KR101430987B1 - Manufacturing method of magnetic particle bonded with nanoparticle cluster of antibody binding, agnetic particle bonded with nanoparticle cluster of antibody binding made by the same, magnetic particle array for extensive culture of antigen-specific cytotoxic cells using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법, 이에 의하여 제조된 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자, 및 이를 이용하여 제조된 세포 독성 T 세포 확대 배양을 위한 자성 입자 어레이에 관한 것이다.
본 발명의 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자는 수지상 세포가 세포 독성 T 세포와 상호 작용을 형성할 때 형성되는 다양한 기능성 나노/마이크로 도메인을 형성하기 때문에 실제 세포내에서의 면역 시냅스의 구조와 유사하여 T 세포의 기능 강화 없이 세포 독성 T 세포를 대량으로 배양할 수 있다.The present invention relates to a method for producing magnetic particles in which clusters of antibody-bound nanoparticles are bound, magnetic particles to which clusters of antibody-bound nanoparticles thus prepared are bound, and magnetic particles for expanding cytotoxic T- Array. ≪ / RTI >
The method of producing the magnetic particles in which the clusters of the antibody-bound nanoparticles of the present invention are combined and the magnetic particles to which the cluster of the antibody-bound nanoparticles thus prepared are bonded is formed when the dendritic cells form an interaction with cytotoxic T cells Because it forms various functional nano / microdomains, cytotoxic T cells can be cultured in large quantities without enhancing T cell function similar to the structure of immunity synapses in actual cells.
Description
본 발명은 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법, 이에 의하여 제조된 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자, 및 이를 이용하여 제조된 세포 독성 T 세포 확대 배양을 위한 자성 입자 어레이에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing magnetic particles in which clusters of antibody-bound nanoparticles are bound, magnetic particles to which clusters of antibody-bound nanoparticles thus prepared are bound, and magnetic particles for expanding cytotoxic T- Array. ≪ / RTI >
T 세포는 CD (Cluster Designation) 4 마커를 갖고 주로 항체 산생의 보조나 각종 면역응답의 유도에 관여하는 헬퍼 T 세포 (이하 T H ), CD8 마커를 갖고 주로 세포상해활성을 나타내는 세포상해성 T 세포 [TC ; 세포상해성 T 림프구 (cytotoxic T lymphocyte), 킬러 T 세포로도 불린다.] 로 아분류된다. T cells have helper T cells (hereinafter, referred to as T H ), CD8 markers, which are mainly involved in assisting in the production of antibodies or inducing various immune responses, and have cytostatic T cells [T C ; Cytotoxic T lymphocytes, also known as killer T cells.
종양세포나 바이러스 감염 세포 등을 인식하여 파괴, 제거하는 데에 가장 중요한 역할을 하는 세포상해성 T 세포는, B 세포와 같이 항원에 대해 특이적으로 반응하는 항체를 생산하는 것이 아니고, 표적세포막 표면상에 존재하는 주요 조직 적합 복합체 (major histocompatibility complex, MHC : 인간의 경우에는 인간백혈구항원 (human leukocyte antigen, HLA) 으로 불리기도 함) 클래스 I 분자에 회합한 표적세포유래의 항원 (항원성 펩티드) 을 직접 인식하여 작용한다. 이 때, 세포상해성 T 세포의 막 표면의 T 세포 리셉터 (T cell receptor, 이하 TCR 이라고 함) 가 상기 서술한 항원성 펩티드 및 MHC 클래스 I 분자를 특이적으로 인식하여 항원성 펩티드가 자기 유래의 것인지 혹은 비자기 유래의 것인지를 판단한다. 그리고, 비자기유래로 판단된 표적세포는 CTL 에 의해 특이적으로 파괴, 제거된다.
Cytotoxic T cells, which play the most important role in recognizing and destroying and removing tumor cells or virus-infected cells, do not produce an antibody that specifically reacts with an antigen such as B cells, (Antigenic peptides) associated with a class I molecule that bind to a major histocompatibility complex (MHC: human leukocyte antigen (HLA) in humans) And directly operates. At this time, a T cell receptor (hereinafter referred to as TCR) on the membrane surface of the cytotoxic T cell specifically recognizes the above-described antigenic peptide and MHC class I molecule, and the antigenic peptide specifically binds to Or whether it is non-self-originated. Then, target cells judged to be non-magnetic originated are specifically destroyed and removed by CTL.
최근 약제치료법이나 방사선치료법과 같이 환자에게 무거운 육체적 부담이 있는 치료법이 다시 검토되어, 환자의 육체적 부담이 가벼운 면역치료법에 대한 관심이 높아지고 있다. 특히 면역기능이 정상인 인간 유래의 세포상해성 T 세포 또는 T 세포로부터 목적하는 항원에 대해 특이적으로 반응하는 세포상해성 T 세포를 생체외 (인비트로) 에서 유도한 후, 환자에게 이입하는 양자면역치료의 유효성이 주목되고 있다. 예를 들어 동물 모델을 사용한 양자면역요법이 바이러스 감염 및 종양에 대해 유효한 치료법인 것이 시사되어 있고 [그린버그 (Greenberg, P. D.) 저, 어드밴시즈 인 이뮤놀로지 (Advances in Immunology), 1992 년 발행], 또한 면역부전 환자에게 세포상해성 T 세포를 투여함으로써, 독성을 나타내지 않고, 급속하고 지속적으로 사이토메갈로바이러스가 배제되는 특이적 세포상해성 T 세포 응답이 재구축된 [로이젤 P. 등 (Reusser P., et al.), 블러드 (Blood), 제 78 권, 제 5 호, 제 1373 ∼ 1380 면 (1991)] 점 등에서, 선천성, 후천성 및 의원성에 의한 T 세포 면역부전증 환자에 대한 사용도 주목되고 있다. 이 치료법에서는 세포상해성 T 세포의 항원특이적 상해활성을 유지 혹은 증강시킨 상태에서 그 세포수를 유지 혹은 증가시키는 것이 중요하다.
Recently, a treatment method with a heavy physical burden on a patient such as a medicament or a radiotherapy has been reexamined, and there is a growing interest in immunotherapy in which the patient's physical burden is light. In particular, a cytotoxic T cell that specifically reacts with a target antigen from human-derived cytotoxic T cells or T cells having normal immune function is induced in vitro (Invitro), and then quantum immune The efficacy of treatment has been noted. For example, quantum immunotherapy using animal models has been suggested to be an effective treatment for viral infections and tumors (Greenberg, PD, Advances in Immunology, issued 1992), and By administering cytotoxic T cells to immunodeficient patients, a specific cytotoxic T cell response in which the cytomegalovirus is excluded rapidly and continuously without toxicity is reconstructed (Reusser P. et al. (Blood), 78, 5, 1373-1380 (1991)], the use of T-cell immunodeficiency due to congenital, acquisitive and / . In this treatment method, it is important to maintain or increase the number of the cells while maintaining or enhancing the antigen-specific injury activity of cytotoxic T cells.
상기 세포상해성 T 세포는 비(非)펩티드 항원에 의해서도 활성화 및/또는 증식되는 것이 알려져 있으며, 알킬아민 등의 알카로이드, 피로인산모노에스테르, 비스포스포네이트에 의해 활성화 및/또는 증식되는 것이 알려져 있다. The cytotoxic T cells are known to be activated and / or proliferated by non-peptide antigens, and are known to be activated and / or proliferated by alkaloids such as alkyl amines, mono-esters of pyrophosphoric acid, and bisphosphonates.
이러한 다른 세포를 사용하지 않고 세포상해성 T 세포를 배양하는 대표적인 방법은 수지상세포가 T세포에게 전달하는 핵심 신호를 전달할 수 있는 항체가 코팅된 비드 (bead)나 배양용기를 사용하는 것이다. 이러한 핵심 신호에는 T 세포 수용체를 자극하는 항원 신호와 그러한 자극을 보조하는 다양한 종류의 보조자극신호 (co-stimulation signal)가 있다. T 세포 수용체는 anti-CD3라는 항체를 사용하여 자극할 수 있으며 보조자극신호를 전달하는데 가장 널리 사용되는 것은 anti-CD28이라는 항체이다. 때로는 필요에 따라 T 세포의 성장요소 (growth factor)로 알려진 인터루킨-2 (interleukin-2, IL-2)를 넣어주기도 한다. A typical method for culturing cytotoxic T cells without using such other cells is to use beads or culture vessels coated with antibodies capable of delivering a core signal that the dendritic cells transmit to T cells. These key signals include antigen signals that stimulate T cell receptors and various types of co-stimulation signals that support such stimuli. T cell receptors can be stimulated using an anti-CD3 antibody, and the most widely used anti-CD28 antibody is an anti-CD28 antibody. Sometimes, interleukin-2 (IL-2), known as the growth factor of T cells, is inserted as needed.
그러나, 이러한 배양방법을 사용하였을 때 T 세포가 증식을 거듭하면서 점점 더 late effector T 세포로 분화하여 간다는 문제점이 있었다. 즉, 앞에서 언급한 것과 마찬가지로 독성 T 세포의 수를 늘리면 그 질이 떨어지고 반대로 질을 향상시키면 그 수가 줄어드는 것이다. However, when such a culture method is used, there has been a problem that T cells are gradually differentiated into late effector T cells by repeated proliferation. In other words, as mentioned above, increasing the number of toxic T cells will decrease the quality, and vice versa, the number will decrease.
이러한 한계의 이유는 아직 명확하게 알려져 있지 않으며, 한 가지 가능성은 세포상해성 T 세포의 활성화 과정에서 나타나는 초분자구조인 면역 시냅스의 역할을 간과한 것이 이러한 문제점의 원인이 될 수 있다는 것이다. T-세포는 T-세포 수용체(T-cell receptor) 통해 APC 표면의 항원을 인식하지만, 이 정보는 T-세포와 APC가 직접적인 접착을 통해서 전달된다. 그 접착면에는 세포 표면의 다양한 수용체와 세포의 신호전달 분자들이 동심원을 형성하며 규칙적으로 나열하고 있으며, 이 구조는 신경계의 시냅스와 유사하다는 것으로부터 ‘면역 시냅스’라고 불린다. 실제로 면역 시넵스는 T 세포의 활성화에 필요한 신호의 강도를 조절하고, 활성화 이후의 분화에 있어서 중요한 역할을 한다. The reason for this limitation is not clearly known yet, and one possibility is that overlooking the role of the supramolecular structure of the immune synapse in the activation process of cytotoxic T cells may be the cause of this problem. T-cells recognize antigen on the surface of APC via T-cell receptor, but this information is transmitted through direct adhesion of T-cell and APC. On the adhesive surface, various receptors on the cell surface and signaling molecules of the cell form concentric circles and are regularly arranged. This structure is called 'immunity synapse' because it is similar to the synapse of the nervous system. In fact, immunization synapses regulate the signal intensity required for activation of T cells and play an important role in post-activation differentiation.
그러나, 현재 사용되고 있는 여러 가지 신호전달물질들은 균일하게 표면상에 분포하는 방법으로는 실제 항원 제시 세포와 T 세포의 상호작용을 그대로 흉내낼 수 없다.
However, various signal transduction agents currently in use can not mimic the interaction of T cells with actual antigen presenting cells in a uniformly distributed manner on the surface.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위한 것으로서, 항원 제시 세포와 T 세포 사이의 상호 작용을 그대로 재현할 수 있는 새로운 구조의 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 새로운 구조의 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자를 제공하는 것을 목적으로 한다. Disclosure of the Invention The present invention has been made to solve the above problems, and it is an object of the present invention to provide a method for producing magnetic particles in which clusters of antibody-bound nanoparticles having a novel structure capable of reproducing the interaction between antigen- Bonded nanoparticles of the present invention to a magnetic particle having a cluster structure of antibody-bound nanoparticles having a novel structure.
본 발명은 또한, 상기 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자를 이용하여 제조된 자성 입자 어레이로서, 항원 제시 세포와 T 세포의 상호 작용을 그대로 나타내면서 세포 독성 T 세포를 확대 배양할 수 있는 어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.
The present invention also relates to a magnetic particle array prepared by using the magnetic particles to which the cluster of antibody-bound nanoparticles prepared by the method of the present invention is bound, wherein the magnetic particle array shows the interaction between the antigen- The present invention provides an array capable of expanding T cells.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 항체 결합 나노 입자를 준비하는 단계; 및 상기 항체 결합 나노 입자와 자성 입자를 혼합하여, 상기 항체 결합 나노 입자가 클러스터를 형성하면서 상기 자성 입자의 표면에 부착되는 단계를 포함하는 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법을 제공한다. The present invention provides a method of preparing antibody-bound nanoparticles comprising: preparing antibody-bound nanoparticles; And binding the antibody-bound nanoparticles and the magnetic particles to attach the antibody-bound nanoparticles to the surface of the magnetic particles while forming clusters. to provide.
도 1에 본 발명에 의한 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법을 모식적으로 나타내었다. 도 1에서 보는 바와 같이 표면에 항체(130)가 결합된 항체 결합 나노 입자(120)를 자성 입자(110)와 혼합하게 되면, 상기 항체 결합 나노 입자(120)가 상기 자성 입자(110)의 표면에 클러스터를 형성하면서 부착하게 된다.
FIG. 1 schematically shows a method for producing magnetic particles in which clusters of antibody-bound nanoparticles according to the present invention are bound. As shown in FIG. 1, when the antibody-bound
본 발명에 있어서, 상기 항체 결합 나노 입자를 준비하는 단계는 In the present invention, the step of preparing the antibody-bound nanoparticles
i)항체를 티올 반응성 시약과 반응시켜 항체를 티올화시키는 단계i) reacting the antibody with a thiol-reactive reagent to thiolate the antibody
ii)나노 입자를 준비하는 단계;ii) preparing nanoparticles;
iii)상기 나노 입자의 표면을, 상기 티올화된 항체와 티오-에테르 결합을 형성할 수 있는 작용기로 기능화시키는 단계; 및iii) functionalizing the surface of the nanoparticle with a functional group capable of forming a thio-ether bond with the thiolated antibody; And
iv)상기 티올화된 항체와, 표면이 상기 티올화된 항체와 티오-에테르 결합을 형성할 수 있는 작용기로 기능화된 나노 입자를 반응시켜, 상기 나노 입자의 표면에 상기 항체를 티오-에테르 결합에 의해 결합시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
iv) reacting the thiolated antibody and the surface with nanoparticles functionalized with a functional group capable of forming a thio-ether bond with the thiolated antibody to form a thioether bond on the surface of the nanoparticle; And a step of combining the first and second electrodes.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. In the present invention, the antibody is selected from a monoclonal antibody, a bispecific antibody, a chimeric antibody, a human antibody, and a humanized antibody.
본 명세서에 있어서 이용될 수 있는 「항체」는 자연 발생적인 것이거나 통상의 하이브리도마 기술에 의해 생산된 모노클로날 항체와 같은 인공의 것일 수 있다. 항체 자체 및 항체 조각의 외, 유도화 또는 수식된 항체 등을 포함하고 있고, 가장 광의적으로 해석되어야 한다. 또한, 항체로는 치료 대상이 되는 조직, 세포, 세균, 바이러스 등과 반응성을 가지는 항체를 이용할 수 있다. 예를 들면, 각종동물의 다클론성 항체, 마우스 단일 클론성 항체, 사람-마우스의 키메라 항체, 사람 단일 클론성 항체 등을 이용할 수 있다. 이종동물의 단백질이 아니라는 점에서 사람 단일 클론성 항체가 보다 바람직하다. &Quot; Antibodies " as used herein may be either naturally occurring or artificial such as monoclonal antibodies produced by conventional hybridoma techniques. Other than the antibody itself and the antibody fragment, an inducible or modified antibody, etc., and should be interpreted most broadly. As the antibody, an antibody having reactivity with tissues, cells, bacteria, viruses, etc. to be treated can be used. For example, polyclonal antibodies of various animals, mouse monoclonal antibodies, human-mouse chimeric antibodies, human monoclonal antibodies, and the like can be used. Human monoclonal antibody is more preferred in that it is not a heterologous animal protein.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 형광 물질을 부착하고 있는 것이 가능하다. 상기 형광 물질은 상기 항체당 5 내지 15개 부착되는 것이 바람직하다.
In the present invention, the antibody may be attached with a fluorescent substance. It is preferable that 5 to 15 fluorescent substances are attached to the antibody.
본 발명에 있어서, 상기 항체를 나노 입자와 결합시키기 위해 항체의 표면을 티올화 시킨다. In the present invention, the surface of the antibody is thiolized to bind the antibody to nanoparticles.
이러한 티올화를 위해 H2S2, H2S3, H2S4 형태의 폴리설피드, 티오글리콜산, 1,4-디티오트레이톨, 머캅토에탄올, 벤질 머캅탄, 에탄티올, 벤젠티올, 2-아미노에탄티올, 시스테인을 포함하는 티올 환원제; 포스핀, 테트라키스(히드록시메틸)포스포늄 클로라이드, 트리스(히드록시메틸)포스핀, 트리-n-부틸포스핀, 트리에틸포스핀, 및 아민 및 포름알데히드와의 반응에 의해 포스핀으로부터 유도된 3차 포스핀을 포함하는 포스핀류를 포함하는 환원제; 트리에틸 포스파이트, 수소화붕소염, 바이설파이트, 설파이트, 디티오나이트, 모노에탄올아민 세스퀴설파이트, 설피드, 히드로설피드, 이산화황을 포함하는 기타 환원제; 아세틸메캅토숙신산 무수물, N-아세틸-호모시스테인 티오락톤, 호모시스테인 티오락톤 및 티오글리콜리드 등의 티올화 제제를 사용하는 것이 가능하다. For such thiolation, polysulfide, thioglycolic acid, 1,4-dithiothreitol, mercaptoethanol, benzylmercaptan, ethanethiol, benzene in the form of H 2 S 2 , H 2 S 3 and H 2 S 4 Thiol, 2-aminoethanethiol, thiol reducing agent including cysteine; Derived from phosphine by reaction with phosphine, tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium chloride, tris (hydroxymethyl) phosphine, tri-n-butylphosphine, triethylphosphine and amine and formaldehyde. A reducing agent comprising a phosphine comprising a tertiary phosphine; Other reducing agents including triethyl phosphite, borohydride salts, bisulfite, sulfite, dithionite, monoethanolamine sesquisulfite, sulfide, hydrosulfide, sulfur dioxide; It is possible to use thiolating agents such as acetylmercaptosuccinic anhydride, N-acetyl-homocysteine thiolactone, homocysteine thiolactone and thioglycolide.
본 발명에 있어서, 구체적으로 상기 티올 반응성 시약은 트리메틸머틸머캅티드, 티오우레아, 에틸잔테이트및 DTT(디티오트레이톨)로 구성된 그룹에서 선택되는 것이 바람직하며, DTT(디티오트레이톨)인 것이 더욱 바람직하다.
In the present invention, specifically, the thiol-reactive reagent is preferably selected from the group consisting of trimethylmethacrylate, thiourea, ethylantanate and DTT (dithiothreitol), and DTT (dithiothreitol) More preferable.
본 발명에 있어서, 상기 나노 입자의 크기는 50 nm 내지 250 nm 인 것을 특징으로 한다. In the present invention, the size of the nanoparticles is 50 nm to 250 nm.
본 발명에 있어서, 상기 나노 입자의 표면을 상기 티올화된 항체와 티오-에테르 결합을 형성할 수 있는 작용기로 기능화시킨다. 상기 티올화된 항체와 티오-에테르 결합을 형성할 수 있는 작용기는 말레이미드, 요오도알킬 또는 브로모알킬기의 할로알킬기인 것이 바람직하며, 말레이미드인 것이 더욱 바람직하다.
In the present invention, the surface of the nanoparticles is functionalized with a functional group capable of forming a thio-ether bond with the thiolated antibody. The functional group capable of forming a thio-ether bond with the thiolated antibody is preferably a haloalkyl group of maleimide, iodoalkyl or bromoalkyl group, more preferably maleimide.
본 발명에 있어서, 상기 자성 입자는 특별히 제한되지 않으며, 상기 자성 입자의 크기는 5 ㎛ 내지 20 ㎛ 인 것이 바람직하다. In the present invention, the magnetic particles are not particularly limited, and the size of the magnetic particles is preferably 5 to 20 탆.
본 발명에 있어서, 상기 자성 입자는 상기 항체 결합 나노 입자와 결합시키기 위해 표면이 카르복시기로 기능화되는 것이 바람직하다. 이와 같이 표면이 카르복시기로 기능화된 자성 입자와 상기 항체 결합 나노 입자를 혼합하게 되면, 상기 항체의 아민기와 상기 자성 입자 표면의 카르복시기 사이의 축합 반응이 일어나면서 상기 항체 결합 나노 입자가 상기 자성 입자 표면에 고정화 된다. In the present invention, it is preferable that the surface of the magnetic particles is functionalized with a carboxyl group in order to bind to the antibody-bound nanoparticles. When the surface of a magnetic particle functionalized with a carboxyl group is mixed with the antibody-bonded nanoparticles, a condensation reaction occurs between the amine group of the antibody and the carboxyl group on the surface of the magnetic particle, and the antibody- Is immobilized.
본 발명에 있어서, 상기 항체 결합 나노 입자를 자성 입자와 혼합하는 단계에서는 pH 를 5.5 내지 6.0 으로 조절하는 것이 상기 항체 결합 나노 입자를 상기 자성 입자에 효율적으로 고정시킬 수 있게 된다. 본 발명에 있어서, 이러한 pH 조절을 위해서는 MES buffer 를 사용하였다.
In the present invention, in the step of mixing the antibody-bound nanoparticles with the magnetic particles, adjusting the pH to 5.5 to 6.0 enables the antibody-bound nanoparticles to be efficiently fixed to the magnetic particles. In the present invention, MES buffer was used for such pH control.
본 발명은 또한, 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자를 제공하는 것을 목적으로 한다. It is another object of the present invention to provide magnetic particles in which clusters of antibody-bound nanoparticles prepared by the production method of the present invention are combined.
도 2에 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자를 모식적으로 나타내었다. 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 항체(130)가 결합된 항체 결합 나노 입자(120)의 클러스터가 결합된 자성 입자(100)는, 도 2에서 보는 바와 같이 중심 자성 입자(110) 주변에 클러스터를 이루면서 결합된 항체 결합 나노 입자(120)로 구성된다.
FIG. 2 schematically shows magnetic particles to which clusters of antibody-bound nanoparticles prepared by the production method of the present invention are bound. As shown in FIG. 2, the
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자를 이용하여 제조된 자성 입자 어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 있어서, 상기 자성 입자 어레이는 세포 독성 T 세포의 확대 배양을 위해 사용되는 것을 특징으로 한다. The present invention also aims to provide a magnetic particle array produced by using magnetic particles to which clusters of antibody-bound nanoparticles of the present invention are bound. In the present invention, the magnetic particle array is characterized in that it is used for the expansion of cytotoxic T cells.
본 발명에 있어서, 상기 자성 입자 어레이를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 일반적인 나노 입자 어레이를 제조하기 위한 미세 가공 방법, 마이크로어레이어 등을 사용하여 제조할 수 있다.
In the present invention, the method for producing the magnetic particle array is not particularly limited, and may be manufactured using a micromachining method for producing general nanoparticle arrays, a microarray layer, or the like.
본 발명의 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법 및 이에 의하여 제조된 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자는 수지상 세포가 세포 독성 T 세포와 상호 작용을 형성할 때 형성되는 다양한 기능성 나노/마이크로 도메인을 형성하기 때문에 실제 세포내에서의 면역 시냅스의 구조와 유사하여 T 세포의 기능 강화 없이 세포 독성 T 세포를 대량으로 배양할 수 있다. The method of producing the magnetic particles in which the clusters of the antibody-bound nanoparticles of the present invention are combined and the magnetic particles to which the cluster of the antibody-bound nanoparticles thus prepared are bonded is formed when the dendritic cells form an interaction with cytotoxic T cells Because it forms various functional nano / microdomains, cytotoxic T cells can be cultured in large quantities without enhancing T cell function similar to the structure of immunity synapses in actual cells.
도 1에 본 발명에 의한 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법을 모식적으로 나타내었다.
도 2는 본 발명의 제조 방법에 의하여 제조된 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자를 모식적으로 나타내었다.
도 3은 항체가 나노 입자에 부착되었는지를 형광 현미경을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 제조된 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 주사 전자 현미경 사진을 나타낸다.
도 5는 면역 시냅스 어레이 상의 T 세포들이 면역 시냅스를 형성하는가 여부를 면역형광염색법을 활용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 세포 독성 T 세포와 면역 시냅스 어레이 사이의 반응을 실시간으로 영상 촬영한 결과를 나타낸다. FIG. 1 schematically shows a method for producing magnetic particles in which clusters of antibody-bound nanoparticles according to the present invention are bound.
FIG. 2 schematically shows magnetic particles to which clusters of antibody-bound nanoparticles prepared by the production method of the present invention are bound.
Fig. 3 shows the result of confirming whether the antibody was attached to the nanoparticles using a fluorescence microscope.
FIG. 4 shows a scanning electron microscopic photograph of magnetic particles having clusters of antibody-bound nanoparticles prepared.
FIG. 5 shows the results of confirming whether T cells on the immunological synapse array form an immunological synapse using immunofluorescence staining.
FIG. 6 shows the result of real-time imaging of the reaction between cytotoxic T cells and the immunological synapse array.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
<< 실시예Example 1> 1> 단클론Monoclonal 항체 생산 Antibody production
hybridoma 세포를 배양하여 항체 anti-CD3와 anti-CD28을 생산하였다. 구입한 항체의 amine group 에 녹색 (FITC) 혹은 far red (Alexa-647) 형광물질을 NHS 반응을 통하여 부착하였으며, 반응하지 않은 형광 물질을 dialysis로 제거하였다. 항체당 붙은 형광물질의 수를 spectrophotometer를 이용하여 정량화. 항체당 형광 염료의 수를 5-15개로 조절하였다.
Hybridoma cells were cultured to produce anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. Green (FITC) or far red (Alexa-647) fluorescent material was attached to the amine group of the purchased antibody through NHS reaction, and unreacted fluorescent material was removed by dialysis. Quantification of the number of fluorescent substances attached to the antibody by spectrophotometer. The number of fluorescent dyes per antibody was adjusted to 5-15.
<< 실시예Example 2> 항체 결합 나노 입자의 제조 2> Preparation of antibody-bound nanoparticles
먼저, 상기 실시예 1에서 제조된 항체를 티올 반응성 시약과 반응시켜 티올화하였다. Pierce에서 구입한 NHS-maleimide를 이용하여 나노입자의 표면에 말레이미드 작용기 도입하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 형광 물질이 부착된 항체를 티올 반응성 시약으로서 DTT(디티오트레이톨)를 이용하여 hinge 부분의 disulfide bond를 환원시켜서 항체를 티올화 시켰다. First, the antibody prepared in Example 1 was thiolized by reacting with a thiol-reactive reagent. Maleimide functional groups were introduced on the surface of the nanoparticles using NHS-maleimide purchased from Pierce. The antibody with the fluorescent substance prepared in Example 1 was thiolized by reducing the disulfide bond in the hinge region using DTT (dithiothreitol) as a thiol reactive reagent.
50 nm, 250 nm 크기의 실리카 나노 입자를 준비한 후, 상기 나노 입자의 표면에 말레이미드 작용기를 도입하였다. Silica nanoparticles having a size of 50 nm and 250 nm were prepared and maleimide functional groups were introduced on the surfaces of the nanoparticles.
상기 말레이미드 작용기가 도입된 나노 입자와 상기 티올기를 가지는 항체를 반응시켜 상기 나노 입자에 상기 항체를 부착시켰다. The maleimide functional group-introduced nanoparticles were reacted with an antibody having the thiol group to attach the antibody to the nanoparticles.
항체가 나노 입자에 부착되었는지를 형광 현미경을 이용하여 확인하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 나노 입자가 있는 곳에서 녹색 형광이 검출되어 항체가 나노 입자에 부착되었음을 확인할 수 있다.
Whether the antibody adhered to the nanoparticles was confirmed by fluorescence microscopy. As shown in FIG. 3, green fluorescence was detected in the presence of nanoparticles, indicating that the antibody was attached to the nanoparticles.
<< 실시예Example 3> 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 3> The cluster of antibody-bound nanoparticles 결합된Combined 자성 입자 합성 Magnetic particle synthesis
자성 입자와 상기 실시예 2에서 제조된 형광 물질이 부착된 항체 결합 나노 입자를 혼합하여 상기 항체 결합 나노 입자가 상기 자성 입자의 표면에 클러스터를 형성하면서 결합된 자성 입자를 제조하였다. The magnetic particles and the antibody-bonded nanoparticles attached with the fluorescent substance prepared in Example 2 were mixed to produce magnetic particles bonded together while the antibody-bonded nanoparticles were clustered on the surface of the magnetic particles.
상기 자성 입자와 상기 항체 결합 나노 입자와의 혼합시, pH 를 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 로 변경시키면서 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자를 제조하였으며, 각각의 경우 전자 현미경 사진을 도 4에 나타내었다. 도 4에서 pH 가 6.0 일 때 가장 안정적인 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자가 제조되는 것을 확인할 수 있었다.
When the magnetic particles were mixed with the antibody-bound nanoparticles, magnetic particles having clusters of antibody-bound nanoparticles were prepared while changing the pH to 5.0, 5.5, 6.0, and 6.5. In each case, Respectively. FIG. 4 shows that when the pH is 6.0, the most stable antibody-bound nanoparticle clusters are bound to produce magnetic particles.
<< 실시예Example 4> 세포 독성 T 세포 확대 배양을 위한 면역 시냅스 어레이 제조 4> Production of immunosynaptic arrays for cytotoxic T cell expansion
상기 실시예 3에서 제조된 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자를 이용하여 미세 가공 기술로 세포 독성 T 세포의 배양 어레이로서, 면역 시냅스 어레이를 제조하였다.
Immunosynaptic arrays were prepared as microbial culturing arrays of cytotoxic T cells using the magnetic particles having the cluster of antibody-bound nanoparticles prepared in Example 3 combined.
<<
실험예Experimental Example
1> 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 1 > antibody-bound nanoparticle cluster
결합된Combined
자성 입자를 이용한 세포 독성 T 세포 배양 장치에서의 면역 시냅스 생성 확인. Identification of Immune Synapse Generation in Cytotoxic T Cell Culture System Using Magnetic Particles.
상기 실시예 4 에서 제조된 면역 시냅스 어레이 상의 T 세포들이 확대 배양 되었는지를 확인하기 위해, 면역형광염색법을 활용하여 면역 시냅스를 제대로 형성하는지 여부를 평가하였다. In order to confirm whether the T cells on the immunosynaptic arrays prepared in Example 4 were expanded, immunological fluorescent staining was used to evaluate whether or not the immune synapses were properly formed.
먼저 제조된 T 세포를 면역 시냅스 어레이에 뿌리고, 30분간 배양한 후, PFA로 고정하고 T 세포 리셉터를 형광 물질이 붙은 항체를 이용하여 염색하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 면역 시냅스 어레이 상의 T 세포들의 T 세포 리셉터가 검출되어, 상기 실시예 4 에서 제조된 면역 시냅스 어레이 상의 T 세포들이이 면역 시냅스를 형성하였음을 확인할 수 있었다.
The prepared T cells were spiked into an immunological synapse array, cultured for 30 minutes, fixed with PFA, and the T cell receptor was stained using an antibody with a fluorescent substance. The results are shown in FIG. In FIG. 5, T cell receptors of T cells on the immune synaptic array were detected, and it was confirmed that the T cells on the immunosynaptic array prepared in Example 4 formed the immune synapse.
<<
실험예Experimental Example
2> 제조된 면역 시냅스 어레이에서 배양된 T 세포의 신호 전달 확인 2> signaling of T cells cultured in the prepared immunosynaptic arrays
2C 쥐로부터 분리한 CD8+ T 세포를 C57/BL6 쥐의 비장에서 추출한 세포에 ovalbumin peptide를 함께 넣어서 활성화를 시켜서 세포 독성 T 세포로 분화한 2C T cell blast를 얻었다.
CD8 + T cells isolated from 2C mice were incubated with ovalbumin peptides in the C57 / BL6 mouse spleen to obtain cytotoxic T cell differentiated 2C T cell blasts.
2C blast에 intracellular calcium sensitive dye인 fura-2-AM을 loading 하고, 상기 실시예 4 에서 제조된 면역 시냅스 어레이 표면에 뿌려준 후 T 세포와 면역 시냅스 어레이 사이의 반응을 실시간으로 영상 촬영하였다.The 2C blast was loaded with intracellular calcium sensitive dye, fura-2-AM, and was sprayed on the surface of the immunosynaptic array prepared in Example 4, and the reaction between the T cell and the immune synaptic array was photographed in real time.
상기 얻어진 2C blast를 live cell imaging chamber에 넣어주고 Bright filed, 나노 입자에 부착한 항체의 형광 물질에서 나오는 형광, fura-2에 반응하는 형광을 순차적으로 20초 간격으로 이미지화 하였다. 이렇게 얻어진 영상을 Metamorph 분석하여. Fura-340 image와 Fura-380 image를 비를 구하여 세포 내부의 Ca2 + 농도 변화를 실시간으로 분석하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. The obtained 2C blast was put into a live cell imaging chamber, and fluorescence emitted from the fluorescent substance of the antibody attached to the bright filed, nanoparticles, and fluorescence corresponding to the fura-2 was sequentially imaged at 20 second intervals. The obtained images were analyzed by Metamorph. The Fura-image 340 and image 380 Fura-ratio was calculated to the cells inside of the Ca 2 + concentration change in real time the results are shown in Fig.
도 6에서 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 부착된 부분에서는 fura ratio 가 변화하지만, 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 부착되지 않은 부분에서는 fura ratio 가 변화 하지 않는 것을 확인할 수 있었다. In FIG. 6, the fura ratio of the antibody-bound nanoparticle clusters was changed, but the fura ratio did not change at the portion where the antibody-bound nanoparticles were not attached.
따라서, 본 발명의 실시예에 의하여 제조된 면역 시냅스 어레이가 T 세포와의 신호 전달을 triggering 하는 것을 확인할 수 있다. Therefore, it can be confirmed that the immunosynaptic array prepared according to the embodiment of the present invention triggers signal transduction with T cells.
Claims (13)
ii)나노 입자를 준비하는 단계;
iii)상기 나노 입자의 표면을, 상기 티올화된 항체와 티오-에테르 결합을 형성할 수 있는 말레이미드기로 기능화시키는 단계; 및
iv)상기 티올화된 항체와, 표면이 상기 티올화된 항체와 티오-에테르 결합을 형성할 수 있는 말레이미드기로 기능화된 나노 입자를 반응시켜 티오-에테르 결합에 의해 상기 나노 입자의 표면에 상기 항체를 결합시키는 단계;
를 포함하는 항체 결합 나노 입자를 준비하는 단계; 및
상기 항체 결합 나노 입자와 표면이 카르복시기로 기능화된 자성 입자를 혼합하여, 상기 항체 결합 나노 입자가 클러스터를 형성하면서 상기 자성 입자의 표면에 부착되는 단계;를 포함하는 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법
i) reacting the antibody with a thiol-reactive reagent to thiolate the antibody
ii) preparing nanoparticles;
iii) functionalizing the surface of the nanoparticle with a maleimide group capable of forming a thio-ether bond with the thiolated antibody; And
iv) reacting the thiolated antibody with nanoparticles whose surface is functionalized with a maleimide group capable of forming a thio-ether bond with the thiolated antibody to form a nanoparticle on the surface of the nanoparticle by thio- ;
Preparing an antibody-bound nanoparticle comprising the antibody; And
Binding nanoparticles are bonded to the surfaces of the magnetic particles while forming the clusters by mixing the antibody-bonded nanoparticles and the magnetic particles whose surface is functionalized with a carboxyl group to form clusters of the antibody-bound nanoparticles. Method for producing magnetic particles
상기 항체는 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 키메라 항체, 인간 항체 및 인간화 항체로부터 선택되는 것인 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the antibody is selected from the group consisting of a monoclonal antibody, a bispecific antibody, a chimeric antibody, a human antibody, and a humanized antibody.
상기 티올 반응성 시약은 트리메틸머틸머캅티드, 티오우레아, 에틸잔테이트및 DTT(디티오트레이톨)로 구성된 그룹에서 선택되는 것인 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the thiol-reactive reagent is selected from the group consisting of trimethylmethacrylate, thiourea, ethylantanate, and DTT (dithiothreitol).
상기 티올 반응성 시약은 DTT(디티오트레이톨)인 것인 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the thiol-reactive reagent is DTT (dithiothreitol).
상기 나노 입자의 크기는 50 nm 내지 250 nm 인 것인 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the nanoparticles have a size of 50 nm to 250 nm.
상기 자성 입자의 크기는 5 ㎛ 내지 20 ㎛ 인 것인 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the magnetic particles have a size of 5 占 퐉 to 20 占 퐉.
상기 항체 결합 나노 입자를 상기 자성 입자와 혼합하는 단계에서는 pH 를 5.5 내지 6.0 으로 조절하는 것인 항체 결합 나노 입자의 클러스터가 결합된 자성 입자의 제조 방법.
The method according to claim 1,
Wherein the pH of the antibody-bound nanoparticles is adjusted to 5.5 to 6.0 in the step of mixing the antibody-bound nanoparticles with the magnetic particles.
A magnetic particle to which a cluster of antibody-bound nanoparticles prepared according to any one of claims 1, 3 to 6, 9 and 11 is bound.
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