KR101424334B1 - 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 핵산분자, 그를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조방법 및 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퍼록시다아제(peroxidase) 변이형 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 핵산분자, 그를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조방법 및 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 표시되는 퍼록시다아제(HRPC)에서 68, 142, 143 및 179 위치의 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 핵산분자, 그를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조방법 및 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 제조방법이다.
본 발명에 따른 변이형 퍼록시다아제는 산화 과정 동안 야생형 퍼록시다아제에 비해 현저히 증가된 라디칼 안정성을 나타내어 퍼록시다아제의 활성을 유지하므로, 바이오센서 및 면역분석(immunoassay)의 필수적 구성성분부터 페놀계 중합체를 포함하는 정밀 화합물의 합성을 위한 생물학적 효소, 여러 의약 분야나 퍼록시다아제가 관여하는 것으로 알려진 염증이나 갑상선 질환에 효과적인 치료제에 이르기까지 다양한 산업에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 핵산분자, 그를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조방법 및 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 제조방법{Mutant of Peroxidase Polypeptide, Nucleic acid molecule coding the same, Vector comprising the Nucleic acid molecule, Transformant transformed by the vector, Preparation method of the transformant, and Preparation method of the Mutant of Peroxidase Polypeptide}

본 발명은 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 핵산분자, 그를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조방법 및 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 제조방법에 관한 것이다.

퍼록시다아제(peroxidase)는 과산화수소 또는 유기과산화물에 의한 환원성의 유기화합물(예컨대 아스코르브산이나 p(파라)-아미노벤조산 등)의 산화를 촉매하는 효소로서 과산화효소라고도 하고, 모든 생명체에 널리 존재하는 것으로 알려져 있으며, 고분자 합성 분야 및 환경 오염물질 처리 공정 등에 이용되는 상업적으로 중요한 효소이다.

이러한 퍼록시다아제는 산화과정 동안 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 발생시킨다. 상기 활성산소종은 모든 생체 고분자에 영향을 미치고, 특히 활성산소종에 의한 산화에 민감한 방향족 아미노산과 같은 세포 성분에 심각한 손상을 입힌다. 이러한 단백질 산화는 알츠하이머병이나 레프숨병과 같은 질환의 원인이 되거나 노화와 연관되어 있는 것으로 알려져 있다.

최근에는, 진단 분야는 물론 살충제, 다환방향족탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons) 및 다이옥신 등의 비생체물질(xenobiotics)의 환경 정화에 이르기까지 다양한 분야에서 퍼록시다아제가 활용된다. 가장 활발하게 이용되는 분야 중 하나인 분석적 진단 분야에서 퍼록시다아제, 특히 horseradish peroxidase (서양고추냉이 과산화수소, HRP)는 바이오센서 및 발광을 활용한 면역분석방법에서 중요한 요소이다.

또한, 퍼록시다아제는 산화제로서, 과산화수소를 만나면 두 개의 활성형 산소 복합체를 형성하는데, 이는 기질로부터 수소원자를 탈리시켜 결과적으로 기질을 산화시킨다. 페놀의 경우에는 페녹시(phenoxy) 라디칼이 생성되며, 이들 라디칼의 커플링에 의해 고분자 중합이 진행되어 페놀계 고분자를 생성한다. 이러한 라디칼 짝지음 반응(radical coupling reaction)은 폐수로부터 페놀계 또는 방향족 오염물을 제거하거나 산업적으로 유용한 고분자를 생산하는 데 이용된다. 따라서 최근에는 퍼록시다아제가 중합제, 페놀 함유 정밀화학제품 및 의약품과 같은 물질의 친환경적 합성(green chemical synthesis) 과정에서 생체촉매로서 중요한 역할을 수행하는 점에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

그러나, 상기의 유용성에도 불구하고 퍼록시다아제는 페놀화합물의 산화 반응 과정 동안 빠르게 불활성화되어 유의적으로 효소 활성을 상실하고 반응이 불완전하게 되어 산업적 활용이 제한되는 문제점이 있다. 이는 소위 '자살적 불활성화'(suicide inactivation)라고 불리우며, 그에 대한 많은 연구에서 불구하고 이러한 불활성화의 분자학적 기전은 명확하게 규명되어 있지 않다.

지금까지 알려진 바에 따르면, 페놀화합물의 산화 과정 동안 발생하는 퍼록시다아제의 불활성화는 과산화수소와 페놀 기질과의 반응에 의한 페녹시 라디칼에 의해 발생하며, 이와 관련하여 두 개의 경로가 알려져 있다.

하나는 산화된 페놀화합물이 퍼록시다아제의 헴 보결기(prosthetic group)에 공유결합하여 발생하는 헴 파괴에 의한 것이다. 다만, HRPC(Horseradish peroxidase isoenzyme C)를 대상으로 한 연구에서 페놀-변성 헴 결합물이 보고되기도 하고, 그러한 변성 헴이 반응하지 않는 결과도 보고된 적 있다. 한편 Coprinus cinereus 유래 퍼록시다아제(CiP)를 대상으로 한 연구에서는 변성 헴이 감지되지 않은 것으로 보고되었다(비특허문헌 1 내지 4 참조).

또 다른 하나는, 활성산소종에서 생성된 자유 페녹시 라디칼이 헴 보결기 대신에 퍼록시다아제의 펩타이드 잔기에 공유결합하여서 퍼록시다아제의 불활성화가 일어난다. Horseradish peroxidase, Coprinus cinereus peroxidase 및 Lactoperoxidase는 페녹시 라디칼과 펩타이드 라디칼 간의 라디칼 결합 반응을 통하여 페놀 기질로 공유 결합적으로 변화한다.

이러한 문제점을 극복하고자, 과산화수소를 단계적으로 희석하여 첨가하거나, 충분한 환원 기질을 공급하여 라디칼의 농도를 낮게 유지하는 방안 등이 제시되었으나, 그럼에도 불구하고 퍼록시다아제의 낮은 활성은 개선되지 않았다. 따라서, 퍼록시다아제의 광범위한 적용을 위하여 라디칼 안정성이 증가되어 다양한 산업분야에서 활용될 수 있는 적합한 퍼록시다아제의 제공 및 확보가 요구되고 있다.

1. 한국등록특허 제1059873호 2. 한국등록특허 제1098873호

1. Huang, Q. et al. Inactivation of horseradish peroxidase by phenoxyl radical attack. J. Am. Chem. Soc. 127, 1431-1437 (2005) 2. Chang, H. C., Holland, R. D. & Bumpus, J. A. Inactivation of Coprinus cinereus peroxidase by 4-chloroaniline during turnover: comparison with horseradish peroxidase and bovine lactoperoxidase. Chem. Biol. interact. 123, 197-217 (1999). 3. Gilfoyle, D. J., Rodriguez-Lopez, J. N. & Smith, A. T. Probing the aromatic-donor-binding site of horseradish peroxidase using site-directed mutagenesis and the suicide substrate phenylhydrazine. Eur. J. Biochem. 236, 714-722 (2004). 4. Cohen-Yaniv, V. & Dosoretz, C. G. Fate of horseradish peroxidase during oxidation of monobrominated phenols. J. Chem. Technol. Biotechnol. 84, 1559-1566 (2009) 5. Smith, A. T. et al. Expression of a synthetic gene for horseradish peroxidase C in Escherichia coli and folding and activation of the recombinant enzyme with Ca2+ and heme. Biological Chemistry, 265, 13335-13343 (1990). 6. Wood W. L. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., vol.82, pp.1585-1588, 1985.

본 발명에 따른 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드, 이를 코딩하는 핵산분자, 그를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체의 제조방법 및 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 제조방법을 통하여 페놀 산화과정 동안 안정적인 퍼록시다아제를 수득하여 다양한 산업분야에 적용하고자 한다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 표시되는 퍼록시다아제(peroxidase)에서 68, 142, 143 및 179 위치의 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드는 서열목록 제2서열에 표시된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, (a) 상기 상술한 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열; (b) 서열목록 제2서열에 기재된 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 상보적 서열 중에서 선택된 어느 하나로 이루어진 핵산 분자를 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 핵산 분자를 구성하는 상기 상술한 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열 또는 서열목록 제2서열에 기재된 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열은 서열목록 제3서열에 기재된 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 상술한 핵산 분자 중 어느 하나 이상을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 숙주 세포는 효모, 고초균 및 대장균 중에서 선택된 것임을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 상술한 핵산 분자 중 어느 하나 이상을 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 단계; 및 상기에서 수득한 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 상술한 핵산 분자 중 어느 하나 이상을 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 단계를 포함하는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 합성하는 형질전환체의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 라디칼 안정성이 증가된 변이형 퍼록시다아제(peroxidase, HRPC)는 야생형 퍼록시다아제에 비해 증가된 라디칼 안정성을 나타내어 효소 활성을 유지하므로 바이오센서 및 면역분석(immunoassay)의 필수적 구성성분부터 페놀계 중합체를 포함하는 정밀 화합물의 합성을 위한 생물학적 효소, 분석진단 분야, 면역학 분야부터 정밀화학 산업 분야를 비롯한 다양한 산업에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명을 통해 유용한 마이엘로퍼록시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 억제제와 같은 의약 분야 및 퍼록시다아제가 관여하는 것으로 알려진 염증이나 갑상선 질환에 효과적인 치료제를 제공할 수 있다.

도 1은 페놀 산화 과정 동안 다양한 퍼록시다아제의 잔여 활성을 나타낸 그래프이다. (a)는 과산화수소 및 페놀 부존재, (b)는 0.5 mM 과산화수소 존재, (c)는 0.5 mM 과산화수소 및 0.5 mM 페놀 존재. CiP; Coprinus cinereus peroxidase, HRPC; Horseradish peroxidase isoenzyme C, HRP A2; Horseradish peroxidase isoenzyme A2, SBP; soybean peroxidase, LPO; Lactoperoxidase.
도 2는 불활성화된 HRPC 펩타이드에 대한 LC-MS/MS 분석 결과이다. (a) trypsin fragment (m/z 1151.703)에 대한 LC-MS/MS 스펙트럼 결과, (b) 불활성화된 퍼록시다아제의 trypsin fragment (m/z 1322.777) 에 대한 LC-MS/MS 스펙트럼 결과.
도 3은 산화과정 동안 퍼록시다아제를 측정한 그래프이다. (a)는 퍼록시다아제별 잔여 활성, (b)는 페놀 농도.
도 4는 산화과정 동안 퍼록시다아제의 잔여 활성을 측정한 그래프이다(야생형, F130A 치환형, 트리플 치환형 대비)
도 5는 분자 도킹 모의실험 결과를 나타낸 그림이다. (a) 야생형 퍼록시다아제(페놀과 효소촉매반응잔기 His42와의 거리:2.2Å), (b) 다중 변이형 퍼록시다아제(실시예, 페놀과 효소촉매반응잔기 His42와의 거리:6.1Å)
도 6은 퍼록시다아제에 대한 스펙트럼 분석 결과이다. 오른쪽 상단의 작은 그래프는 상기 스펙트럼 결과를 파장 450-700nm 부분만 확대하여 나타낸 부분확대도이다.

본 발명의 구체적인 내용을 기술하기에 앞서 본 명세서에 사용된 용어에 대하여 의미를 서술한다.

본 명세서에서 사용되는 '폴리펩타이드'는 해당 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 퍼록시다아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 동일성 % 는 높은 것이 더욱 바람직하다.

또한 상기 동일성을 가지는 폴리펩타이드는 기재된 특정 아미노산 서열의 폴리펩타이드에서 1 내지 100, 1 내지 90, 1 내지 80, 1 내지 70, 1 내지 60, 1 내지 50, 1 내지 40, 1 내지 39, 1 내지 38, 1 내지 37, 1 내지 36, 1 내지 35, 1 내지 34, 1 내지 33, 1 내지 32, 1 내지 31, 1 내지 30, 1 내지 29, 1 내지 28, 1 내지 27, 1 내지 26, 1 내지 25, 1 내지 24, 1 내지 23, 1 내지 22, 1 내지 21, 1 내지 20, 1 내지 19, 1 내지 18, 1 내지 17, 1 내지 16, 1 내지 15, 1 내지 14, 1 내지 13, 1 내지 12, 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 또는 1 개의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열을 포함하면서 퍼록시다아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 일반적으로, 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가의 수는 더 적은 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용되는 '핵산 분자'는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드)에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogues)도 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 상기 기재된 특정의 아미노산 서열(폴리펩타이드)을 암호화하는 핵산 분자에 제한되지 않고, 상기에서 서술한 것처럼 특정 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 서열 또는 그에 상응하는 기능을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 바람직하게는 최소 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 90%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

상기 상응하는 기능을 가진 폴리펩타이드는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가되는 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함한다. 그러한 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 1 개 이상의 아미노산 잔기가 소실, 치환, 삽입, 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 이루어지며 퍼록시다아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하며, 아미노산 잔기의 소실,치환,삽입, 및/또는 첨가의 수가 적은 것이 바람직하다. 또한, 상기 폴리펩타이드는 상기 상술한 것처럼 기재된 특정의 아미노산 서열과 약 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며 퍼록시다아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함하며, 동일성이 높을 수록 바람직하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 형성하는 능력을 의미하며, 부분적으로 상보적인 경우도 포함한다. 하기 염기쌍이 상보성과 관련된다: 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실. "상보적"은 상기 언급된 관계가 전장의 상기 분자에 걸쳐 2개의 싱글-스트랜드 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 모든 염기쌍에 실질적으로 적용된다. "부분적으로 상보적"은 2개의 싱글-스트랜드 폴리뉴클레오타이드 중 하나의 길이가 짧기 때문에 그 분자들 중 하나의 일부가 싱글 스트랜드로 남아있는 것 관계를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화"는 싱글 스트랜드 폴리뉴클레오타이드가 뉴클레오티드 염기 쌍을 통해 상보적인 스트랜드와 결합하는 과정을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 '서열번호 1과 혼성화 되는 염기 서열"은 서열목록 제1서열에 기재된 염기 서열의 전부 또는 일부를 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 와 같은 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 혼성화 방법은 당업자에게 알려진 다양한 방법이 사용가능하며, 예를 들어, Wood W. I. 등 (비특허문헌 6)에 기술된 방법일 수 있다.

한편 상기 '혼성화'는 발명에 필요한 범위 내에서 행해지는 '엄격한 조건하에서 혼성화'되는 것으로 해석될 수 있다. 상기 "엄격"은 혼성화 조건을 언급한다. 고도로 엄격한 조건은 비상동성인 염기 쌍에 바람직하지 못하다. 낮은 엄격성은 반대 작용을 갖고 있다. 엄격성은 예를 들면, 온도, 염 농도에 의해 변경될 수 있다. 상기 "엄격한 조건" 은 낮은 엄격한 조건, 중간 엄격한 조건, 또는 높은 엄격한 조건 중 임의일 수 있다. "낮은 엄격한 조건" 은, 예를 들어, 32℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% Sodium Dodecyl Sulfate(SDS), 50% 포름아미드(formamide)이다. "중간 엄격한 조건" 은 예를 들어, 42℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. "높은 엄격한 조건" 은 예를 들어, 50℃ 에서 5 x SSC, 5 x Denhardt's 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드이다. 상기 조건 하에, 더 높은 상동성을 가진 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드가 더 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되며, 그럼에도 불구하고, 다수의 요소가 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 세기, 시간, 염 농도 및 기타를 포함하여 혼성화 엄격성에 관여하고, 당업자는 이러한 요소를 적절하게 선택하여, 유사한 엄격성을 실현시킬 수 있다. 혼성화에 사용될 수 있는 시판용 키트로는, 예를 들어, Alkphos Direct Labeling Reagents (Amersham Pharmacia, 영국)가 있다. 이 경우, 첨부된 프로토콜에 따르면, 표지된 프로브로 밤새 인큐베이션시킨 후, 55℃에서 0.1% (w/v) SDS 를 함유하는 1 차 세정 완충액으로 막을 세정하여, DNA 와 같은 혼성화 된 폴리뉴클레오타이드를 검출한다.

한편, 혼성화될 수 있는 기타 뉴클레오타이드는 디폴트 변수를 사용하는 FASTA 및 BLAST 와 같은 상동성 연구 소프트웨어에 의해 계산된 바와 같이, 기재된 특정 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클오타이드에 약 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 약 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 가진 폴리뉴클오타이드를 포함한다.

아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열 사이의 동일성은 Karlin 및 Altschul 에 의한 알고리즘 BLAST를 사용해 측정될 수 있으며, BLAST 알고리즘을 바탕으로 한 BLASTN 및 BLASTX 라고 하는 프로그램에 의할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열이 BLASTN 을 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 100 이고, 워드길이 = 12 이다. 아미노산 서열이 BLASTX 를 사용하여 서열화되는 경우, 변수는 예를 들어, 스코어 = 50 이고 워드 길이 = 3 이다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램이 사용되는 경우, 각각의 프로그램에 대해 디폴트 변수가 적용된다.

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 표시되는 퍼록시다아제(peroxidase)에서 68, 142, 143 및 179 위치의 페닐알라닌이 페닐알라닌 이외의 다른 아미노산으로 치환된 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 특징으로 한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 표시되는 퍼록시다아제(peroxidase)에서 68, 142, 143 및 179 위치의 페닐알라닌이 페닐알라닌 이외의 다른 아미노산으로 치환된 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 퍼록시다아제(peroxidase)는 과산화수소 또는 유기과산화물에 의한 환원성의 유기화합물(예컨대 아스코르브산이나 p(파라)-아미노벤조산 등)의 산화를 촉매하는 효소로, 상기 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 표시되는 퍼록시다아제는 서양고추냉이에서 유래한 horseradish peroxidase(HRPC)일 수 있다.

본 발명의 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드는 실질적으로 동등한 기능적인 활성을 갖는 기능적 동등물 또는 기능적 유도체가 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 기능적 동등물의 예로서, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열에서의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환되거나 또는 이들의 조합에 의해 변이된 변이체를 포함할 수 있다.

경우에 따라, 본 발명의 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드는 이들의 물리, 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가질 수 있어 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아밀화(amidation) 등으로 변형(modification)될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 퍼록시다아제의 활성이 유지되는 한, 이러한 기능적 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에 따르면, 상기 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드는 서열목록 제2서열로 표시될 수 있다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 68, 142, 143 및 179 위치의 페닐알라닌이 모두 알라닌으로 치환된 것이다.

본 발명에 따르면, (a) 상기 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열; (b) 서열목록 제2서열에 기재된 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열; 및 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 상보적 서열 중에서 선택된 어느 하나로 이루어진 핵산 분자를 제공한다.

상기 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자(유전자)는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 상기 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩 영역을 제외한 부분에서도 단백질의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 핵산 분자를 구성하는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열은 바람직하게는 서열번호 3의 염기 서열로 표시될 수 있다. 상기 서열번호 3의 염기 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 퍼록시다아제 폴리펩타이드의 68, 142, 143 및 179 위치의 페닐알라닌이 모두 알라닌으로 치환된 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드(바람직하게는 서열목록 2로 표시되는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드)를 암호화하는 염기 서열이다.

본 발명에 따르면, 상기 상술한 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 "벡터"는 숙주 세포에 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA를 도입하여 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 수단을 말하며, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함하고, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다.

상기 적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 숙주가 효모인 경우에는 AOX1 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터 및 ADH 프로모터 등이 사용될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가복제하거나 숙주 세포 DNA에 통합될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 T7 프로모터를 포함하는 pET21a/BL21 벡터(Novagen)에 상기에서 상술한 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 삽입하여 제조될 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.

상기 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 것이면 제한되지 않으나, 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현양과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주 세포를 선택하여 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 사용할 수 있는 숙주 세포로는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)등과 같은 진핵 세포를 숙주 세포로 사용할 수 있다. 이 중에서 특히, 에쉐리키아 콜라이가 단백질의 발현 및 취급의 효율성 면에서 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키기 위하여 당 분야에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이러한 방법에는 전기충격 유전자전달법(electroporation), 원형질 융합법, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전법 및 염화 칼슘(CaCl₂) 침전법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

본 발명에 따르면, 상기 상술한 핵산 분자를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 단계; 및 상기에서 수득한 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 상기 상술한 핵산 분자를 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 단계를 포함하는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 합성하는 형질전환체의 생산 방법을 제공한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

[ 실시예 ]

1. 시약 및 시료

퍼록시다아제 활성을 측정하기 위한 기질인 아지노비스(2,2'-azinobis, ethylbenzthiazoline-6-sulfonate, ABTS), 과산화수소(H₂O₂) 및 트립신(trypsin)은 시그마(Sigma; USA)로부터 구입하였고, Tag DNA 폴리머라아제는 로슈(Roche Applied Science; USA)로부터 구입하였다.

고성능 액체크로마토그래피(HPLC)에 사용되는 물 및 에탄올은 버딕 & 잭슨 실험실(Burdick & Jackson Lab., USA)로부터 제공받았다. 효모 추출물, 펩톤(peptone) 및 트립톤(tryptone)과 같은 미생물 배양 배지는 벡톤 디킨슨(Becton Dichinson Co.; USA)으로부터 구입하였다.

2.1. pET21a / BL21 의 제작

단백질 정보은행 (RCSB PDB)에 공개되어 있는 Horsrasish peroxidase isoenzyme C (HPRC; PDB code 2ATJ)의 아미노산 서열을 기초로, 이 아미노산 서열에 해당되는 유전자 서열을 E. coli의 코돈 선호도(codon usage)를 고려하여 HRPC 합성 유전자를 제작하였다(GenScript, USA).

변이형 퍼록시다아제는 특정 프라이머를 이용한 위치-특이적 변이유발 (site-directed mutagenesis) 방법으로 제작하였으며(비특허문헌 5 참조), 하기 표에 기재된 프라이머를 이용하여 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 다양한 형태의 변이형 퍼록시다아제를 암호화하는 벡터를 제조하였다.

구분		서열(5'-3')	서열 번호	설명
돌연변이 유발 프라이머	M1-F	CGCACCGAAAAAGATGCGGCGGGCAACGCGAACAGCGCG	4	F68A 돌연변이증폭(정)
	M1-R	CGCGCTGTTCGCGTTGCCCGCCGCATCTTTTTCGGTGCG	5	F68A 돌연변이증폭(역)
	M2-F	GCGAACCTGCCGGCGCCGGCGTTTACCCTGCCGCAGCTG	6	F142A 돌연변이증폭(정)
	M2-R	CAGCTGCGGCAGGGTAAACGCCGGCGCCGGCAGGTTCGC	7	F142A 돌연변이증폭(역)
	M3-F	AACCTGCCGGCGCCGTTTGCGACCCTGCCGCAGCTGAAA	8	F143A 돌연변이증폭(정)
	M3-R	TTTCAGCTGCGGCAGGGTCGCAAACGGCGCCGGCAGGTT	9	F143A 돌연변이증폭(역)
	M4-F	GGCAAAAACCAGTGCCGCGCGATTATGGATCGCCTGTAT	10	F179A 돌연변이증폭(정)
	M4-R	ATACAGGCGATCCATAATCGCGCGGCACTGGTTTTTGCC	11	F179A 돌연변이증폭(역)
	M5-F	GCGAACCTGCCGGCGCCGGCGGCGACCCTGCCGCAGCTGAAA	12	F142AF143A 돌연변이증폭(정)
	M5-R	TTTCAGCTGCGGCAGGGTCGCCGCCGGCGCCGGCAGGTTCGC	13	F142AF143A 돌연변이증폭(역)
플랭킹 프라이머	NdeI	CATATGCAGCTGACCCCGACCTTT	14
	EcoRI	GAATTCTTACACAAAATCCACCACT	15

상기에서 F68A 는 HRPC 아미노산 서열에서 (서열목록 1 참조) 68번째 위치의 페닐알라닌을 알라닌으로 치환한 것을 의미하고, 다른 것들도 동일한 방식으로 표현한다.

따라서 'F68A/F142A/F143A/F179A'(실시예)는 68, 142, 143 및 179 번째 위치의 페닐알라닌을 모두 알라닌으로 치환한 다중 변이형을 의미하며, 상기 표에서 M1-F, M1-R, M4-F, M4-R, M5-F, M5-R 프라이머를 사용하여 제조하였다.

2.2. 변이형 퍼록시다아제의 제조

먼저, 제한효소 NdeI의 절단부위를 가진 5'-플랭킹 프라이머 (서열번호 14)와 각각의 돌연변이유발 프라이머(돌연변이 유발 프라미어; 서열번호 5, 7, 9, 11, 13)를 이용한 PCR로 HRPC의 앞쪽에 해당하는 DNA를 증폭하였고, 제한효소 EcoRI의 절단부위를 갖는 3'-플랭킹 프라이머(서열번호 15)와 각각의 돌연변이유발 프라이머(서열번호 4, 6, 8, 10, 12)를 이용한 PCR로 뒤쪽에 해당하는 DNA를 증폭하였다.

상기 PCR은 100 ㎕의 반응액(100 ng pET21a-HRPC, 1 ㎕ 돌연변이유발 프라이머(서열번호 4 내지 13 ; 50 pmol), 1 ㎕ 5'-플랭킹 프라이머 또는 3'-플랭킹 프라이머(서열번호 14 또는 서열번호 15 ; 50 pmol), 12 ㎕ 염화마그네슘(25 mM), 10 ㎕ 반응 완충액(10x), 2.5 ㎕ 디옥시뉴클레오티드(2.5 mM), 0.5 ㎕의 Tag DNA 폴리머라아제(5 units/㎕) 및 물)을 마이사이클러(My cycler^TM; BioRad, USA)를 이용하여 95 ℃에서 5분 반응시키고, 95 ℃에서 30초, 54 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분 반응시키는 것을 1 사이클(cycle)로 하여 30 사이클 반응시킨 후, 72 ℃에서 10분 반응시킴으로써 종결시켰다. 상기에서 수득된 두 PCR 생성물을 PCR 정제 키트(PCR purification kit; Qiagen)를 이용하여 정제하였다.

증폭된 두 DNA 조각과 서열번호 14의 프라이머, 서열번호 15의 프라이머를 이용한 PCR로 (HRPC 합성 유전자 대신 동량의 상기 두 PCR 생성물을 첨가하고 1 ㎕의 두 플랭킹 프라이머 (50 pmol)를 사용하는 것을 제외하고 상기 상술한 PCR 반응조건과 동일한 조건에서 수행) 변이가 일어난 유전자를 수득하였다.

상기 변이형 퍼록시다아제 폴리펩타이드의 유전자를 NdeI과 EcoRI으로 자르고 같은 방법으로 절단한 발현벡터 pET21a에 클로닝(cloning)하였다. 모든 PCR 생성물 및 변이체 유전자를 시퀀싱하여(Solgent, 대한민국) 변이가 제대로 일어났음을 확인하였다. pET21a에 클로닝된 변이형 퍼록시다아제 폴리펩타이드로 E. coli BL21 스트레인 (Invitrogen, USA)에 형질전환시키고, LA 배지(1% 효모 추출물, 1% 펩톤, 0.5% 염화나트륨, 50 ㎍/㎖ 암피실린 포함)에서 배양시켜 선별하였다.

2.3. 퍼록시다아제의 발현 및 생체외 재접힘( invitro - refolding)

선별된 양성 클론을 LB배지, 37 ℃에서 흡광도값(OD) 0.7이 될 때까지 배양한 후, 0.5 mM 이소프로필 β-D-1 티오갈락토피라노시드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)로 단백질 발현을 유도하고 5시간 더 배양하였다. 원심분리(10,000g, 20분, 4℃)를 통해 세포를 수거하고, 수거한 세포에 Bugbuster protein extraction reagent (5 ㎖/g of wet cell, Novagen, USA), Benzonase (25 units/㎖, Novagen, USA), lysozyme (200 ㎍/㎖, Sigma-Aldrich, USA)를 첨가한 후 세포를 풀어주고, 상온에서 20분 동안 반응시켰다.

상기 반응액을 16,000g에서 15분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 inclusion body pellet를 얻어낸 후, Buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8.0)를 이용하여 원심분리를 통해 pellet을 3회 세척하였다. 이렇게 얻어낸 inclusion body pellet은 Solubilization buffer (8 M 요소, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 1 ㎎/㎖ 농도로 녹여주었다.

90 ㎖ folding medium에 HRPC 단백질 용액 10 ㎖ 첨가하여 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. Folding medium의 조건은 1.8 M 요소, 5 mM 염화칼슘, 5μM Bovin hemin (Sigma-Aldrich, USA), 0.7 mM oxidized glutathione (Sigma-Aldrich, USA), 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 이다.

2.4. 변이형 퍼록시다아제의 정제

재접합(folding) 반응이 끝난 후, 20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM 염화칼슘 버퍼를 이용하여 2차례의 투석을 진행하였다. 침전된 단백질은 원심분리 (10,000 g, 30분)를 통해 제거하고, soluble한 단백질 용액은 음이온 교환 칼럼(anion-exchange column, Mono Q 5/50 GL; GE Healthcare,

FPLC System)을 이용하여 정제하였다.

3. 효소의 페놀 개질 방법

페놀의 산화 반응 동안 페녹시 라디칼 또는 페놀 기질에 의한 HRPC의 개질을 알아보기 위해, 페놀 산화 반응 후 분리된 HRPC를 질량 분석(mass spectrometry)에 의해 분석하였다. 다음과 같이, 반응 후 분리된 HRPC와 본래의 HRPC를 트립신을 이용하여 단백질 분해(proteolytic digestion)시킨 후 LC MS/MS로 분석하였다.

25 ㎖의 포스페이트 완충액(0.1 M, pH 7.0)에 18 mM의 페놀을 넣어 반응 혼합물을 준비하였다. 퍼록시다아제(HRPC)를 최종 농도가 25 units/㎖가 되도록 첨가하고 18 mM의 과산화수소를 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응 혼합물을 실온에서 40 분동안 부드럽게 교반시키면서 배양한 후, 4 배의 차가운 아세톤을 빠르게 첨가하여 단백질 시료를 침전시켰다. 혼합물을 -20℃에서 밤새 배양한 후, 20 분 동안 13,000g, 4℃에서 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, 1 ㎖의 차가운 아세톤을 첨가하여 침전물을 세척하였다. 침전물 시료를 얼음에서 15 분 동안 배양한 후, 20 분 동안 13,000g, 4℃에서 원심분리시켰다. 아세톤을 함유한 상청액을 제거하고 침전물을 동결건조하였다. 아세톤 침전으로부터 수득한 침전물을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel)로 분석하였다.

젤을 30분 동안 콜로이드 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250(Coomassie Brilliant Blue G-250; CBB)으로 염색시키고, 남은 염색은 8% 아세트산을 함유한 10% 메탄올로 세척하였다. HRPC(35 kDa)를 함유한 적절한 단백질 밴드를 잘라내고 트립신 분해시켰다. 마이크로튜브 안의 각각의 젤 슬라이스를 25 mM 중탄산 암모늄(ammonium bicarbonate, NH₄HCO₃, pH 7.8)과 아세토나이트릴(acetonitrile)의 1:1 혼합물 200 ㎕로 젤 슬라이스가 깨끗해질 때까지 각각 10 분 동안 3 또는 4 회 탈염색시킨 후, 스피드백(SpeedVac^TM) 증발기로 건조시켰다. 건조시킨 젤 조각을 10 mM 다이티오트레이톨(dithiothreitol)/100 mM 중탄산 암모늄(ammonium bicarbonate) 용액 100 ㎕, 60 분 동안 56 ℃에서 배양하였다. 시료 용액을 제거한 후, 바로 제조된 55 mM 아이오도아세트아마이드(iodoacetamide)/100 mM 중탄산 암모늄(ammonium bicarbonate) 용액 100 ㎕를 첨가하고 빛을 차단한 채로 실온에서 45 분 동안 배양하였다. 젤 슬라이스를 아세토나이트릴이 있는 100 mM 중탄산 암모늄 용액으로 두 번 세척하고, 진공 농축기에서 완전히 건조시켰다. 탈염색시킨 젤 슬라이스를 25 mM 중탄산 암모늄 용액에 용해된 트립신(0.02 ㎍/㎕, w/v, Sigma-Aldrich, MO, USA)으로 37 ℃에서 밤새 배양시킨 후, 아세토나이트릴 및 5% 포름산(50:50, v/v) 30 ㎕로 두 번 추출하였다. 추출한 펩티드를 수집하여 진공건조시키고, 5% 포름산을 2㎕가 될 때까지 첨가하여 산성화하였다. 산성화시킨 펩티드를 젤로더 팁(GelLoader tip; Eppendorf, Hamburg, Germany)으로 만든 마이크로컬럼(microcolumn)을 사용하여 제염하고, 0.1 ㎕의 포로스 R2 수지(POROS R2 resin; Perseptive Biosystems, MA, USA)로 패킹하였다. 로딩한 펩티드를 5% 포름산으로 세척하고, 탈이온수에 희석한 50% 아세토나이트릴 및 0.1% 포름산 용액 1 ㎕에 용출시키고, 진공 원심분리기에서 건조시킨 후, 4 ㎕의 0.1% 포름산 중에 용해시켰다.

4. 질량분석 및 자료 처리

트립신 처리한 펩티드를 분리하고 LCQ DECA 이온 트랩(Thermo Fisher Scientific, CA, USA)에 온-라인 연결된 스플리터(splitter; Agilent)를 사용하여 HP 1100 HPLC 나노-플로우 시스템으로 질량분석하였다. Zorbax 300 SB-C18 수지(입자 크기 5 ㎛; Agilent Technologies, CA, USA)를 홈-빌트 퓨즈드 실리카 컬럼(home-built fused silica column; 100 ㎜ 길이 × 75 ㎛ I.D., 팁 직경 10 ㎛)에 패킹시켰다. 결합한 펩티드를 0.1% (v/v) 포름산을 함유한 5 내지 90% (v/v)의 아세토나이트릴을 50 분 농도 구배로 0.2 ㎕/min의 유동속도에서 용출시켰다. ESI 소스에서 1.7 kV의 분사 전압을 적용하였고, 모세관 이동 온도(transfer capillary temperature)는 180 ℃로 설정하였다. 양이온 모드의 MS 스캔은 Xcalibur 1.2 소프트웨어로 제어하였다. 전구체 이온은 데이터-의존(data-dependent) 모드에서 계속적인 MS/MS 스캔을 위한 ±3 m/z 윈도우 내의 MS/MS 단편화를 위해 m/z 350 내지 2,000의 범위에서 선택하였다. 배제 다이나믹(exclusion dynamic) 모드를 적용하여 2 분 기간을 초과하는 추가의 선택으로부터 선택된 가장 집중적인 이온을 배제하였다. 자동화 획득 제어(AGC) 모드(전체 MS 및 MS/MS에 대해 5.00e+04 및 1.00e+04의 AGC 값을 설정하였다)에서 2 m/z 유닛 이온 고립 윈도우를 사용하여 MS/MS 데이터를 얻었다. 표준화 CID는 35.0으로 설정하였다.

MS/MS 스펙트럼의 피크 리스트를 다음의 설정하에 바이오웍스(Bioworks) 3.3 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, CA, USA)를 사용하여 데이터 포맷으로 된 각각의 파일로서 이출하였다: 펩티드 질량 범위, 500 내지 3500 Da; 최소 총 이온 강도 역치, 10000; 단편 이온의 최소 수, 20; 전구체 질량 허용오차, 1.4 amu; 그룹 스캔, 1; 최소 그룹 수, 1.

각각의 분석으로부터 만들어진 데이터 파일의 자동화된 조합에 의해 생성된 단일 텍스트 파일을 곰팡이균 종으로 제한한 미국 국가생물공학센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) non-redundant 데이터베이스(2009.7.) 또는 다음의 변수를 갖고 로컬 서버(버전 2.1, Matrix Science)에서 작동하는 매스콧(Mascot)을 사용한 퍼록시다아제 단백질 데이터베이스에서 조사하였다: 하나의 잠재적 미절단 효소로는 트립신, trypsin as the enzyme with one potential missed cleavage; 단일동위원소 질량 선택, a 2-2.5 Da 펩티드 질량 관용 및 1-Da MS/MS toloerance; 시스테인의 카바미도메틸화(carbamidomethylation), 메티오닌의 산화, 아스파라긴(asparagine)/글루타민(glutamine)의 탈아미노화(정식으로는 'deamidation'이지만 데이터 추출 과정에서의 deisotoping artefact가 있을 수 있음), 페닐알라닌에서 1 내지 4개 페닐렌의 다양한 변이; 일가, 이가 또는 삼가 이온상태. 또한 매스콧 확률 분석(p<0.05)에 의한 중요한 히트만 고려하였다.

5. LC - MS / MS 분석결과

페놀 개질된 퍼록시다아제의 시퀀싱을 통한 서열 정보는 하기 표에 기재하였고, MS/MS 스펙트럼은 도 2에 도시하였다.

효소	구분	관찰된 피크	분자량		서열 및 개질
			기대값	계산값
HRPC	야생형	1372.974	2743.933	2743.459	DSLQAFLDLANANLPAPFFTLPQLK
		697.389	696.382	696.327	FIMDR
	불활성형	1151.703	3452.088	3453.685	RDSLQAFLDLANANLPAPFFTLPQLK 2F with 1×phenol, F with 4×phenol
		1322.777	3965.308	3963.838	FIMDRLYNFSTGLPDPTLNTTYLQTLR F with 7×phenol

불활성화된 HRPC(m/z 1151.703 및 m/z 1322.777)의 단편 서열은 RDSLQAFLDLANANLPAPFFTLPQLK(잔기 124-149) 및 FIMDRLYNFSTGLPDPTLNTTYLQTLR(잔기 179-206)이었고, 페놀 분자에 의해 개질된 반면, 본래의 HRPC의 단편(m/z 1372.974 및 m/z 697.389)은 그렇지 않았다. 페놀로 개질된 펩티드는 상기에서 밑줄 친 4개의 페닐알라닌 잔기(F130, F142, F143, F179)가 하나의 페놀 또는 페놀 올리고트리머(oligotrimer)와 공유결합하였다. 이로써 페놀 라디칼과 공유 결합함으로써 HRPC를 불활성화시키는 부위는 F130, F142, F143, F179 위치의 페닐알라닌 잔기임을 알 수 있었다.

그러나, 상기 중 F142, F143, F179 잔기는 활성 부위의 입구에 위치하고 있는 반면, F130은 활성부위로부터 거리가 떨어져 있는 효소 표면에 위치한다.

따라서, 상기 실험결과를 토대로 F130 잔기를 제외한 F142, F143, F179 잔기에 기질 결합 부위로 알려져 있는 F68 잔기를 포함하는 부위에 단일 또는 다중 변이를 형성하여 라디칼 결합을 억제하여 라디칼에 안정적인 변이형 퍼록시다아제를 제조하기로 하였다.

[ 실험예 1] 효소의 턴오버 용량 및 라디칼 안정성

1) 실험 방법

바이얼(100㎖)에 0.5 mM 페놀을 함유하는 100 mM 인산 완충액(phosphate buffer) 30㎖를 넣은 후, 퍼록시다아제의 최종 농도가 1.0 U/㎖가 되도록 퍼록시다아제를 가하였다. 이후 0.5 mM의 과산화수소를 첨가한 후, 테플론 코팅된 자성바(Teflon-coated magnetic bar)를 사용하여 실온에서 20분 동안 강하게 교반하면서 페놀 산화 반응을 개시하였다.

페놀 산화 반응을 개시한 후 매 5 분마다 시료를 채취하고 15 분 동안 12,000 rpm에서 원심분리하여 중합된 침전물을 제거하였다. 상청액을 채취하여 페놀화합물의 최종농도를 분석하였다. 280 nm에서 작동하는 다이오드 어레이 검출기(diode-array detector)를 갖는 Agilent model 1200 liquid chromatography((Agilent Technologies, CA, USA)를 이용하여 액체 크로마토그래피법으로 페놀의 농도를 분석하였다. Zorbax XDB-C₁₈ 컬럼(150 x 0.3 mm, 3.5 μm; Agilent Technologies, CA, USA)으로, 25℃에서, 0.3% 아세트산(70%) 및 메탄올(30%)의 이동상을 1.0 ㎖/min 유속으로 하여 분리단계를 수행하였다.

페놀의 농도는 외부표준법으로 표준 곡선(calibration curve)을 이용하여 정량하였다. 턴오버 용량(turnover capacity)은 반응 시작 후 20 분 동안 소모된 효소(△E)당 소모된 페놀(△S)의 비율이다.

산화 과정 동안 퍼록시다아제의 불활성화를 관찰하기 위하여, 다양한 퍼록시다아제 관여 페놀 산화 반응을 수행하였다. 각각 HRPC (horseradish peroxidase isozyme C), HRP A2 (horseradish peroxidase isozyme A2) 및 SBP (soybean peroxidase)는 식물에서 유래한 것이고, CiP는 곰팡이 유래, LPO는 포유류에서 각각 유래한 것이다.

퍼록시다아제 활성은 ABTS를 산화시키고 이를 흡광계를 이용하여 420 nm에서의 발색양을 측정하는 방법을 이용하여 측정하였는데, 시료 20 ㎕를 2 ㎖의 ABTS-H₂O₂(0.18 mM ABTS 및 2.9 mM H₂O₂, pH 5.0)와 석영 큐벳(quartz cuvette)에서 혼합하고, 25 ℃에서 UV-Vis 스펙트로미터(Shimadzu; Japan)를 이용하여 420 nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다(ABTS의 몰 흡광계수: 34,799 M-1cm-1).

2) 실험 결과

퍼록시다아제 활성 실험 결과는 도 1에 도시하였다. 잘 알려진 바처럼, 기질이 없는 상태에서 과도한 과산화수소를 가하면 다양한 퍼록시다아제는 불활성화된다. 페놀 결핍 상태에서 20분 동안 배양하면, 모든 퍼록시다아제의 활성이 약 30% 정도 저하하였다(도 1b 참조). 반면, 0.5 mM 페놀 및 0.5 mM 과산화수소가 존재하는 상태에서는 모든 퍼록시다아제의 활성이 10분 안에 98% 이상 상실하였다(도 1c 참조). 즉, 퍼록시다아제는 페놀 및 과산화수소가 함께 존재하는 경우 더욱 빠르게 불활성화된다.

본 발명에 따른 변이형 퍼록시다아제의 턴오버 용량 및 라디칼 안정성 실험 결과는 하기 표와 같고, 그 결과는 도 3에 도시하였다.

구분 (효소)	효소활성			페놀 농도(mM)			턴오버용량 (mM/U) (증가율,배)
	초기	최종	잔여 활성 (%)	초기	최종	소비량 (%)
야생형	0.86±0.04	0.002±0.009	0.23	0.52±0.008	0.13±0.005	75	0.45(1.0)
F68A	0.85±0.15	0.002±0.001	0.23	0.2±0.006	0.45±0.008	10	0.06(0.1)
F142A	0.88±0.01	0.002±0.002	0.23	0.53±0.01	0.19±0.01	64	0.39(0.9)
F143A	1.00±0.02	0.002±0.007	0.20	0.51±0.008	0.31±0.009	39	0.20(0.4)
F179A	0.98±0.02	0.002±0.03	0.20	0.52±0.01	0.23±0.01	56	0.30(0.7)
F68A/F142A/F143A/F179A (실시예)	1.08±0.005	0.44±0.1	40.7	0.53±0.009	0.03±0.006	94	0.78(1.7)

야생형 및 단일 변이형 퍼록시다아제(F68A, F142A, F143A, F179A)는 10분 이내에 급격하게 효소 활성이 저하된 반면, 다중 변이형 퍼록시다아제(F68A/F142A/F143A/F179A, 실시예)는 초기 활성 대비 40%의 활성을 유지하였고, 이는 야생형 퍼록시다아제에 비하여 40배 이상 높은 것이다(도 3a 참조)

또한, 페놀 중합체 사용되는 페놀도 초기 투입량 대비 약 94%를 소모하였다. 단일 변이형 퍼록시다아제는 야생형 퍼록시다아제와 비교하여 페놀 소비량이 더 낮았고, 턴오버용량도 더 낮았다(도 3b 참조).

한편, 트리플 변이형 퍼록시다아제(F142A/F143A/F179A)에 대한 효소 활성 결과도 도 4에 도시하였다. 실험 결과, 트리플 변이형 퍼록시다아제도 야생형이나(HRPC+H+P) 및 F130A 변이형과 대비하여 반응 초기 10분 동안의 효소 활성이 높은 것을 알 수 있다 .

[ 실험예 2] 효소의 동역학( Kinetics )

1) 실험 방법

HRPC 단백질을 0 내지 100 μM의 다양한 농도(0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75 및 100 μM)의 ABTS와 반응시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하여, 다양한 농도의 ABTS에 대한 촉매반응 비율을 측정함으로써, 동역학 변수를 결정하였다. 100 μM의 과산화수소 및 0 내지 100 μM의 범위의 ABTS를 혼합한 반응액에 0.05 μM의 HRPC 단백질을 첨가하여 반응을 개시하였다. 상기 모든 시료는 50 mM의 포스페이트-시트레이트 완충액(phospahte-citrate buffer, pH 5.0)에 용해시켰다.

2) 실험 결과

상기에서 얻어진 ABTS 농도에 대한 반응속도를 그래프로 도시한 Hanes-Woolf plot에 기초한 Michaelis-Menten 방정식으로부터, 야생형 퍼록시다아제(HRPC), 단일 변이형 퍼록시다아제(HRPC) 및 다중 변이형 퍼록시다아제(HRPC, 실시예)의 Michaelis-Menten 상수(K _m), 최대 턴오버수(k_cat) 및 촉매효율(k_cat/K _m)을 도출하여 하기 표에 정리하였다.

구분	K m(μM)	k cat(s-1)	k cat/K m(μM-1·s-1)
야생형	407.05±102.44	1.06±0.12	2.60×10-3±3.58×10-3
F68A	255.74±39.26	0.65±0.03	2.56×10-3±2.71×10-3
F142A	576.56±106.02	1.29±0.2	2.25×10-3±2.31×10-3
F143A	575.28±122.78	1.29±0.14	1.84×10-3±2.39×10-3
F179A	506.02±55.67	1.12±0.06	2.09×10-3±3.40×10-3
F68A/F142A/F143A/F179A (실시예)	1119.78±130.77	3.26±0.002	2.91×10-3±2.40×10-4

실험 결과, 단일 변이형 퍼록시다아제 중 F142A, F143A, F179A는 K _m 값 및 k _cat 값이 증가하였으나, F68A는 K _m 값 및 k _cat 값이 감소하였다. 그 결과 단일 변이형 퍼록시다아제는 야생형 퍼록시다아제와 대비하여 유사한 정도의 k _cat/K _m값을 나타냈다.

이에 반해, 다중 변이형 퍼록시다아제(F68A/F142A/F143A/F179A)는 기질 결합 친화도는 야생형 퍼록시다아제와 대비하여 3배 이상 감소하였고(K _m =1119.78 μM), k _cat 값은 야생형 퍼록시다아제와 대비하여 3배 이상 증가하여서, 결론적으로 높은 k _cat/K _m 값을 나타내어 야생형 퍼록시다아제과 대비하여 동등한 정도의 산화 효율(k _cat/K _m)을 나타냈다.

[ 실험예 3] 분자 도킹 모의실험( Molecular docking simulation )

1)실험 방법

디스커버리 스튜디오(Discovery Studio version 2.1; Accelrys, CA, USA)를 사용하여 퍼록시다아제와 페놀 분자의 분자 도킹 모의실험을 수행하였다. HRPC (pdb code: 2atj)의 구조는 단백질 데이터 뱅크(http://www.rcsb.org)에서 다운로드 받았으며, 페놀의 구조는 디스커버리 스튜디오의 프래그먼트 빌더 툴(Fragment Builder tools)로 만들었다.

야생형 퍼록시다아제 및 다중 변이형 퍼록시다아제(F68A/F142A/F143A/F179A, 실시예)에 대하여 실험을 수행하였고, 페놀 분자의 초기 위치는 야생형 HRPC(2atj) 의 benzhydroxamic acid에 맞추어 정렬하였다가 후속 모의실험에서는 제거하였다.

본 실험에서 변이형 퍼록시다아제-페놀의 모든 가능한 복합체를 생성하였다. 야생형 퍼록시다아제의 초기 도킹 위치 및 변이형 퍼록시다아제에서 그에 상응하는 위치로부터 8Å내의 잔기를 결합부위로 사용하고 다른 잔기는 고정시켰다. CDOCKER 모듈의 기본 값(default parameter)으로 분자 도킹 모의실험을 수행하였다.

도킹 스코어 하위 10개를 복합체의 결합 자유에너지(binding free energy)를 계산하는 데 사용하였다. 기본값 변수(default parameters)를 갖는 디스커버리 스튜디오의 프로토콜에 따라 복합체의 결합 자유 에너지를 계산하였다. 가장 낮은 결합 자유 에너지를 갖는 HRPC 단백질과 페놀의 복합체를 구조 분석에 사용하였다. HRPC 단백질의 결합 거리는 복합체의 모델링된 구조를 이용하여, 전자 운반에 대해 촉매반응 잔기로 알려진 히스티딘 잔기(His42)의 δN 원자와 페놀의 활성 OH 기 간의 거리를 계산함으로써 결정하였다.

2) 실험 결과

분자 도킹 모의실험 결과 페놀 기질의 결합에 방향족 잔기가 중요한 역할을 함을 알 수 있었다. 4개 페닐알라닌에 대한 다중 변이형 퍼록시다아제(F68A/F142A/F143A/F179A, 실시예)는 페놀 기질의 결합에 결정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 활성 부위의 입구에 존재하는 방향족 벨트가 제거된 것으로 나타났다(도 5 참조).

모델링한 복합체의 결합 자유 에너지 및 결합 거리는 하기 표에 나타내었다.

효소	결합 자유 에너지(㎉/mol)	거리(Å)
야생형	-37.6	2.1
실시예 (F68A/F142A/F143A/F179A)	-21.6	6.1

실험 결과, 본 발명의 실시예(다중 변이형 퍼록시다아제)는 야생형 퍼록시다아제와 비교하여 긴 결합거리(6.1Å) 및 높은 결합 에너지(-21.6㎉/mol)를 가지는 것으로 나타났다. 이처럼 헴 포켓의 입구에서 방향족 잔기를 제거하면 특이적인 방향족-방향족 상호작용을 파괴하기 때문에 방향족 기질에 대한 결합 친화도를 감소시킨다.

[ 실험예 4] 스펙트럼 분석( Spectroscopic analysis )

1) 실험 방법

농축된 퍼록시다아제를 100mM 인산완충액(pH 7.0)에 10.0 units/㎖ 농도로 희석하였다. 상기 퍼록시다아제에 0.5 mM 페놀 또는 0.5 mM 과산화수소를 가한 다음, 0.5 mM 페놀 및 0.5 mM 과산화수소가 존재하는 상황에서 반응시켰다. 상기 혼합액을 20분 동안 25℃에서 교반하고, 0.45㎛ 공극 크기를 갖는 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인(polytertafluoroethylene membrane) 필터를 사용하여 여과한 다음, Amicon　ultrafiltration device(Millipore, MA, USA)를 사용하여 농축하였다. 이중 0.5 mM 페놀과 0.5 mM 과산화수소를 동시에 처리한 샘플은 퍼록시다아제의 산화반응 중 형성된 페놀 중합체를 제거하기 위해 음이온 교환 칼럼 (anionexchange column, Mono Q 5/50 GL; GE Healthcare, AKTA FPLC System)을 이용하여 한번 더 정제 후 농축하였다.

각각의 퍼록시다아제에 대한 스펙트럼 변화는 350 내지 700㎚의 범위에서 UV-Vis spectrophotometer (Multiskan GO, Thermo Scientific, MA, USA)를 사용하여 측정하였다.

2) 실험 결과

퍼록시다아제에 대한 스펙트럼 분석결과는 도 6에 도시하였다.

휴지상태 퍼록시다아제(HRPC, 적색 실선)의 Soret maximum은 401㎚에서 나타났고, 499㎚ 및 640㎚에서 두 개의 피크가 더 나타났다(도 6의 오른쪽 상단 부분확대도 참조).

과산화수소 반응 후에는(오렌지색 실선) Soret maximum가 412㎚로 이동하였고, 과량의 과산화수소에 의한 헴 산화로 인하여 544㎚, 578㎚ 및 659㎚에서 피크가 나타났다.

결론적으로 퍼록시다아제에 페놀 단독 또는 페놀 및 과산화수소를 가하였을 때의 흡수 스펙트럼은 휴지 상태의 퍼록시다아제와 동일한 것을 알 수 있다. 즉, 불활성화된 퍼록시다아제의 흡광도는 야생형 퍼록시다아제와 비교하여 상당히 다르지 않았으며, 페놀 산화 과정 동안 퍼록시다아제의 헴 파괴는 일어나지 않고 퍼록시다아제의 구형 구조를 잘 보존하는 것을 알 수 있다.

이를 종합하면, 페놀 산화 과정 동안의 퍼록시다아제(HRPC) 불활성화는 헴 파괴에 의한 것이라기 보다는, F130, F142, F143 및 F179 잔기에의 페놀 기질의 공유결합에 의한 것임을 알 수 있다.

따라서, 페놀 결합 부위를 제거한 변이형 퍼록시다아제, 보다 구체적으로는 F68/F142/F143/F179의 페닐알라닌을 알라닌으로 치환한 다중 변이형 퍼록시다아제는 야생형 퍼록시다아제와 비교하여 페놀 산화 과정 동안 약 40 내지 80배의 우수한 안정성을 나타냈다.

한편, HRPC나 CiP를 포함한 다양한 퍼록시다아제, 예를 들면 HRP A2, SBP, LPO 등도 모두 페놀에 의하여 불활성화되고, MPO, LPO 및 LPG는 페닐하이드라진(phenylhydrazine)에 의하여 자살적으로 불활성화되고, LPO는 또한 4-클로로아닐린(chloroaninline) 및 제니스테인(genistein)에 의해서도 불활성화된다.

따라서, 상기 발명에 의한 페닐 잔기와의 공유결합 부위를 제거하여서 안정화하는 방법, 보다 구체적으로 HRPC에서는 F68, F142, F143 및 F179의 페닐알라닌을 다른 아미노산으로 치환하는 방법은 그와 공통적인 불활성화 기전을 갖는 다른 효소에도 동일하게 적용될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Kwangwoon University Industry-Academic Collaboration Foundation <120> Mutant of Peroxidase Polypeptide, Nucleic acid molecule coding the same, Vector comprising the Nucleic acid molecule, Transformant transformed by the vector, Preparation method of the transformant, and Preparation method of the Mutant of Peroxidase Polypeptide <130> DP120216 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 320 <212> PRT <213> Horseradish Peroxidase C <400> 1 Gln Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn 1 5 10 15 Ile Val Arg Asp Thr Ile Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg Ile 20 25 30 Ala Ala Ser Ile Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45 Cys Asp Ala Ser Ile Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu 50 55 60 Lys Asp Ala Phe Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val Ile 65 70 75 80 Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser 85 90 95 Cys Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ala Ala Gln Gln Ser Val Thr Leu Ala 100 105 110 Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gln 115 120 125 Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Phe Phe Thr 130 135 140 Leu Pro Gln Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg Ser 145 150 155 160 Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn Gln 165 170 175 Cys Arg Phe Ile Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu 180 185 190 Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gln Thr Leu Arg Gly Leu 195 200 205 Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg 210 215 220 Thr Pro Thr Ile Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Gln 225 230 235 240 Lys Gly Leu Ile Gln Ser Asp Gln Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala 245 250 255 Thr Asp Thr Ile Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gln Thr 260 265 270 Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn Ile Thr 275 280 285 Pro Leu Thr Gly Thr Gln Gly Gln Ile Arg Leu Asn Cys Arg Val Val 290 295 300 Asn Ser Asn Ser Leu Leu His Asp Met Val Glu Val Val Asp Phe Val 305 310 315 320 <210> 2 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant of Horseradish Peroxidase C <400> 2 Gln Leu Thr Pro Thr Phe Tyr Asp Asn Ser Cys Pro Asn Val Ser Asn 1 5 10 15 Ile Val Arg Asp Thr Ile Val Asn Glu Leu Arg Ser Asp Pro Arg Ile 20 25 30 Ala Ala Ser Ile Leu Arg Leu His Phe His Asp Cys Phe Val Asn Gly 35 40 45 Cys Asp Ala Ser Ile Leu Leu Asp Asn Thr Thr Ser Phe Arg Thr Glu 50 55 60 Lys Asp Ala Ala Gly Asn Ala Asn Ser Ala Arg Gly Phe Pro Val Ile 65 70 75 80 Asp Arg Met Lys Ala Ala Val Glu Ser Ala Cys Pro Arg Thr Val Ser 85 90 95 Cys Ala Asp Leu Leu Thr Ile Ala Ala Gln Gln Ser Val Thr Leu Ala 100 105 110 Gly Gly Pro Ser Trp Arg Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Leu Gln 115 120 125 Ala Phe Leu Asp Leu Ala Asn Ala Asn Leu Pro Ala Pro Ala Ala Thr 130 135 140 Leu Pro Gln Leu Lys Asp Ser Phe Arg Asn Val Gly Leu Asn Arg Ser 145 150 155 160 Ser Asp Leu Val Ala Leu Ser Gly Gly His Thr Phe Gly Lys Asn Gln 165 170 175 Cys Arg Ala Ile Met Asp Arg Leu Tyr Asn Phe Ser Asn Thr Gly Leu 180 185 190 Pro Asp Pro Thr Leu Asn Thr Thr Tyr Leu Gln Thr Leu Arg Gly Leu 195 200 205 Cys Pro Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Leu Val Asp Phe Asp Leu Arg 210 215 220 Thr Pro Thr Ile Phe Asp Asn Lys Tyr Tyr Val Asn Leu Glu Glu Gln 225 230 235 240 Lys Gly Leu Ile Gln Ser Asp Gln Glu Leu Phe Ser Ser Pro Asn Ala 245 250 255 Thr Asp Thr Ile Pro Leu Val Arg Ser Phe Ala Asn Ser Thr Gln Thr 260 265 270 Phe Phe Asn Ala Phe Val Glu Ala Met Asp Arg Met Gly Asn Ile Thr 275 280 285 Pro Leu Thr Gly Thr Gln Gly Gln Ile Arg Leu Asn Cys Arg Val Val 290 295 300 Asn Ser Asn Ser Leu Leu His Asp Met Val Glu Val Val Asp Phe Val 305 310 315 320 <210> 3 <211> 963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant of Horseradish Peroxidase C <400> 3 cagctgaccc cgacctttta tgataacagc tgcccgaacg tgagcaacat tgtgcgcgat 60 accattgtga acgaactgcg cagcgatccg cgcattgcgg cgagcattct gcgcctgcat 120 tttcatgatt gctttgtgaa cggctgcgat gcgagcattc tgctggataa caccaccagc 180 tttcgcaccg aaaaagatgc ggcgggcaac gcgaacagcg cgcgcggctt tccggtgatt 240 gatcgcatga aagcggcggt ggaaagcgcg tgcccgcgca ccgtgagctg cgcggatctg 300 ctgaccattg cggcgcagca gagcgtgacc ctggcgggcg gcccgagctg gcgcgtgccg 360 ctgggccgcc gcgatagcct gcaggcgttt ctggatctgg cgaacgcgaa cctgccggcg 420 ccggcggcga ccctgccgca gctgaaagat agctttcgca acgtgggcct gaaccgcagc 480 agcgatctgg tggcgctgag cggcggccat acctttggca aaaaccagtg ccgcgcgatt 540 atggatcgcc tgtataactt tagcaacacc ggcctgccgg atccgaccct gaacaccacc 600 tatctgcaga ccctgcgcgg cctgtgcccg ctgaacggca acctgagcgc gctggtggat 660 tttgatctgc gcaccccgac catttttgat aacaaatatt atgtgaacct ggaagaacag 720 aaaggcctga ttcagagcga tcaggaactg tttagcagcc cgaacgcgac cgataccatt 780 ccgctggtgc gcagctttgc gaacagcacc cagacctttt ttaacgcgtt tgtggaagcg 840 atggatcgca tgggcaacat taccccgctg accggcaccc agggccagat tcgcctgaac 900 tgccgcgtgg tgaacagcaa cagcctgctg catgatatgg tggaagtggt ggattttgtg 960 taa 963

Claims (9)

1. 서열목록 제1서열의 아미노산 서열로 표시되는 퍼록시다아제(peroxidase)에서 68, 142, 143 및 179 위치의 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드는 서열목록 제2서열에 기재된 것을 특징으로 하는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드.
   
3. 하기 (a) 내지 (c) 중에서 선택된 어느 하나로 이루어진 핵산 분자:
   (a) 제1항에 따른 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열;
   (b) 서열목록 제2서열에 기재된 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 암호화하는 염기 서열; 및
   (c) 상기 (a) 또는 (b)의 상보적 서열.
   
4. 제3항에 있어서,
   (a) 또는 (b)가 서열목록 제3서열에 기재된 것임을 특징으로 하는 핵산 분자.
   
5. 제3항 또는 제4항에 따른 핵산 분자 중 어느 하나 이상을 포함하는 재조합 벡터.
   
6. 제5항의 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입한 형질전환체.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 숙주 세포는 효모, 고초균 및 대장균 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 형질전환체.
   
8. 제3항 또는 제4항에 따른 핵산 분자 중 어느 하나 이상을 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 단계를 포함하는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드를 합성하는 형질전환체의 생산 방법.
   
9. 제3항 또는 제4항에 따른 핵산 분자 중 어느 하나 이상을 숙주세포에 도입하여 형질전환하는 단계; 및 상기에서 수득한 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 퍼록시다아제 변이형 폴리펩타이드의 생산 방법.

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