substances are known.
상기 조성물은 목적에 따라 적절한 약제학적 조성물의 형태로 제조할 수 있다.The composition may be prepared in the form of a pharmaceutical composition suitable for the purpose.
구체적인 양태로서, 본 발명의 상기 분비형 재조합 12량체 TRAIL 단백질을 생산하는 벡터 또는 상기 벡터를 이용하여 생성된 유도성 아데노바이러스는 치료 백신 조성물로 제공된다. 상기 백신 조성물은 사람을 포함하여 다른 포유류에 백신 접종될 수 있다.In a specific embodiment, a vector producing the secretory recombinant 12-mer TRAIL protein of the present invention or an inducible adenovirus produced using the vector is provided as a therapeutic vaccine composition. The vaccine composition can be vaccinated against other mammals, including humans.
구체적인 양태로서, 본 발명의 분비형 재조합 12량체 TRAIL 단백질를 포함하는 조성물은 경구 투여, 또는 근육, 정맥, 동맥, 복강, 피하, 피내 등의 비경구 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제, 종양내에 직접 주사 등이다. 상기 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다.In a specific embodiment, the composition comprising the secretory recombinant 12-mer TRAIL protein of the present invention can be administered orally or parenterally such as muscle, vein, artery, abdominal cavity, subcutaneous, intradermal. Preferred modes of administration and formulations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intradermal, intratumoral, and the like. The composition may be administered singly or multiply.
또한, 상기 조성물은 약제학적으로 유효량 투여되도록 한다. 약제학적 유효량은 투여 방법 및 횟수, 암의 종류 및 중증도, 환자의 연령과 성별, 환자의 상태, 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 투여 유효량은 결정될 수 있다. 상기 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다.In addition, the composition is intended to be administered in a pharmaceutically effective amount. The pharmaceutically effective amount may be determined depending on factors known to those skilled in the art of administration and the number and type of cancer, the type and severity of the cancer, the age and sex of the patient, the condition of the patient, and other medical fields. The composition may be administered singly or multiply.
발명의 실시를 위한 형태DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention, and it is to be understood by those skilled in the art that the present invention is not limited thereto It will be self-evident.
실시예 1: tPA-SPD-TRAIL (114-281) DNA (tdTRAILExample 1: tPA-SPD-TRAIL (114-281) DNA (tdTRAIL coco ) 카세트의 구성) Composition of cassette
서열번호 1의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 tPA 분비 신호 서열과 서열번호 2의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 SPD 12량체(dodecamer) 형성 서열을 연결된 형태로 화학적으로 합성하였다. 벡터에 삽입하기 용이하기 위해 말단에 KpnI(5')과 NotI(3') 사이트를 첨가하였다. tPA-SPD 신호 서열을 KpnI과 NotI으로 절단된 유도성 아데노바이러스 셔틀 벡터인 pShuttle-Tet10 벡터에 삽입시켜 pShuttle-Tet10/tPA-SPD 벡터를 구성하였다. 유도성 아데노바이러스 셔틀 벡터인 pShuttle-Tet10은 유도성 프로모터인 CMV-Tet10을 가지고 있다. 이어서 서열번호 3의 핵산서열을 가지는 코돈 최적화된 사람 TRAIL (114-281)을 화학적으로 합성하였다. 마찬가지로 벡터 삽입을 용이하게 하기 위해 말단에 NotI(5')과 XbaI(3') 사이트를 첨가하였다. 이 후 NotI과 XbaI으로 절단된 pShuttle-Tet10/tPA-SPD 벡터에 삽입하여 pShuttle-Tet10/tPA-SPD-hTRAILco를 구축하였다.A codon-optimized tPA secretion signal sequence having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a codon-optimized SPD dodecamer formation sequence having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 were chemically synthesized. KpnI (5 ') and NotI (3') sites were added to the ends to facilitate insertion into the vector. The pShuttle-Tet10 / tPA-SPD vector was constructed by inserting the tPA-SPD signal sequence into the pShuttle-Tet10 vector, an inductive adenovirus shuttle vector cut with KpnI and NotI. The inducible adenovirus shuttle vector pShuttle-Tet10 has the inducible promoter CMV-Tet10. The codon-optimized human TRAIL (114-281) having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 was then chemically synthesized. Likewise, NotI (5 ') and XbaI (3') sites were added to the ends to facilitate vector insertion. And then inserted into pShuttle-Tet10 / tPA-SPD vector digested with NotI and XbaI to construct pShuttle-Tet10 / tPA-SPD-hTRAIL co .
실시예 2: TRAIL 카세트를 발현하는 재조합 아데노바이러스의 생성Example 2: Generation of recombinant adenovirus expressing TRAIL cassette
pShuttle/tPA-SPD-hTRAILco를 PmeI으로 절단한 후 복제 불가능한 pAd/Easy 벡터와 BJ5183 competent cell에서 상동 재조합(homologous recombination) 반응을 수행하였다. 이 후 카나마이신(Kanamycin) 항생제를 이용하여 TRAIL 카세트가 내재된 pAd/tPA-SPD-hTRAILco (이후 pAd/tdTRAILco로 명명)를 선별하였다. 정확한 확인을 위해 PacI으로 절단하여 35+4.5kb의 DNA 밴드를 확인하였다. 그리고 pAd/tdTRAILco를 293 세포주에 형질전환시켜 10일 후 TRAIL 카세트를 발현하는 재조합 아데노바이러스 rAd/tdTRAIL co를 얻었다.After cleavage of pShuttle / tPA-SPD-hTRAILco with PmeI, homologous recombination reactions were performed in non-replicable pAd / Easy vector and BJ5183 competent cells. After that, kanamycin antibiotics were used to select pAd / tPA-SPD-hTRAIL co (hereinafter referred to as pAd / tdTRAIL co ) with the TRAIL cassette. The DNA band of 35 + 4.5kb was confirmed by cutting with PacI for accurate confirmation. Then, pAd / tdTRAIL co was transfected into 293 cell line to obtain recombinant adenovirus rAd / tdTRAIL co expressing TRAIL cassette after 10 days.
실시예 3: rAd/tdTRAILExample 3: rAd / tdTRAIL coco 의 12량체 TRAIL발현 확인Of 12-mer TRAIL expression
rAd/tdTRAILco가 12량체의 TRAIL을 발현하는지를 확인하기 위해 원숭이 신장세포 (Cos7)과 사람 신장세포(293)을 각각 200 MOI와 10 MOI의 rAd/tdTRAILco로 감염시켰다. 감염 후 48시간 뒤에 배양배지 (Culture supernatant)를 채취한 후, 단백질을 변성시키지 않는 조건 (Native and non-reducing condition)에서 웨스턴 블랏을 수행하였다. 실험 결과, rAd/tdTRAILco가 1량체, 3량체, 그리고 12량체 형태의 TRAIL을 발현한다는 것을 확인하였다.Monkey kidney cells (Cos7) and human kidney cells (293) were infected with 200 MOI and 10 MOI of rAd / tdTRAIL co , respectively, to confirm whether rAd / tdTRAIL co- expresses 12-mer TRAIL. Forty-eight hours after infection, the culture supernatant was collected and Western blotting was performed in a native and non-reducing condition. Experimental results show that rAd / tdTRAIL co expresses TRAIL in the form of monomers, trimer and trimer.
실시예 4: rAd/tdTRAILExample 4: rAd / tdTRAIL coco 의 암세포 살상 효과 확인Of Cancer Cell Lines
rAd/tdTRAILco의 암세포 사멸 유도 효과를 확인하기 위해 사람 뇌종양세포 (U-87MG), 사람 흑색종세포 (A375), 사람 자궁암세포 (Hela)을 각각 10MOI, 100 MOI, 100 MOI의 rAd/tdTRAILco와 대조군인 rAd/stTRAIL로 감염시켰다. rAd/stTRAIL은 분비 신호 서열, 삼량체(trimer)를 유도하는 류신 지퍼(Isoleucin Zipper) 서열과 인간 TRAIL (114-281)로 이루어진 재조합 아데노바이러스로 암세포 사멸 유도 효과가 우수하다고 보고되었다 (Gene Therapy, in press, 2005). 감염 후 48시간 뒤에 세포 독성을 Annexin V 염색법을 통해 확인한 결과, rAd/tdTRAILco가 기존의 rAd/stTRAIL에 비해 암세포 사멸 유도 효과가 5∼15배 정도 우수한 것으로 확인되었다. 이는 코돈 최적화된 분비 신호 서열(tPA)의 연결, 코돈 최적화된 12량체 형성 도메인(SPD)의 연결, 코돈 최적화된 TRAIL 핵산서열로 구성되는 본 발명의 TRAIL 재조합 유도성 아데노바이러스가 기존의 TRAIL 아데노바이러스에 비해 보다 탁월한 항암 유전자 치료제의 성능을 가짐을 말해 준다.rAd / tdTRAIL co human brain tumor cells (U-87MG) in order to determine the cancer cell death inducing effects of, one for melanoma cells (A375), human cervical cancer cells (Hela) each 10MOI, 100 MOI, 100 MOI rAd / tdTRAIL co of And the control rAd / stTRAIL. rAd / stTRAIL has been reported to exert excellent cytotoxic effect on cancer cell death by recombinant adenovirus consisting of secretory signal sequence, Isoleucin Zipper sequence inducing trimer (trimer) and human TRAIL (114-281) (Gene Therapy, in press, 2005). Forty-eight hours after infection, the cytotoxicity was confirmed by Annexin V staining. As a result, rAd / tdTRAIL co was found to be 5 ~ 15 times more effective than rAd / stTRAIL in inducing cancer cell death. This is because the TRAIL recombinant inducible adenovirus of the present invention comprising the linkage of the codon-optimized secretory signal sequence (tPA), the linkage of the codon-optimized 12-mer formation domain (SPD), and the codon-optimized TRAIL nucleic acid sequence, And the ability of the cancer gene therapy agent to be superior.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 DNA 카세트를 포함하는 아데노바이러스 벡터는 암세포 사멸 유도 효과가 우수하므로, 이를 이용하여 암 등의 치료에 효과적으로 이용할 수 있다.As described above, the adenovirus vector comprising the DNA cassette of the present invention is excellent in inducing cancer cell death, and thus can be effectively used for the treatment of cancer and the like.
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