KR101386710B1 - 비환식 석시노글리칸의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비환식 석시노글리칸의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비환식 석시노글리칸을 유효성분으로 하는 가용화제, 안정화제 및 약학적 용도에 관한 것이다.

Description

비환식 석시노글리칸의 용도{Use of acyclic succinoglycan dimer}

본 발명은 비환식 석시노글리칸의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비환식 석시노글리칸을 유효성분으로 하는 가용화제, 안정화제 및 약학적 용도에 관한 것이다.

일반적으로 질소 고정 토양 박테리아인 Sinorhizobium meliloti (Rm 1021)는 산성 exopolysaccharide(EPS)를 생성하고, 그것은 알파파의 레귐(legumes)과 박테리아 사이의 뿌리 혹 고정의 발생에서 중요한 역할을 한다(Battisti, L., Lara, L., & Leigh, J. A. (1992). Proceedings of the National Academy of Sciences, 89, 5625-5629;Gonzalez, J. E., Reuhs, B. L. & Walker, G. C.(1996) Medicago sativa. Proceedings of the National Academy of Sciences , 93, 8636-8641 ; Gonzalez, J. E., York, G. M. & Walker, G. C. (1996) Gene, 179, 141-146; Brewin, N. J. (1991). Annual Review of Cell Biology , 7, 191-226).

Sinorhizobium melioti에 의하여 분비되는 Succinoglycan 옥타사카라이드는 환원 말단에 하나의 갈락토스와 7개 포도당 잔기를 가지고, 7번째 당 잔기의 C-6에 위치한 하나에서 두 석시닐 기가 8번째 당 잔기와 4, 6-ketal 연결을 통하여 연결된 것을 포함하는 β-1,3, β-1,4, and β-1,6 연결된 옥타사카라이드 소단위체로 구성되었다(도 1).(Chouly, C., Colquhoun, I. J., & Jodelet, A. (1995) International Journal of Biological Macromolecules, 17, 357-363; Reinhold, B. B., Chan, S. Y., Reuber, T. L., Marra, A., Walker, G. C. & Reinhold. V.N. (1994) Journal of Bacteriology, 176,1997-2002)

Haloperidol (HAL)은 4-[4-(4-chlorophenyl)-4-hydroxy-1-piperidyl]-1-(4-fluorophenyl)-butan-1-one, 이고 그것은 정신분열증, 망상 및 환각의 치료에 사용되는 butyrophenone 항정신병약물이다.(Bernard G., & Simona A. (2005) Annals of Clinical Psychiatry, 17, 137-140) 그러나 이 화합물은 실질적으로 물에 불용성이고(1.4 mg/100 mL) (Remington, J.P. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences. (18th ed.) (pp. 1086.) Easton : Mack Pub) 상대적으로 낮은 경구 생체이용률을 가진다(60%) (Drug Information, A.H.F.S.: Haloperidol.www.ashp.org/mngrphs/ahfs/a382159.htm, 2008).

HAL의 수용화에 대한 한 방법이 cyclodextrins (CDs) 및 그것의 유도체와 복합체 형성이다. HAL 수용성은 methyl β CD (Me β-CD)의 10배 과량 존재시에 20배 증가하고 2-hydroxypropyl β-CD (HP β-CD)의 10배 과량에서는 12배 증가한다.

관련특허로 대한민국특허공개번호 제1020010086293호는 선형 사이클로덱스트린 공중합체에 관한 발명으로, 중합체의 주쇄로 통합된 비산화 및/또는 산화 사이클로덱스트린 부분을 함유하는 선형 사이클로덱스트린 공중합체 및 산화된 선형 사이클로덱스트린 공중합체 및 상기 공중합체의 제조 방법 또한 기술되어 있으며, 선형 사이클로덱스트린 공중합체 및 산화된 선형 사이클로덱스트린 공중합체는 다양한 치료 약제의 운반체로서 사용될 수 있다고 기술되어 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 새로운 가용화제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 새로운 안정화제를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 할로페리돌의 가용성 증가용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 R₁,R₂,R₃ 및 R₄는 H 또는 석시네이트(succinate)인 것을 특징으로 하고,

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 화합물은 R₁, R₂, R₃ 및 R₄는 중 3개는 석시네이트이고 하나는 H인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 화합물은 다이머(dimer) 시리즈는 　R1,2,3,4 중 어느 위치에 존재하느냐에 따라서 구분 되는 것이 아니고 석시네이트의 숫자에 따라 구분이 된다. 따라서 석시네이트가 1개이면 D1, 2개이면 D2 등의 식으로 구분하였고, D3의 경우 R 1,2,3,4 중 3개가 석시네이트 이고, 하나는 H 인 형태로 존재하고 그 위치는 따로 정해져 있지 않은 믹스쳐 상태로 존재한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 화합물은 화학적 또는 생물학적 방법에 의하여 합성될 수 있으며 본 발명의 실시예에서는 Sinorhizobium melioti로부터 유래한 것을 사용하였다.

또 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 할로페리돌의 안정성 증가용 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서 R₁,R₂,R₃ 및 R₄는 H 또는 석시네이트(succinate)인 것을 특징으로 함.

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본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 치료 약제는 불용성 약제인 것이 바람직하고,할로페리돌(Haloperidol)인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 조성물은 공지 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 치료 약제와 혼합되어 스스로 집합된다. 본 발명에 따르면, 치료 약제 및 본 발명의 화합물은 서로 결합되어 상기 화합물이 치료 약제에 대한 운반체로서 작용한다. 상기 치료 약제 및 화합물은 정전기 상호 작용 및 소수성 상호 작용과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 결합될 수 있다. 결합도는 예로 형광 검사, DNA 유동성 조사, 빛 산란, 전자현미경을 포함하는 공지 기술로 결정될 수 있고, 치료 약제에 따라서 변경된다.

본 발명의 조성물은 예로, 고체, 액체, 현탁액, 또는 유탁액일 수 있다. 본 발명의 조성물은 정맥내로 주입될 수 있는 형태인 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물을 투여하는 다른 방법은 조성물의 상태에 따라 구강 투여, 국부 적용, 비경구, 정맥내, 비강내, 두개골내, 복강내 주사와 같은 공지된 방법이 사용되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

사용되는 치료 약제의 타입에 따라서, 본 발명의 조성물은 낭포성 섬유증, 가우커 질환(Gaucher's disease),근위축증, AIDS, 암(예로, 다골수증, 백혈병, 흑색소 세포종, 및 난소암), 심장혈관 이상(예로, 진행성 심장병, 협착증, 및 형우병), 및 신경계 장애(예로, 뇌의 상해)와 같은 선천성 또는 후천성 장애의 다양한 치료 방법(예로 DNA 백신,항생물질, 항바이러스성 약제)에 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물을 치료에 효과적인 양으로 투여하는 치료 방법이 제공된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 치료에 효과적인 양은 상황에 따라 결정된다. 고려되는 것으로 치료되는 질환 및 그 질환을 겪는 이의 물리적 특징등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 높은 수용성 acyclic succinoglycan 다이머를 처음으로 새로운 가용화제(solubilizers)로 테스트하고 acyclic 형태의 이들 올리고사카라이드가 Haloperidol의 수용성을 증가시킬 수 있는지를 알아 보았다.

phase solubility 다이아그램으로부터 얻은 데이터는 Haloperidol의 수용성을 증가시키는 acyclic succinoglycans의 능력을 나타내었다. 본 발명자들은 또한 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), Differential scanning calorimetry (DSC) 및 FT-IR spectra 분석으로부터 얻은 데이터로 그 결과를 확인하였다.

본 발명을 상세하게 설명한다.

Sinorhizobium meliloti 1021로부터 분리된 succinoglycan 옥타사카라이드는 독특한 acyclic 구조를 가지고 물에 대해서 amphipathic 특성을 나타낸다. 따라서 그들의 여러 불용성 약제의 비공유 복합체를 통한 가용화제로 사용이 가능할 것이다.본 발명에서 본 발명자들은 succinoglycan 다이머의 acyclic 형태의 존재하에서 불용성 약물인 haloperidol의 수용성을 조사하였고 그것의 수용성이 87 배까지 증가한다는 것을 알 수 있었다. 흥미롭게도 그것의 수용성 수준은 사이클릭 형태인 cyclodextrin 또는 그 유도체에서 달성한 것보다 7-10배 더 높았다. 각 복합체에 대한 안정화 상수 및 화학량론 분석은 각각 phase solubility 방법을 사용하여 수행하였다. 추가적인 분석을 succinoglycan-약물 복합체의 형성을 확인하기 위하여 수행하였다. 복합체의 가설적인 3차원 형태를 Molecular 도킹 시뮬레이션을 통하여 평가하였다. 인간 세포주에 대한 세포독성 실험에서, 그 succinoglycan 다이머는 1000 μM까지 독성이 없었고, 이것은 불용성 치료제의 생체이용률 및 수용성을 개선하기 위한 그들의 용도를 시사한다.

본 발명에서 Haloperidol와 S. meliloti 유래 succinoglycan 다이머의 안정성, 수용성, 결합 능력, 복합체 형태 등을 조사하였다. 그 결과 succinoglycan 다이머들은 HAL의 안정성 뿐만 아니라 수용성도 증가시켰다. HAL/D3 복합체는 안정성 상수의 관점에서 다른 HAL/Dimers (D1, D2, 및 D4) 보다 더 안정적이었다. FT-IR, DSC, 및 SEM 결과들도 haloperidol와 acyclic succinoglycan 다이머 복합체의 효과적인 형성을 확인하였다. NOESY 실험에서, 분자간 크로스-피크들이 HAL 및 D3 사이에서 관찰되었고, HAL 및 D3 사이 복합체는 1:1 및 1:2 복합체 모두를 형성한다는 것을 시사한다. 이 결과들은 분자 도킹 연구에서도 관찰되었다. 따라서 본 발명자들은 복합체에 대한 다이머의 결합 능력은 다이머의 3차 구조에 의하여 영향을 받는다고 결론 내릴 수 있고, 다이머들은 복합체의 효율을 조절할 수 있으며 그것은 succinoglycan 다이머 내에 카르복실 기의 차별적인 차지 분포에 기인한다. 이들 결과에 기초하여, 미생물 유래 acyclic glycan는 소수성 약제 및 그들의 유도체의 안정성 및 수용성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 결과들은 succinoglycan 다이머 세포독성은 HEK293 세포에 특이적이지 않았다. succinoglycan 다이머들은 안전한 생체물질이어서 치료제로 사용될 수 있다는 것을 시시한다.

도 1은 (a) Haloperidol 및 (b) succinogylcan 다이머의 구조를 나타냄. R1 및 R2는 succinyl 기에 대한 부위를 나타냄.
도 2는 30℃, 물에서 복합체를 가지는 여러 농도(0, 0.5, 1, 1.5, 2.0mM)의 D1(◇), D2(○), D3(■), D4(▲) 및 Methyl β CD(x)의 Phase solubility 다이어그램을 나타냄.
도 3은 (a) HAL, (b) D3, (c) 물리적 혼합물 및 (d) Hal/D3 복합체의 FT-IR 스펙트럼.스펙트럼은 4000 및 400 cm^-1 사이에서 얻음.
도 4는 HAL, 다이머, 동일 몰의 물리적 혼합물(10mM) 및 동일 몰의 복합체(10mM)의 DSC곡선을 나타냄. (a) D1, (b) D2, (c) D3 및 (d) D4.
도 5는 80% dimethyl Sulfoxide-d6 (D, 99.9%) 및 20% deutrated water (D2O, 99.96%)을 포함하는 용액 및 동일 몰의 HAL (10mM) 및 D3 (10mM)의 NOESY 스펙트럼을 나타냄.
도 6은 (a) HAL, (b) D3, 및 (c) 1:1, 몰비 복합체의 주사 전자 현미경 사진, 500x확대, bar = 50μm.
도 7은 D3 및 haloperidol 사이의 복합체의 1:2 결합 모델의 전면도(A) 및 후면도(B). haloperidol의 pose-1 구조를 공간-충진 모델로 나타내고 pose-2 구조는 녹색에 용매 접근가능한 표면적으로 나타냄.
도 8은 HEK293 세포주(n = 3)에 대한 0, 5, 10, 50, 100, 500, 1000μM 농도에서 succinoglycan 다이머 (a) D1, (b) D2, (3) D3, 및 (d) D4의 세포독성을 나타낸 그림.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명에 사용된 Haloperidol (>98.0%(LC)(T))은 Tokyo Chemical Industry Co., LTD.(Tokyo, Japan)로부터 β-cyclodextrin 및 2-hydropropy-β-cyclodextrin (HP-β-CD)은 Sigma-Aldrich Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. D2O (99.9 at.% D) 및 Dimethyl Sulfoxide-d6 (D, 99.9%)는 Cambridge Isotope Laboratories, Inc.(Andover, MA, USA)로부터 구입하였다. 그들은 추가적인 정제없이 사용하였다.

실시예 1: succinoglycan 다이머의 제조

S. meliloti 로부터 succinoglycan 다이머의 분리 및 정제는 Wang, L. X., Wang, Y., Pellock, B., & Walcker G.C. (1999) Journal of Bacteriology, 181, 6788.에 기재된 것과 같이 수행하였다. S. meliloti 를 500 mL의 GMS 배지에서 30 ℃, 150 rpm에서 5일간 배양하였다. 세포들을 원심분리(8000 xg, 10 분간)로 제거하였다. 원심분리 후, 그 상등액을 로터리 증류에 의하여 원래 부피의 5배 농축하였다. 그 상등액은 exopolysaccharide (EPS)를 포함하였고 EPS는 3 부피의 냉 에탄올을 첨가하여 그 농축된 상등액으로부터 침전시킨 후 그 샘플을 원심분리(8000 xg, 10min)를 수행하였다. EPS를 제거한 후, 그 상등액을 또 원래 부피의 5배 농축하였다. 그 다음 Succinoglycan을 7부피의 에탄올을 첨가하여 침전시킨 후 그 샘플을 원심분리를 수행하였다.

그 침전물을 증류수에 녹였다. 추가 정제를 위하여 크로마토그래피를 수행하였다. 샘플을 Bio-Gel P6 컬럼(2.5 x145 cm)에 적용하고, 상온에서 0.5% AcOH으로 용출하였다. 모노머 분획을 모아서 농축하였다. 그 농축된 샘플을 DEAE Sephadex A-25 (1.5 x 48 cm)을 사용하여 숙신산 부위에 따라 네 분획(D1, D2, D3, 및 D4)으로 나누었다(도 1). 그 샘플을 5-400 mM KCl의 선형 구배를 사용하여 MOS버퍼의 KCl로 용출하였다.

분획들을 모아서 Bio-Gel P2 (2 x 48 cm) 컬럼을 사용하여 추가적으로 탈염하였다. 그 정제된 succinoglycan 다이머를 매트릭스로 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)를 사용한 네가티브 이온 모드에서 MALDI.TOF 질량 분광기(Voyager-DETM STR Bio-Spectrometry, Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)를 통하여 확인하였다. 그 질량 스펙트럼을 1μg 의 샘플의 전체 로딩을 가지고 10^-3 몰비에서 DHB에서 기록하였다.

실시예 2: Phase solubility 분석

Phase solubility 연구는 Higuchi 및 Connors (Higuchi, T., & Connors, K. A. (1965) Phase-solubility techniques. Advances in Analytical Chemistry and Instrumentation, 4, 117-212)에 기재된 방법을 사용하여 수행하였다. 과량의 HAL (50mM)을 바이얼 내에 여러 농도의 succinoglycan 다이머(D1, D2, D3, 및 D4)에 첨가하고 그 용액을 30 분간 소니케이터를 사용하여 분산하였다. 바이얼들을 증류로 인한 변화를 막기 위하여 밀봉하고 24 시간 동안 30 ℃에서 교반하고 분자들의 분해를 방지하기 위하여 빛으로부터 차단하였다. 평형에 도달한 후, 그 샘플들을 0.2 μm PVDF 필터로 여과하였다. 각 샘플을 녹은 HAL의 농도를 측정하기 위하여 220에서 350nm까지 UV-vis 분광기(UV 2450, Shimadzu Corporation)를 사용하여 분석하였다. Phase solubility 다이어그램을 그 복합체의 복합체 형성 상수를 평가하여 결정하였다. [SmLn]의 형성에 대한 평형상수(K)는 :

K_{1 :1} = [SL]/[S][L] (1)

K_{1 :2} = [SL₂]/[SL][L] (2)로 나타낼 수 있다.

여러 농도의 수용액에서 HAL의 수용성(S_eq)은 :

S_eq = S_o + [SL] + [SL₂] = S_o + K_{1 :1} S_o[L] + K_{1 :1}K_{1 :2}S_o[L]² (3)에 의하여 주어지고,

여기서 So 및 [L]은 각각 free HAL 및 succinoglycan 다이머의 농도를 나타내며, [SL] 및 [SL₂]은 각각 1:1 및 1:2 HAL/다이머 복합체의 농도를 나타낸다. 각 상평형도에 해당하는 실험 데이터의 비선형 회귀는 복합체 형성 상수(Kij )를 평가하기 위항여 수행하였다. 이 분석의 결과는 HAL/dimer 비율이 1:1 및 1:2라는 것을 시사한다.(Martin, E.M. & Valle, D. (2004) Cyclodextrins and their uses: a review, Process Biochemistry, 39(9), 1033-1046)

실시예 3: FT - IR 분광 분석

Fourier-transform 적외선 스펙트럼을 Bruker IFS-66/Sspectrometer (AMX, Germany) 상에서 얻었다. 1.5-2.0 mg의 네 다른 샘플, HAL, 다이머들, 물리적 혼합물 및 HAL/다이머 복합체를 KBr 펠렛과 혼합하였다.

실시예 4: Differential Scanning Calorymetry

succinoglycan 다이머 및 HAL의 물리적 성질을 Differential scanning calorymetry DSC Q200 V24.4 (TA Instruments, USA)에 의하여 측정하였다. 약 5 mg의 HAL, 다이머들, 물리적 혼합물 및 HAL/다이머 복합체를 밀봉된 알루미늄 팬에서 레퍼런스로 빈 밀봉된 팬을 사용하여 30에서 300℃의 온도범위에서 10℃/min의 속도로 가열하였다. indium 스탠다드를 온도 스케일을 보정하기 위하여 사용하였다.

실시예 5: 2D Nuclear Overhauser effect spectroscopy ( NOESY )

2D NMR 분광 분석은 Bruker 500MHz spectrometer (AMX, Germany) 상에서 수행하였다. 그 샘플들을 80% dimethyl sulfoxide-d6 (D, 99.9%) 및 20% deutrated water (D2O, 99.96%)에서 녹였다.

실시예 6: Scanning electron microphotographs ( SEM )

SEM 사진은 JSM-6380 scanning 전자 현미경을 통하여 얻었다. 그 분말들을 사전에 이중면 부착 탄소 테이프를 사용하여 brass stub 상에서 고정하고 진공에서 30 W에서 30초 동안 금 박막을 코팅하여 전기적으로 도체화하였다. 그 사진들을 20 kV의 여기 전압에서 촬영하였다.

실시예 7: 계산방법( Computational Method )

D3 succinoglycan의 원자 수준 구조는 MacroModel software (Schrodinger Inc.)에서 Conformation Search 모듈을 사용하여 구축하였다. D3의 초기 구조는 에너지 최소화하고 형태 검색을 수행하였다. D3에 대한 전체 에너지-최소는 혼합된 torsional/low-모드 샘플링 방법을 사용하여 OPLS2001 force field 로 계산하였다. 그 결과 D3 구조는 추가적으로 더 에너지 최소화이고 그 후 haloperidol 분자에 대한 수용체 구조로 사용되었다.

분자 도킹 시뮬레이션은 프렉시블 모드에서 Maestro 9.2 software (Schrodinger Inc.)를 가지는 Glide module (Friesner et al., 2004)을 사용하여 수행되었다. haloperidol의 시작 구조는 Maestro software의 Builder 모듈을 사용하여 구축하였다. 그 분자 그리드는 각 차원에서 cubic box 30 Å를 가지는 Glide의 Receptor Grid Generation 툴을 사용하여 D3에 대하여 정의하였다. 분자적 도킹은 합리적인 결합 모드와 친화도 데이터를 얻기 위하여 Glide XP 5.0 스코어링 함수를 사용하여 표준 프리시젼 SP모드 하에서 수행하였다. 이 도킹 모드에서, 0.5 kcal/mol 에너지 윈도우 및 거리-의존적인 dielectric 상수(ε= 1)를 그 샘플링 과정에 적용하였다. D3에 대한 haloperidol의 초기 도킹 포즈를 생성하기 위하여, 최대 100,000 poses를 도킹의 초기 phase 동안 유지시키고 1,000 poses를 확장된 샘프링 방법을 사용하여 에너지 최소화하였다. 30 도킹된 poses들을 도킹 과정을 통하여 기록하였다.D3와 haloperidol 사이에 1:2 결합 모델을 서로 steric constraint를 파괴하지 아니하는 2 haloperidol의 결합을 사용하여 구축하였다.

실시예 8: 세포 배양

Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) 세포주를 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 세포들을 10% 열 불활성화된 우태아 혈청(FBS, WelGENE Inc. Daegu, Korea), 1% 항생물질(100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin)이 보충된 최소 필수 배지 Eagle(MEM, WelGENE Inc. Daegu, Korea)에서 5 % CO₂, 37 ℃ 조건의 배양기에 유지시켰다.

실시예 9:세포독성 분석

MTS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2Htetrazolium, inner salt; MTS) 방법을 HEK293 세포(Mosmann, 1983)의 생존률을 결정하는데 사용하였다. HEK293 세포들을 96웰 마이크로타이터 플레이트(Costar, Cambridge, MA, USA)에서 5x10³ 세포/웰 최종 밀도로 시딩하고 5 % CO₂, 37 ℃ 조건의 배양기에 밤새 배양시켰다. 그 배양 세포를 여러 농도(0, 5, 10, 50, 100, 500, 및 1000 μM)의 succinoglycan 다이머를 처리하고 5 % CO₂, 37 ℃ 조건의 배양기에 24시간 배양시켰다. 24 시간 배양 후 세포들을 PBS로 세척하고 20μl MTS (CellTiter 96®AQueous One Solution; Promega, Madison, WI) 용액을 각 웰에 첨가하고 5 % CO₂, 37 ℃ 조건의 배양기에 4시간 배양시켰다. 4시간 배양 후, 96-웰 플레이트 리더(Zenyth 1100; ANTHOS, Austria)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 기록하였다. 세포 생존률을 비처리된 대조군의 퍼센트로 나타내었다. 실험은 3회 수행하였다.

상기 실시예의 결과는 하기와 같다.

Phase solubility 연구

HAL/Dimers (D1, D2, D3 및 D4) 및 Methyl-β-CD의 phase soulubility 다이어그램을 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 모든 다이머 복합체는 AP-타입 곡선을 형성하고, 그것은 더 높은 HAL농도와 더 높은 차수 복합체의 형성을 시사한다.

이 결과들은 HAL이 succinoglycan 다이머와 1:2 복합체를 형성한다는 것을 시사한다. D3의 가용화 효과가 복합체 중에서 가장 크다는 것을 나타낸다(도 2). 복합체의 안정화 상수, K,는 방정식 (3)을 사용하여 계산하고 표 1에 리스트하였다.

FT - IR 분광 분석

D3 (도 3a), HAL (도 3b), 그들의 물리적 혼합물(도 3c), 및 그들의 복합체의 FT-IR 스펙트럼을 도 3d에 나타내었다. HAL의 스펙트럼은 1361, 1220, 1135 및 829 cm.1에서 C-Cl stretching vibration 및 1681에서, C-F, C-N, C-O carbonyl stretching vibration에 대한 독특한 흡수 밴드를 함유하고(도 3a), D3 스펙트럼은 1729 및 1629에서 carbonyl stretching vibration을 포함하였다. 물리적 혼합물의 FT-IR 스펙트럼은 순수한 HAL의 C-Cl 피크와 동일 위치에서 감소된 밀도를 가지는 흡수 피크를 포함하였고 그것은 HAL 및 D3의 첨가로부터 기인하였다. 그러나 특정 흡수 피크는 복합체 산물에서는 사라졌고 이것은 그 약물 환경이 변화되었다는 것을 시사한다. C-Cl의 stretching vibration 피크의 소멸은 복합체에서 강한 분자 상호작용의 존재를 시사하고 이것은 수소 결합의 형성에 기인될 수 있다.

Differential Scanning Calorimetry ( DSC )

다이머, HAL, 물리적 혼합물, 및 복합체의 열 특성을 DSC로 조사하였다(도 5). 150 ℃에서 HAL의 DSC 곡선에서 급격한 흡열 피크가 있고, 이것은 HAL의 녹는점에 해당된다. 대조적으로, 다이머의 DSC 곡선은 각각 220 ℃ 근처에서 흡열 피크를 포함하였다(도 4. a-d). HAL 및 다이어의 물리적 혼합물에서, 150 ℃ 및 220 ℃ 근처의 흡열 피크는 각 HAL 및 다이머에 기인한다. 그러나 HAL/Dimer 복합체의 DSC 곡선에서, 약 150 ℃에서 흡열 피크가 있고, 그것은 free HAL에 해당하고, 사라지고 단지 220 ℃ 근처의 발열 피크만이 존재하였다(도 4. ad). 이 결과들은 HAL가 다이머와 복합체를 형성하였다는 것을 시사한다.

2D Nuclear Overhauser effect spectroscopy ( NOESY ) 분석

a, b, 및 d protons을 가지는 H-2 및 5 및 C protons 을 가지는 H-1, 2, 3, 4의 자신 상관관계뿐 아니라 D3의 f H-4, hH-6 및 aH-6 protons과 HAL의 proton d 사이의 상관관계를 HAL/D3 복합체의 NOESY 스펙트럼에서 관찰하였다(도 5).

Scanning electron microscope ( SEM ) 분석

HAL, D3 및 HAL/D3 복합체의 SEM 사진을 도 6에 나타내었다. HAL의 규칙적인 결정 형태를 많은 여러 크기에서 관찰하였다(도 6a). 또한 D3는 큰 차원을 가지는 불규칙한 형태 결정입자를 나타내었다(도 6b). 그러나 HAL/D3 복합체의 형태는 무정형 입자로 나타나고 HAL 및 D3와 크기와 형태가 전혀 달라서(도 6c), 복합체의 형성을 확인하였다.

계산 분석

도 7은 D3 succinoglycan에 대한 두 haloperidol 분자의 도킹된 포즈의 스냅샷이다. pose-1 및 pose-2에 대한 Glide 도킹 스코어는 각각 -5.474 및 -4.943에 랭크되었다. haloperidol의 각 포즈에 대한 도킹 스코어는 D3 및 haloperidol 사이 복합체에 대한 겉보기 안정화 상수, K1:1 및 K1:2와 상관관계를 나타내었다.

두 haloperidol는 haloperidol-D3 및 haloperidol-haloperidol 모두 사이에 원자적 상호작용을 사용하여 D3의 분자 표면과 결합하였다. 두 haloperidol 분자의 fluorophenyl 및 piperidyl 잔기는 서로 밀접한 접촉을 가진다. haloperidol의 안정한 pose-1 구조는 D3의 f- 및 h-sugar 링과 밀접한 접촉을 만드는 반면 pose-2는 D3의 a-sugar 링과 접촉한다는 것을 나타내었다. 전체적으로, 그 도킹된 형태는 D3와 haloperidol 분자 사이 복합체의 NMR-유래 구조적 특성에 밀접하게 해당된다. D3 및 haloperidol 사이에 1:1 및 1:2 복합체 모두의 형성은 분자 도킹 시뮬레이션으로부터 이론적으로 가능하다는 결론이다.

세포독성 어세이

3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide를 퍼플 formazan으로 환원시키는 살아있는 세포의 선택적 능력에 기초한 발색 MTS 테스트는 세포의 본래 대사 능력에 의존하고 종종 세포독성의 스크리닝에 사용된다(Mosmann, T. (1983).Journal of Immunological Methods, 65, 55-63). 따라서 본 발명자들은 약제 후보물질의 효과를 평가하는 독성 연구에서 통상적으로 사용되는 인간 세포 주 HEK 293을 사용하여 MTS분석에 의하여 succinoglycan 다이머의 세포독성을 조사하였다(Hettiarachchi G., Nguyen D., Wu J, Lucas D., Ma D., Isaacs L. & Briken V. (2010) PLoS ONE, 5(5), e10514). 도 8은 succinoglycan 다이머들에 대한 세포독성 곡선을 보여준다. 생존하는 HEK293 세포들의 퍼센트를 각각 여러 농도의 4 succinoglycan 다이머에 대해서 작도하였다. 비록 D4 다이머에서 세포 생존률이 500 μM 이상의 농도에서 감소하는 경향을 가지지만, 모든 4 succinoglycan 다이머는 1000 μM 이상으로 세포에 처리할 때 유의적인 세포독성을 야기하지 않았고 심지어 포지티브를 나타내었다.

표 1은 HAL과 다이머 복합체의 안정성 상수이다.

Claims (9)

1. 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 할로페리돌의 가용성 증가용 조성물.
   

   

   
   [화학식 1]
   상기 화학식 1에서 R₁,R₂,R₃ 및 R₄는 H 또는 석시네이트(succinate)인 것을 특징으로 함.
2. 삭제
3. 삭제
4. 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 할로페리돌의 안정성 증가용 조성물.
   

   

   
   [화학식 1]
   상기 화학식 1에서 R₁,R₂,R₃ 및 R₄는 H 또는 석시네이트(succinate)인 것을 특징으로 함.
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