KR101395945B1 - A device for measuring quantity of bacteria using nanobiosensor - Google Patents

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KR101395945B1 KR1020120055655A KR20120055655A KR101395945B1 KR 101395945 B1 KR101395945 B1 KR 101395945B1 KR 1020120055655 A KR1020120055655 A KR 1020120055655A KR 20120055655 A KR20120055655 A KR 20120055655A KR 101395945 B1 KR101395945 B1 KR 101395945B1
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    • C12Q1/06—Quantitative determination

Abstract

본 발명은 나노바이오센서를 이용한 시료 내의 세균양 측정 장치에 있어서, 나노바이오센서, 시료 및 마이크로 자석입자가 반응하여 생성된 결합체를 수용하는 시료홀더를 포함하며, 암환경이 조성되는 반응챔버, 나노바이오센서에 자외선을 조사하는 자외선 램프 및 조사된 자외선에 의해 나노바이오센서로부터 발생하는 형광신호를 측정하는 형광신호 검출부를 포함하며, 시료홀더는 형광신호 측정부를 포함하는 마이크로칩이며, 결합체가 상기 마이크로 자석입자의 자력에 의해 형광신호 측정부에 농축되는 것을 특징으로 하는 나노바이오센서를 이용한 세균양 측정 장치에 관한 것이다.
본 발명을 통해 미세유로를 갖는 마이크로칩을 포함하는 고감도 세균양 측정 장치를 통하여 일례로서 살모넬라균의 양이 103CFU/mL인 경우도 살모넬라균을 검출할 수 있다.The present invention relates to an apparatus for measuring the amount of bacteria in a sample using a nano-biosensor, the apparatus comprising: a nano-biosensor, a sample holder for accommodating a sample produced by reaction of the micromagnet particles and a reaction chamber, An ultraviolet lamp for irradiating ultraviolet rays to the biosensor and a fluorescence signal detector for measuring a fluorescence signal generated from the nano-biosensor by irradiated ultraviolet rays, wherein the sample holder is a microchip including a fluorescence signal measuring unit, And is concentrated in the fluorescence signal measuring section by the magnetic force of the magnet particles. [0002] The present invention relates to a device for measuring the amount of bacteria using a nano-biosensor.
Through the present invention, Salmonella can be detected even when the amount of Salmonella is 10 3 CFU / mL through a highly sensitive bacterial amount measuring device including a microchip having a micro channel.

Description

나노바이오센서를 이용한 세균양 측정 장치{A device for measuring quantity of bacteria using nanobiosensor}Technical Field [0001] The present invention relates to a device for measuring a quantity of bacteria using a nanobiosensor,

본 발명은 나노바이오센서를 이용한 세균양 측정 장치에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 나노바이오센서와 세균의 결합체를 좁은 영역으로 농축시키는 역할을 하는 미세유로를 갖는 마이크로칩 및 광 잡음을 제거하기 위한 여기 필터 및 형광 필터를 포함하여 고감도의 세균양 측정이 가능한 나노바이오센서를 이용한 고감도 세균양 측정 장치에 관한 것이다.
The present invention relates to a device for measuring the amount of bacteria using a nano-biosensor, and more particularly, to a device for measuring a quantity of bacteria using a nano-biosensor, The present invention relates to a device for measuring the amount of highly sensitive bacteria using a nano-biosensor capable of measuring the amount of bacteria with high sensitivity including a filter and a fluorescence filter.

국내 연간 식중독 사고 관련 경제적 피해 예상액은 약 1조 3천억원으로 유통 전 농식품의 유해물질 검사에 대한 요구가 증가하고 있는 추세이다.The estimated annual economic damage incurred by domestic food poisoning accidents is about 1.3 trillion won, and the demand for inspection of toxic substances in agricultural products before distribution is increasing.

그러나, 식중독균을 포함한 세균의 양을 측정하는 일반적 방법인 표준평판법은 2~3일의 배양 시간을 포함한 장시간이 소요되어, 유통 전 농식품의 유해물질 검사에 대한 실질적인 해결책이 되지 못하고 있는 실정이다.However, the standard plate method, which is a general method for measuring the amount of bacteria including food poisoning bacteria, takes a long time including the incubation time of 2 to 3 days, and thus is not a practical solution to the inspection of toxic substances in pre-circulation agricultural products.

이에 따라, 최근 세균양 측정 시간을 감소하기 위해 나노바이오센서를 이용한 세균양 측정 장치에 대한 연구가 진행되고 있다.In order to reduce the time required for measuring the amount of bacteria recently, research on a device for measuring the amount of bacteria using a nano-biosensor is under way.

그러나 나노바이오센서에 의한 형광신호는 매우 미약하여, 외부 빛을 차단할 수 있는 실험실 환경에서 성능이 뛰어난 형광스펙트로미터와 같은 장비를 이용하여야만 측정이 가능하였다.However, the fluorescence signal due to the nano-biosensor was very weak, and measurements were possible only by using a device such as a fluorescence spectrometer with excellent performance in a laboratory environment capable of blocking external light.

본 출원의 발명자의 이전 출원인 한국공개특허 "세균양 측정 방법(공개번호 제10-2011-0006334호)"에서는 이를 극복한 휴대형 형광검출기에 대해서 기재하고 있으나, 상기한 휴대형 형광검출기는 살모넬라균 검출한계가 106CFU/mL에 불과하다는 문제점을 갖기에, 고감도의 휴대용 세균양 측정 장치가 요구되는 실정이다.Although the portable fluorescence detector that overcomes this problem is described in Korean Patent Application Publication No. 10-2011-0006334, which is a prior application of the present inventor, the above portable type fluorescence detector has a salmonella detection limit Is only 10 < 6 > CFU / mL. Therefore, a device for measuring the amount of portable bacteria is required.

(특허문헌 1) KR10-2011-0006334 A
(Patent Document 1) KR10-2011-0006334A

상기한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 일례로서 살모넬라균이 106CFU/mL이하인 경우에도 세균의 검출이 가능한 나노바이오센서를 이용한 고감도 세균양 측정 장치를 제공하고자 한다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a device for measuring the amount of highly sensitive bacteria using a nano-biosensor capable of detecting bacteria even when Salmonella is 10 6 CFU / mL or less.

또한, 측정단계에서 광잡음을 제거하여 보다 정확한 측정을 제공하고자 한다.
In addition, we intend to provide more accurate measurements by removing optical noise in the measurement step.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 나노바이오센서를 이용한 시료 내의 세균양 측정 장치에 있어서, 상기 나노바이오센서, 상기 시료 및 마이크로 자석입자가 반응하여 생성된 결합체를 수용하는 시료홀더를 포함하며, 암환경이 조성되는 반응챔버; 상기 나노바이오센서에 자외선을 조사하는 자외선 램프; 및 상기 조사된 자외선에 의해 상기 나노바이오센서로부터 발생하는 형광신호를 측정하는 형광신호 검출부;를 포함하며, 상기 시료홀더는 형광신호 측정부를 포함하는 마이크로칩이며, 상기 결합체가 상기 마이크로 자석입자의 자력에 의해 상기 형광신호 측정부에 농축되는 것을 특징으로 하는 나노바이오센서를 이용한 세균양 측정 장치를 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides an apparatus for measuring the amount of bacteria in a sample using a nano-biosensor, the apparatus comprising a sample holder for receiving the nanobio sensor, the sample, A reaction chamber in which an environment is formed; An ultraviolet lamp for irradiating the nano-biosensor with ultraviolet rays; And a fluorescence signal detector for measuring a fluorescence signal generated from the nano-biosensor by the irradiated ultraviolet light, wherein the sample holder is a microchip including a fluorescence signal measuring unit, And the concentration of the bacteria is measured by the fluorescence signal measuring unit.

또한, 여기 필터 및 형광 필터 중 어느 하나 이상을 더 포함하며, 상기 여기 필터 및 형광 필터 중 어느 하나 이상은 상기 반응챔버와 상기 형광신호 검출부 사이에 위치하여 상기 형광신호의 광 잡음을 제거하는 것이 바람직하다.Further, it is preferable that at least one of the excitation filter and the fluorescence filter is disposed between the reaction chamber and the fluorescence signal detection unit to remove the optical noise of the fluorescence signal Do.

또한, 상기 형광신호 검출부는 실리콘 광전자 증배관(PMT; Photo Multiplier Tube)인 것이 바람직하다.Preferably, the fluorescence signal detecting unit is a photomultiplier tube (PMT).

또한, 높이가 50㎛보다 작을 경우, 나노바이오센서, 자석입자, 세균 결합물이 미세유로를 막아 시료가 흐르지 못하고 정체되게 만들기 때문에 상기 미세유로의 폭은 400㎛, 높이는 50㎛인 것이 바람직하다.When the height is smaller than 50 탆, it is preferable that the width of the micro channel is 400 탆 and the height of the micro channel is 50 탆, because the nano-biosensor, the magnet particle, and the bacterial bond block the micro channel to prevent the sample from flowing.

또한, 기존 세균양 측정방법에서 제시된 측정기는 측면에서 여기광을 조사하고 형광신호를 측정하였으나, 나노바이오센서, 자석입자, 세균 결합물이 중력에 의해 아래쪽으로 침전되고, 시간 경과에 따라 형광신호가 변하기 때문에, 상기 형광신호 검출부는 상기 반응챔버의 상기 형광신호 측정부와 광섬유로 연결되고, 상기 광섬유의 일단이 상기 형광신호 측정부의 아래쪽에 위치하는 것이 바람직하다.In addition, the measuring device proposed in the conventional method for quantifying the amount of bacteria irradiated the excitation light on the side and measured the fluorescence signal. However, since the nano-biosensor, magnet particle, and bacterial bond are precipitated downward by gravity, The fluorescence signal detecting unit is connected to the fluorescence signal measuring unit of the reaction chamber by an optical fiber and one end of the optical fiber is positioned below the fluorescence signal measuring unit.

또한, 상기 시료는 살모넬라균인 것이 바람직하다.
In addition, the sample is preferably Salmonella.

이상에서 살펴본 바와 같이, 미세유로를 갖는 마이크로칩을 포함하는 고감도 세균양 측정 장치를 통하여 일례로서 살모넬라균의 양이 종래에 106CFU/mL와 비교하여 향상된 약 1000배 이상 향상된 103CFU/mL인 경우도 살모넬라균을 검출할 수 있다.As it described above, the amount of Salmonella compared to 10 6 CFU / mL in the prior art by way of example via a highly sensitive bacterial quantity measuring device including a microchip having a micro channel enhanced about 1000-fold improved 10 3 CFU / mL Salmonella can also be detected.

또한, 여기 필터 및 형광 필터를 포함하여 광잡음에 따른 오차가 없는 정확한 측정을 제공한다.It also provides an accurate measurement without errors due to optical noise, including excitation filters and fluorescence filters.

또한, 소형으로 제작되어 휴대가 가능한 세균양 측정 장치를 제공한다.
Also provided is a device for measuring the amount of bacteria which can be made compact and portable.

도 1은 본 발명에 따른 나노바이오센서를 이용한 고감도 세균양 측정 장치를 도시하는 구성도,
도 2는 나노바이오센서를 도시하는 개념도,
도 3은 일례로로서 살모넬라균과 나노바이오센서의 결합체를 도시하는 개념도,
도 4a는 마이크로칩을 도시하는 평면도,
도 4b는 마이크로칩의 제작과정을 설명하기 위한 개념도,
도 4c는 나노바이오센서 및 마이크로 자석입자 결합물에 의해 포획되어 형광신호 측정부에 농축된 살모넬라균을 보여주는 사진,
도 4d는 마이크로칩의 형태의 예를 도시하는 평면도,
도 5a는 표준형광물질을 이용한 실리콘 광전자 증배관을 이용한 형광 측정 성능 검정 결과를 도시하는 그래프,
도 5b는 나노양자점을 이용한 실리콘 광전자 증배관을 이용한 형광 측정 성능 검정 결과를 도시하는 그래프,
도 6a는 표준버퍼를 이용한 살모넬라균 검출한계 시험에 대한 결과를 도시하는 그래프 및
도 6b는 식품시료를 이용한 살모넬라균 검출한계 시험에 대한 결과를 도시하는 그래프이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a schematic view showing a device for measuring a high sensitivity bacterium using a nano-biosensor according to the present invention;
2 is a conceptual diagram showing a nano-biosensor,
FIG. 3 is a conceptual diagram showing a combination of Salmonella and a nano-biosensor as an example,
4A is a plan view showing a microchip,
FIG. 4B is a conceptual view for explaining a manufacturing process of a microchip,
FIG. 4c is a photograph showing the Salmonella bacteria captured by the nanobio-sensor and the micromagnet particle combination and concentrated in the fluorescence signal measuring unit,
4D is a plan view showing an example of the shape of a microchip,
FIG. 5A is a graph showing the results of fluorescence measurement performance test using a silicon photoelectron multiplier tube using a standard-type mineral,
FIG. 5B is a graph showing a result of fluorescence measurement performance test using a silicon optoelectronic amplifier using nano quantum dots,
Figure 6a is a graph showing the results for a Salmonella detection limit test using a standard buffer and
FIG. 6B is a graph showing the results of a Salmonella detection limit test using a food sample. FIG.

이하에서 사용되는 "나노바이오센서"는 자외선의 조사 시 형광신호를 발생시키는 형광나노입자인 나노양자점에 특정 세균에만 결합하는 항체를 붙인 물질로 정의한다.The "nano-biosensor" used below is defined as a substance having an antibody binding only to a specific bacterium to a nano-quantum dot, which is a fluorescent nanoparticle generating a fluorescence signal upon irradiation with ultraviolet light.

이하에서 사용되는 "결합체"는 나노바이오센서의 항체와 세균 간의 결합에 의해 형성된 나노바이오센서와 세균이 결합된 물질로 정의한다.
The term "conjugate" used below is defined as a substance in which a bacterium is combined with a nano-biosensor formed by binding between an antibody and a bacterium of a nano-biosensor.

나노바이오센서를Nano biosensors 이용한  Used 고감고Tighten 세균양Amount of bacteria 측정 장치 Measuring device

이하에서는 도면을 참조하여 나노바이오센서를 이용한 고감도 세균양 측정 장치에 대하여 상세히 설명한다.Hereinafter, an apparatus for measuring the amount of highly sensitive bacteria using a nano-biosensor will be described in detail with reference to the drawings.

본 발명은 나노바이오센서(110) 및 시료(120)가 반응하여 생성된 결합체(130)를 수용하는 시료홀더(150)를 포함하며, 암환경이 조성되는 반응챔버(100), 결합체(130)에 자외선을 조사하는 자외선 램프(200) 및 조사된 자외선에 의해 결합체(130)로부터 발생하는 형광신호를 측정하는 형광신호 검출부(300)를 포함한다.
The present invention includes a reaction chamber 100 in which a nano biosensor 110 and a sample 120 are accommodated and a sample holder 150 in which a sample 130 is accommodated, An ultraviolet lamp 200 for irradiating ultraviolet rays and a fluorescent signal detector 300 for measuring a fluorescent signal generated from the combined body 130 by irradiated ultraviolet rays.

반응챔버(100)는 나노바이오센서(110) 및 시료(120)가 반응하여 결합체(130)를 형성하는 곳이다. 또한, 반응챔버(100) 내에는 암환경이 조성된다. 이는 나노바이오센서(110)에 의한 형광신호가 매우 미약하기 때문이다.The reaction chamber 100 is a place where the nano-biosensor 110 and the sample 120 react to form a combined body 130. In addition, a dark environment is formed in the reaction chamber 100. This is because the fluorescence signal by the nano-biosensor 110 is very weak.

나노바이오센서(110)는 상술한 것과 같이 나노양자점(111)과 항체(117)의 결합물질로서 도 2에 도시된다. 일례로서 나노양자점(111)은 15 내지 20nm 정도의 크기를 갖는 반도체입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. The nano-biosensor 110 is shown in Fig. 2 as a binding substance of the nano quantum dot 111 and the antibody 117 as described above. As an example, the nano quantum dot 111 may be semiconductor particles having a size of about 15 to 20 nm, but is not limited thereto.

본 실시예에서는 시료(120)는 살모넬라균이다. 나노바이오센서(110)는 살모넬라균과 항원-항체 반응이 가능한 것을 설명하나 이는 예시적일 뿐이며, 어떠한 종류의 세균에서도 작동이 가능함을 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 용이하게 이해할 것이다.In this embodiment, the sample 120 is Salmonella. Although it is described that the nano-bio sensor 110 is capable of an antigen-antibody reaction with Salmonella, it is an illustrative example, and it is easily understood by a person skilled in the art to which the present invention belongs. will be.

일실시예에서, 나노양자점(111)은 내부로부터 카드뮴과 셀레늄의 혼합체(CdSe)로 이루어진 중심체(112), 광학적 특성을 좋게 하기 위한 황화아연(ZnS) 막(113), 생체물질을 부착할 수 있는 고분자 막(114)으로 이루어진다. 여기에 항체(117)와의 결합을 위해 스트렙트아비딘(115)을 형성시킨다.In one embodiment, the nano quantum dot 111 includes a central body 112 made of a mixture of cadmium and selenium (CdSe), a zinc sulfide (ZnS) film 113 for improving optical characteristics, And a polymer film 114 formed on the substrate. Here, streptavidin 115 is formed for binding with the antibody 117.

바이오틴(116)이 형성된 항체(117)와 스트렙트아비딘(115)이 형성된 나노양자점은 도 2에 도시된 것과 같이 스트렙트아비딘-바이오틴 결합을 한다. 상기와 같은 결합을 통해 나노바이오센서(110)가 완성된다.The nanotubes formed with the antibody 117 and the streptavidin 115 formed with the biotin 116 have a streptavidin-biotin bond as shown in FIG. The nano-biosensor 110 is completed through the above-described coupling.

시료(120)는 본 발명에서 세균의 존재 여부를 검사하고자 하는 음식물로 볼 것이지만, 단순히 세균만 존재하는 경우도 포함하는 것은 물론이다. 세균은 일례로서 식중독을 일으키는 살모넬라균(121)일 수 있다. The sample 120 is considered to be a food to be inspected for the presence or absence of bacteria in the present invention, but it goes without saying that the sample 120 includes only bacteria. The bacterium may be salmonella (121) causing food poisoning as an example.

도 3은 살모넬라균(121)과 나노바이오센서(110)의 결합체(130)를 도시하는 개념도이다. 식중독균으로 오염된 시료에 나노바이오센서(110)를 주입하면 항원-항체 반응에 의해 나노바이오센서(110)가 살모넬라균(121)과 반응하여 결합체(130)을 형성한다.FIG. 3 is a conceptual diagram showing a combined body 130 of the salmonella 121 and the nano-biosensor 110. When the nano-biosensor 110 is injected into a sample contaminated with food poisoning bacteria, the nano-biosensor 110 reacts with the salmonella 121 by an antigen-antibody reaction to form a complex 130.

바람직하게 결합체(131)는 마이크로 자석입자(미도시)를 더 포함할 수 있다. 마이크로 자석입자는 나노바이오센서(110)와 마찬가지로 시료 내의 세균과 항원-항체 반응에 의해 결합한다. 이렇게 생성된 마이크로 자석입자를 더 포함하는 결합체(131)는 마이크로칩(151) 내의 형광신호 측정부(155)에 자석에 의해 농축될 수 있다. 상기한 농축과정은 이하에서 설명한다.Preferably, the combination 131 may further include micromagnet particles (not shown). The micro magnet particles are bound to the bacteria in the sample by an antigen-antibody reaction as in the case of the nano-biosensor 110. The combined body 131, which further includes the micromagnet particles thus generated, can be concentrated by the magnet to the fluorescent signal measuring unit 155 in the microchip 151. [ The above-described concentration process will be described below.

시료홀더(150)는 나노바이오센서(110) 및 시료(120)가 반응하여 생성된 결합체(130)를 수용한다. 일례로서 배양용 슬라이드일 수 있으나, 상기한 결합체(130)를 수용할 수 있는 어떠한 부재도 가능하다.The sample holder 150 receives the combined body 130 generated by the reaction of the nano-biosensor 110 and the sample 120. As an example, it may be a culture slide, but any member capable of accommodating the above-described assembly 130 is also possible.

바람직하게는 시료홀더(150)는 마이크로칩(151)일 수 있다. 도 4a는 일례로서 마이크로칩(151)을 도시한다. 마이크로칩(151)은 시료투입부(152), 나노바이오센서투입부(153), 반응부(154), 형광신호 측정부(155) 및 시료배출부(156)를 포함한다.Preferably, the sample holder 150 may be a microchip 151. 4A shows a microchip 151 as an example. The microchip 151 includes a sample input unit 152, a nano-biosensor input unit 153, a reaction unit 154, a fluorescence signal measurement unit 155, and a sample discharge unit 156.

이하에서는 도 4b를 참조하여 MEMS 공정을 통한 미세유로를 가진 마이크로칩(151) 제작방법에 대하여 상세히 설명한다. 나노바이오센서(110)로부터 발생하는 형광신호가 투과될 수 있도록 투명하면서도 취급이 용이한 Polydimethylsiloxane(PDMS)을 이용하여 마이크로칩(151)을 제작한다.Hereinafter, a method of manufacturing a microchip 151 having a microchannel through a MEMS process will be described in detail with reference to FIG. 4B. The microchip 151 is fabricated using transparent and easy-to-handle polydimethylsiloxane (PDMS) so that the fluorescence signal generated from the nano-biosensor 110 can be transmitted.

마이크로칩(151)의 미세유로는 CFD프로그램인 CoventorWare2010을 이용하여 패턴을 설계한 다음, 초소형 MEMS 센서 제작과정과 동일한 반도체 공정을 사용하여 제작한다. 미세유로 기반의 마이크로칩(151) 제작 공정을 도 4b를 참조하여 상세히 설명한다.The microchannel of the microchip 151 is designed by using CoventorWare 2010, which is a CFD program, and then fabricated using the same semiconductor process as the micro-MEMS sensor fabrication process. The manufacturing process of the microchip 151 based on the microchannel will be described in detail with reference to FIG. 4B.

설계된 미세유로 패턴을 정밀 레이저프린터를 이용하여 프린트하여 패턴 마스크(161) 제작하고(a), 실리콘 웨이퍼(162)에 SU-8 포토레지스트(163)를 도포한다(b). (A), and the SU-8 photoresist 163 is applied to the silicon wafer 162 (b). The patterned mask 161 is fabricated by printing a designed fine flow path pattern using a precision laser printer.

이후, 얼라이너에 패턴 마스크(161)와 포토레지스트(163)가 도포된 실리콘 웨이퍼(162)를 장착하고 자외선을 조사하고(c), 식각 용액을 이용하여 패턴 외부의 포토레지스터(163)를 제거하여 양각으로 미세유로가 형성된 실리콘 마스터(164)를 제작한다(d). Thereafter, the silicon wafer 162 coated with the pattern mask 161 and the photoresist 163 is mounted on the aligner, ultraviolet light is irradiated (c), and the photoresist 163 outside the pattern is removed using the etching solution (D), a silicon master 164 having a minute flow path formed thereon is fabricated.

그리고, 미세유로 패턴이 새겨진 마스터 플레이트를 위에 PDMS 혼합 용액(165)을 부어 PDMS 틀을 형성하고(e), 60?에서 2시간 처리하여 PDMS를 경화하여 마이크로칩(151)의 윗면을 제작한다(f). The upper surface of the microchip 151 is fabricated by curing the PDMS by treating the microchannel pattern with a PDMS mixture solution 165 on a master plate, forming a PDMS mold (e) f).

제작된 PDMS와 유리 슬라이드를 아세톤과 에틸 알코올로 세척한 후 플라즈마를 처리한다. 이후, PDMS 재질의 윗면과 유리 재질의 아랫면을 서로 접합하여 마이크로칩을 제작하고, 시료 용액주입과 배출을 위한 튜브 연결을 위해 PDMS에 작은 주사침으로 연결 구멍을 형성한 후 21G 크기의 주사바늘로 만들어진 커넥터를 PDMS에 설치하고, 커넥터 주위의 빈틈을 PDMS를 이용하여 메움으로서 마이크로칩(151) 제작 공정을 완료한다.The prepared PDMS and glass slides are washed with acetone and ethyl alcohol and then treated with plasma. Then, a microchip was prepared by bonding the upper surface of the PDMS material and the lower surface of the glass material, and a connecting hole was formed in the PDMS with a small needle to connect the tube for injecting and discharging the sample solution. The connector is installed in the PDMS, and the microchip 151 is fabricated by filling the gaps around the connector with PDMS.

상기와 같이 제작된 마이크로칩(151)의 시료(120) 농축 성능 검증을 위해, 마이크로칩(151) 형광신호 측정부(155) 아래에 자석을 설치하고 나노바이오센서(110)와 마이크로 자석입자 결합물이 포함된 시료를 흘려주는 실험을 수행하였다. 도 4c는 나노바이오센서(110) 및 마이크로 자석입자 결합물에 의해 포획되어 형광신호 측정부(155)에 농축된 살모넬라균을 보여주는 사진이다. 도 4c를 통해 형광신호 측정부(155)에 농축된 농축된 살모넬라균을 육안으로 확인가능하다.A magneto is installed under the fluorescence signal measuring unit 155 of the microchip 151 and the magnets are attached to the nano-biosensor 110 and the micromagnet particle bonding unit 150. In order to verify the concentration performance of the sample 120, Experiments were carried out to shed samples containing water. 4C is a photograph showing the nano-biosensor 110 and the salmonella bacteria captured by the micro-magnet particle combination and concentrated in the fluorescence signal measuring unit 155. 4C, the concentrated salmonella bacteria concentrated in the fluorescence signal measuring unit 155 can be visually confirmed.

바람직하게는 미세유로의 폭은 400㎛이며, 높이는 50㎛일 수 있다. 폭은 식중독균과 마이크로 자석입자의 엉김 현상시 유로의 막힘 고려하여 400㎛으로 선정한 것이며, 높이는 반도체 공정을 이용한 제작 기술상 채널의 제한을 높이 고려하여 50㎛로 선정한 것이다.Preferably, the width of the fine flow path is 400 占 퐉, and the height may be 50 占 퐉. The width was selected to be 400 μm considering the clogging of the flow path when the food poisoning bacteria and the micromagnet particles were entangled and the height was selected to be 50 μm considering the limitation of the channel manufacturing technology using the semiconductor process.

또한, 미세유로는 다양한 형태를 가질 수 있으며, 예로서 도 4d에 미세유로의 다양한 형태가 도시된다.In addition, the microfluidic channel can have various shapes, for example, various types of microfluid channels are shown in Fig. 4D.

시료홀더(150)가 밑면적 1cm2인 배양용 슬라이드인 경우 살모넬라균의 검출한계가 106CFU/mL인 것과 비교하여, 시료홀더(150)가 마이크로칩(151)인 경우 살모넬라균 103CFU/mL까지도 측정이 가능하여 현저한 효과 상승을 확인할 수 있다. 이는 마이크로칩(151)이 결합물(130)을 좁은 영역, 즉 형광신호 측정부(155)로 농축시켰기 때문이다.If the sample holder 150, the footprint of the slide for the 1cm 2 of the culture when the the detection limit of Salmonella compared to the 10 6 CFU / mL, the sample holder 150, a microchip 151 Salmonella 10 3 CFU / mL can be measured and a remarkable increase in the effect can be confirmed. This is because the microchip 151 has concentrated the binding substance 130 into a narrow region, that is, the fluorescence signal measurement unit 155.

따라서, 마이크로칩(151)을 통해 사용 시약의 절약, 시료 농축, 시료간 반응시간 단축 및 균일화를 통한 검출감도 향상의 효과를 제공할 수 있다.
Therefore, through the microchip 151, it is possible to provide the effect of saving the reagent used, concentration of the sample, shortening the reaction time between samples, and improving the detection sensitivity through homogenization.

자외선 램프(200)는 나노바이오센서(110)가 자외선을 받으면 형광신호를 발생시키는 특징을 이용하기 위한 것으로 일례로서 자외선 LED 램프 일수 있으나, 나노바이오센서(110)에 자외선을 조사할 수 있는 어떠한 종류의 램프도 가능하다. 자외선 램프(200)와 반응챔버(100)는 광섬유에 의해 연결된다.
The ultraviolet lamp 200 may be an ultraviolet LED lamp, for example, in order to utilize a feature of generating a fluorescence signal when the nano-biosensor 110 receives ultraviolet rays. However, Lamps are also possible. The UV lamp 200 and the reaction chamber 100 are connected by an optical fiber.

형광신호 검출부(300)는 나오바이오센서(110)로부터 발생된 형광신호를 측정하기 위한 것으로 일례로서 실리콘 광전자 증배관(PMT)일 수 있으나, 형광신호를 측정가능한 어떠한 장치도 가능하다. 또한, 형광신호 검출부(300)는 자외선 램프(200)와 마찬가지로 반응챔버(100)와 광섬유에 의해 연결된다.The fluorescence signal detecting unit 300 may be a silicon photomultiplier tube (PMT) for measuring a fluorescence signal generated from the bio-sensor 110, but any device capable of measuring a fluorescence signal is possible. The fluorescence signal detecting unit 300 is connected to the reaction chamber 100 by an optical fiber as in the case of the ultraviolet lamp 200.

광전자 증배관이란, 광전 효과를 이용한 입력 변화기로서, 고진공의 유리관 내에 음극의 광전면과 양극을 봉한 것으로, 양자 사이에 다이노드라 부르는 2차 전자 방출 효과가 있는 전극을 십수 단으로 겹쳐서 광전류를 증폭하도록 하고 있다. 따라서, 미약광의 측정에 유용하다.A photo-multiplier tube is an input changer using a photoelectric effect. It is a device that seals a light front face and an anode of a cathode in a high-vacuum glass tube and superimposes an electrode having a secondary electron emission effect called a dynode . Therefore, it is useful for measurement of weak light.

실리콘 광전자 증배관을 이용한 형광 측정 성능 검정의 결과가 도 5a 및 5b에 도시된다. 도 5a는 표준형광물질을 이용한 형광 측정 성능 검정이며, 도 5b는 나노양자점을 이용한 형광 측정 성능 검정으로 두 경우 모두 형광신호의 세기에 따라 측정량 역시 선형적으로 증가함을 확인하였다.The results of the fluorescence measurement performance test using a silicon optoelectronic amplifier are shown in FIGS. 5A and 5B. FIG. 5A is a fluorescence measurement performance test using a standard type of minerals, and FIG. 5B is a fluorescence measurement performance test using nano quantum dots. In both cases, the measured amount increases linearly with the intensity of the fluorescence signal.

또한, 형광신호 검출부(300)로 형광신호를 측정하는 과정에서, 나노바이오센서(110)와 세균이 결합한 결합체(130)의 무게로 인해 아래로 가라앉는 것을 고려하여, 형광신호 검출부(300)는 반응챔버(100)의 형광신호 측정부(155)와 광섬유로 연결되고, 광섬유의 일단이 형광신호 측정부(155)의 아래쪽에 위치 것이 바람직할 수 있다.
The fluorescence signal detector 300 may be configured to detect the fluorescence intensity of the fluorescence signal detected by the fluorescence signal detector 300 in consideration of the fact that the nano- It may be preferable that the fluorescence signal measuring unit 155 of the reaction chamber 100 is connected to an optical fiber and one end of the optical fiber is located below the fluorescence signal measuring unit 155.

바람직하게 나노바이오센서를 이용한 고감도 세균양 측정 장치는 광잡음 제거 필터(400)를 더 포함할 수 있다.Preferably, the device for measuring the amount of highly sensitive bacteria using the nano-biosensor further includes the optical noise elimination filter 400.

도 1에는 반응챔버(100)와 형광신호 검출부(300) 사이에 광잡음 제거 필터(400)가 도시된다. 상기한 광잡음 제거 필터의 일례로서 여기 필터 및 형광 필터가 포함될 수 있으나, 광잡음 제거 기능을 수행가능한 어떠한 종류의 광학 필터도 가능하다.1, an optical noise canceling filter 400 is shown between the reaction chamber 100 and the fluorescence signal detecting unit 300. As an example of the optical noise canceling filter, an excitation filter and a fluorescence filter may be included, but any kind of optical filter capable of performing the optical noise canceling function is possible.

상기한 광잡음 제거 필터(400)는 형광 이외의 빛을 제거하여 나노양자점의 미약한 형광신호를 간섭없이 정확히 측정하기 위해 이용된다.
The optical noise elimination filter 400 is used to accurately measure weak fluorescence signals of nano quantum dots without interference by removing light other than fluorescence.

측정 방법의 설명Explanation of measurement method

이하에서는 본 발명이 적용된 나노바이오센서를 이용한 고감도 세균양 측정 장치를 이용한 세균양의 측정 방법에 대하여 상세히 설명하다.Hereinafter, a method for measuring the amount of bacteria using the apparatus for measuring the amount of highly sensitive bacteria using the nano-biosensor to which the present invention is applied will be described in detail.

시료홀더(150) 상에 나노바이오센서(110) 및 시료(120)를 주입하면서 측정과정이 시작된다. 주입된 나노바이오센서(110) 및 시료(120)는 항원-항체 반응을 통한 결합으로 결합체(130)를 생성한다.The measurement process is started while injecting the nano-biosensor 110 and the sample 120 onto the sample holder 150. The injected nanobio sensor 110 and the sample 120 generate the conjugate 130 by binding through an antigen-antibody reaction.

상기 결합체(130)에 자외선 램프(200)로 자외선을 조사하고, 조사된 자외선에 의해 발생된 형광신호를 형광신호 검출부(300)로 측정한다.Ultraviolet rays are irradiated to the combined body 130 with the ultraviolet lamp 200 and the fluorescence signal generated by the irradiated ultraviolet rays is measured by the fluorescence signal detector 300.

이하에서는 일례로서 마이크로칩(151)을 포함하는 나노바이오센서를 이용한 고감도 세균양 측정장치를 이용한 세균양의 측정 방법에 대하여 상세히 설명한다.Hereinafter, a method for measuring the amount of bacteria using a device for measuring the amount of highly sensitive bacteria using the nano-biosensor including the microchip 151 will be described in detail as an example.

상기한 세균양 측정 방법에 더하여 마이크로칩(151) 상에서 결합체(130)가 농축되는 과정을 더 포함하게 된다.In addition to the method for measuring the amount of bacteria, the method further includes a process of concentrating the complex 130 on the microchip 151.

상세하게는, 시료투입부(152)에 시료(120)를 투입하고, 나노바이오센서투입부(153)에 나노바이오센서(110)와 마이크로 자석입자를 투입한다. 상기한 시료(120), 나노바이오센서(110) 및 마이크로 자석입자는 반응부(154)를 지나며, 항원-항체 반응에 의해 결합체(131)를 형성한다. 상기한 결합체(131)는 마이크로 자석입자의 자력에 의해 형광신호 측정부(155)로 농축된다. 상기한 농축은 자석과 마이크로 자석입자의 인력에 의한 것이다. 형광신호가 측정된 결합체(131)는 시료배출부(136)로 배출될 수 있다.In detail, the sample 120 is put into the sample input part 152, and the nano-biosensor 110 and the micromagnet particles are introduced into the nano-biosensor input part 153. The sample 120, the nano-biosensor 110, and the micromagnet particles pass through the reaction unit 154 and form a binding unit 131 by an antigen-antibody reaction. The coupling 131 is concentrated by the magnetic force of the micromagnet particles to the fluorescence signal measurement unit 155. The above-mentioned concentration is due to attraction of the magnet and the micromagnet particles. The assembly 131 in which the fluorescence signal is measured can be discharged to the sample discharge portion 136.

보다 상세하게, 반응부(154)를 지나는 시료(120), 나노바이오센서(110) 및 마이크로 자석입자에 대하여 설명한다. 도 4b는 3차원 유동해석 프로그램(CFD)인 CoventorWare 2010을 사용하여 미세유로 내의 시료(120) 유동을 분석한 결과를 도시한 것이다. 시료(120)와 나노바이오센서(110) 시약들이 서로 잘 혼합되면서 형광신호 측정부(155)로 이동하는 것을 확인할 수 있다.The sample 120, the nano-biosensor 110, and the micromagnet particles passing through the reaction part 154 will be described in more detail. FIG. 4B shows a result of analyzing the flow of the sample 120 in the microfluidic channel using CoventorWare 2010, which is a three-dimensional flow analysis program (CFD). It can be confirmed that the sample 120 and the reagents of the nano-biosensor 110 are mixed with each other and moved to the fluorescence signal measuring unit 155.

다른 예로서, 본 발명인 나노바이오센서를 이용한 고감도 세균양 측정 장치 내에 마이크로칩(151)을 삽입하기 이전에 상기의 마이크로칩(151)에 의한 농축과정을 전처리로서 장치의 외부에서 실행하는 것도 가능함은 물론이다.
As another example, before the microchip 151 is inserted into the apparatus for measuring the amount of bacteria with high sensitivity using the nano-biosensor according to the present invention, the concentration process by the microchip 151 may be performed as a pretreatment from the outside of the apparatus Of course.

도 6a 및 6b는 도 4d 중 (d)형태의 마이크로칩(151)을 이용한 살모넬라균 검출한계 시험에 대한 결과를 도시한 것이다.FIGS. 6A and 6B show the results of the Salmonella detection limit test using the microchip 151 of FIG. 4D (d).

마이크로칩(151)을 펌프에 연결하여 표준버퍼 또는 식품시료에 접종된 서로 다른 농도의 살모넬라균을 마이크로 자석입자로 분리, 농축하면서 나노바이오센서에 결합시킨 다음 본 발명에 따른 세균양 측정 장치에 장착하여 형광신호를 측정하는 방법으로 시험을 수행하였다.The microchip 151 is connected to the pump to separate the salmonella of different concentrations inoculated into the standard buffer or the food sample into micro magnet particles, and the micro-magnet 151 is attached to the nano-biosensor while being concentrated And the fluorescence signal was measured.

살모넬라균이 103 내지 106 CFU/ml로 접종된 표준버퍼(Borate 버퍼, 한국공개특허 제 10-2011-0006334호에서는 PBS(표준인산버퍼)를 사용한 것과 차이를 가진다. PBS로 실험한 경우 형광 신호가 감소하는 현상이 발견되었으나, Borate 버퍼를 표준버퍼로 이용하여 신호감소가 현저히 줄어드는 것을 확인하였다.) (도 6a에 결과 도시) 및 실제 식품시료인 닭고기 세척액(도 6b에 결과 도시)을 이용하여 검출한계를 구했다. 항체 및 나노양자점의 농도는 각각 10㎍/ml와 40nmol을 사용하였다.(Borate buffer, in Korean Patent Laid-open No. 10-2011-0006334, PBS (standard phosphate buffer)) inoculated with Salmonella at 10 3 to 10 6 CFU / ml. (Fig. 6A), and the actual food sample, chicken washing solution (the result city in Fig. 6B), was used as the standard buffer. And the detection limit was obtained. The concentrations of antibody and nano-quantum dot were 10 μg / ml and 40 nmol, respectively.

또한, 농축을 위한 시료 이송속도는 기초 실험을 통해 자석입자가 외부자기력에 의해 형광신호 측정부(155)에 고정될 때의 속도인 50㎕/min로 설정하여 시험을 수행하였다.In addition, the sample conveyance speed for concentration was set at 50 μl / min, which is the speed at which the magnet particles are fixed to the fluorescence signal measuring unit 155 by an external magnetic force through a basic experiment.

도 6a 및 6b에 도시된 것과 같이, 표준버퍼와 닭고기 세척액 모두에서 검출한계가 103CFU/ml임을 확인했다.
As shown in Figs. 6A and 6B, it was confirmed that the detection limit was 10 3 CFU / ml in both the standard buffer and the chicken washing solution.

100 : 반응챔버
110 : 나노바이오센서
111 : 나노양자점
112 : 중심체
113 : 황화아연 막
114 : 고분자 막
115 : 스트렙트아비딘
116 : 바이오틴
117 : 항체
120 : 시료
121 : 살모넬라균
130 : 결합체
131 : (마이크로 자석입자가 더 포함된) 결합체
150 : 시료홀더
151 : 마이크로칩
152 : 시료투입부
153 : 나노바이오센서투입부
154 : 반응부
155 : 형광신호 측정부
156 : 시료배출부
161 : 마스크
162 : 실리콘 웨이퍼
163 : 포토레지스트
164 : 실리콘 마스터
165 : PDMS 혼합 용액
200 : 자외선 램프
300 : 형광신호 검출부
400 : 광잡음 제거 필터100: reaction chamber
110: Nano biosensor
111: Nano quantum dot
112: center body
113: zinc sulphide film
114: polymer membrane
115: Streptavidin
116: Biotin
117: Antibody
120: sample
121: Salmonella
130: Coupling
131: Coupling (further comprising micromagnet particles)
150: sample holder
151: Microchip
152: sample introduction part
153: Nano-biosensor input part
154:
155: Fluorescence signal measuring unit
156:
161: Mask
162: Silicon wafer
163: Photoresist
164: Silicone master
165: PDMS mixed solution
200: ultraviolet lamp
300: Fluorescence signal detector
400: Optical Noise Reduction Filter

Claims (6)

나노바이오센서를 이용한 시료 내의 세균양 측정 장치에 있어서,
상기 나노바이오센서, 상기 시료 및 마이크로 자석입자가 반응하여 생성된 결합체를 수용하는 시료홀더를 포함하며, 암환경이 조성되는 반응챔버;
상기 나노바이오센서에 자외선을 조사하는 자외선 램프; 및
상기 조사된 자외선에 의해 상기 나노바이오센서로부터 발생하는 형광신호를 측정하는 형광신호 검출부
를 포함하며,
상기 시료홀더는 형광신호 측정부를 포함하는 마이크로칩이며, 상기 결합체가 상기 마이크로 자석입자의 자력에 의해 상기 형광신호 측정부에 농축되며,
상기 형광신호 검출부는 상기 반응챔버의 상기 형광신호 측정부와 광섬유로 연결되고, 상기 광섬유의 일단이 상기 형광신호 측정부의 아래쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는,
나노바이오센서를 이용한 세균양 측정 장치.
An apparatus for measuring the amount of bacteria in a sample using a nano-biosensor,
A reaction chamber including a sample holder for receiving the nano-biosensor, the sample, and a complex formed by reaction of the micromagnet particles;
An ultraviolet lamp for irradiating the nano-biosensor with ultraviolet rays; And
And a fluorescence signal detector for measuring a fluorescence signal generated from the nano-biosensor by the irradiated ultraviolet light,
/ RTI >
Wherein the sample holder is a microchip including a fluorescence signal measuring unit, the conjugate is concentrated in the fluorescence signal measuring unit by the magnetic force of the micromagnet particles,
Wherein the fluorescence signal detecting unit is connected to the fluorescence signal measuring unit of the reaction chamber by an optical fiber and one end of the optical fiber is located below the fluorescence signal measuring unit,
A device for measuring the amount of bacteria using a nano - biosensor.
제 1 항에 있어서,
여기 필터 및 형광 필터 중 어느 하나 이상을 더 포함하며,
상기 여기 필터 및 형광 필터 중 어느 하나 이상은 상기 반응챔버와 상기 형광신호 검출부 사이에 위치하여 상기 형광신호의 광 잡음을 제거하는 것을 특징으로 하는,
나노바이오센서를 이용한 세균양 측정 장치.
The method according to claim 1,
An excitation filter, and a fluorescence filter,
Wherein at least one of the excitation filter and the fluorescence filter is positioned between the reaction chamber and the fluorescence signal detection unit to remove optical noise of the fluorescence signal.
A device for measuring the amount of bacteria using a nano - biosensor.
제 1 항에 있어서,
상기 형광신호 검출부는 실리콘 광전자 증배관(PMT; Photo Multiplier Tube)인 것을 특징으로 하는,
나노바이오센서를 이용한 세균양 측정 장치.
The method according to claim 1,
Wherein the fluorescence signal detecting unit is a photomultiplier tube (PMT)
A device for measuring the amount of bacteria using a nano - biosensor.
제 1 항에 있어서,
상기 마이크로칩은 미세유로를 더 포함하며,
상기 미세유로의 폭은 400㎛, 높이는 50㎛인 것을 특징으로 하는,
나노바이오센서를 이용한 세균양 측정 장치.
The method according to claim 1,
The microchip further comprises a microchannel,
Wherein the micro channel has a width of 400 mu m and a height of 50 mu m.
A device for measuring the amount of bacteria using a nano - biosensor.
삭제delete 제 1 항에 있어서,
상기 시료는 살모넬라균인 것을 특징으로 하는,
나노바이오센서를 이용한 세균양 측정 장치.
The method according to claim 1,
Characterized in that the sample is salmonella,
A device for measuring the amount of bacteria using a nano - biosensor.
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