KR101386095B1 - Nanoaggregates sensitive to pH and reduction, a process for the preparation thereof, and a pharmaceutical composition for treating malignant tumor comprising the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 소수성 화학요법제가 결합되고 다른 말단에 친수성 항암 유전자가 결합된 복합체인 1 미셀 단위체를 포함하는 미셀 형태의 나노 응집체로서,
상기 소수성 화학 요법제는 환원제의 존재 하에서 분리되는 환원 민감성 링커를 경유하여 상기 생체 적합성 비이온성 고분자에 결합되고,
상기 친수성 항암 유전자는 pH 4 ~ 6에서 분리되는 pH 민감성 링커를 경유하여 상기 생체 적합성 비이온성 고분자에 결합된, 나노 응집체, 그 나노 응집체의 제조방법, 및 그 나노 응집체를 포함하는 악성 종양 치료용 약학 조성물을 제공한다. The present invention relates to a micelle-shaped nano-agglomerate including 1 micelle unit which is a complex in which a hydrophobic chemotherapeutic agent is coupled to one end of a biocompatible nonionic polymer and a hydrophilic anticancer gene is bound to the other end thereof.
The hydrophobic chemotherapeutic agent is bound to the biocompatible nonionic polymer via a reducing sensitive linker which is separated in the presence of a reducing agent,
The hydrophilic anticancer gene is bound to the biocompatible nonionic polymer via a pH-sensitive linker separated at pH 4-6, nano aggregates, a method for producing the nano aggregates, and a pharmaceutical for treating malignant tumors including the nano aggregates To provide a composition.

Description

산도 및 환원 민감성 나노 응집체, 그 나노 응집체의 제조방법, 및 그 나노 응집체를 포함하는 악성 종양 치료용 약학 조성물{Nanoaggregates sensitive to pH and reduction, a process for the preparation thereof, and a pharmaceutical composition for treating malignant tumor comprising the same} Nanoaggregates sensitive to pH and reduction, a process for the preparation, and a pharmaceutical composition for treating malignant tumors configuring the same}

본 발명은 항암제 전달 자가-조립 나노 응집체, 그 나노 응집체의 제조방법, 및 그 나노 응집체를 포함하는 악성 종양 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 화학요법제 및 항암 유전자를 동시에 투여할 수 있으면서, 화학요법제를 고효율로 투여할 수 있고, 약물 캐리어에 의한 부작용의 우려가 없는 pH 및 환원 민감성 나노 응집체, 그 나노 응집체의 제조방법, 및 그 나노 응집체를 포함하는 악성 종양 치료용 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to anticancer drug delivery self-assembled nano-aggregates, methods for preparing the nano-aggregates, and pharmaceutical compositions for treating malignant tumors comprising the nano-aggregates, and more specifically, chemotherapeutic agents and anti-cancer genes can be administered simultaneously. The present invention relates to a composition for treating malignant tumors, wherein the chemotherapeutic agent can be administered with high efficiency and has no fear of side effects due to drug carriers, and a method for producing the nano-aggregates, and methods for producing the nano-aggregates. will be.

항암제 전달 자가-조립 나노 응집체(self-assembled nanoaggregates)는 약물의 전달, 유전자의 전달 및 종양 세포에 약물 표적화 등을 위하여 현재 활발히 연구되고 있다. 이러한 자가-조립 나노 응집체 중 유전자의 전달로 종양 세포의 유전자 치료를 위한 나노 응집체는 양이온성 고분자와 유전자의 정전기적 결합 (electronic conjugation)을 이용하여 이루어진 것이다. 그러나, 정전기적 결합을 이용한 나노 응집체는 체내 축적에 따른 세포독성 (cytotoxicity)이 높고(비특허문헌 1) 나노 응집체 자체가 혈액 내의 혈청 단백질과의 응집 확률이 높아 전달체로서의 기능을 잘 수행하지 못하는 문제점이 있다(비특허문헌 2). 또한, 항암제나 유전자가 나노 응집체로부터 방출이 되고 난 후에 약물 전달체로서 사용된 나노 응집체가 사라지지 않고 잔존하여 또 다른 부작용을 나타낼 수 있다는 문제점이 있다.Anticancer drug delivery self-assembled nanoaggregates are currently being actively studied for drug delivery, gene delivery and drug targeting to tumor cells. The transfer of genes in such self-assembled nano-aggregates results in nano-aggregates for gene therapy of tumor cells using electronic conjugation of cationic polymers and genes. However, nano-aggregates using electrostatic bonds have high cytotoxicity due to accumulation in the body (Non-Patent Document 1), and nano-aggregates themselves have a high probability of aggregation with serum proteins in blood, and thus do not function well as carriers. There is (nonpatent literature 2). In addition, after the anticancer agent or gene is released from the nano-aggregates, there is a problem that the nano-aggregates used as drug carriers do not disappear and may have other side effects.

악성 종양의 치료는 화학 요법제 단독으로 치료할 경우, 내성이 발생하기 쉽기 때문에, 화학요법제를 복합투여하거나 항암 유전자와 같은 다른종류의 항암제와 함께 병용투여하기도 한다. 따라서, 화학요법제 및 항암 유전자를 모두 전달할 수 있는 악성 종양 치료용 약물 전달체가 요구되고 있다. 또한, 이러한 경우 화학요법제가 항암 유전자에 비해 투여 몰수가 더 높을 필요가 있으므로, 화학요법제를 항암 유전자에 비해 더 많이 전달할 수 있는 약물 전달체를 개발할 필요가 있다. Since the treatment of malignant tumors is easy to develop when treated with chemotherapy alone, chemotherapy may be combined or combined with other anticancer agents such as anticancer genes. Accordingly, there is a need for drug carriers for treating malignant tumors that can deliver both chemotherapeutic agents and anticancer genes. In addition, in this case, since the chemotherapeutic agent needs to have a higher molar number than the anticancer gene, it is necessary to develop a drug carrier that can deliver more chemotherapeutic agent than the anticancer gene.

또한, 나노응집체가 표적으로 하는 암세포 부위에서 약물을 방출하고, 부작용을 유발할 수 있는 혈중에서는 약물을 방출하지 않기 위해서는 세포내 이입(endocytosis) 시 약물을 방출하면서 혈중에서는 나노 응집체로부터 약물의 방출이 이루지지 않는 것이 중요하다. In addition, in order to release the drug in the cancer cell site targeted by the nano-aggregate, and not to release the drug in the blood which may cause side effects, the drug is released from the nano-aggregates in the blood while releasing the drug during endocytosis. It is important not to lose.

1. Dagmar Fischer et al., Biomaterials 24, (2003) 1121??1131, Dagmar Fischer et al., Biomaterials 24, (2003) 1121 ?? 1131, 2. VS Trubetskoy et al., Gene Therapy 10, (2003) 261??271VS Trubetskoy et al., Gene Therapy 10, (2003) 261 ?? 271

본 발명의 목적은 약물 전달 후 분해되어 나노 응집체가 체내에 축적되지 않아 약물 전달체에 의한 독성의 우려가 없고, 화학 요법제 및 항암 유전자를 동시에 전달할 수 있으면서 화학요법제의 전달효율을 증가시킬 수 있고, 혈중에서는 약물을 방출하지 않고 세포내 이입 시 비로소 약물을 방출할 수 있는 나노 응집체를 제공하는 것이다. It is an object of the present invention that there is no fear of toxicity caused by drug carriers because the nano aggregates do not accumulate after drug delivery and accumulate in the body, and can simultaneously deliver chemotherapeutic agents and anticancer genes and increase the delivery efficiency of chemotherapeutic agents. In addition, the present invention provides a nano-aggregate capable of releasing drugs at the time of endocytosis without releasing drugs in the blood.

본 발명의 다른 목적은 상기 나노 응집체의 제조방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing the nano-aggregate.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 나노 응집체를 포함하는 악성 종양 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다. Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating malignant tumors including the nano-aggregates.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은 In order to achieve the above object, one aspect of the present invention is

생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 소수성 항암제가 결합되고 다른 말단에 친수성 항암 유전자가 결합된 복합체인 1 미셀 단위체를 포함하는 미셀 형태의 나노 응집체로서, As a micelle-shaped nano-agglomerate including 1 micelle unit which is a complex in which a hydrophobic anticancer agent is coupled to one end of the biocompatible nonionic polymer and a hydrophilic anticancer gene is bound to the other end,

상기 소수성 화학 요법제는 환원제의 존재 하에서 분리되는 환원 민감성 링커를 경유하여 상기 생체 적합성 비이온성 고분자에 결합되고, The hydrophobic chemotherapeutic agent is bound to the biocompatible nonionic polymer via a reducing sensitive linker which is separated in the presence of a reducing agent,

상기 친수성 항암 유전자는 pH 4 ~ 6에서 분리되는 pH 민감성 링커를 경유하여 상기 생체 적합성 비이온성 고분자에 결합된, 나노 응집체를 제공한다.The hydrophilic anticancer gene provides a nano aggregate, bound to the biocompatible nonionic polymer via a pH sensitive linker separated at pH 4-6.

본 발명의 다른 일 측면은 In another aspect of the present invention,

생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 환원 민감성 링커를 경유하여 소수성 항암제를 결합시키는 단계;Binding a hydrophobic anticancer agent to one end of the biocompatible nonionic polymer via a reduction sensitive linker;

생체 적합성 비이온성 고분자의 다른 말단에 pH 민감성 링커를 경유하여 친수성 항암 유전자를 결합시키는 단계; 및Binding a hydrophilic anticancer gene to the other end of the biocompatible nonionic polymer via a pH sensitive linker; And

생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 친수성 항암 유전자가 결합되고 다른 말단에 소수성 항암제가 결합된 복합체를 수중에서 분산시켜 자가조립시키는 단계를 포함하는, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체의 제조방법을 제공한다. Method for producing a nano-aggregate according to one aspect of the present invention, comprising the step of dispersing the self-assembled complex in which a hydrophilic anticancer gene is coupled to one end of the biocompatible nonionic polymer and a hydrophobic anticancer agent to the other end in water To provide.

본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 본 발명에 따른 나노 응집체를 포함하는 악성 종양 치료용 약학 조성물을 제공한다. Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for treating malignancies comprising the nano-aggregates according to the present invention.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 전체가 참고로 통합된다. All technical terms used in the present invention are used in the sense that they are generally understood by those of ordinary skill in the relevant field of the present invention unless otherwise defined. Also, preferred methods or samples are described in this specification, but similar or equivalent ones are also included in the scope of the present invention. The contents of all publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

본 발명자들은 항암 유전자 전달에 사용되는 종래의 나노 응집체의 부작용의 우려를 극복하기 위해, 비이온성 물질을 이용한 나노 응집체의 개발을 연구하였으며, 또한 약물 전달후 분해되어 체내에 축적되지 않는 나노 응집체에 대해 연구하였다. 또한, 화학 요법제 및 항암 유전자를 동시에 전달할 수 있으면서 화학요법제의 전달효율을 증가시킬 수 있고, 혈중에서는 약물을 방출하지 않고 세포내 이입 시 비로소 약물을 방출할 수 있는 나노 응집체에 대해 연구하였다. 그 결과, 생체 적합성의 비이온성 고분자의 일 측면에 소수성 화학 요법제를 환원제 민감성 링커에 의해 연결하고, 다른 말단에 친수성 항암 유전자를 pH 민감성 링커에 연결하여 복합체를 형성하면 미셀을 형성할 수 있는 단위체가 제조될 수 있으며, 이러한 미셀 단위체를 이용하여 수중에서 자가 조립에 의해 나노 응집체를 형성시킬 수 있게 되었다. 이와 같이 개발된 나노 응집체에서는 세포 내의 글루타치온 환원제 존재 하에서는 환원 민감성 링커의 분리에 의해 화학요법제가 분리되어 화학요법제가 방출되고 나노 응집체의 분해가 일어나며, 세포 내의 낮은 pH 환경, 즉 리소짐, 엔도솜 등에서는 pH 민감성 링커의 분리에 의해 항암 유전자가 분리되어 항암 유전자가 방출 될 수 있는 것으로 나타났다. The present inventors have studied the development of nano-aggregates using non-ionic substances to overcome the concern of the side effects of conventional nano-aggregates used for anti-cancer gene delivery, and also for nano-aggregates that do not degrade and accumulate in the body after drug delivery. Studied. In addition, nano-aggregates that can simultaneously deliver chemotherapeutic and anti-cancer genes can increase the delivery efficiency of chemotherapeutic agents, and can release drugs during intracellular transfer without releasing drugs in the blood. As a result, a monomer capable of forming micelles by connecting a hydrophobic chemotherapeutic agent to one side of a biocompatible nonionic polymer by a reducing agent-sensitive linker, and connecting a hydrophilic anticancer gene to a pH-sensitive linker at the other end to form a complex It can be prepared, it is possible to use this micelle unit to form nano-aggregates by self-assembly in water. In the nano-aggregates thus developed, in the presence of glutathione-reducing agents in cells, chemotherapy agents are separated by separation of reduction-sensitive linkers, chemotherapeutic agents are released, and nano-aggregates are degraded, and in low pH environments such as lysozyme and endosome, etc. It has been shown that the anticancer genes can be released by the separation of the pH sensitive linker to release the anticancer genes.

따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서, Accordingly, in one aspect of the present invention,

생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 소수성 항암제가 결합되고 다른 말단에 친수성 항암 유전자가 결합된 복합체인 1 미셀 단위체를 포함하는 미셀 형태의 나노 응집체로서, As a micelle-shaped nano-agglomerate including 1 micelle unit which is a complex in which a hydrophobic anticancer agent is coupled to one end of the biocompatible nonionic polymer and a hydrophilic anticancer gene is bound to the other end,

상기 소수성 화학 요법제는 환원제의 존재 하에서 분리되는 환원 민감성 링커를 경유하여 상기 생체 적합성 비이온성 고분자에 결합되고, The hydrophobic chemotherapeutic agent is bound to the biocompatible nonionic polymer via a reducing sensitive linker which is separated in the presence of a reducing agent,

상기 친수성 항암 유전자는 pH 4 ~ 6에서 분리되는 pH 민감성 링커를 경유하여 상기 생체 적합성 비이온성 고분자에 결합된, 나노 응집체를 제공한다.The hydrophilic anticancer gene provides a nano aggregate, bound to the biocompatible nonionic polymer via a pH sensitive linker separated at pH 4-6.

본 명세서에서 "생체 적합성 비이온성 고분자"란 산도(pH)의 변화에 의해 이온화되지 않으면서 생체에 독성을 부여하지 않는 임의의 고분자를 의미한다. 상기 생체 적합성 비이온성 고분자로는 생체에 안전한 것으로 공지되어 있는 임의의 비이온성 고분자가 이용될 수 있으며, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 폴리락틱코글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide), 플루로닉(pluronic), 폴리에틸렌옥사이드(poly(ethylene oxide), 폴리프로필렌옥사이드(poly(propylene oxide), 엔-옥틸트리에틸렌글라이콜에테르(n-octyltriethylene glycol ether, C8E3) 및 이들의 유도체로 구성된 그룹에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.As used herein, "biocompatible nonionic polymer" means any polymer that does not become toxic to a living body without being ionized by a change in pH (pH). As the biocompatible nonionic polymer, any nonionic polymer known to be safe for the living body may be used. For example, polyethyleneglycol (PEG), polylacticcoglycolic acid (poly (lactic-co-glycolic) acid, PLGA), polyacrylamide, pluronic, poly (ethylene oxide), polypropylene oxide, en-octyltriethylene glycol ether ( n-octyltriethylene glycol ether, C 8 E 3 ) and derivatives thereof may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.

본 명세서에서 "소수성 화학요법제"는 유수분배계수가 5 이상인 임의의 악성 종양 치료용 화학요법제를 의미한다. 상기 소수성 화학요법제는 예를 들어 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 아지트로마이신(azithromycin), 에리트로마이신(erythromycin), 빈블라스틴(vinblastin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantron), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin), 또는 이들의 조합 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.As used herein, "hydrophobic chemotherapeutic agent" means a chemotherapeutic agent for the treatment of any malignant tumor with a distribution factor of 5 or greater. The hydrophobic chemotherapeutic agent is for example doxorubicin, paclitaxel, azithromycin, erythromycin, erythromycin, vinblastin, bleomycin, dactinomycin ), Daunorubicin, daidarubicin, idarubicin, mitoxantron, plicamycin, plicamycin, mitomycin, or combinations thereof, and the like, but are not limited thereto.

본 명세서에서 "친수성 항암 유전자"는 항암 효과가 있는 임의의 유전자를 의미하며, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 플라스미드디엔에이 (pDNA) 등의 형태일 수 있다. 상기 친수성 항암 유전자는 예를 들어 안티센스 안티-에이팝토틱 유전자일 수 있으며, 상기 안티센스 안티-에이팝토틱 유전자로는 안티센스 Bcl-2, 안티센스 Bcl-XL, 안티센스 Mcl-1, 안티센스 CED-9, 안티센스 A1, 또는 안티센스 Bfl-1 등이 있으나(Daniel E. Lopes de Menezes et al., Clin Cancer Res 6, (2000) 2891-2902; Olga B. Garbuzenko et al., PNAS 107, (2010) 10737-70742) 이에 한정되는 것은 아니다. As used herein, "hydrophilic anticancer gene" means any gene having an anticancer effect, and may be in the form of an oligonucleotide, siRNA, plasmid diene (pDNA), or the like. The hydrophilic anticancer gene may be, for example, an antisense anti-apoptotic gene, and the antisense anti-apoptotic gene may include antisense Bcl-2, antisense Bcl-XL, antisense Mcl-1, antisense CED-9, antisense A1, or antisense Bfl-1 (Daniel E. Lopes de Menezes et al., Clin Cancer Res 6, (2000) 2891-2902; Olga B. Garbuzenko et al., PNAS 107, (2010) 10737-70742 ) It is not limited thereto.

본 명세서에서 "환원 민감성 링커"란 환원제의 존재 하에서 결합이 분리되는 링커를 의미한다. 세포 내의 세포질 내에는 환원제로서 역할하는 글루타치온이 존재하는 것으로 알려져 있으므로, 상기 환원 민감성 링커는 세포내 유입 시 세포질에서 분리되어 소수성 화학요법제가 분리될 수 있다. 상기 환원 민감성 링커는 예를 들어 디설파이드를 포함하는 링커 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. As used herein, "reduction sensitive linker" means a linker in which a bond is separated in the presence of a reducing agent. Since glutathione is known to exist as a reducing agent in the cytoplasm in the cell, the reduction-sensitive linker may be separated from the cytoplasm upon entry into the cell, thereby separating the hydrophobic chemotherapeutic agent. The reduction sensitive linker includes, for example, a linker including a disulfide, but is not limited thereto.

본 명세서에서 "pH 민감성 링커"란 pH의 환경에 따라 결합이 분리되는 링커를 의미하며, 상기 pH 4 ~ 6에서 분리되는 pH 민감성 링커는 pH 4 ~ 6의 조건에서 분리되는 임의의 링커를 의미한다. 세포 내의 리소좀, 엔도솜 내의 pH는 4 ~ 6인 것으로 알려져 있으므로, 상기 pH 민감성 링커는 세포내 유입 시 엔도솜, 리소좀에서 분리되어 친수성 항암 유전자가 분리될 수 있다. 상기 pH 4 ~ 6에서 분리되는 pH 민감성 링커는 예를 들어 히드라존, 포스포라미다이트, 시스아코니틸본드(cis-aconityl bond), pH 민감 이민 본드(pH-sensitive imine bond), pH 민감 C-ON 본드(pH-sensitive C-ON bond), 또는 아세탈 본드(acetal bond)를 포함하는 링커 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. As used herein, the term "pH sensitive linker" refers to a linker in which a bond is separated according to the environment of pH, and the pH sensitive linker to be separated at pH 4 to 6 means any linker that is separated under the conditions of pH 4 to 6. . Since the pH in the lysosomes and endosomes in the cells is 4 to 6, the pH-sensitive linker may be separated from the endosomes and lysosomes when the cell is introduced into the cell, thereby separating the hydrophilic anticancer genes. The pH sensitive linker to be separated at pH 4 to 6 is, for example, hydrazone, phosphoramidite, cis-aconityl bond, pH-sensitive imine bond, pH-sensitive C And a linker including a -ON bond (pH-sensitive C-ON bond) or an acetal bond, but is not limited thereto.

상기 1 미셀 단위체인 복합체는 복합체 중의 상기 소수성 화학요법제의 상기 친수성 항암 유전자에 대한 몰비가 1 내지 13일 수 있다. 화학요법제가 항암 유전자에 비해 투여 몰수가 더 높을 필요가 있으므로, 화학요법제를 항암 유전자에 비해 더 많이 전달하는 효과가 있는 약물 전달체를 개발할 필요가 있다. 따라서, 상기 복합체 중의 상기 소수성 항암제의 친수성 항암 유전자에 대한 몰비를 높게 함으로써, 상기 효과를 발생시킬 수 있다. 복합체 중의 상기 소수성 화학요법제의 상기 친수성 항암 유전자에 대한 몰비를 높이기 위해서는, 상기 복합체 중의 소수성 화학요법제와 결합하는 환원 민감성 링커의 결합부위를 늘리는 것이 바람직하다. 이를 위해서, 상기 생체 적합성 비이온성 고분자를 4-암-폴리에틸렌글리콜(4-arm-PEG)과 같은 분지형의 생체 적합성 고분자를 사용하고, 각각의 분지에 화학요법제와의 결합하는 환원 민감성 링커를 결합시킴으로써 가능하게 할 수 있다.The 1 micelle unit complex may have a molar ratio of the hydrophobic chemotherapeutic agent to the hydrophilic anticancer gene in the complex of 1 to 13. Since chemotherapeutic agents need to have higher moles of administration than anticancer genes, there is a need to develop drug carriers that are effective in delivering more chemotherapeutic agents than anticancer genes. Therefore, the above effect can be generated by increasing the molar ratio of the hydrophobic anticancer agent in the complex to the hydrophilic anticancer gene. In order to increase the molar ratio of the hydrophobic chemotherapeutic agent to the hydrophilic anticancer gene in the complex, it is preferable to increase the binding site of the reduction-sensitive linker that binds to the hydrophobic chemotherapeutic agent in the complex. To this end, a branched biocompatible polymer such as 4-arm-polyethylene glycol (4-arm-PEG) is used as the biocompatible nonionic polymer, and a reduction sensitive linker which binds to a chemotherapeutic agent to each branch is used. It can be made possible by combining.

본 발명의 일 구현예에 따른 나노 응집체는 하기 화학식 I의 복합체를 1 미셀 단위체로서 이용하여 형성될 수 있다:Nano aggregates according to one embodiment of the present invention may be formed using a complex of formula I as one micelle unit:

[화학식 1][Chemical Formula 1]

Figure 112012016814085-pat00001
Figure 112012016814085-pat00001

상기 화학식 1에서, 상기 PEG의 분자량은 5,000 ~ 20,000 일 수 있고, 상기 멀티-암-PEG는 2,000 ~ 20,000 일 수 있다.In Chemical Formula 1, the molecular weight of PEG may be 5,000 to 20,000, and the multi-arm-PEG may be 2,000 to 20,000.

상기 멀티-암-PEG(poly-arm-PEG)는 4 개 이상의 분지를 갖는 폴리에틸렌글리콜로서, 각각의 분지에 디설피드 링커를 결합시키고 그 링커를 경유하여 소수성 화학요법제를 결합시킴으로써 복합체 중의 화학요법제의 함량을 증가시킬 수 있으며, 친수성 항암 유전자에 대한 소수성 화학요법제의 몰비를 증가시킬 수 있다. 상기 멀티-암-PEG는 분지가 4-13개일 수 있으며, 이러한 멀티-암-PEG는 당해 기술분야에 공지된 기술에 기초하여 당업자가 적절히 합성할 수도 있고, 시중에 판매되고 있는 4-암-PEG-티올, 6-암-PEG-티올, 또는 8-암-PEG-티올(4, 6, 8-arm-PEG-Thiol, Creative PEGWorks, USA) 등를 구입하여 상기 화학식 1의 호합물의 제조에 사용할 수도 있다. The poly-arm-PEG (poly-arm-PEG) is a polyethylene glycol having four or more branches, chemotherapy in the complex by binding a disulfide linker to each branch and a hydrophobic chemotherapeutic agent via the linker The content of the agent may be increased, and the molar ratio of the hydrophobic chemotherapeutic agent to the hydrophilic anticancer gene may be increased. The multi-arm-PEG may have 4-13 branches, and such multi-arm-PEG may be appropriately synthesized by a person skilled in the art based on techniques known in the art, and commercially available 4-arm- PEG-thiol, 6-arm-PEG-thiol, or 8-arm-PEG-thiol (4, 6, 8-arm-PEG-Thiol, Creative PEGWorks, USA) and the like can be purchased and used for the preparation of the compound of Formula 1 It may be.

상기 화학식 1에서 소수성 화학요법제는 유수분배계수가 5 이상인 임의의 악성 종양 치료용 화학요법제이며, 예를 들어 독소루비신, 파클리탁셀 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 독소루비신이다. In Formula 1, the hydrophobic chemotherapeutic agent is a chemotherapeutic agent for treating malignant tumors having a distribution coefficient of 5 or more, for example, doxorubicin, paclitaxel, and the like, but are not limited thereto. Most preferably doxorubicin.

상기 화학식 1에서 친수성 항암 유전자는 항암 효과가 있는 임의의 유전자를 의미하며, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 플라스미드디엔에이 (pDNA) 등의 형태일 수 있다. 상기 친수성 항암 유전자는 예를 들어 안티센스 안티-에이팝토틱 유전자일 수 있으며, 상기 안티센스 안티-에이팝토틱 유전자로는 안티센스 Bcl-2, 안티센스 Bcl-XL, 안티센스 Mcl-1, 안티센스 CED-9, 안티센스 A1, 또는 안티센스 Bfl-1 등이 있으나(Daniel E. Lopes de Menezes et al., Clin Cancer Res 6, (2000) 2891-2902; Olga B. Garbuzenko et al., PNAS 107, (2010) 10737-70742), 이에 한정되는 것은 아니다. Hydrophilic anticancer gene in the formula (1) means any gene having an anticancer effect, it may be in the form of oligonucleotides, siRNA, plasmid die (pDNA) and the like. The hydrophilic anticancer gene may be, for example, an antisense anti-apoptotic gene, and the antisense anti-apoptotic gene may include antisense Bcl-2, antisense Bcl-XL, antisense Mcl-1, antisense CED-9, antisense A1, or antisense Bfl-1 (Daniel E. Lopes de Menezes et al., Clin Cancer Res 6, (2000) 2891-2902; Olga B. Garbuzenko et al., PNAS 107, (2010) 10737-70742 ), But is not limited thereto.

상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체는 나노입자의 EPR(Enhanced Permeability and Retention effect) 효과에 의한 암세포로의 타겟팅에 사용될 수 있는 크기를 가질 수 있으며, 예를 들어 직경이 약 10 내지 500 nm일 수 있고, 바람직하게는 직경이 약 50 내지 400 nm, 더 바람직하게는 약 100 내지 300 nm 일 수 있다. Nano aggregate according to an aspect of the present invention may have a size that can be used for targeting to cancer cells by the enhanced permeability and retention effect (EPR) effect of the nanoparticles, for example about 10 to 500 nm in diameter And preferably about 50 to 400 nm in diameter, more preferably about 100 to 300 nm in diameter.

상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체는 상기 복합체의 소수성 화학요법제 부분이 응집체의 중심(core)을 향하고 친수성 항암 유전자 부분이 외곽(shell)을 향하는 미셀 형태를 띤다. The nano-aggregate according to the aspect of the present invention has a micelle form in which the hydrophobic chemotherapeutic portion of the complex faces the core of the aggregate and the hydrophilic anti-cancer gene portion faces the shell.

본 발명은 다른 측면에 있어서, In another aspect of the present invention,

생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 환원 민감성 링커를 경유하여 소수성 화학요법제를 결합시키는 단계;Binding a hydrophobic chemotherapeutic agent to one end of the biocompatible nonionic polymer via a reduction sensitive linker;

생체 적합성 비이온성 고분자의 다른 말단에 pH 민감성 링커를 경유하여 친수성 항암 유전자를 결합시키는 단계; 및Binding a hydrophilic anticancer gene to the other end of the biocompatible nonionic polymer via a pH sensitive linker; And

생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 친수성 항암 유전자가 결합되고 다른 말단에 소수성 화학요법제가 결합된 복합체를 수중에서 분산시켜 자가조립시키는 단계를 포함하는, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체의 제조방법을 제공한다. Preparation of the nano-aggregate according to one aspect of the present invention, comprising the step of dispersing in water and self-assembling the complex in which the hydrophilic anticancer gene is coupled to one end of the biocompatible nonionic polymer and the hydrophobic chemotherapeutic agent to the other end Provide a method.

상기 제조방법에서의 생체 적합성 비이온성 고분자, 소수성 화학요법제, 친수성 항암 유전자, 환원 민감성 링커, 및 pH 민감성 링커는 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체에 대한 설명이 그대로 적용된다.The biocompatible nonionic polymer, the hydrophobic chemotherapeutic agent, the hydrophilic anticancer gene, the reduction sensitive linker, and the pH sensitive linker in the preparation method are applied to the description of the nano aggregate according to the aspect of the present invention.

상기 생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 환원 민감성 링커를 경유하여 소수성 화학요법제를 결합시키는 것은 구체적으로 사용되는 고분자의 화학구조, 환원 민감성 링커의 화학 구조 및 소수성 화학요법제의 화학 구조에 기초하여 유기 화학분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 반응 조건을 선택함으로써 수행할 수 있다.Coupling the hydrophobic chemotherapeutic agent to one end of the biocompatible nonionic polymer via a reduction sensitive linker is based on the chemical structure of the polymer used, the chemical structure of the reducing sensitive linker, and the chemical structure of the hydrophobic chemotherapeutic agent. One of ordinary skill in the art of organic chemistry can be carried out by appropriately selecting the reaction conditions.

상기 생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 pH 민감성 링커를 경유하여 친수성 항암 유전자를 결합시키는 것은 구체적으로 사용되는 고분자의 화학구조, pH 민감성 링커의 화학 구조 및 친수성 항암 유전자의 화학 구조에 기초하여 유기 화학분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 반응 조건을 선택함으로써 수행할 수 있다.Coupling the hydrophilic anticancer gene to the one end of the biocompatible nonionic polymer via a pH sensitive linker is an organic chemistry based on the chemical structure of the polymer used specifically, the chemical structure of the pH sensitive linker and the chemical structure of the hydrophilic anticancer gene It can be carried out by those skilled in the art by appropriately selecting the reaction conditions.

상기 복합체를 수중에서 분산시켜 자가조립시키기 위해서는, 상기 복합체를 임의의 용매에 용해시킨 후 수중에 분산시킴으로써 자가응집에 의해 나노 응집체를 형성시킬 수 있다. 상기 용매로는 아세톤, 메탄올(methanol), 클로로포름(chloroform), 에테르(ether), 에탄올(ethanol), 또는 니클로로메탄(dichloromethane) 등이 이용될 수 있으며, 상기 복합체를 용해시키고 휘발성이 있기만 하면 특별히 한정되는 것은 아니다. In order to disperse the complex in water and self-assemble, the nano-aggregate may be formed by self-aggregation by dissolving the complex in an arbitrary solvent and then dispersing it in water. As the solvent, acetone, methanol, chloroform, ether, ethanol, or dichloromethane may be used. The solvent may be dissolved as long as the complex is dissolved and volatile. It is not limited.

생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 소수성 화학요법제가 결합되고 다른 말단에 친수성 항암 유전자가 결합된 복합체는 하나의 분자에 친수성 작용기 및 소수성 작용기를 모두 가져 양쪽성을 띄게 되므로, 수중에서 미셀을 형성하는 1 미셀 단위체로서 작용할 수 있다. 따라서, 수중에서 상기 복합체를 임계응집농도(critical aggregation concentration, CAC) 이상으로 분산시키는 것만으로 미셀 형태의 나노 응집체가 형성될 수 있다. 상기 복합체의 CMC는 복합체가 어떤 화학구조를 가지느냐에 따라 달라질 수 있으며, 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 적절히 결정할 수 있다. 상기 제조방법의 일 구현예에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 일 실시예가 수중에서 자기-조립(self-assembled)에 의해 나노 응집체를 형성하는 원리를 도 1에 나타내었다. The complex in which a hydrophobic chemotherapeutic agent is coupled to one end of the biocompatible nonionic polymer and a hydrophilic anticancer gene is bound to the other end has both hydrophilic and hydrophobic functional groups in one molecule, thus exhibiting amphoteric properties, thus forming micelles in water. It can act as one micelle unit. Therefore, micelle-shaped nano-aggregates may be formed only by dispersing the complex above a critical aggregation concentration (CAC) in water. The CMC of the complex may vary depending on what chemical structure the complex has, and may be appropriately determined according to methods known in the art. One embodiment of the compound of Formula 1 according to one embodiment of the preparation method is shown in Figure 1 the principle of forming nano-aggregates by self-assembled in water (self-assembled).

도 1은 화학식 1의 화합물의 일 실시예가 수중에서 자가-조립(self-assembled)에 의해 나노 응집체를 형성하는 원리를 도식적으로 나타낸 것이다. FIG. 1 schematically illustrates the principle of one embodiment of a compound of Formula 1 forming nano-agglomerates by self-assembly in water.

상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체는 생체의 세포 내에서 도 2에 나타낸 바와 같이 작용할 수 있다. Nano aggregates according to an aspect of the present invention may act as shown in Figure 2 in the cells of the living body.

도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 나노 응집체에 함유되어 있는 화학요법제 및 항암 유전자가 생체의 세포 내에서 작용하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다. Figure 2 schematically shows the process of the chemotherapeutic agent and the anti-cancer gene contained in the nano-aggregates according to an embodiment of the present invention to act in the cells of the living body.

도 2에 따르면, pH 5와 같은 낮은 pH 환경 하에서는 pH 민감성 링커가 분리되어 pH 민감성 링커에 결합된 친수성 항암 유전자가 분리되고, 환원 조건 하에서는 환원 민감성 링커에 결합된 소수성 화학요법제가 분리되어 상기 항암 유전자 및 화학요법제가 세포 내에서 유리되어 항암 효과를 발휘할 수 있다. According to Figure 2, in a low pH environment, such as pH 5, the pH-sensitive linker is separated to separate the hydrophilic anti-cancer genes bound to the pH-sensitive linker, the hydrophobic chemotherapeutic agent bound to the reduction-sensitive linker is isolated under reducing conditions to the anti-cancer gene And chemotherapeutic agents may be liberated in cells to exert anticancer effects.

상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체에 대해 pH 8.0 조건에서, pH 8.0 및 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT) 존재 하에서, 그리고 pH 5.0 조건 하에서, 나노 응집체의 크기를 측정하였다. 그 결과, pH 8.0 조건에서는 나노 응집체의 입자크기 변화가 거의 없었으며, pH 8.0 및 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT) 존재 하에서는 시간의 경과에 따라 입자크기가 급격히 증가하다가 약 24 시간 후에는 입자 크기가 0인 것으로 나타나 나노 응집체가 붕괴된 것을 확인할 수 있다. 그리고 pH 5.0 조건 하에서는 시간의 경과에 따라 입자의 크기가 감소하기만 하였으며, 입자가 소실되지는 않는 것으로 나타났다(도 8). 또한, 상기 각각의 조건 하에서 약 24시간 뒤 HPLC를 이용하여, 용출된 약물의 존재를 확인하였다. 그 결과, pH 8.0 및 DTT 존재 하에서는 소수성 화학용법제가 용출되고, pH 5.0 하에서는 친수성 항암 유전자가 용출되는 것으로 확인되었다(도 10). 또한, 상기 나노 응집체에 대해, 약물의 암세포로의 전달을 확인하는 시험을 수행하였으며, 공촛점 레이저 현미경으로 세포 내로의 분포를 확인한 결과 항암 유전자 및 화학요법제가 암세포 내에 존재하는 것으로 확인되었다(도 9). 또한, 상기 나노 응집체에 대해 실제로 암세포에 대해 투여 후 DTT를 부가하여 세포독성 시험을 수행한 결과, 해당 화학요법제 유리약물에 비해 세포독성 효과가 현저히 높은 것으로 나타났다(도 12).For the nano aggregates according to the aspect of the present invention, the size of the nano aggregates was measured under pH 8.0 conditions, in the presence of pH 8.0 and dithiothreitol (DTT), and under pH 5.0 conditions. As a result, the particle size of the nano-agglomerates showed little change under the pH 8.0 conditions, and in the presence of pH 8.0 and dithiothreitol (DTT), the particle size rapidly increased with time, and after about 24 hours Appears to be 0 to confirm that the nano-aggregates collapsed. And under pH 5.0 conditions, the size of the particles only decreased with time, and the particles were not lost (FIG. 8). Also, after about 24 hours under each of the above conditions, HPLC was used to confirm the presence of the eluted drug. As a result, it was confirmed that the hydrophobic chemotherapy agent was eluted in the presence of pH 8.0 and DTT, and the hydrophilic anticancer gene was eluted at pH 5.0 (FIG. 10). In addition, the nano-aggregates were tested to confirm the delivery of the drug to the cancer cells, and the distribution into the cells was confirmed by confocal laser microscopy, and it was confirmed that anti-cancer genes and chemotherapeutic agents exist in the cancer cells (FIG. 9). ). In addition, as a result of performing a cytotoxicity test by adding DTT to the nano-aggregates after actually administering the cancer cells, the cytotoxic effect was significantly higher than that of the chemotherapeutic free drug (FIG. 12).

이러한 결과에 따르면, pH 7.2인 생체의 혈중에서는 본 발명에 따른 나노 응집체가 안정적으로 존재하지만, pH 5.0의 세포내 리소좀, 엔도좀 등의 낮은 pH 조건 하에서는 나노 응집체로부터 외곽에 존재하는 수용성 항암 유전자가 분리되며, 글루타치온과 동일한 정도의 환원작용을 하는 것으로 알려진 DTT의 존재 하에서는 나노 응집체의 코어에 존재하는 소수성 화학요법제가 환원 민감성 링커의 분리에 의해 분리되고 미셀 형태가 파괴되어 나노 응집체의 형태가 붕괴된다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체는 세포 내에 유입되어 세포 내의 pH 조건 및 환원 조건 하에서 안정적으로 항암 유전자 및 화학요법제의 약효를 발휘한다는 것을 알 수 있다. 따라서, 나노 응집체의 나노입자 특성으로 인한 EPR 효과, 및 상기 혈중에서의 안정성과 세포 내에서의 안정적인 약물 방출 효과로 인해, 상기 나노 응집체는 화학요법제를 암세포에 타겟팅하면서 효과적인 약물 전달을 수행할 수 있다.According to these results, the nano-aggregates according to the present invention are stably present in the blood of pH 7.2 living body, but the water-soluble anticancer genes circumscribed from the nano-aggregates under low pH conditions such as intracellular lysosomes and endosomes at pH 5.0 In the presence of DTT, which is known to exert the same degree of reduction as glutathione, the hydrophobic chemotherapeutic agent present in the core of the nanoaggregate is separated by the separation of the reducing sensitive linker and the micelle form is disrupted, resulting in the collapse of the nanoaggregate. It can be seen that. Therefore, it can be seen that the nano-aggregate according to one aspect of the present invention is introduced into the cell and stably exhibits the efficacy of anticancer genes and chemotherapeutic agents under pH and reducing conditions in the cell. Therefore, due to the EPR effect due to the nanoparticle properties of the nano aggregate, and the stability in the blood and the stable drug release effect in the cell, the nano aggregate can perform effective drug delivery while targeting chemotherapeutic agents to cancer cells. have.

따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명의 일 측면에 따른 나노 응집체를 포함하는 악성 종양 치료용 약학 조성물을 제공한다.Therefore, in another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for treating malignancies comprising the nano-aggregates according to the aspect of the present invention.

상기 악성 종양 치료용 약학 조성물은 하나의 약물 전달체인 나노 응집체 내에서 항암 유전자 및 화학 요법제를 동시에 투여할 수 있고, 화학요법제를 표적 암세포에 타겟팅하여 다량 전달할 수 있으며, 나노 응집체를 구성하는 고분자가 비이온성을 나타내어 종래 항암 유전자의 전달에 사용되었던 양이온성 고분자의 부작용 문제를 해소할 수 있다. 또한, 상기 나노 응집체가 세포에 전달 시 세포질에서의 글루타치온 존재 하에서 소수성 화학요법제의 비이온성 고분자와의 결합이 분리되어, 나노 응집체가 약물 방출후 자가분해되므로 약물 전달체 자체로 인한 독성의 우려도 없다. 또한, 나노 응집체 자체의 EPR 효과, 그리고 상기 나노 응집체가 혈중에서는 약물이 방출되지 않고 세포 내에서의 낮은 pH 조건 및 글루타치온 존재 하에서 약물 방출 효과로 인한 세포 내에서의 안정적 약물 방출 효과로 인해, 상기 약학 조성물은 항암용 유전자 및 화학 요법제를 부작용 없이 표적에 선택적으로 투여할 수 있다. The pharmaceutical composition for treating malignant tumors may simultaneously administer an anticancer gene and a chemotherapeutic agent in a nanoparticle aggregate, which is a drug carrier, and deliver a large amount of the chemotherapeutic agent to a target cancer cell, and constitute a polymer The nonionic property can solve the side effect problem of the cationic polymer that has been used for the delivery of anticancer genes. In addition, when the nano-aggregates are delivered to the cell, the binding of the hydrophobic chemotherapeutic agent to the nonionic polymer is separated in the presence of glutathione in the cytoplasm, and the nano-aggregates autolyze after drug release, so there is no fear of toxicity due to the drug carrier itself. . In addition, due to the EPR effect of the nano-aggregates themselves, and the nano-aggregates do not release the drug in the blood, the drug release effect in the cell due to the drug release effect in the presence of low pH conditions and glutathione in the cells, the pharmaceutical The composition may selectively administer the anti-cancer genes and chemotherapeutic agents to the target without side effects.

상기 악성 종양 치료용 약학 조성물의 투여량은 포함하는 나노 응집체의 미셀 단위체에 결합된 항암 유전자 및 화학요법제의 종류에 따라 달라 질 수 있을 뿐만 아니라, 조성물의 투여경로, 환자의 성별, 나이, 인종, 질병이 심각한 정도에 따라 달라질 수 있으며, 당업자가 통상적인 임상실험에 의해 투여량을 결정할 수 있다. The dosage of the pharmaceutical composition for treating malignant tumors may vary depending on the type of anti-cancer gene and chemotherapeutic agent bound to the micelle unit of the nano-aggregate, and the route of administration of the composition, sex, age and race of the patient. However, the disease may vary depending on the severity and the skilled person can determine the dosage by routine clinical trials.

상기 나노 응집체를 포함하는 약학 조성물은 주사, 경구, 또는 경피로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 주사제로서 투여될 수 있다. 상기 나노 응집체를 포함하는 약학 조성물을 주사제로서 투여하기 위해서는, 나노입자의 직경의 크기가 50 내지 400 nm 의 범위인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 100 nm 내지 300 nm 이다. The pharmaceutical composition comprising the nano-aggregates may be administered by injection, oral or transdermal, preferably as an injection. In order to administer the pharmaceutical composition comprising the nano-aggregates as an injection, the size of the diameter of the nanoparticles is preferably in the range of 50 to 400 nm, more preferably 100 nm to 300 nm.

상기 주사제는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여 시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수도 있으며, 투여 시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다. 상기 약학 조성물의 제제화 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 방법에 따라 당업자가 적절한 제조할 수 있으며, Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company Easton, Pennsylvania 19042 (Chapter 87; Blaug, Seymour) 을 참조할 수 있다. The injection may be prepared according to conventional injection preparation methods known in the art. The injection according to the present invention may be in the form of dispersed in a sterile medium so that it can be used as it is when administered to a patient, or may be in the form of dispersing to an appropriate concentration by adding distilled water for injection during administration. Formulation methods of the pharmaceutical composition may be appropriately prepared by those skilled in the art according to conventional methods known in the art, Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company Easton, Pennsylvania 19042 (Chapter 87; Blaug, Seymour ).

앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 나노 응집체는 친수성인 항암 유전자 및 소수성인 화학 요법제를 하나의 약물 전달체로 동시에 세포 내에 전달할 수 있고, 고효율로 항암제를 전달할 수 있으며, 약물을 표적 부위에 타겟팅하면서 혈중에서는 안정적으로 약물을 방출하지 않고 세포에 유입된 후에야 비로소 약물을 방출하여 약효를 발휘하므로 타겟팅 및 부작용 감소가 가능하다. 또한, 약물 전달 후 약물전달체가 분해되고 생체 내에 축적되지 않아 약물 전달체에 의한 생체 내 독성을 피할 수 있으며, 비이온성 고분자를 사용하므로 양이온성 고분자에 의해 발생 가능한 부작용을 피할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 나노 응집체는 항암 효과를 증대시키면서 부작용의 우려를 해소할 수 있는 효과적인 항암 유전자 및 화학 요법제의 약물 전달체라고 할 수 있다. As described above, the nano-aggregates according to the present invention can simultaneously deliver hydrophilic anticancer genes and hydrophobic chemotherapy agents into cells in one drug carrier, deliver anticancer agents with high efficiency, and target drugs to target sites. The blood does not release the drug stably, but only after it enters the cell to release the drug to exert its efficacy, so targeting and reducing side effects are possible. In addition, after drug delivery, the drug carrier is decomposed and not accumulated in the living body, thereby avoiding toxicity in vivo by the drug carrier, and since the nonionic polymer is used, side effects that may be caused by the cationic polymer may be avoided. Therefore, the nano-aggregates according to the present invention can be said to be effective drug carriers of anti-cancer genes and chemotherapeutic agents that can alleviate the concern of side effects while increasing anti-cancer effects.

도 1은 화학식 1의 화합물의 일 실시예가 수중에서 자기-조립(self-assembled)에 의해 나노 응집체를 형성하는 원리를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 나노 응집체에 함유되어 있는 화학요법제 및 항암 유전자가 생체의 세포 내에서 작용하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 PEG-DOX(3)를 구성하는 DOX, MAL-PEG-AM, 및 4-arm-PEG의 몰수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 복합체 ODN-PEG-DOX(3)의 제조 및 이를 이용한 나노 응집체의 제조과정을 나타낸 반응식이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 ODN-PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA), 및 PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(DOX NA)의 입자크기를 동적 레이저 산란에 의해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(DOX NA)에서의 황의 분포(A) 및 ODN-PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)에서의 인의 분포(B)를 TEM을 이용해 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 7은 PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(DOX NA) 및 ODN-PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)의 제조를 위한 임계응집농도(CAC)를 파이렌을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 pH 8.0, pH 8.0 및 DTT의 존재, 그리고 pH 5.0 의 각각 조건 하에서 시간의 경과에 따라 나노 응집체의 입자 크기를 DLS로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 pH 8.0, pH 8.0 및 DTT의 존재, 그리고 pH 5.0 의 각각 조건 하에서 시간의 경과에 따라 나노 응집체의 분해양상을 TEM으로 촬영한 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를, pH 8.0의 PBS에 10 mM의 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)을 첨가한 용액에 넣은 후 약 24시간 경과 후의 매질 중에 존재하는 DOX를 확인한 HPLC 그래프(A) 및 pH 5.0의 PBS(B)에 넣은 후 약 24 시간 경과 후의 매질 중에 존재하는 ODN을 확인한 HPLC 그래프(B)이다.
도 11은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 인간의 폐암세포 A549에 주입한 후 약 2 시간 및 약 24 시간 후 ODN@DOX NA의 세포 내로의 분포를 공초점 레이저현미경으로 촬영한 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 인간의 폐암세포 A549에 다양한 농도로 주입한 후 MTT 어세이를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
<도면의 기호에 대한 설명>
DOX: 독소루비신
ODN:올리고뉴클레오티드
MAL-PEG-AM: 말레이미드-폴리에틸렌글라이콜-아민
4-arm-PEG: 4-암-폴리에틸렌글리콜
DOX NA: PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체
ODN@DOX NA: 본 발명의 일 구현예에 따른 ODN-PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체 FIG. 1 schematically illustrates the principle of the formation of nano-aggregates by self-assembled in water in one embodiment of the compound of Formula 1. FIG.
Figure 2 schematically shows the process of the chemotherapeutic agent and the anti-cancer gene contained in the nano-aggregates according to an embodiment of the present invention to act in the cells of the living body.
Figure 3 is a graph showing the results of measuring the number of moles of DOX, MAL-PEG-AM, and 4-arm-PEG constituting the PEG-DOX (3) prepared according to an embodiment of the present invention.
Figure 4 is a scheme showing the preparation of the composite ODN-PEG-DOX (3) according to an embodiment of the present invention and the manufacturing process of the nano-aggregates using the same.
Figure 5 is a nano aggregate prepared by self-assembly of ODN-PEG-DOX (3) according to an embodiment of the present invention (ODN @ DOX NA), and nano-manufactured by self-assembly of PEG-DOX (3) It is a graph showing the result of measuring the particle size of the aggregate (DOX NA) by dynamic laser scattering.
FIG. 6 shows the distribution of sulfur in nanoaggregates prepared by self-assembly of PEG-DOX (3) (A) and nanoaggregates prepared by self-assembly of ODN-PEG-DOX (3) (ODN @ DOX NA) shows the distribution of phosphorus (B) by TEM.
7 shows nanoparticles prepared by self-assembly of PEG-DOX (3) (DOX NA) and nanoparticles prepared by self-assembly of ODN-PEG-DOX (3) (ODN @ DOX NA) It is a graph showing the result of measuring the critical concentration (CAC) using pyrene.
8 shows nanoparticles (ODN @ DOX NA) prepared according to one embodiment of the present invention in the presence of pH 8.0, pH 8.0 and DTT, and the particle size of the nanoaggregates over time under respective conditions of pH 5.0. It is a graph showing the result measured by DLS.
9 is a graph showing the degradation behavior of nano-aggregates (ODN @ DOX NA) prepared according to one embodiment of the present invention over time in the presence of pH 8.0, pH 8.0 and DTT, and pH 5.0, respectively. The picture was taken by TEM.
10 is about 24 hours after the nano-aggregate (ODN @ DOX NA) prepared according to one embodiment of the present invention in a solution in which 10 mM dithiothreitol (DTT) is added to PBS at pH 8.0. It is the HPLC graph (A) which confirmed the DOX which exists in the medium after passage, and the HPLC graph (B) which confirmed the ODN which exists in the medium after about 24 hours after putting into PBS (B) of pH 5.0.
Figure 11 shows the distribution of ODN @ DOX NA into cells about 2 hours and about 24 hours after injecting nano aggregates (ODN @ DOX NA) prepared according to one embodiment of the present invention into human lung cancer cells A549. The photograph was taken with a focus laser microscope.
12 is a graph showing the results of MTT assay after injecting nano aggregates (ODN @ DOX NA) prepared according to one embodiment of the present invention to human lung cancer cells A549 at various concentrations.
&Lt; Description of Symbols in Drawings >
DOX: Doxorubicin
ODN: Oligonucleotide
MAL-PEG-AM: maleimide-polyethylene glycol-amine
4-arm-PEG: 4-arm-polyethylene glycol
DOX NA: Nano-Agglomerates Prepared by Self-Assembly of PEG-DOX (3)
ODN @ DOX NA: Nano-Agglomerates Prepared by Self-Assembly of ODN-PEG-DOX (3) According to One Embodiment of the Present Invention

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1: 나노 응집체의 제조Example 1: Preparation of Nano Aggregates

1.1 화학요법제-PEG 블록 공중합체(PEG-DOX (3))의 합성 1.1 Synthesis of Chemotherapy Agent-PEG Block Copolymer (PEG-DOX (3))

독소루비신(doxorubicin, DOX)-폴리에틸렌글리콜(poly ethyleneglycol, PEG) 블록 공중합체(DOX-PEG diblock copolymer, PEG-DOX (3))를 다음과 같은 방법으로 제조하였다. Doxorubicin (DOX) -polyethyleneglycol (PEG) block copolymer (DOX-PEG diblock copolymer, PEG-DOX (3)) was prepared by the following method.

디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 100 mL를 100℃ 오븐에서 약 5 시간이상 방치하여 수분을 모두 제거하였다. 그 후 수분이 제거된 DMSO는 분자체(molecular sieve)를 넣어 보관하였다. 수분이 모두 제거된 DMSO 10 mL에 DOX 9.4 mg을 가하고 교반하여 녹였다. 그 후 얻은 DOX 용액에 트리에틸아민(triethylamine, TEA) 1.7 mL를 교반하면서 부가하여 DOX 및 TEA 혼합용액을 제조하였다. 100 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO) was left in a 100 ° C. oven for about 5 hours to remove all moisture. After the removal of the DMSO was stored in a molecular sieve (molecular sieve). 9.4 mg of DOX was added to 10 mL of DMSO in which all the water was removed, and the mixture was dissolved by stirring. Then, 1.7 mL of triethylamine (triA) was added to the obtained DOX solution with stirring to prepare a mixed solution of DOX and TEA.

별도로 수분이 모두 제거된 DMSO 1 mL에 N-숙신이미딜 2-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP) 6.7 mg을 녹였다. 얻어진 그 용액을 상기 DOX 및 TEA 혼합용액에 서서히 교반하며 부가하였다. 그리하여 얻어진 DOX, TEA 및 SPDP 혼합용액에서 산소를 모두 제거하기 위해 질소가스를 충진하였고, 50℃에서 교반하며 약 12 시간 동안 반응시켜 DOX를 활성화 시켰다.Separately, 6.7 mg of N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) was dissolved in 1 mL of dehydrated DMSO. The resulting solution was added to the DOX and TEA mixed solution slowly with stirring. Nitrogen gas was charged to remove all oxygen from the resulting DOX, TEA, and SPDP mixed solution, and stirred at 50 ° C. for about 12 hours to activate DOX.

수분이 모두 제거된 DMSO 10 mL에 4-암-폴리에틸렌글리콜(4-arm-PEG) 9 mg을 교반하며 녹여 4-arm-PEG 용액을 제조하였다. 수분이 모두 제거된 DMSO 1 mL에 말레이미드-폴리에틸렌글라이콜-아민(maleimide-polyethylene glycol-amine, MAL-PEG-AM) 27 mg을 녹인 후, 상기 4-arm-PEG 용액에 천천히 교반하며 넣었다. 그리하여 얻어진 용액에 질소가스를 충진하고 50℃에서 약 5 시간 동안 반응시켰다. A 4-arm-PEG solution was prepared by dissolving 9 mg of 4-arm-polyethylene glycol (4-arm-PEG) in 10 mL of DMSO in which all moisture was removed. After dissolving 27 mg of maleimide-polyethylene glycol-amine (MAL-PEG-AM) in 1 mL of dehydrated DMSO, the mixture was slowly added to the 4-arm-PEG solution. . The solution thus obtained was charged with nitrogen gas and reacted at 50 ° C. for about 5 hours.

상기에서 얻어진 DOX가 활성화된 용액을 상기 4-arm-PEG 및 MAL-PEG-AM를 반응시킨 용액에 천천히 교반하며 부가하였다. 그리하여 얻어진 용액에 질소가스를 충진하고 50℃에서 약 24 시간 동안 반응시켰다. 이때 4-arm-PEG, DOX 및 MAL-PEG-AM의 반응비율은 1:3.2:1.2 이다. The DOX-activated solution obtained above was added to the solution reacted with 4-arm-PEG and MAL-PEG-AM with slow stirring. The solution thus obtained was charged with nitrogen gas and reacted at 50 ° C. for about 24 hours. At this time, the reaction ratio of 4-arm-PEG, DOX and MAL-PEG-AM is 1: 3.2: 1.2.

상기 반응이 완료된 합성물을 분획 분자량(molecular weight cut off, MWCO) 3,500의 투석 주머니로 충분히 투석시켰다. 투석이 완료된 합성물질은 동결 건조한 다음 냉동 보관(-25℃)하였다. The completed reaction was sufficiently dialyzed with a dialysis bag of molecular weight cut off (MWCO) 3,500. The dialysis material was lyophilized and then frozen (-25 ° C.).

얻어진 PEG-DOX(3)에 대해 DOX의 흡광 측정, MAL-PEG-AM의 아민기 (amine group) 측정, 4-arm-PEG의 티올기(thiol group) 정량을 통하여, 그 물질의 합성여부를 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. Whether or not the PEG-DOX (3) was synthesized by measuring the absorbance of DOX, measuring the amine group of MAL-PEG-AM, and quantifying the thiol group of 4-arm-PEG It confirmed, and the result is shown in FIG.

도 3은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 PEG-DOX(3)를 구성하는 DOX, MAL-PEG-AM, 및 4-arm-PEG의 몰수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. Figure 3 is a graph showing the results of measuring the number of moles of DOX, MAL-PEG-AM, and 4-arm-PEG constituting the PEG-DOX (3) prepared according to an embodiment of the present invention.

도 3에 따르면, PEG-DOX(3)를 구성하는 4-arm-PEG, DOX 및 MAL-PEG -AM의 비율은 약 1:3:1인 것으로 확인되었다.
According to FIG. 3, the ratio of 4-arm-PEG, DOX and MAL-PEG-AM constituting PEG-DOX (3) was found to be about 1: 3: 1.

1.2 화학요법제-PEG-항암 유전자(ODN-PEG-DOX(3))의 합성1.2 Synthesis of Chemotherapy-PEG-anticancer Gene (ODN-PEG-DOX (3))

독소루비신(doxorubicin, DOX)-폴리에틸렌글라이콜(poly ethyleneglycol, PEG)-올리고뉴클레오티드(oligonucleotide, ODN) (ODN-PEG-DOX(3))은 하기 방법으로 제조하였다. Doxorubicin (DOX) -polyethyleneglycol (PEG) -oligonucleotide (ODN) (ODN-PEG-DOX (3)) was prepared by the following method.

5'말단이 포스페이트기(phosphate group)로 꾸며진 ODN 24.3 mg을 pH 6.0인 0.1 M 이미다졸 버퍼(imidazole buffer) 10 mL에 1-에틸-3,3-디메틸아미노프로필카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, EDC) 76mg, TEA 35.2 ㎕와 함께 교반하며 녹였다. 그 후 얻어진 용액에 질소가스를 충진하고 상온에서 약 1 시간 동안 반응시켰다.24.3 mg of ODN decorated with a 5'-end phosphate group was added to 1-ethyl-3,3-dimethylaminopropylcarbodiimide (1-ethyl-) in 10 mL of 0.1 M imidazole buffer at pH 6.0. 76 mg of 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and 35.2 μl of TEA were dissolved with stirring. Thereafter, the obtained solution was filled with nitrogen gas and reacted at room temperature for about 1 hour.

반응이 완료된 합성물을 분획 분자량(molecular weight cut off, MWCO) 1,000의 투석 주머니로 충분히 투석시켰다. 투석이 완료된 합성물질은 동결건조시켜 냉동 보관(-25℃)하였다. 이 때, ODN, EDC 및 TEA의 몰비율은 1:100:120이다.The completed reaction was sufficiently dialyzed with a dialysis bag of molecular weight cut off (MWCO) 1,000. The dialysis-synthesized material was lyophilized and frozen (-25 ° C). At this time, the molar ratio of ODN, EDC and TEA is 1: 100: 120.

상기에서 얻어진 합성물을 수분이 모두 제거된 DMSO 40 mL에 상기 PEG-DOX(3) 36mg을 녹인 용액에 교반하며 녹였다. 이때, ODN과 PEG-DOX(3)의 반응 몰비는 약 1:1이다. 그리하여 얻어진 용액에 질소가스를 충진하고 상온에서 약 3 시간 동안 반응시켰다. The obtained compound was dissolved in 40 mL of DMSO in which all of the water was removed, in a solution of 36 mg of PEG-DOX (3). At this time, the reaction molar ratio of ODN and PEG-DOX (3) is about 1: 1. The solution thus obtained was charged with nitrogen gas and reacted at room temperature for about 3 hours.

반응이 완료된 ODN 합성물을 분획 분자량(molecular weight cut off, MWCO) 10,000의 투석 주머니로 충분히 투석시켰다. 투석이 완료된 합성물질은 동결건조 시켜 냉동 보관(-25℃)하였다. The completed ODN composite was sufficiently dialyzed with a dialysis bag of 10,000 molecular weight cut off (MWCO). The dialysis-synthesized material was freeze-dried and stored frozen (-25 ° C).

1.3. 나노 응집체의 제조1.3. Preparation of Nano Aggregates

상기 ODN-PEG-DOX(3) 2 mg을 아세톤(acetone) 500 mL에 녹였다. 2 mg of the ODN-PEG-DOX (3) was dissolved in 500 mL of acetone.

증류수(distilled water, DW) 3 mL에 상기 제조된 ODN-PEG-DOX(3)를 서서히 교반하면서 가하여 각각 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 제조하였다.Nano agglomerates (ODN @ DOX NA) were prepared by slowly adding ODN-PEG-DOX (3) prepared above to 3 mL of distilled water (DW) with gentle stirring.

상기 ODN-PEG-DOX(3)의 제조 및 나노 응집체의 제조과정을 반응식으로서 도 4에 나타내었다. The production process of the ODN-PEG-DOX (3) and the production of nano-aggregates are shown in Figure 4 as a reaction scheme.

비교예 1: 나노 응집체의 제조Comparative Example 1: Preparation of Nano Aggregates

상기 실시예 1에서 제조된 PEG-DOX(3) 2 mg을 아세톤(acetone) 500 mL에 녹였다. 증류수(distilled water, DW) 3 mL에 상기 제조된 PEG-DOX(3)를 서서히 교반하면서 가하여 각각 나노 응집체(DOX NA)를 제조하였다.2 mg of PEG-DOX (3) prepared in Example 1 was dissolved in 500 mL of acetone. The nano-aggregates (DOX NA) were each prepared by slowly adding PEG-DOX (3) prepared above to 3 mL of distilled water (DW) while stirring.

실험예 1: 나노 응집체의 크기 측정 Experimental Example 1 Measurement of Size of Nano Aggregates

상기 비교예 1 및 실시예 1에서 제조된 PEG-DOX(3)로 제조된 나노 응집체(DOX NA) 및 ODN-PEG-DOX(3)로 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 시료로 하여, 동적 레이저 산란(dynamic laser scattering, DLS)에 의한 입자 크기를 측정하였다.Using nano-aggregates (DOX NA) made of PEG-DOX (3) prepared in Comparative Example 1 and Example 1 and nano-aggregates (ODN @ DOX NA) made of ODN-PEG-DOX (3) as a sample Particle size was measured by dynamic laser scattering (DLS).

DLS를 이용하여 나노 응집체의 입자 크기를 측정하는 방법은 통상의 방법으로 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.The method for measuring the particle size of the nano-aggregates using DLS was carried out in a conventional manner. The results are shown in Fig.

도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 ODN-PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA), 및 PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(DOX NA)의 입자크기를 동적 레이저 산란에 의해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 5 is prepared by self-assembly of nano aggregates (ODN @ DOX NA) prepared by self-assembly of ODN-PEG-DOX (3) prepared according to one embodiment of the present invention, and PEG-DOX (3). It is a graph showing the results of measuring the particle size of the nano-aggregates (DOX NA) by dynamic laser scattering.

도 5에 따르면, DOX NA의 크기는 약 300nm, ODN@DOX NA의 크기는 약 400nm로 ODN이 추가로 결합됨에 따라 나노 응집체의 크기가 증가함을 확인하였다. According to Figure 5, the size of the DOX NA is about 300nm, the size of the ODN @ DOX NA is about 400nm it was confirmed that the size of the nano-aggregates increases as the ODN is further coupled.

실험예 2: 나노 응집체의 형성 및 형태 검증 Experimental Example 2: Formation and Verification of Nano Aggregates

상기 비교예 1 및 실시예 1에서 제조된 PEG-DOX(3)로 제조된 나노 응집체(DOX NA) 및 ODN-PEG-DOX(3)로 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 시료로 하여, 투과 전자 현미경(Transmission electron microscope, TEM)을 이용해 황 및 인의 분포를 확인함으로써 나노 응집체의 형성과 형태 검증을 하였다. TEM을 이용한 검증은 통상의 방법으로 수행하였다. Using nano-aggregates (DOX NA) made of PEG-DOX (3) prepared in Comparative Example 1 and Example 1 and nano-aggregates (ODN @ DOX NA) made of ODN-PEG-DOX (3) as a sample The formation and morphology of the nano-aggregates were verified by confirming the distribution of sulfur and phosphorus using a transmission electron microscope (TEM). Verification using TEM was performed in a conventional manner.

그 결과를 도 6에 나노 응집체의 모식도와 함께 나타내었다.The result is shown with the schematic diagram of a nano aggregate in FIG.

도 6은 PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(DOX NA)에서의 황의 분포(A) 및 ODN-PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)에서의 인의 분포(B)를 TEM을 이용해 확인한 결과를 촬영한 사진이다. FIG. 6 shows the distribution of sulfur in nanoaggregates prepared by self-assembly of PEG-DOX (3) (A) and nanoaggregates prepared by self-assembly of ODN-PEG-DOX (3) (ODN @ DOX NA) shows the distribution of phosphorus (B) by TEM.

도 6에서 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 나노 응집체는 나노 응집체가 잘 형성되었으며, TEM 원소분석(TEM-mapping)을 통하여 황 및 인의 분포를 알아본 결과 그 형태가 황은 코어(core)에 인은 쉘(shell)에 분포하여 코어-셀(core-shell) 구조를 이루고 있는 것으로 확인되었다. As shown in Figure 6, the nano-agglomerates prepared in Example 1 was well formed nano-aggregates, and as a result of examining the distribution of sulfur and phosphorus through TEM elemental analysis (TEM-mapping), the form of the sulfur core (core) It is confirmed that the phosphorus is distributed in the shell to form a core-shell structure.

실험예 3: 나노 응집체 제조를 위한 임계응집농도 측정Experimental Example 3: Measurement of Critical Aggregate Concentration for Nano Aggregates

상기 실시예 1 및 비교예 1에서 DOX NA 및 ODN@DOX NA를 제조하는 과정에서 파이렌(pyrene)을 이용하여 임계응집농도(critical aggregate concentration, CAC)를 측정하였다. 구체적으로는 Hyuk Sang Yoo et al., Journal of Controlled Release 70 (2001) 63-70에 개시된 방법에 따라 CAC를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. Critical aggregate concentration (CAC) was measured using pyrene in the process of preparing DOX NA and ODN @ DOX NA in Example 1 and Comparative Example 1. Specifically, CAC was measured according to the method disclosed in Hyuk Sang Yoo et al., Journal of Controlled Release 70 (2001) 63-70. The results are shown in Fig.

도 7은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 ODN-PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA), 및 PEG-DOX(3)의 자가조립에 의해 제조된 나노 응집체(DOX NA)의 제조를 위한 임계응집농도를 파이렌을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 7 is prepared by self-assembly of nano aggregates (ODN @ DOX NA), and PEG-DOX (3) prepared by self-assembly of ODN-PEG-DOX (3) prepared according to one embodiment of the present invention It is a graph showing the results of the measurement of the critical agglomerate concentration for the production of nano-aggregates (DOX NA) using pyrene.

도 7에 따르면, DOX NA 및 ODN@DOX NA의 입계응집농도가 각각 약 2㎕, 약 1 ㎕로 유사한 것으로 확인되었다. According to FIG. 7, the grain aggregate concentrations of DOX NA and ODN @ DOX NA were similar to about 2 μl and about 1 μl, respectively.

실험예 4: 나노 응집체로부터의 약물이 방출 양상 평가Experimental Example 4: Evaluation of Release Pattern of Drugs from Nano Aggregates

상기 실시예 1에서 얻어진 나노 응집체(ODN@DOX NA)로부터 올리고뉴클레오티드(ODN)와 독소루비신(DOX)의 약물 방출 양상을 평가하였다.The drug release pattern of the oligonucleotide (ODN) and doxorubicin (DOX) was evaluated from the nano aggregate obtained in Example 1 (ODN @ DOX NA).

상기 제조된 ODN@DOX NA를 각각 pH 8.0의 인산완충용액(PBS), pH 8.0의 PBS에 10 mM의 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)을 첨가한 용액, 및 pH 5.0의 PBS에 넣어 방출 양상을 평가하였다. 시간의 경과에 따라 나노 응집체(ODN@DOX NA)의 크기를 동적 레이저 산란(DLS)으로 측정하여 그 결과를 도 8에 나타내었고, TEM을 이용하여 ODN@DOX NA의 분해양상을 확인하였고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 또한, 상기 pH 8.0의 PBS에 10 mM의 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)을 첨가한 용액, 및 pH 5.0의 PBS에 ODN@DOX NA를 넣은 후 약 24 시간 경과 후의 매질 중에 존재하는 DOX 및 ODN을 HPLC를 이용하여 확인하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. The prepared ODN @ DOX NA was added to a phosphate buffer solution (PBS) at pH 8.0, a solution in which 10 mM dithiothreitol (DTT) was added to PBS at pH 8.0, and PBS at pH 5.0, respectively. Was evaluated. The size of the nano-aggregates (ODN @ DOX NA) was measured by dynamic laser scattering (DLS) over time, and the results are shown in FIG. 8, and the dissolution patterns of ODN @ DOX NA were confirmed using TEM. Is shown in FIG. 9. In addition, a solution in which 10 mM dithiothreitol (DTT) was added to the PBS at pH 8.0, and DOX and ODN present in the medium about 24 hours after ODN @ DOX NA was added to PBS at pH 5.0 Was confirmed using HPLC. The results are shown in Fig.

도 8은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 pH 8.0, pH 8.0 및 DTT의 존재, 그리고 pH 5.0 의 각각 조건 하에서 시간의 경과에 따라 나노 응집체의 입자 크기를 DLS로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 8 shows nanoparticles (ODN @ DOX NA) prepared according to one embodiment of the present invention in the presence of pH 8.0, pH 8.0 and DTT, and the particle size of the nanoaggregates over time under respective conditions of pH 5.0. A graph showing the results measured by DLS.

도 9는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 pH 8.0, pH 8.0 및 DTT의 존재, 그리고 pH 5.0 의 각각 조건 하에서 시간의 경과에 따라 나노 응집체의 분해양상을 TEM으로 촬영한 사진이다. 9 is a graph showing the degradation behavior of nano-aggregates (ODN @ DOX NA) prepared according to one embodiment of the present invention over time in the presence of pH 8.0, pH 8.0 and DTT, and pH 5.0, respectively. The picture was taken by TEM.

도 10은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를, pH 8.0의 PBS에 10 mM의 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)을 첨가한 용액에 넣은 후 약 24 시간 경과 후의 매질 중에 존재하는 DOX를 확인한 HPLC 그래프(A) 및 pH 5.0의 PBS(B)에 넣은 후 약 24 시간 경과 후의 매질 중에 존재하는 ODN을 확인한 HPLC 그래프(B)이다.10 is about 24 hours after the nano-aggregate (ODN @ DOX NA) prepared according to one embodiment of the present invention in a solution in which 10 mM dithiothreitol (DTT) is added to PBS at pH 8.0. It is the HPLC graph (A) which confirmed the DOX which exists in the medium after passage, and the HPLC graph (B) which confirmed the ODN which exists in the medium after about 24 hours after putting into PBS (B) of pH 5.0.

도 8 내지 10에 따르면, ODN@DOX NA에서 낮은 pH 조건 하에서 ODN이 잘 분리되고, 환원제 조건 하에서 DOX가 잘 분리되는 것으로 확인되었다.
8 to 10, it was confirmed that ODN was well separated under low pH conditions in ODN @ DOX NA, and DOX was well separated under reducing agent conditions.

실험예 5: 나노 응집체의 전달성Experimental Example 5: Transferability of Nano Aggregates

상기 합성된 나노 응집체(ODN@DOX NA)의 세포로의 약물 전달을 확인하기 위해 실험을 진행하였다. Experiments were conducted to confirm drug delivery of the synthesized nano aggregates (ODN @ DOX NA) to cells.

인간의 폐암세포의 한 종류인 A549 세포를 12 well 플레이트에 커버 글라스(cover glass)를 놓고 그 위에 5x104 수의 세포를 FBS 10%의 RPMI 1640 배지 1 mL와 함께 배치하고 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 배양하였다. 약 12 시간 후, 배지를 새롭게 바꾸고 RPMI1640배지 100 ㎕에 상기 실시예 1에서 제조된 ODN-PEG-DOX(3) 약 0.5 mg을 녹여 100℃의 ODN@DOX NA를 만들어 주입하였다. A549 cells, a type of human lung cancer cells, were placed in a 12-well plate cover glass, and 5 × 10 4 cells were placed on top of 1 mL of FBS 10% RPMI 1640 medium with 5% CO 2 , 37 Incubated under the conditions of ℃. After about 12 hours, the medium was newly changed and about 0.5 mg of the ODN-PEG-DOX (3) prepared in Example 1 was dissolved in 100 µl of RPMI 1640 medium to prepare and inject ODN @ DOX NA at 100 ° C.

상기 ODN@DOX NA 주입 후 약 2 시간, 약 24 시간 후 공초점 레이저현미경(confocal laser microscope, CLM)으로 ODN@DOX NA의 세포 내로의 분포를 확인하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.The distribution of ODN @ DOX NA into cells was confirmed by a confocal laser microscope (CLM) about 2 hours and about 24 hours after the ODN @ DOX NA injection. The results are shown in Fig.

도 11은 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 인간의 폐암세포 A549에 주입한 후 약 2 시간 및 약 24 시간 후 ODN@DOX NA의 세포 내로의 분포를 공초점 레이저현미경으로 촬영한 사진이다. Figure 11 shows the distribution of ODN @ DOX NA into cells about 2 hours and about 24 hours after injecting nano aggregates (ODN @ DOX NA) prepared according to one embodiment of the present invention into human lung cancer cells A549. The photograph was taken with a focus laser microscope.

도 11에 따르면, 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체는 폐암세포 A549에 주입한 후 약 24 시간 뒤에 ODN@DOX NA가 세포의 핵 안으로 위치하는 것으로 확인되었다. According to FIG. 11, the nano-aggregates prepared according to one embodiment of the present invention were found to have ODN @ DOX NA located in the nucleus of the cells about 24 hours after injection into lung cancer cells A549.

실험예 6: 나노 응집체의 세포독성Experimental Example 6: Cytotoxicity of Nano Aggregates

상기에서 합성된 나노 응집체 (ODN@DOX NA)의 세포로의 독성을 확인하기 위해 실험을 진행하였다. Experiments were conducted to confirm the toxicity of the synthesized nano aggregates (ODN @ DOX NA) to the cells.

A549 세포를 96 well 플레이트에 104 수의 농도로 FBS 10%의 RPMI1640 배지 100 ㎕와 함께 배치하여 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 배양하였다. 약 12 시간 후, 배지를 새롭게 바꾸고 RPMI1640배지 10 ㎕에 상기 실시예1에서 제조된 ODN-PEG-DOX(3)을 각각 약 0, 0.07, 0.35, 0.71, 3.54, 7.08, 35.42, 70.84, 141.68 ㎍을 녹여 각각 10 ㎕의 ODN@DOX NA를 만들어 주입하였다. 약 6 시간 후, 배지를 새롭게 바꾸어 약 42 시간 더 배양하였다. ODN@DOX NA를 주입한지 총 48 시간 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT reagent)를 10 ㎕ 주입하였다. 약 6 시간 후, 배지를 석션(suction)하고 PBS로 2번 세척하였다. 100 ㎕의 DMSO와 25 ㎕의 0.1M 글라이신 버퍼 (glycine buffer)를 주입하고 상온에서 약 1 시간 배양하였다. A549 cells were placed in 96 well plates with 100 μl of FBS 10% RPMI1640 medium at a concentration of 10 4 water and incubated under 5% CO 2, 37 ° C. conditions. After about 12 hours, the medium was freshly changed and the ODN-PEG-DOX (3) prepared in Example 1 was added to 10 μl of RPMI 1640 medium, respectively, about 0, 0.07, 0.35, 0.71, 3.54, 7.08, 35.42, 70.84, 141.68 μg. 10 μl of ODN @ DOX NA was prepared and injected. After about 6 hours, the medium was freshly changed and incubated for about 42 hours. After 48 hours of injecting ODN @ DOX NA, 10 μl of 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT reagent) was injected. After about 6 hours, the medium was suctioned and washed twice with PBS. 100 μl of DMSO and 25 μl of 0.1M glycine buffer were injected and incubated at room temperature for about 1 hour.

약 1 시간 후, 흡광기기를 이용하여 570 nm에서 흡광을 관찰하여 그 결과를 도 12에 나타내었다. 비교를 위해, 4-암-PEG, 유리 독소루비신(free DOX), 상기 비교예 1에서 제조된 나노 응집체(DOX NA)에 대해서도 상기 ODN@DOX NA 대신 동일한 시험을 수행하였다.After about 1 hour, the absorbance was observed at 570 nm using an absorber, and the results are shown in FIG. 12. For comparison, the same test was performed instead of the ODN @ DOX NA for 4-arm-PEG, free doxorubicin (free DOX), and the nano aggregates prepared in Comparative Example 1 (DOX NA).

도 12는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조된 나노 응집체(ODN@DOX NA)를 인간의 폐암세포 A549에 다양한 농도로 주입한 후 MTT 어세이를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 12 is a graph showing the results of MTT assay after injecting nano aggregates (ODN @ DOX NA) prepared according to one embodiment of the present invention to human lung cancer cells A549 at various concentrations.

도 12에 따르면, 본 발명에 따른 나노 응집체가 세포독성이 가장 높은 것으로 나타나 높은 항암 효과를 나타낼 수 있는 약물 전달체임이 확인되었다. According to Figure 12, it was confirmed that the nano-aggregates according to the present invention is the drug carrier which can be shown to have the highest cytotoxicity and exhibit a high anticancer effect.

Claims (14)

생체 적합성 비이온성 고분자의 일 말단에 소수성 화학요법제가 결합되고 다른 말단에 친수성 항암 유전자가 결합된 복합체인 1 미셀 단위체를 포함하는 미셀 형태의 나노 응집체로서, 상기 1 미셀 단위체는 하기 화학식 1의 구조를 갖는 나노 복합체:
[화학식 1]
Figure 112013089208870-pat00015
A micelle-shaped nano-agglomerate comprising one micelle unit, a complex in which a hydrophobic chemotherapeutic agent is coupled to one end of the biocompatible nonionic polymer and a hydrophilic anticancer gene is coupled to the other end, wherein the one micelle unit has a structure of Formula 1 Having nanocomposites:
[Chemical Formula 1]
Figure 112013089208870-pat00015
 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 소수성 화학요법제는 독소루비신, 파클리탁셀, 아지트로마이신(azithromycin), 에리트로마이신(erythromycin), 빈블라스틴(vinblastin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 아이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantron), 플리카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin), 또는 이들의 조합인 나노 응집체.The method of claim 1, wherein the hydrophobic chemotherapeutic agent is doxorubicin, paclitaxel, azithromycin, erythromycin, vinblastin, bleomycin, dactinomycin, dactinomycin Nano aggregates that are norubicin, idarubicin, mitoxantron, plicamycin, mitomycin, or a combination thereof. 제1항에 있어서, 상기 친수성 항암 유전자는 안티센스 Bcl-2, 안티센스 Bcl-XL, 안티센스 Mcl-1, 안티센스 CED-9, 안티센스 A1, 또는 안티센스 Bfl-1인 나노 응집체.The nano-aggregate of claim 1, wherein the hydrophilic anticancer gene is antisense Bcl-2, antisense Bcl-XL, antisense Mcl-1, antisense CED-9, antisense A1, or antisense Bfl-1. 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 나노 응집체의 직경이 10 내지 500 nm인 나노 응집체.The nano aggregate of claim 1, wherein the nano aggregate has a diameter of 10 to 500 nm. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항, 제6항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 나노 응집체를 포함하는 악성 종양 치료용 약학 조성물. A pharmaceutical composition for treating malignant tumors comprising the nano-aggregates according to any one of claims 1, 6, 7, and 9. 제13항에 있어서, 상기 약학 조성물은 주사제인 악성 종양 치료용 약학 조성물. The pharmaceutical composition of claim 13, wherein the pharmaceutical composition is an injection.
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