KR101447534B1 - Method for producing fermentable sugar solution containing less toxic acetate from lignocellulosic biomass - Google Patents

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KR101447534B1
KR101447534B1 KR20130100559A KR20130100559A KR101447534B1 KR 101447534 B1 KR101447534 B1 KR 101447534B1 KR 20130100559 A KR20130100559 A KR 20130100559A KR 20130100559 A KR20130100559 A KR 20130100559A KR 101447534 B1 KR101447534 B1 KR 101447534B1
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KR
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biomass
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KR20130100559A
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유주현
엄인용
홍경식
정찬덕
제갈종건
송봉근
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한국화학연구원
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    • C12P2201/00Pretreatment of cellulosic or lignocellulosic material for subsequent enzymatic treatment or hydrolysis

Abstract

The present invention relates to a method for preparing fermentable sugar from lignocellulosic biomass, which can be useful in cultivating various industrial fermentation strains. Provided is a method for preparing fermentable sugar which can alleviate toxicity on fermentation strain of acetate without removing the acetate by using, as a neutralizing agent for enzymatic saccharification of pretreated materials after hot water pretreatment of biomass, alkali reagent which has divalent or higher hydroxyl group and does not dissociate under acidity below neutrality from a second acetic acid group of an acetate generated by neutral-reaction with the acetic acid.

Description

목질계 바이오매스로부터 초산의 독성이 경감된 발효당의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING FERMENTABLE SUGAR SOLUTION CONTAINING LESS TOXIC ACETATE FROM LIGNOCELLULOSIC BIOMASS} Method per the toxic relief of acid from lignocellulosic biomass fermentation production {METHOD FOR PRODUCING FERMENTABLE SUGAR SOLUTION CONTAINING LESS TOXIC ACETATE FROM LIGNOCELLULOSIC BIOMASS}

본 발명은 목질계 바이오매스를 원료로 하여 제조된 발효당이 초산을 함유하면서도 산업용 미생물에 대한 독성이 매우 경감된 발효당을 제조하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a process for the production of fermented sugar toxicity is very relief for industrial micro-organisms, yet containing a sugar acid produced by the fermentation of lignocellulosic biomass as a raw material.

목질계 바이오매스(lignocellulosic biomass)를 구성하고 있는 구조적 성분(structural component)으로 발효당 제조의 직접적 원료가 되는 셀룰로오스(cellulose)는 바이오매스의 25% 내지 60%를 차지하고 있으며, 포도당의 탈수 축합에 의해 만들어진 고분자이다. Structural components that make up the wood-based biomass (lignocellulosic biomass) (structural component) of cellulose (cellulose) that is a direct raw material for producing sugar fermentation and account for 25% to 60% of the biomass, by the dehydration condensation of glucose It is made of a polymer. 이 셀룰로오스를 산 당화(acid hydrolysis) 혹은 효소당화(enzymatic hydrolysis)하여 포도당을 제조하고자 할 때 목질계 바이오매스가 함유하는 헤미셀룰로오스와 리그닌이 이를 방해하는 장애물로 작용한다. The cellulose of this glycosylation acid (acid hydrolysis) or hemicellulose and lignin, which are wood-based biomass contained when the enzyme saccharification (enzymatic hydrolysis) to be produced of a glucose acts as an obstacle that prevents this. 따라서 셀룰로오스의 가수분해 반응을 수행하기 전에 이러한 헤미셀룰로오스와 리그닌 중 최소한 어느 하나의 성분을 화학적으로 분해하거나 조직을 와해시킬 수 있는 바이오매스의 전처리(pretreatment)는 필수적인 공정이다. Thus, pre-treatment (pretreatment) of biomass such as hemicellulose decomposition chemically at least one of the components of the lignin can be broken down or tissue prior to performing the hydrolysis reaction of cellulose is an essential step.

목질계 바이오매스를 구성하는 헤미셀룰로오스(15 내지 35%)는 자일로오스의 탈수 축합으로 형성된 자일란 골격에 포도당, 갈락토오스, 만노오스 및 아라비노오스가 곁사슬로 결합되어 있고, 유론산(uronic acid)과 초산(acetic acid) 등의 유기산이 에스테르 결합으로 연결되어 있기 때문에, 산 촉매에 의한 가수분해가 비교적 용이하다. Hemicellulose (15 to 35%) that make up the lignocellulosic biomass, and xylene xylan backbone glucose, galactose, a formed by dehydration condensation of agarose as mannose and arabinose are joined in the side chains, organic acid (uronic acid) and acetic acid it is, decomposition is relatively easily by acid hydrolysis catalyst, since an organic acid, such as is associated with an ester bond (acetic acid).

바이오매스를 효소로 가수분해하여 발효당을 제조하기 위해 초본계 바이오매스의 전처리에 널리 적용되고 있는 열수전처리(autohydrolysis 혹은 hydrothermolysis) 혹은 약산 전처리(dilute acid treatment)는, 바이오매스와 물 혹은 산을 고압반응기에 넣고 밀봉한 후 140℃ 내지 230℃에서 일정한 시간 동안 반응시키는 기술이다. Biomass for the hydrolysis with enzyme hydrothermal pre-treatment, which is widely applied to the pre-treatment of a herbal-based biomass to produce the sugar fermentation (autohydrolysis or hydrothermolysis) or a weak acid pretreatment (dilute acid treatment), the biomass with high-pressure water or acid and then placed in a reactor, sealing the technique of reaction for a period of time at 140 ℃ to 230 ℃. 이러한 산 촉매 전처리에 의해 목질계 바이오매스 중의 헤미셀룰로오스는 가수분해되어 자일로오스와 함께 자일로올리고당 형태로 수중에 용출되는데, 이 때 헤미셀룰로오스의 자일란 주사슬에 에스테르 결합으로 붙어있던 초산기가 함께 가수분해되어 용출된다. By such an acid catalyst pretreatment hemicellulose of the lignocellulosic biomass is in xylene with a xylene is hydrolyzed agarose there is dissolution in the water in the oligosaccharide form, at this time, groups of acetic acid was attached by an ester linkage to the xylan main chains of hemicellulose is with hydrolyzing It is eluted.

하지만 초산이 헤미셀룰로오스로부터 가수분해되어 용출되는 비율은 전처리 공정의 가혹도(severity)에 따라 달라지며, 미반응 상태로 남게 되는 초산기는 이후 효소당화 혹은 산당화 과정에서 가수분해되어 나오게 된다. However, the acetic acid from hemicellulose hydrolysis rate of elution is dependent on the severity (severity) of the pre-processing step, acetate groups are left unreacted is out the hydrolysis in a later enzymatic saccharification process or Chaenomeles speciosa. 산 촉매 전처리 과정에서 헤미셀룰로오스 중의 초산기를 모두 가수분해하여 제거하려면 산농도 혹은 전처리 온도를 보다 높게 하여야 한다. To remove all groups by hydrolysis of the hemicellulose in acetic acid catalyst pre-treatment to be higher than the acid concentration or pre-treatment temperature. 하지만, 이와 같은 높은 가혹도에서는 헤미셀룰로오스의 가수분해로 생성된 자일로오스가 과분해되어 퍼퓨랄(2-furfural), 초산 및 개미산(formic acid)으로, 포도당이 과분해되어 5-하이드록시메틸-2-퓨랄데하이드(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde, HMF)와 레브린산(levulinic acid) 등이 생성될 수 있다고 알려져 있다. However, this same high severity in pyural is to agarose are too good buffer in the xylene produced in the hydrolysis of hemicellulose (2-furfural), acetic acid and formic acid (formic acid), glucose is too good to 5-hydroxymethyl- it is known that the hydroxy and 2-Pugh ralde (5-hydroxymethyl-2-furaldehyde, HMF) and Rev acid (levulinic acid) can be produced.

반면, 탄수화물의 과분해를 피하기 위해서 전처리의 가혹도를 낮추는 경우 불완전 가수분해에 의해 남게 되는 헤미셀룰로오스가 당화과정에서 효소에 의해 가수분해될 때 초산 등 유기산을 방출시키므로 효소당화 후 당용액에는 이러한 산이 함유되게 된다. On the other hand, if in order to avoid to too good a carbohydrate to lower the severity of the pre-treatment because release of acetic acid such as an organic acid when the hemicellulose that is to be left by incomplete hydrolysis be hydrolyzed by the enzyme in the glycosylation process, sugar solutions after enzymatic saccharification is containing such acid It is presented.

이와 같이 목질계 바이오매스를 원료로 하여 열수전처리와 효소당화에 의해 제조된 발효당은 불순물로 퍼퓨랄, HMF, 페놀성 물질 및 초산 등을 함유하는데, 이러한 물질들은 발효균주의 종류에 따라 다르지만 미생물의 생육 혹은 대사산물의 생성을 저해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. In this manner, the wood-based biomass as a raw material fermented sugar produced by the hydrothermal pre-treatment and enzymatic saccharification is to contain pyural buffer as impurities, HMF, phenolic compounds and nitric acid or the like, such materials are of a different microorganism according to the zymogen note type it is known that the action to inhibit the growth or production of a metabolite. 보고된 바에 의하면 인공적으로 조제한 당용액에 상기 각각의 불순물들을 농도별로 첨가하고 에탄올 발효균주로 효모를 사용하여 생육을 시험한 연구에서 퍼퓨랄은 에탄올 생산에 영향을 미치지 않았던 반면 HMF는 약간의 영향을 미쳤으며, 초산은 농도가 높을수록 뚜렷하게 에탄올 생성을 저해하였다(Jeffrey D. Keating 등, 2006, Biotechnology and Bioengineering , 93(6), 1196-1206). On the other hand, according reportedly added by artificially concentrations of the respective impurities in the sugar solution prepared and ethanol zymogen pyural flops in the study tested the growth mainly using the yeast did not affect the production of ethanol HMF has had a slight effect was, inhibited the ethanol produced a higher acetic acid concentration significantly (Jeffrey D. Keating, etc., 2006, Biotechnology and Bioengineering, 93 (6), 1196-1206). 또한 페놀성 화합물은 효모의 생육을 크게 저해하였으며, 초산과 퍼퓨랄은 함께 사용되는 경우 단독으로 사용되는 것에 비해 에탄올 생성 저해력이 더 큰 것으로 보고되었다. In addition, phenolic compounds was significantly inhibit the growth of yeasts, ethanol production-inhibiting force than that used alone when used in combination is pyural buffer and acetate have been reported to be greater.

일반적으로 대장균이나 클로스트리듐 아세토부틸리쿰( Clostridium acetobutylicum ) 등 대부분의 산업용 미생물들은 바이오매스로부터 제조된 당용액 중의 몇 가지 불순물에 의해 생육 혹은 대사산물 생산이 크게 저하될 수 있다. In general, Escherichia coli or Clostridium acetonitrile unit Tilikum (Clostridium acetobutylicum), etc. Most industrial micro-organisms are some impurities in the growth or metabolic products produced by the solution per produced from biomass may be significantly reduced. 따라서, 목질계 바이오매스로부터 제조된 당용액 내에 함유된 여러 미생물 저해물질들을 무독화(detoxification)하기 위해 과량의 석회 사용(overliming), 리그닌 과산화효소(lignin peroxidase) 등을 이용한 고분자화 등 여러 가지 연구가 수행되어 왔다. Thus, a number of studies, an excess of lime used for detoxification (detoxification) a number of microbial inhibitor contained in the saccharide solution prepared from lignocellulosic biomass (overliming), polymers with such as lignin peroxidase (lignin peroxidase) Chemistry It has been carried out. 다른 많은 연구자들은 이러한 물질의 제거 연구에 흡착(adsorption)과 분배(partition)를 이용한 각종 크로마토그래피를 적용하고 있다(Villarreal, MLM 등, 2006, Enzyme and Micrbial Technology , 40, 17-24). Many other researchers have applied various kinds of chromatography with adsorption (adsorption) and distribution (partition) the removal of such materials research (Villarreal, MLM, etc., 2006, Enzyme and Micrbial Technology, 40, 17-24). 특히, 당용액이 함유하는 초산을 제거하기 위해 흡착 크로마토그래피를 이용하는 기술(Hee-Geun Nam, Sungyong Mun, 2012, Process In particular, the removal of acetic acid containing adsorption chromatography using the technique (Hee-Geun Nam, to which sugar solutions Sungyong Mun, 2012, Process Biochemistry , 47, 725-734; Biochemistry, 47, 725-734; S. Ranil Wickramasinghe, David L. Grzenia, 2008, Desalination , 234, 144-151), 분리막을 이용하는 기술(David L. Grzenia 등, 2012, Journal S. Ranil Wickramasinghe, David L. Grzenia, 2008, Desalination, 234, 144-151), using membrane technology (David L. Grzenia etc., 2012, Journal of of Membrane Membrane Science , 415-415, 75-84; Science, 415-415, 75-84; Sung-Jae Kim 등, 2012, Process Biochemistry , 47, 2051-2057) 등이 많이 시도되고 있다. Etc. etc. Sung-Jae Kim, 2012, Process Biochemistry, 47, 2051-2057) has been tried plenty.

당용액의 무독화를 위한 과량의 석회사용 기술은 가장 비용이 저렴하므로 널리 이용되고 있는 기술로, 당용액의 pH가 10에 이르기 전까지 석회를 가하여 녹인 다음 60℃ 이하에서 일정 시간 동안 가열하는 것이다. Excess lime used techniques for the detoxification of the sugar solution is heated for a predetermined time and then dissolve the lime until down to the 10 pH of the sugar solution as a technology, which is widely used because the cost is low, below 60 ℃. 그 결과 퍼퓨랄, HMF, 단백질 등 여러 가지 불순물이 침전되므로 여과 혹은 침전에 의해 제거할 수 있다. As a result, the buffer pyural, HMF, since the number of impurities to precipitate the protein and the like can be removed by filtration or sedimentation. 하지만 그 원리에 대해서는 많이 알려져 있지 않으며, 그 과정 중에 헤미셀룰로오스 당의 손실이 수반되는 것이 일반적이다. But it does not much is known about its principles, it is generally accompanied by a loss of hemicellulose sugars during the process.

바이오매스로부터 초산을 제거하는 또 다른 방법은 바이오매스에 수산화나트륨을 가하고 가열하여 초산을 가수분해하여 용출시킨 다음 고액분리와 물 세척을 통해 제거하는 방법이 있다(Cho, DH 등, 2010, Bioresource Technology , 10, 4947-4951). Another method of removing nitric acid from biomass is a method of heating was added to sodium hydroxide in the biomass removed by the following solid-liquid separation and the washing water which was hydrolyzed to elute the acid (Cho, DH, etc., 2010, Bioresource Technology , 10, 4947-4951). 이 방법은 바이오매스의 약산 전처리(dilute acid pretreatment) 전에 수행하는 방법으로, 전처리에 촉매로 작용할 산을 첨가해 주기 때문에 사용 가능한 방법이다. This method is possible because the method uses a method for performing pre-treatment of biomass before weak acid (dilute acid pretreatment), Cycle by addition of an acid acting as a catalyst in the pre-treatment. 즉, 미리 강알칼리를 처리하여 헤미셀룰로오스가 가지고 있는 초산을 가수분해하여 제거한 바이오매스는 산촉매 작용에 의한 헤미셀룰로오스 주사슬의 가수분해 반응을 기대할 수 없으므로 인위적으로 산을 첨가해 주지 않으면 230℃ 내지 250℃ 이상으로 가열하여야만 전처리 효과를 기대할 수 있게 된다. That is, to more than 230 ℃ to 250 ℃ if not previously treated for a strong alkali to artificially adding an acid to the biomass removal by hydrolysis of acetic acid in hemicellulose has is not expected for the hydrolysis of hemicellulose main chain due to the acid catalyst effect it is possible to expect the effect of pre-treatment hayeoyaman heating. 이러한 전처리 기술은 산도 조절 열수전처리(pH controlled liquid hot water pretreatment)로 알려져 있다. This preprocessing technique is known as hydrothermal pre-treatment pH adjustment (pH controlled liquid hot water pretreatment).

한편, 당용액이 함유할 수 있는 미생물 저해물질의 양을 최소화하기 위해서 효소당화 전에 전처리물을 과량의 물로 세척하는 방법도 이용되고 있다(Jan Larsen 등, 2012, Biomass On the other hand, it has been used a method of washing the pretreated water with excess water prior to enzymatic saccharification in order to minimize the amount of microbial inhibitor which may contain a sugar solution (such as Jan Larsen, 2012, Biomass and and Bioenergy , 46, 36-45). Bioenergy, 46, 36-45). 하지만, 효소당화와 에탄올 발효가 진행됨에 따라 초산과 페놀성 화합물 등 미생물 저해물질이 전처리물로부터 방출되므로, 이러한 방법을 다른 발효균주의 배양에 적합한 발효당 제조에 적용하기 위해서는 더 많은 연구개발이 필요할 것이다. However, since the acetic acid and phenolic compounds such as microbial inhibitor it is released from the pre-processing of water in accordance with the enzymatic saccharification and ethanol fermentation proceeds, will require more research and development in order to apply these methods in fermentation production per suitable for other zymogen care culture .

최근 바이오매스 열수전처리물을 알칼리 수용액으로 세척함으로써 효소당화에 의한 초산 생성율을 최소화할 수 있는 기술이 제안된 바 있지만(대한민국 특허출원 제 10-2013-0082290호), 알칼리 약품과 과량의 물을 사용해야할 뿐 아니라, 두 개 이상의 공정이 추가됨으로써 발효당 제조단가의 상승을 피할 수 없다. Recently biomass by washing the hydrothermal pre-treatment of water with an aqueous alkali solution, although a technology that can minimize the production rate of acetic acid by the enzyme saccharification proposed (Republic of Korea Patent Application No. 10-2013-0082290 Ho), should use the alkaline chemicals and an excess of water as well as to add more than one process can not avoid being the rise in production costs per fermentation.

따라서, 본 발명의 목적은 바이오매스 전처리물로부터 생성될 수 있는 산업용 발효균주의 생육 저해 물질 중 특히 초산의 독성을 경감시킬 수 있는 효소당화 기술을 제공하는 것이다. Accordingly, it is an object of the invention to provide a biomass pre-processing industry, which can be produced from zymogen water attention Growth inhibition of particular glycosylation enzyme technology that can reduce the toxicity of the acid.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object, the present invention

1) 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 효소당화용 전처리물을 제조하는 단계; 1) the method comprising hot-water pre-treatment to prepare a pre-treatment of water for enzymatic saccharification to a wood-based biomass; And

2) 단계 1에서 얻은 전처리물에 섬유소 가수분해효소를 가하고, 초산염의 두 번째 초산기 해리상수(p K a 2 )가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 시약으로 처리하여 효소 당화하는 단계 2) the pre-treatment water from step 1 was added and the cellulose hydrolyzing enzyme, a second acid group dissociation constant (p K a 2) is 8.0 or more glycosylation enzymes by treatment with an alkaline reagent to 2 comprises a base having at least hydroxyl groups of the acetate comprising:

를 포함하는, 초산의 독성이 경감된 발효당의 제조방법을 제공한다. And it provides a method for producing fermented sugar toxicity reduction of acetic acid containing.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 초산의 독성이 경감된 발효당을 이용하여 미생물을 발효시키는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method of fermentation of microorganisms by using the fermentation of the resulting sugar-toxic acid reduction according to the above method.

본 발명의 방법은 바이오매스의 열수전처리 후 전처리물 중에 포함되어 있는 초산과 전처리 고형분 중 미반응 상태로 남아있는 초산기가 효소당화에서 가수분해되어 물에 용출될 때 초산염의 두 번째 초산기 해리상수(p K a 2 )가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 시약으로 중화함으로써 이후 미생물 발효에서 미생물의 생육을 저해하는 초산의 생물학적 농도를 1/2 이하로 줄이는 효과를 기대할 수 있다. The method of the invention acetic acid, which remains during contained in the after hydrothermal pre-treatment of the biomass pre-treatment with water acid and pretreated solid unreacted groups are hydrolyzed in the enzymatic saccharification second acid group dissociation constant of acetate when eluted with water ( p K a 2) that can be expected to reduce the biological effect of concentration of acetic acid in a subsequent microbial fermentation inhibits the growth of microorganisms in less than one-half, by neutralizing with an alkaline reagent comprising a base having a hydroxyl group is more than 8.0, not less than 2.

본 발명에 따른 발효당의 제조 방법은, 1) 바이오매스의 열수 전처리에 의한 효소당화용 전처리물의 제조 단계와, 2) 초산염의 두 번째 초산기 해리상수(p K a 2 )가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 시약을 중화제로 사용하는 효소당화 단계를 포함하는 일련의 공정을 통하여 초산 등의 미생물 생육억제물질 함유량을 최소화함으로써, 결과적으로 여러 가지 산업 미생물의 발효에 두루 사용될 수 있는 발효당을 제조하는 것을 기술 구성상 특징으로 한다. Fermented sugar production process according to the present invention, 1) the bio hydrothermal pretreatment pretreatment water production step for enzymatic saccharification by mass, and 2) a second acid group of acetates dissociation constant (p K a 2) is 8.0 or more bivalent or higher by through a series of processes including the enzyme saccharification step using an alkaline reagent comprising a base having a hydroxyl group as a neutralizing agent to minimize microbial growth inhibitory substance content such as acetic acid, as a result, that throughout used in a variety of fermentation of industrial microorganisms be configured as a technique for producing sugar characterized in that the fermentation.

하기 반응식 1에 초산염의 생성과 해리 과정을 나타내었다. To indicated the formation and dissociation process of nitrate in Scheme 1.

[반응식 1] [Reaction Scheme 1]

Figure 112013076975945-pat00001

상기 식에서, Wherein

M은 칼슘, 바륨 또는 마그네슘이고, M is calcium, barium or magnesium,

y는 수산기의 수이다. y is the number of hydroxyl groups.

본 발명에 따른 초산의 독성이 크게 경감된 발효당의 제조 방법에서, 첫 번째 공정은 바이오매스의 열수 전처리에 의해 효소당화용 전처리물을 제조하는 단계이다. In acetic acid fermented sugar production method of the toxicity is greatly alleviated in accordance with the present invention, the first step is a step for preparing a pre-treatment of water for Enzymatic Hydrolysis by the hydrothermal pre-treatment of the biomass.

상기 효소당화용 전처리물은 a) 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 수득한 액상물 및 고상물 전체; The enzymatic pre-treatment of water for the saccharification of a) wood-based biomass to open whole of a liquid substance and a solid phase of water obtained by pre-treatment; b) 목질계 바이오매스를 열수 전처리한 후 고액분리하여 수득한 고형분; b) wood-based bio after the hydrothermal pre-treatment of biomass solids obtained by solid-liquid separation; 및 c) 목질계 바이오매스를 열수 전처리한 후 고액분리하여 수득한 고형분을 물 또는 알칼리 수용액으로 씻은 후 탈수한 전처리물로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. And c) after the wood-based biomass, the hydrothermal pre-treatment may be selected from the group consisting of a dehydrated pre-treatment water after washing, a solid component obtained by solid-liquid separation with water or an aqueous alkaline solution.

구체적으로, 상기 효소당화용 전처리물은 다음과 같은 세 가지 방법으로 제조될 수 있다. Specifically, the pretreatment enzyme for saccharification of water can be prepared in the following three ways: 효소당화용 전처리물을 제조하는 첫 번째 방법은, 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 얻은 전처리 액상물과 고상물을 모두 포함하는 전처리물 전체를 그대로 효소당화에 사용하는 것이다. The first process for preparing a pre-treatment for enzymatic saccharification water, to the hydrothermal pre-treatment with the pretreatment liquid of water and enzyme saccharification as a complete pre-treatment of water containing both solids obtained a wood-based biomass. 이 때 전처리 액상물에 포함된 초산과 전처리 고상물에 미반응 상태로 남아 있는 초산기가 모두 효소당화 과정에서 2가 이상의 수산기를 가지는 알칼리 시약에 의해 중화반응을 거쳐 초산염으로 전환될 수 있다. At this time acetic acid remaining unreacted in the acid pretreatment and solids contained in the pretreatment liquid water group all through the neutralization reaction by the alkali reagent in the second enzyme saccharification process having the above hydroxyl group can be converted to nitrate.

효소당화용 전처리물을 제조하는 두 번째 방법은, 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 얻은 전처리물을 고액분리하여 액상물을 최대한 제거하는 것이다. The second method is to remove as much as possible the liquid water by solid-liquid separation of the pretreated water obtained by the hydrothermal pre-treatment the wood-based biomass for producing a pre-treatment of water for Enzymatic Hydrolysis. 전처리 후 산성을 띠고 있는 전처리 액상물을 가능한 한 많이 제거할수록 초산의 잔류량이 줄어들 뿐만 아니라 뒤에 이어지는 효소당화 단계에서 소요되는 약품의 양을 줄일 수 있다. The more pre-treatment after the pre-treatment liquid material tinged with an acid to remove as much as possible to reduce the amount of chemicals spent in the enzymatic saccharification step that follows, as well as reducing the residual amount of acetic acid. 이 때 전처리물로부터 산성 액상물을 분리 제거하는 데에는 당업계에 통상적으로 사용되는 모든 고액분리 방법을 이용할 수 있으며, 그 예로서 원심분리, 회전 탈수, 흡인 여과 및 가압여과 등을 들 수 있다. At this time, and take advantage of all the solid-liquid separation method commonly used in the art to remove There separate the acidic liquid water from the pre-processing water, there may be mentioned a centrifuge, rotary dried and suction filtration and pressure filtration or the like as an example.

효소당화용 전처리물을 제조하는 세 번째 방법은, 목질계 바이오매스를 열수 전처리한 후 고액분리하여 수득한 고형분을 물 혹은 알칼리 수용액으로 씻은 다음 탈수하여 남아있는 초산을 모두 제거하는 것이다. The third method, after the hydrothermal pre-treatment of lignocellulosic biomass is to remove all of the following: acetic acid remaining was dehydrated, washed solid component obtained by solid-liquid separation with water or an aqueous alkaline solution to manufacture a pre-treatment of water for Enzymatic Hydrolysis.

본 발명에서 열수 전처리 단계는 당업계에서 잘 알려진 방식에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 목질계 바이오매스를 160 내지 230℃에서 1 내지 60분 동안 열수 전처리할 수 있다. Hydrothermal pre-treatment step in the present invention can be well can be carried out according to known methods, for example hot water for 1 to 60 minutes the wood-based biomass pretreatment at 160 to 230 ℃ in the art.

본 발명의 방법에서 두 번째 단계는, 상기 첫 번째 단계에서 수득한 효소당화용 전처리물을 당화조로 옮긴 후, 섬유소 가수분해효소를 가하여 가수분해하고, 효소의 활성이 최대가 되는 온도, 산도 및 교반속도를 유지하면서 효소당화하는 단계이다. The second step in the process of the invention, the first, move the enzymatic pre-treatment of water for saccharification obtained in the second step twos glycosylation, cellulose hydrolysis was added to the decomposition enzyme and hydrolyzed, the temperature of the enzymatic activity is maximum, pH and agitation a step of enzymatic saccharification, while maintaining the velocity. 여기에서 일정한 산도를 유지하기 위해 첨가하는 산도 조절용 알칼리 시약으로 이 알칼리 초산염의 두 번째 초산기 해리상수(p K a 2 )가 8.0 이상이 되는 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 수용액 혹은 현탁액을 사용하는 것이 본 발명의 핵심기술이다. This second acid group of the alkali acetate in the adjustment alkaline reagent pH to be added to maintain a constant pH dissociation constant (p K a 2) an alkaline aqueous solution or suspension that the two becomes equal to or greater than 8.0, comprising a base having at least a hydroxyl group is the key technology of the present invention to use the.

상기 효소당화 단계에서, 효소의 활성이 최대가 되는 온도와 교반속도는 효소에 따라 다르므로 한정할 수는 없지만, 예를 들어 노보자임스(덴마크 효소제조회사)의 Cellic CTec2와 Cellic HTec2 혼합물을 사용할 때는 45 내지 70℃일 수 있으며, 교반속도는 50 내지 200 rpm일 수 있다. In the enzymatic saccharification step, it is not possible to limit varies depending on the activity of the temperature and stirring speed at which the maximum enzyme of the enzyme, for example, furnace let Eames (Denmark enzyme manufacturer) Cellic CTec2 and Cellic HTec2 mixture used in If may be 45 to 70 ℃, the stirring rate may be 50 to 200 rpm.

본 발명의 방법에 따라 제조된 발효당은 짝염으로 변환된 초산을 함유할 수 있다. Fermented sugar prepared according to the process of the present invention may contain a conversion of acetic acid to jjakyeom. 짝염의 가장 쉬운 예로서 상기 반응식 1의 초산칼슘[calcium diacetate, Ca(CH 3 COO) 2 ]을 들어 설명한다. A pair easiest salts example will be described for example calcium acetate [calcium diacetate, Ca (CH 3 COO) 2] in the above Reaction Scheme 1. 본 발명의 두 번째 단계인 바이오매스 열수 전처리물의 효소당화 단계에서, 효소의 최적 산도인 pH 4.5 내지 pH 5.5를 유지하기 위해 수산화칼슘 수용액 혹은 수산화칼슘 현탁액을 사용하면 헤미셀룰로오스의 가수분해에 의해 생성된 초산이 중화되어 초산칼슘이 생성된다. In the second step the biomass hydrothermal pre-treatment of water enzyme saccharification step, the optimal pH of pH 4.5 to pH using calcium hydroxide aqueous solution or a calcium hydroxide suspension in order to maintain 5.5 the acid generated by the hydrolysis of hemicellulose neutralization of the enzyme of the present invention this is calcium acetate is produced. 이 초산칼슘의 첫 번째 해리상수(p K a 1 =6.3)는 산성 영역에 속하지만, 두 번째 해리상수(p K a 2 =9.6)는 중성 이상의 알칼리 영역에 속한다. The first dissociation constant of calcium acetate (p K a 1 = 6.3) is in the acidic region, but the second dissociation constant (p K a 2 = 9.6) belong to the alkaline region than the neutral. 첫 번째 산성영역에서 해리된 초산 음이온은 미생물의 미토콘드리아로 들어가 에너지 대사를 교란시킬 수 있으므로 독성을 나타내게 되지만, 두 번째 초산기를 가지는 초산칼슘 양이온은 산성이나 중성의 산도에서는 거의 해리될 수 없으므로 사실상 초산기로 작용할 수 없는 형태이다. First the acetate anion dissociated in the acidic region is entered into the microorganism mitochondria can be disturbed energy metabolism, but exhibit the toxicity, both calcium acetate cationic group-having second acid is not be substantially dissociated in the acidic or neutral pH practically acetate groups is a function that can not form. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 발효당은 통상적으로 제조된 발효당과 동일한 농도의 초산을 함유하는 것으로 분석되어도, 이후 이를 탄소원으로 하여 산업용 미생물을 배양할 때에는 미생물에 유해한 초산의 농도가 약 절반 이하로 줄어드는 효과를 나타낸다. Thus, the sugar fermentation produced according to the method of the present invention may be analyzed to contain acetic acid of the same concentration and typically a sugar fermentation made of, since the time to do this as a carbon source to culture in industrial microorganism the concentration of harmful acetate microorganisms about It shows the effect of decreasing by more than half.

본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 알칼리 시약은, 초산염으로 변환되었을 때 초산염의 두 번째 초산기 해리상수(p K a 2 )가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기이면서 중성 부근의 산도에서 미생물에 독성이 없는 것이면 특별히 한정되지 않는다. Alkaline reagents which can be used in the method of the present invention, when converted to acetate while the base is of 8.0 or more second second acid group dissociation constant of nitrate (p K a 2) having at least a hydroxyl group-toxic to microorganisms at pH near neutral this is not as long as not particularly limited. 이러한 염기는 미세 분말 형태로 만든 후 당용액의 중화를 위해 직접 투입되도록 사용하거나, 염기를 물에 녹인 알칼리 수용액으로 또는 상기 염기를 습식 미분쇄하여 콜로이드상의 현탁액으로 사용할 수 있다. The base may be used to directly input to the neutralization of the saccharide solution and then made into a fine powder form, or an aqueous solution of alkali, or the base dissolved in a base to the water used in the wet milling a suspension colloidal. 상기 염기의 예로는 수산화칼슘, 수산화바륨 및 수산화마그네슘 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 수산화칼슘이다. Examples of the base may be mentioned calcium hydroxide, barium hydroxide and magnesium hydroxide or the like, preferably calcium hydroxide.

수산화칼슘은 수용액의 형태로 조제하여 사용할 수 있지만, 낮은 수용해도(0.17g/100ml, 25℃)로 인하여 과도한 양의 수용액이 사용되게 됨으로써 당용액의 농도를 현저하게 저하시킬 수 있다. Calcium hydroxide can be significantly reduced the concentration of the sugar solution thereby can be used to prepare in the form of an aqueous solution, due to the low water solubility (0.17g / 100ml, 25 ℃) the excessive amount of aqueous solution to be used. 이를 방지하기 위해서는 예를 들어 수산화칼슘을 0.001 내지 10 ㎛의 평균입경을 갖도록 미분쇄하여 고농도의 콜로이드상 현탁액의 형태로 조제하여 사용하는 것이 보다 바람직하다. In order to prevent this, for example by milling to have an average particle size of 0.001 to 10 ㎛ the calcium hydroxide is more preferred to use preparation in the form of a colloidal suspension of high concentration. 이때 현탁액에 포함되는 수산화칼슘의 농도는 예를 들어 1%(w/w) 내지 20%(w/w)일 수 있다. The concentration of the calcium hydroxide contained in the suspension may be, for example, 1% (w / w) to 20% (w / w).

상기 효소당화 단계를 거쳐 수득한 효소당화 물질은 원심분리 등의 과정을 거쳐 당용액을 회수함으로써, 독성이 경감된 초산을 함유하는 발효당을 수득할 수 있다. Enzymatic Hydrolysis material obtained via the enzymatic saccharification step can give the fermented sugar-containing acetic acid by the number of the sugar solutions through a process such as centrifugation, toxicity is reduced.

본 발명의 방법으로 제조한 발효당을 이용하면, 바이오매스의 전처리와 효소당화에서 생성될 수 있는 초산의 절반 이상이 통상적인 발효조건에서는 해리되지 않아 산성을 유발하지 않는다. With the fermentable sugars produced by the method of the present invention, more than half of the acetic acid which may be produced in the biomass pre-treatment and enzymatic saccharification is conventional fermentation conditions do not dissociate does not cause acid. 따라서, 본 발명에 따른 발효당은 여러 가지 화학물질과 바이오연료의 생산에 범용적인 균주로 사용되는 대장균 및 효모, 부탄올과 아세톤 등의 생산에 사용되는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰( Clostridium acetobutylicum ) 및 클로스트리듐 베이제린키( Clostridium beijerinckii ), 젖산을 주로 생산하는 락토코커스 락티스( Lactococcus lactis ) 및 락토바실러스 종( Lactobacillus sp .), 아미노산의 생산에 주로 사용되는 코린박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum ) 등 많은 산업용 미생물의 발효에 적합하다. Thus, the fermented sugar in accordance with the present invention is Clostridium acetonitrile unit Tilikum (Clostridium acetobutylicum) used in the production, such as E. coli and yeast, butanol and acetone is used as a generic strains in the production of various chemical and bio-fuels and Clostridium Bay the rinki (Clostridium beijerinckii), Lactococcus lactis, which mainly produce lactic acid (Lactococcus lactis) and Lactobacillus species (Lactobacillus sp.), choline is mainly used in the production of amino acids tumefaciens glutamicum (Corynebacterium glutamicum ), etc. it is suitable for many industrial fermentation of microorganisms. 특히, 생육 시 초산의 농도에 매우 민감하게 반응할 수 있는 균주의 배양에 유용한데, 그러한 균주로서 이스트(사카로미세스 세레비지애, Saccharomyces cerevisuae )를 들 수 있다. In particular, useful in the culture of the strain that can be very sensitive to the concentration of acetic acid during the growth, such as the yeast strains may be mentioned (three jiae Levy, Mrs in Saccharomyces Saccharomyces cerevisuae).

따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 제조된 초산의 독성이 경감된 발효당을 이용하여 미생물을 발효시키는 방법을 제공한다. Accordingly, the present invention provides a method of fermentation of microorganisms by using the fermentation of the resulting sugar-toxic acid reduction according to the method of the invention.

본 발명의 발효당 제조 방법에 원료로서 사용될 수 있는 목질계 바이오매스는 초본계 바이오매스와 목본계 바이오매스 모두를 포함한다. Be used as a raw material in the production process per fermentation Lignocellulosic biomass of the invention includes all herbal-based biomass and neck Benxi biomass. 초본계 바이오매스의 예로는 오일팜(oil palm)의 수간(trunk), 잎자루(frond), 공과방(empty fruit bunch), 해바라기 줄기, 볏짚, 보릿짚, 밀짚, 옥수수 줄기, 갈대, 억새, 스위치그래스, 유채 줄기, 단수수 줄기, 수수 줄기, 부들 등을 들 수 있으며, 목본계 바이오매스의 예로는 백합나무, 버드나무, 아카시아, 유칼립투스, 가문비 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Examples of herbal-based biomass oil palm (oil palm) of bestiality (trunk), petiole (frond), the lesson room (empty fruit bunch), sunflower stalks, straw, cornstalk, straw, corn stalks, reeds, pampas grass, switch grass , which include rape stem, single stem, sorghum stalks, parts, etc. Examples of the neck Benxi biomass but are lily tree, willow, acacia, eucalyptus, spruce, including, but not limited thereto.

본 발명에 따른 발효당을 제조하는 방법은 헤미셀룰로오스의 가수분해로 생성되는 초산을 제거하지 않고도 초산의 독성을 경감시킬 수 있으므로 목질계 바이오매스를 원료로 하는 발효용 당용액의 제조에 유용하다. Method for producing a fermented sugar according to the invention may mitigate the toxicity of acetic acid without having to remove the acetic acid produced by the hydrolysis of hemicellulose is useful in the production of sugar for fermentation solution to the wood-based biomass as a raw material.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. Or less, on the basis of the embodiment to the present invention will be described in more detail. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다. However, it will be in the range, may make the present invention to illustrate the present invention limited to these.

실시예 1: 산도 조절용 수산화칼슘 현탁액의 조제 Example 1: Preparation of pH adjustment calcium hydroxide suspension

수산화칼슘(시약 1급, 동양화학 제품, 한국) 분말 10 g을 비이온수 90 g에 가하였다. Calcium hydroxide powder, 10 g (reagent first grade, Orient Chemical, Korea) was added to the non-ionized water 90 g. 이를 평균입경 2 mm의 유리구슬이 들어있는 습식분쇄기(Eiger motormill, 일본)에 주입하고 3500 rpm으로 20분간 분쇄하여 0.8 ㎛ 내외의 평균입경을 가지는 현탁액을 조제하였다. By injecting it to the wet mill (Eiger motormill, Japan) containing the glass beads having an average particle size of 2 mm and milled 20 minutes at 3500 rpm to prepare a suspension having a mean particle size of around 0.8 ㎛. 제조된 현탁액의 수산화칼슘 농도는 10%(w/w)이었으며, 이 현탁액을 바이오매스 전처리물의 효소당화 시 산도 조절용 알칼리 시약으로 사용하였다. Calcium hydroxide concentration of the resulting suspension was 10% (w / w), the suspension was used as a biomass pre-treatment of water for adjusting the enzyme alkaline reagent pH when glycosylation.

실시예 2: 해바라기 줄기를 원료로 하는 발효당의 제조 Example 2: Preparation of fermented sugar in the sunflower stem material

성분 조성을 알고 있는 해바라기 줄기 분말을 건물중으로 480 g을 저울로 달아 광목자루에 담았다. Sunflower stalks powder known composition ingredients put into a 480 g scale into the building captured in the sack rung. 이러한 시료를 두 개 만들어 입구를 묶고 끓는 물 19 L가 담긴 들통에 넣어 10분간 삶았다. Make two such samples bind to the entrance into the bucket filled with boiling water 19 L atda lives 10 minutes. 탈수기(짤순이, 한일전기 제품, 한국)에 넣어 30분간 탈수하였다. Put in a dehydrator (jjalsun this, Hanil Electronics, Korea), it was dehydrated for 30 minutes. 시료를 꺼내어 무게를 달고 원시료 120 g 상당량을 산출하였다. Take out the samples weighing 120 g was calculated original sample significant amounts. 원시료 120g 상당량을 2 L용 고압 반응기(Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., 미국) 병(jar)에 넣고 증류수를 가하여 내용물 무게가 1,500 g이 되게 하였다. 120g original sample a significant amount of second high-pressure reactor for L (Parr reactor; Parr Instrument Co. Ltd., USA) into the bottle (jar) was added to distilled water to the contents of the weight to be 1,500 g. 상기 반응기를 가열하여 180℃에서 25분간 열수 전처리하였다. By heating the reactor and hot-water pre-treatment for 25 minutes at 180 ℃.

반응이 끝난 후 반응기 병을 흐르는 물에 담가 급속 냉각한 다음 내용물을 5 L용 발효기(BioTron, 한국)의 발효조로 옮겼다. The reaction is rapidly cooled to soak in the water flowing through the reactor bottle after then transferred to the fermenter contents of the 5 L fermenter (BioTron, Korea) for. 셀룰로오스 가수분해 효소로서 Cellic CTec2 12 ml를 상기 발효조에 가하고 50±1℃ 및 pH 5.0±0.1로 유지하면서 150 rpm으로 교반하여 72시간 동안 가수분해하였다. Cellulose as a hydrolysis enzyme was added to 12 ml Cellic CTec2 to the fermenter was digested for 50 ± 1 ℃ and pH 5.0 ± 0.1 by maintaining a stirring at 150 rpm 72 sigan singer. 이 때 산도 조절용 알칼리 시약으로 상기 실시예 1에서 제조한 수산화칼슘 현탁액(10%, w/w%)을 당화계의 산도가 pH 5.0이 유지되게 자동 주입되도록 하였다. At this time, the pH adjustment was adjusted to the pH of the suspension of calcium hydroxide (10%, w / w%) hwagye per a prepared in Example 1 with an alkaline reagent automatic injection maintained a pH 5.0. 수득한 가수분해물을 500 ml용 원심튜브에 옮기고 4300 rpm에서 1시간 동안 원심분리(Combi-514R, Hanil Scientific 제품, 한국)하여 상징액을 얻은 다음, 이 당용액을 역삼투 막모듈(BWRO, 웅진케미칼 제품, 한국)이 장착된 농축기로 농축하여 물만을 제거함으로써 240 g/L의 포도당을 함유하는 발효당을 제조하였다. Transfer the resulting hydrolyzate in the centrifugal tube 500 ml for one hour at 4300 rpm centrifugation (Combi-514R, Hanil Scientific Products, South Korea) to obtain a supernatant, and then, the reverse osmosis membrane module to a sugar solution (BWRO, Woongjin Chemical by products, South Korea) to remove only the water is concentrated in a concentrator mounted to prepare a fermentation of sugar containing 240 g / L glucose. 이 발효당을 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계(refractive index detector)가 장착된 워터스(Waters) HPLC로 분석한 후 포도당과 기타 당 및 초산의 농도를 산출하여 하기 표 1에 나타내었다. After this fermented sugar in a Waters (Waters) HPLC equipped Aminex HPX-87H column and a refractive index BioRad based (refractive index detector) analysis for calculating the glucose and other sugars, and the concentration of acetic acid shown in Table 1 below.

비교예 1: 수산화나트륨 수용액을 중화제로 사용한 해바라기 줄기 원료 발효당의 제조 Comparative Example 1: Sunflowers producing sugar fermented stem material with an aqueous solution of sodium hydroxide with a neutralizing agent

효소 가수분해물의 산도 조절용 알칼리 시약으로 수산화나트륨 수용액(4%, w/w%)을 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방식으로 수행하였다. , Except that an aqueous solution of sodium (4%, w / w%) hydroxide as an alkaline reagent for adjusting the pH of the hydrolysates was carried out in the same manner as in Example 2. 수득한 당 용액의 포도당과 기타 당 및 초산의 농도를 산출하여 하기 표 1에 나타내었다. To calculating the glucose and other sugars, and the concentration of acetic acid in the sugar solution obtained it is shown in Table 1 below.

성분명 Ingredient Name 농도(g/1000g) Concentration (g / 1000g)
실시예 2 Example 2 비교예 1 Comparative Example 1
포도당 glucose 240 240 241 241
기타 당 Other party 147 147 147 147
초산 Acetic acid 39 39 40 40
HMF HMF 0 0 0 0
퍼퓨랄 Fur pyural 0 0 0 0

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 수산화칼슘 현탁액을 산도조절용 알칼리 시약으로 사용하는 본 발명의 방법은 통상의 수산화나트륨 수용액을 사용하는 방법과 비교하여 화학적 분석방법으로는 미생물 생육억제 물질로 작용하는 초산의 농도가 저하되는 것으로 나타나지는 않는다. Method of the invention using a calcium hydroxide suspension, as shown in Table 1 by adjusting the alkaline reagent pH is as compared to the method using a conventional aqueous solution of sodium hydroxide of the chemical analysis method is the concentration of acetic acid which acts as a microbial growth inhibitor It does not appear to have to be lowered. 하지만 이러한 분석적인 농도가 유사할지라도 미생물 발효 시에 작용하는 생물학적 초산 농도는 현저히 다르다는 것을 하기 시험예 1에서 확인할 수 있다. But even if such a similar analysis of biological concentration of acetic acid concentration is applied during microbial fermentation can be found in the following Test Examples 1 to markedly different.

시험예 1: 효모를 이용한 알콜 발효 Test Example 1: alcohol fermentation using yeast

실시예 2 및 비교예 1에서 수득한 발효당, 및 시약용 포도당(시그마알드리치 코리아 제품)을 이용하여 알콜 발효를 수행하였다. Using Example 2 and Comparative Example 1 for the fermentation of glucose sugar, and reagents obtained from (Sigma Aldrich Korea, Ltd.) was carried out the alcohol fermentation.

먼저 실시예 2 및 비교예 1의 발효당을 이용하여 40 ml의 YPD 액체 배지(효모 추출물 10 g/L, 펩톤 20 g/L 및 포도당 50 g/L)에 사카로마이세스 세레비지애( Saccharomyce cerevisiae )를 배양하여 종균(seed)을 제조하였다. First, Example 2 and Comparative Example YPD broth in a 40 ml using a sugar fermentation 1 (yeast extract 10 g / L, peptone 20 g / L and glucose 50 g / L) saccharide in my process three Levy jiae (Saccharomyce in culturing cerevisiae) was prepared in a seed (seed). 이후 시약용 포도당과 비교예 1의 발효당을 각각의 영양원으로 하는 대조구 배지 1 및 2와 실시예 2의 발효당을 영양원으로 하는 실시예 2의 배지를 각각 제조하였다. After the medium was prepared in Example 2 for the control of fermentation medium per 1 and 2 as in Example 2 to the fermentation of sugar glucose in Comparative Example 1, reagent to each nutrient as nutrient sources, respectively. 구체적으로, 대조구 배지 1은 시약용 포도당 120 g/L, 효모 추출물 20 g/L 및 펩톤 40 g/L을 첨가하여 제조하였고, 대조구 배지 2 및 실시예 2의 배지는 시약용 포도당 대신 각각 비교예 1의 발효당 120 g/L 및 실시예 2의 발효당 120 g/L를 사용하여 대조구 1의 배지의 제조 방식과 동일하게 제조하였다. Specifically, the control medium 1 is a comparative example, respectively instead of medium glucose for reagent was prepared by addition of glucose, 120 g / L, yeast extract 20 g / L and the peptone 40 g / L for the reagent, control medium 2 and Example 2 1 using 120 g / L per fermentation of 120 g / L and example 2 each fermentation were prepared in the same manner as in Preparation of the medium of the control group 1. 이후, 상기 각 배지에 7%의 종균을 접종하고, 혐기 조건 하에서 30±1℃에서 배양하였다. Then, the inoculated seed of 7% each medium, and cultured at 30 ± 1 ℃ under anaerobic conditions. 배양 중 일정 시간(6, 12, 24, 48 및 72시간) 간격으로 시료를 채취하여 BioRad Aminex HPX-87H 컬럼과 굴절률계가 장착된 워터스(Waters) HPLC로 분석하여 에탄올 농도를 측정하였다. Sampling at a predetermined time (6, 12, 24, 48 and 72 hours) of incubation intervals was analyzed with a BioRad Aminex HPX-87H column and a refractive index boundaries equipped with Waters (Waters) HPLC to measure the ethanol concentration. 상기 시험을 각각 3 반복으로 수행한 후 결과를 평균하여 표 2에 나타내었다. After performing the test with three replications each by averaging the results it is shown in Table 2.

배양시간 Incubation time
(시간) (time)
에탄올 발효 균주 접종 배양액의 에탄올 수율 변화(g/L) Fermentation ethanol yield changes in strain inoculated culture medium (g / L)
대조구 배지 1 Control medium 1
(시약용 포도당) (Glucose reagent grade)
대조구 배지 2 Control medium 2
(수산화나트륨 중화) (Sodium hydroxide neutralized)
실시예 2의 배지 The medium of Example 2
(수산화칼슘 중화) (Calcium neutralized)
0 0 0.22 0.22 0.16 0.16 0.18 0.18
9 9 34.7 34.7 0.35 0.35 11.8 11.8
12 12 56.5 56.5 0.59 0.59 38.0 38.0
18 18 56.9 56.9 2.70 2.70 58.8 58.8
24 24 56.8 56.8 16.3 16.3 58.0 58.0

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 대조구 배지 2는 수산화나트륨 수용액으로 중화한 초산을 20 g/L 함유하므로 효모의 생육이 크게 억제되어 에탄올 생성량이 매우 적다. Wherein, as shown in Table 2, the control medium 2 is so contained 20 g / L of acetic acid was neutralized with an aqueous solution of sodium hydroxide is suppressed significantly the growth of the yeast is ethanol production amount is small.

반면, 해바라기 전처리물의 효소당화 시 수산화칼슘 현탁액으로 중화한 실시예 2의 발효당은 대조구 배지 2와 동일한 농도의 초산을 함유하는데도 불구하고, 초산을 함유하지 않는 대조구 배지 1과 유사한 수준으로 에탄올 수율을 나타낸다. On the other hand, fermented sugar of Example 2 neutralized with city water sunflower pretreatment Enzymatic Hydrolysis of calcium hydroxide suspension, even though they contain acetic acid of the same concentration to the control medium 2, and shows the ethanol yield in a similar level as the control culture medium 1 containing no acetic acid . 이는 초산칼슘(CH 3 COO-Ca-OOCCH 3 )의 첫 번째 해리에 의해 생성되는 초산 이온(CH 3 COO - )은 효모의 생육에 영향을 미칠 수 있는 형태이지만 농도가 해를 미칠 만큼 높지는 않고, 나머지 CH 3 COO-Ca + 는 약산성 내지 중성 이상의 조건에서는 해리하지 않으므로 산으로 작용하지 않기 때문이다. This acetic acid ion (CH 3 COO -) produced by the first dissociation of calcium acetate (CH 3 COO-Ca-OOCCH 3) but is high enough to harm the shape, but the concentration that may affect the growth of the yeast and the other CH 3 COO-Ca + is that because it does not dissociate in the weakly acidic to neutral conditions than they do not act as acid.

Claims (6)

  1. 1) 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 효소당화용 전처리물을 제조하는 단계; 1) the method comprising hot-water pre-treatment to prepare a pre-treatment of water for enzymatic saccharification to a wood-based biomass; And
    2) 단계 1에서 얻은 전처리물에 섬유소 가수분해효소를 가하고, 초산염의 두 번째 초산기 해리상수(p K a 2 )가 8.0 이상인 2가 이상의 수산기를 갖는 염기를 포함하는 알칼리 시약으로 처리하여 효소 당화하는 단계 2) the pre-treatment water from step 1 was added and the cellulose hydrolyzing enzyme, a second acid group dissociation constant (p K a 2) is 8.0 or more glycosylation enzymes by treatment with an alkaline reagent to 2 comprises a base having at least hydroxyl groups of the acetate comprising:
    를 포함하는, 초산의 독성이 경감된 발효당의 제조방법. , Fermented sugar production method of the toxic reduction acetate containing.
  2. 제 1 항에 있어서, According to claim 1,
    상기 단계 1)의 효소당화용 전처리물이 하기로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법: A method as being selected from the group consisting of pre-treatment water to the enzyme for saccharification of step 1):
    a) 목질계 바이오매스를 열수 전처리하여 수득한 액상물 및 고상물 전체; a) the total lignocellulosic biomass, the hydrothermal pre-treatment to the obtained liquid phase of water and solids;
    b) 목질계 바이오매스를 열수 전처리한 후 고액분리하여 수득한 고형분; b) wood-based bio after the hydrothermal pre-treatment of biomass solids obtained by solid-liquid separation; And
    c) 목질계 바이오매스를 열수 전처리한 후 고액분리하여 수득한 고형분을 물 또는 알칼리 수용액으로 씻은 후 탈수한 전처리물. c) wood-based biomass, the hot water after the pre-treatment after washing, a solid component obtained by solid-liquid separation with water or an aqueous alkali solution a dehydration pre-treatment water.
  3. 제 1 항에 있어서, According to claim 1,
    상기 열수 전처리가 160 내지 230℃에서 1 내지 60분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 제조방법. The manufacturing method characterized in that said hydrothermal pre-treatment is performed for 1 to 60 minutes at 160 to 230 ℃.
  4. 제 1 항에 있어서, According to claim 1,
    상기 염기가 수산화칼슘, 수산화바륨 또는 수산화마그네슘인 것을 특징으로 하는, 제조방법. A method of manufacturing, characterized in that said base is calcium hydroxide, barium hydroxide or magnesium hydroxide.
  5. 제 1 항에 있어서, According to claim 1,
    상기 알칼리 시약이, 미세 분말, 염기를 물에 녹여 제조한 알칼리 수용액, 또는 염기를 0.001 내지 10 ㎛의 평균입경을 갖도록 미분쇄하여 제조한 콜로이드상의 현탁액인 것을 특징으로 하는, 제조방법. The manufacturing method characterized in that the said alkaline reagent, fine powder, a base for the alkaline aqueous solution prepared by dissolving in water, the suspension or on the non-ground prepared by the colloid so as to have an average particle size of 0.001 to 10 ㎛ the base.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 초산의 독성이 경감된 발효당을 이용하여 미생물을 발효시키는 방법. Claim 1 to a method of toxic microbial fermentation using a reduction per fermentation of the acid produced according to any one of the method of claim 5.
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