KR101383536B1 - Dammarenediol synthase promoter analysis of genes involved in saponin biosynthesis - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인삼 사포닌 생합성 관련 유전자인 서열번호 1의 염기서열을 갖는 담마란다이올 생합성 유전자의 프로모터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 DDS cDNA(ABI22080) 유전자의 5’비번역 부위를 포함하는 DDS 유전자 프로모터의 염기 서열, 담마란다이올(dammarenediol) 생합성 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화 하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 벡터에 관한 것이다. 또한, 형질전환 애기장대 및 형질전환 인삼에서 DDS 프로모터의 시기별 발현 패턴, 호르몬과 빛의 영향, TMV 감염에 대한 DDS 프로모터의 활성을 확인하여 DDS 프로모터를 포함하는 벡터를 식물체에 도입한 형질전환 식물체에 관한 것이다. 따라서 이 프로모터는 진세노사이드 함량이 증가된 작물, 형질전환 스트레스 저항성 작물, 바이러스 저항성이 강화된 작물을 개발하고자 할 때 효과적으로 이용될 수 있으며, 유용 의료, 산업용 단백질을 생산하고자 하는 형질전환 식물체 개발에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a promoter of the dammarandiol biosynthesis gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 which is a gene related to ginseng saponin biosynthesis, and more specifically, a DDS gene promoter including a 5 'untranslated region of the DDS cDNA (ABI22080) gene. It relates to a vector for transformation comprising a base sequence of, a promoter of a dammarenediol biosynthetic gene and a base sequence encoding a target protein operably linked with the promoter. In addition, transgenic plants incorporating the vector containing the DDS promoter into the plant by confirming the time-dependent expression pattern of the DDS promoter, the effects of hormones and light, and the activity of the DDS promoter against TMV infection in transgenic Arabidopsis and transgenic ginseng. It is about. Therefore, this promoter can be effectively used to develop crops with increased ginsenoside content, transgenic stress resistant crops and crops with enhanced viral resistance, and can be used for developing transgenic plants for producing useful medical and industrial proteins. It can be usefully used.
Description
본 발명은 인삼 사포닌 생합성에 관여하는 담마란다이올(dammarenediol) 생합성 유전자의 프로모터, 이를 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터를 이용하여 형질전환 된 식물체에 관한 것이다.The present invention relates to a promoter of dammarenediol biosynthesis gene involved in ginseng saponin biosynthesis, an expression vector comprising the same, and a plant transformed using the vector.
최근 식물 생명공학 기술의 발달은 형질전환식물 생산을 가능하게 하였으며 이 형질전환식물 생산기술은 두 가지 측면에서 이용되고 있다. 첫째는 기존의 육종 방법으로는 불가능하였던 새로운 기능을 가진 고부가가치 식물체를 개발하는 것이고, 둘째는 식물을 바이오리액터(bioreactor)로서 이용하는 것, 즉 형질전환 식물이나 형질전환 식물 세포주를 이용하여 동물 혹은 식물 유래의 유용 단백질을 생산하는 것을 가능하게 하였다 (Doran PM., 2000 Biochem. Engineering 11:199-204).Recent developments in plant biotechnology have made it possible to produce transformed plants, which are used in two ways. The first is to develop high value-added plants with new functions that were not possible with conventional breeding methods, and the second is to use plants as bioreactors, that is, animals or plants using transgenic plants or transgenic plant cell lines. It has been made possible to produce useful proteins of origin (Doran PM., 2000 Biochem. Engineering 11: 199-204).
유용단백질을 형질전환 식물 세포주에서 생산하면, 동물 세포 배양에 비해 1) 동물 바이러스 감염의 우려가 없어서 안정성이 확보되며, 2) 식물세포주의 배양 비용이 동물세포배양의 1/30, 3) 미생물 배양의 1/3로서 훨씬 저렴한 장점이 있다.When useful proteins are produced in transgenic plant cell lines, compared to animal cell cultures, 1) there is no risk of animal virus infection, and stability is secured. 2) Culture cost of plant cell lines is 1/30 of animal cell culture, 3) microbial culture. As one-third of it is a much cheaper advantage.
따라서 외래 유전자의 발현양을 조절하는 프로모터에 관한 연구는 동식물유래 유용단백질 생산 및 2차 대사산물의 대사경로에 관련된 유전자의 발현을 현탁배양세포를 통해 증강시키기 위해 중요한 사안이며 이러한 조건을 충족할 다양한 프로모터의 연구를 통한 개발은 다음과 같은 세 가지 이유에서 매우 중요하다.Therefore, studies on promoters that regulate the expression level of foreign genes are important issues to enhance the expression of genes related to the metabolic pathways of plant-derived useful protein and metabolism of secondary metabolites through suspension cultured cells. Development through the research of promoters is very important for three reasons.
첫째, 형질전환체에 삽입된 외래유전자의 발현 정도는 조절되어야 한다. 형질전환에 사용되는 유전자는 목표형질에 따라 매우 다양하게 이용될 수 있다. 그래서 그 발현정도 또한 매우 다양하게 요구된다. 현탁배양세포에서 유용물질의 축적을 목표로 할 때는 유용물질의 생산에 관여하는 유전자의 발현정도가 강할수록 유리하다. 단백질을 대량생산하고자 할 때에는 현탁배양세포의 대수증식기에 강하게 발현하는 프로모터가 요구되며, 이차대사산물을 대량 축적하고자 할 때는 휴지기에 강하게 발현되는 프로모터가 개발되어야 한다. 이처럼 외래유전자의 발현 정도를 미세하게 조절하기 위해서는 다양한 발현 정도의 프로모터가 개발되어야 한다.First, the expression level of the foreign gene inserted into the transformant should be controlled. Genes used for transformation can be used in a variety of ways depending on the target trait. Thus, the degree of expression is also very diverse. In order to accumulate useful substances in suspension cultured cells, the stronger the expression of genes involved in the production of useful substances, the better. In order to mass-produce a protein, a promoter that strongly expresses the logarithmic growth of suspension culture cells is required, and when a large amount of secondary metabolites are to be accumulated, a promoter that is strongly expressed during the resting period should be developed. As such, in order to finely control the expression level of foreign genes, promoters of various expression levels should be developed.
둘째, 형질전환에 사용될 프로모터의 지적재산권을 확보하여야 한다. 현재 많이 사용되고 있는 CaMV 35S 프로모터 (특허번호; JP19931172-AI)는 이미 특허화되어 있기 때문에, 이를 이용하여 유용물질을 대량 생산할 경우 이 형질전환주의 사용과 함께 엄청난 액수의 로얄티를 지불해야 함으로 그 부가가치는 현저하게 감소된다.Second, the intellectual property of the promoter to be used for transformation should be secured. Since the
셋째, 다양한 현탁배양세포주에 적합한 프로모터의 연구개발이 필요하다. 상대적으로 성장속도가 빠른 배양세포주인 담배 BY-2 세포 (Nicotiana tobacum L. cv.)는 현재까지 재조합 단백질의 생산에 가장 적합한 세포주이지만 또한 콩, 토마토 그리고 벼의 현탁배양세포와 담배의 모상근에서도 의료용단백질들이 생성되고 있다. 예를 들면 hGM-CGF (human granulocyte-macrophage colony stimulating factor)의 생성은 항시성 프로모터(constitutive promoter)인 CaMV 35S 프로모터와 담배세포주를 이용한 것 보다 벼 세포주에서 유도성 프로모터(inducible promoter, amylase expression system)를 사용하였을 때가 훨씬 높다 (Shin et al., 2003 Biotech. and Bioengineering 82:778-783). 따라서 유용 단백질의 생산에는 사례별(case-by-case) 분석에 따른 적절한 세포주와 프로모터가 요구된다.Third, research and development of promoters suitable for various suspension culture cell lines is necessary. Tobacco BY-2 cells, a relatively fast growing cell line ( Nicotiana tobacum L. cv.) is by far the most suitable cell line for the production of recombinant proteins, but medical proteins are also produced in the soybean, tomato and rice suspension culture cells and in the hairy roots of tobacco. For example, the production of hGM-CGF (human granulocyte-macrophage colony stimulating factor) is an inducible promoter (amylase expression system) in rice cell lines rather than the
대부분의 뿌리 작물(인삼, 도라지, 더덕 등)은 식용적, 약리적 효과가 뛰어난 고부가가치 작물이다. 하지만 대부분의 뿌리작물이 다년생으로 그 성장기간이 길며 다량의 폴리사카라이드를 함유하고 있어 DNA 및 RNA 추출이 쉽지 않으며 지하에서 성장하는 저장뿌리의 성장을 모니터링하기 어렵다는 이유로 뿌리작물의 분자육종에 관한 연구는 전무한 형편이다. 그러나 최근 이들 생리활성물질에 관여하는 유전자들이 밝혀지기 시작함에 따라 이 대사경로에 관련된 유전자의 발현을 증강시켜 생리활성물질을 대량으로 축적시키는 발현시스템개발의 필요성이 부각되고 있다. 따라서 타 작물에 비해 재배기간이 길어 경제적으로 생산하여 제품화하는데 많은 시간과 비용이 드는 약용뿌리작물의 배양근 또는 배양세포를 이용하여 유용 생리활성물질을 단기간에 많이 축적시키는 프로모터 연구를 통한 원천기술개발은 경제적으로 아주 중요하다.Most root crops (Ginseng, Bellflower, Deodeok, etc.) are high value added crops with excellent edible and pharmacological effects. However, most of the root crops are perennial, their growth period is long, and they contain a large amount of polysaccharides. Therefore, it is not easy to extract DNA and RNA, and it is difficult to monitor the growth of storage roots growing underground. Is the worst. However, as the genes involved in these bioactive substances have recently been revealed, the need for development of expression systems that enhance the expression of genes involved in these metabolic pathways and accumulate large amounts of bioactive substances is highlighted. Therefore, the original technology development through the research of a promoter that accumulates a lot of useful bioactive substances in a short period of time using culture roots or cultured cells of medicinal root crops, which requires a lot of time and cost to produce and commercialize economically due to the longer growing period than other crops. It is very important economically.
따라서 보다 고효율로 저렴하게 식물 현탁배양세포에서 유용한 외래단백질을 대량 생산할 수 있는 방법으로 위와 같은 유전자들, 즉 조직배양세포 고발현 유전자의 프로모터에 관한 연구가 필요하다.Therefore, it is necessary to study the promoters of the above genes, that is, tissue culture cell high expression genes, as a method to mass produce foreign proteins useful in plant suspension culture cells at high efficiency and at low cost.
한편, 인삼 약효를 대표하는 물질은 뿌리에 함유된 사포닌의 일종인 진세노사이드(ginsenoside) 라는 이차대사산물인데 인삼 진세노사이드는 담마란다이올(dammarenediol)이라는 4개의 골격으로 된 독특한 트리털펜(triterpene) 성분이다. 인삼은 타 작물에 비해 재배기간이 4-6년이 되기 때문에 대사공학적으로 형질전환 된 인삼의 배양근을 이용하여 빠른 시간 내에 원하는 사포닌을 대량으로 생산하는 것은 경제적으로 아주 중요하다. 이들 2차대사산물의 축적을 최대화시키기 위해서는 생합성과정에 관여하는 유전자들의 조절기작을 이해하는 것이 필수적이지만 이들 유전자의 발현조절 규명을 통한 발현시스템 개발은 거의 연구되어 있지 않다. 인삼 사포닌 생합성에 관여하는 유전자를 대상으로 인삼 사포닌 생합성에 핵심적인 조절 인자가 되는 기능 분석의 연구가 필요하다 (squalene synthase, squalene epoxidase, dammarenediol II synthase 등). 대한민국 공개특허 10-2007-0017428은 인삼으로부터 담마란다이올 생합성 유전자 기능 발굴과 담마란 다이올 생합성 유전자가 삽입된 이스트에서의 담마란다이올 생산에 관한발명, 대한민국 공개특허 10-2011-0068292 에서는 병풀 유래의 담마레네디올 합성효소 유전자 및 이의 용도를 제시하고 있다. Meanwhile, the representative substance of ginseng medicinal effect is a secondary metabolite called ginsenoside, a kind of saponin contained in the root. Ginseng ginsenoside is a unique triterpene composed of four skeletons called dammarenediol. ) Component. Ginseng is grown for 4-6 years compared to other crops. It is economically important to produce a large amount of the desired saponin in a short time using the culture root. In order to maximize the accumulation of these metabolites, it is essential to understand the regulatory mechanisms of genes involved in the biosynthesis process, but the development of expression systems through the expression regulation of these genes has not been studied. Studies on functional assays that are key regulators of ginseng saponin biosynthesis in genes involved in ginseng saponin biosynthesis are needed (squalene synthase, squalene epoxidase, dammarenediol II synthase, etc.). Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2007-0017428 discloses the function of dammarandiol biosynthesis gene function from ginseng and the production of dammarandiol in yeast into which dammaran diol biosynthesis gene is inserted, and in Korea Patent Publication No. 10-2011-0068292 It has been suggested that the dammarenediol synthase gene and its use.
이에 본 발명의 목적은 다양한 생리활성을 갖는 사포닌의 생합성에 중요한 역할을 하는 DDS(Dammarenediol synthase)의 프로모터 염기서열을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a promoter sequence of DDS (Dammarenediol synthase), which plays an important role in the biosynthesis of saponins having various physiological activities.
본 발명의 다른 목적은 진세노사이드 생산 증진을 위한 형질전환체 생산용 프로모터인 것을 특징으로 하는 프로모터일 수 있다.Another object of the present invention may be a promoter characterized in that the promoter for transformant production for the enhancement of ginsenoside production.
본 발명의 다른 목적은 환경스트레스 저항성 및 TMV 저항성 형질전환체 생산용 프로모터인 것을 특징으로 하는 프로모터일 수 있다.Another object of the present invention may be a promoter characterized in that the promoter for the production of environmental stress resistant and TMV resistant transformants.
본 발명의 다른 목적은 스트레스 유도성 프로모터를 포함하는 식물체 형질전환용 환경 스트레스 저항성 및 TMV 저항성 발현 벡터를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide an environmental stress resistant and TMV resistant expression vector for plant transformation comprising a stress inducible promoter.
본 발명의 다른 목적은 분리된 담마란다이올(dammarenediol) 생합성 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화 하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 벡터를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a vector for transformation comprising a promoter of an isolated dammarenediol biosynthesis gene and a base sequence encoding a target protein operably linked to the promoter. .
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환용 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 진세노사이드 함량이 증가된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a transgenic plant having an increased ginsenoside content, comprising introducing the transgenic vector into a plant.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환용 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 저항성 및 TMV 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a transgenic plant having environmental stress resistance and TMV resistance, comprising introducing the transforming vector into a plant.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 담마란다이올 생합성 유전자(DDS)의 프로모터를 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention provides a promoter of dammarandiol biosynthesis gene (DDS) having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로모터는 진세노사이드 생산 증진을 위한 형질전환체 생산용 프로모터인 것을 특징으로 하는 프로모터일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the promoter may be a promoter, characterized in that the promoter for transformant production for the enhancement of ginsenoside production.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로모터는 환경 스트레스 저항성 형질전환체 생산용 프로모터인 것을 특징으로 하는 프로모터일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the promoter may be a promoter, characterized in that the promoter for the production of environmental stress resistant transformants.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로모터는 TMV 저항성 형질전환체 생산용 프로모터인 것을 특징으로 하는 프로모터일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the promoter may be a promoter, characterized in that the promoter for producing TMV resistant transformants.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 환경 스트레스가 빛, 호르몬, 가뭄, 저온, 염, 상처, 병원균 및 열 쇼크에 의한 스트레스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 형질전환체 생산용 프로모터인 것을 특징으로 하는 프로모터일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the environmental stress is a promoter for transformant production, characterized in that selected from the group consisting of stress, light, hormones, drought, low temperature, salts, wounds, pathogens and heat shock. It may be a promoter characterized.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 담마란다이올(dammarenediol) 생합성 유전자의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 벡터를 제공한다.In addition, the present invention is characterized by comprising a promoter encoding an isolated dammarenediol biosynthesis gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a base sequence encoding a target protein operably linked to the promoter Provide a conversion vector.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 담마란다이올(dammarenediol) 생합성 유전자의 프로모터에 의해 식물체의 잎과 꽃 조직 및 성숙된 식물체의 뿌리에서 발현되는 목적 단백질인 것을 특징으로 하는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 벡터일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the target protein is expressed in the leaves and flower tissues of plants and the roots of mature plants by a promoter of an isolated dammarenediol biosynthesis gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 It may be a transformation vector comprising a nucleotide sequence encoding the target protein, characterized in that the target protein.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 담마란다이올(dammarenediol) 생합성 유전자의 프로모터에 의해 자스몬산(jasmonic acid) 호르몬 분비시 발현되는 목적 단백질인 것을 특징으로 하는 목적단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 벡터일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the target protein is a target protein that is expressed during the secretion of jasmonic acid (jasmonic acid) hormone by the promoter of the isolated dammarenediol biosynthesis gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 It may be a transformation vector comprising a nucleotide sequence encoding the protein of interest.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 목적 단백질은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 분리된 담마란다이올(dammarenediol) 생합성 유전자의 프로모터에 의해 40~50시간 동안 빛을 처리시 발현되는 목적 단백질인 것을 특징으로 하는 목적단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환용 벡터일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the target protein is a target protein that is expressed upon treatment with light for 40 to 50 hours by a promoter of an isolated dammarenediol biosynthetic gene having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 It may be a transformation vector comprising a nucleotide sequence encoding the protein of interest.
또한, 본 발명은 상기 형질전환용 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 진세노사이드 함량이 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.In addition, the present invention provides a transgenic plant having an increased ginsenoside content, comprising the step of introducing the transforming vector into a plant.
또한, 본 발명은 상기 형질전환용 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 환경 스트레스 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다.The present invention also provides a transgenic plant having environmental stress resistance, comprising the step of introducing the transforming vector into the plant.
나아가 본 발명은 상기 형질전환용 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 TMV 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다.Furthermore, the present invention provides a transgenic plant having TMV resistance, comprising the step of introducing the transforming vector into a plant.
상술한 바와 같이, 본 발명에서는 DDS(dammarenediol synthase) cDNA (ABI22080)에 해당하는 유전자의 5' 비번역 부위를 포함한 프로모터부위를 확보하였고, 바이너리 식물체 발현 벡터를 제조하였다. 애기장대 형질전환체와 인삼 형질전환체에서 프로모터 활성을 조사한 결과, 본 발명에 의한 프로모터를 가지는 형질전환 식물체는 식물 발달 시기별 다른 발현 패턴을 보였고, 상기 프로모터는 자스몬산(jasmonic acid) 호르몬과 빛 및 TMV 감염에 의해 프로모터의 활성이 유도되는 것을 확인하였다.As described above, in the present invention, a promoter region including a 5 'untranslated region of a gene corresponding to a dammarenediol synthase (DDS) cDNA (ABI22080) was secured, and a binary plant expression vector was prepared. As a result of investigating promoter activity in Arabidopsis transformants and ginseng transformants, the transgenic plants having the promoter according to the present invention showed different expression patterns according to the plant development time, and the promoters were characterized by the hormone jasmonic acid and light. And it was confirmed that the activity of the promoter is induced by TMV infection.
따라서, 본 프로모터는 진세노사이드 함량이 증가된 작물, 형질전환 환경 스트레스 저항성 작물, 바이러스 저항성이 강화된 작물을 개발하고자 할 때 효과적으로 이용될 수 있으며, 인삼의 사포닌생합성과정을 이해하고 이를 응용하며, 사포닌 대사공학을 위한 발현시스템 최적화에 크게 기여할 수 있다.Therefore, this promoter can be effectively used to develop crops with increased ginsenoside content, transgenic environment stress resistant crops and crops with enhanced viral resistance, and to understand and apply the saponin biosynthesis process of ginseng, It can greatly contribute to the optimization of expression systems for saponin metabolic engineering.
도 1은 기내배양된 인삼 뿌리(모상근)를 나타내는 도면이다.
도 2는 Genome walker protocol의 flow chart를 나타내는 도면이다.
도 3은 genomic DNA를 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다 (M, 1 kb marker; 1, 인삼의 genomic DNA ; 2, 대조 genomic DNA).
도 4는 인삼의 genomic DNA를 자른 후 전기영동한 결과를 나타내는 도면이다 (M, 1 kb marker; 1, 자르지 않은 genomic DNA; 2, Dra I; 3, EcoR V; 4, Pvu II; 5, Stu I; 6, Pvu II 로 자른 대조 genomic DNA).
도 5는 본 발명에 의한 인삼 사포닌 생합성 관련 DDS 유전자 프로모터 부위 확보를 위한 GenomeWalker 어댑터와 어댑터서열에 있는 프라이머의 구조를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명에 의한 인삼 사포닌 생합성 관련 DDS 유전자 프로모터 영역 클로닝을 위한 GenomeWalking PCR 의 프라이머를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명에 의한 담마란다이올 생합성 유전자(Stu I library)의 GenomeWalker PCR의 산물을 나타내는 도면이다 (M: 1 kb marker, 1~4 : genomic library 1: Dra I, 2: EcoR V, 3: Pvu II, 4 : Stu I).
도 8은 본 발명에 의한 담마란다이올 생합성 유전자(EcoR V library)의 GenomeWalker PCR 산물을 나타내는 도면이다 (M: 1kb marker, 1~4 : genomic library 1: Dra I, 2: EcoR V, 3: Pvu II, 4 : Stu I ).
도 9는 본 발명에 의한 DDS 프로모터를 pGEM T easy vector에 클로닝 한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명에 의한 DDS cDNA와 DDS 프로모터 부위 사이의 뉴클레오타이드와 아미노산 배열의 비교를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명에 의한 DDS 프로모터 유전자의 염기서열을 나타내는 도면이다.
도 12는 본 발명에 의한 DDS 프로모터의 cis-element를 나타내는 도면이다.
도 13a는 본 발명의 DDS 프로모터::GUS를 포함하는 바이너리벡터 제작을 나타내는 모식도이다.
도 13b는 본 발명의 DDS 바이너리벡터 제작에서 M은 1 kb marker를, ①~④는 Sal I 과 BamH I 으로 자른 플라스미드 DNA를 나타내는, 서브클로닝을 확인한 도면이다.
도 14는 본 발명에 의한 Agrobacterium 형질전환체의 plasmid PCR을 나타내는 도면이다.
도 15는 본 발명에 의한 Arabidopsis 형질전환체에서 DDS 프로모터 삽입여부를 PCR 방법과 GUS 염색으로 확인한 도면이다.
도 16a는 본 발명에 의한 Arabidopsis 형질전환체에서 발달 시기에 따른 DDS 프로모터의 발현을 잎과 꽃에서 조직화학적으로 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 16b는 본 발명에 의한 Arabidopsis 형질전환체에서 발달 시기에 따른 DDS 프로모터의 발현 양상을 확인하기 위해 seedling 성장 시기에 따라 GUS 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 17은 본 발명에 의한 DDS 프로모터의 발현을 인삼 성장에 따른 조직화학적 발현을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 18은 본 발명에 의한 형질전환 Arabidopsis 식물을 각각 다른 호르몬을 첨가했을 때 DDS 프로모터의 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 19는 본 발명에 의한 형질전환 Arabidopsis 식물을 암조건과 명조건으로 처리했을 때 DDS 프로모터 활성을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 20a는 본 발명의 DDS 프로모터의 TMV 유도성을 나타내는 것으로, TMV 감염된 담배잎에서 DDS와 TMV-CP의 전사물의 축적을 나타내는 도면이다.
도 20b는 DDS 프로모터의 W box (TTGAC), GT-1 (GAAAAA), SEBF (TGTCNC)를 색으로 표시한 도면이다.
도 20c는 TMV를 처리한 DDS 프로모터::GUS 형질전환 인삼식물체의 GUS 활성을 나타내는 도면이다.
도 21a는 형질전환 담배의 DDS의 발현을 나타내고, destination vector pK7WG2.0으로 삽입한 CaMV35S 프로모터의 조절하에 PgDDS cDNA를 나타낸 도면이다.
도 21b는 유전자 DNA PCR에 의한 소개된 유전자의 확인을 나타낸 도면이다.
도 21c는 야생형(wild-type,WT) 식물의 잎에서 PgDDS 발현과 형질전환 라인(T2, T5 및 T11)을 나타내는 도면이다. 18s RNA는 loading control로 사용했다. 야생형 라인은 Agrobacterium으로 형질전환하지 않았다.1 is a view showing the cultured ginseng root (hair roots) in the cabin.
2 is a diagram illustrating a flow chart of a genome walker protocol.
3 is a diagram showing the results of electrophoresis of genomic DNA (M, 1 kb marker; 1, genomic DNA of ginseng; 2, control genomic DNA).
4 is a diagram showing the results of electrophoresis after cutting genomic DNA of ginseng (M, 1 kb marker; 1, uncut genomic DNA; 2, Dra I ; 3, EcoR V ; 4, Pvu II ; 5, Stu I ; 6, Pvu Control genomic DNA cut by II ).
5 is a view showing the structure of the genomeWalker adapter and primer in the adapter sequence for securing the ginseng saponin biosynthesis-related DDS gene promoter site according to the present invention.
6 is a view showing a primer of GenomeWalking PCR for cloning the ginseng saponin biosynthesis-related DDS gene promoter region according to the present invention.
7 is a view showing the product of GenomeWalker PCR of the dammarandol oligosynthesis gene ( Stu I library) according to the present invention (M: 1 kb marker, 1-4: genomic library 1: Dra I , 2: EcoR V , 3 Pvu II , 4: Stu I ).
8 is a diagram showing a GenomeWalker PCR product of the dhammaranediol biosynthesis gene ( EcoR V library) according to the present invention (M: 1 kb marker, 1-4: genomic library 1: Dra I , 2: EcoR V , 3: Pvu II , 4: Stu I ).
9 is a view showing the result of cloning the DDS promoter according to the present invention to the pGEM T easy vector.
Figure 10 is a view showing a comparison of the nucleotide and amino acid sequence between the DDS cDNA and DDS promoter region according to the present invention.
11 is a diagram showing the nucleotide sequence of the DDS promoter gene according to the present invention.
12 is a diagram illustrating a cis-element of a DDS promoter according to the present invention.
Figure 13a is a schematic diagram showing the production of a binary vector containing the DDS promoter :: GUS of the present invention.
Figure 13b is a 1 kb marker M, ① ~ ④ Sal I and BamH in the DDS binary vector production of the present invention It is a figure which confirmed subcloning which shows the plasmid DNA cut | disconnected by I. FIG.
14 is Agrobacterium according to the present invention A diagram showing plasmid PCR of transformants.
Figure 15 Arabidopsis according to the present invention DDS promoter insertion in the transformant was confirmed by PCR and GUS staining.
Figure 16a is Arabidopsis according to the present invention It is a diagram showing the results of histochemical analysis of the DDS promoter expression in leaves and flowers according to the developmental time in the transformant.
Figure 16b Arabidopsis according to the present invention In order to confirm the expression pattern of the DDS promoter according to the development time in the transformant is a diagram showing the results of measuring the GUS activity according to the seedling growth time.
17 is a diagram showing the results of measuring histochemical expression according to ginseng growth of the expression of the DDS promoter according to the present invention.
Figure 18 is a diagram showing the results of measuring the activity of the DDS promoter when each of the transformed Arabidopsis plants according to the present invention added different hormones.
19 is a diagram showing the results of measuring the DDS promoter activity when the transgenic Arabidopsis plants according to the present invention were treated with dark and light conditions.
20A shows the TMV inducibility of the DDS promoter of the present invention and shows the accumulation of transcripts of DDS and TMV-CP in TMV infected tobacco leaves.
20B is a color-coded diagram of W box (TTGAC), GT-1 (GAAAAA), and SEBF (TGTCNC) of the DDS promoter.
20C is a diagram showing GUS activity of TMDS-treated DDS promoter :: GUS transformed ginseng plant.
Fig. 21A shows the expression of DDS in transgenic tobacco and shows PgDDS cDNA under the control of the CaMV35S promoter inserted into the destination vector pK7WG2.0.
Figure 21B shows the identification of introduced genes by gene DNA PCR.
FIG. 21C is a diagram showing PgDDS expression and transformation lines (T2, T5 and T11) in the leaves of wild-type (WT) plants. 18s RNA was used as loading control. Wild-type lines were not transformed with Agrobacterium.
본 발명은 인삼 사포닌 생합성 관련 유전자인 담마란다이올 생합성 유전자의 프로모터를 클로닝하여, 식물세포 형질 전환용 발현 벡터를 제작하였으며 동일 벡터들의 발현을 실험을 통해 확인한 바 스트레스 유도성이 뛰어난 것으로 나타나 본 발명을 완성하게 되었다. The present invention cloned the promoter of the Dhammarandiol biosynthesis gene, which is a gene related to ginseng saponin biosynthesis, to produce an expression vector for plant cell transformation, and the expression of the same vectors was confirmed through experiments to show excellent stress induction. It was completed.
본 발명에서 인삼 모상근에서 genomic DNA의 분리는 DNeasy Plant Maxi prep kit (Qiagen)의 manual에 따라 수행하였고 인삼 담마란다이올 생합성 유전자(DDS 유전자)의 프로모터 부위를 얻기 위해서 Genome Walking PCR (Clontech) 방법을 이용하였다 (도 2 참조). 염기서열 분석을 위하여 pGEM T easy vector에 클로닝 하였고, DDS에 특이적인 프라이머 세트를 이용해 재조합벡터에서 insert 확인을 하였다. Genomic Walker library를 이용하여 확보한 DDS 유전자의 프로모터 염기 서열을 결정했다. 그 결과 DDS cDNA(ABI22080) 유전자의 5’비번역 부위를 포함하는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DDS 프로모터를 확인하였다. Isolation of genomic DNA from ginseng hairy roots was performed according to the manual of DNeasy Plant Maxi prep kit (Qiagen), and genome walking PCR (Clontech) method was used to obtain the promoter region of ginseng dammarandiol biosynthesis gene (DDS gene). (See FIG. 2). The gene was cloned into pGEM T easy vector for sequencing and inserted into the recombinant vector using a primer set specific to DDS. The promoter sequence of the DDS gene obtained using the Genomic Walker library was determined. As a result, the DDS promoter having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 including the 5 'untranslated region of the DDS cDNA (ABI22080) gene was identified.
본 발명에 의한 상기 프로모터 내의 발현 조절 인자를 분석하기 위한 PLACE (A database of Plant cis-acting Regulatory DNA elements) program을 이용하여 분석했다. 그 결과 putative cis 서열을 얻을 수 있었고, 이를 바탕으로 사포닌 합성에 관련된 유전자들의 발현에 영향을 미치는 요인을 알 수 있다. 조절인자로 빛, 호르몬, 가뭄, 저온, 염, 상처, 병원균, 열 쇼크가 존재함을 알 수 있었다 (도 12, 표 3 참조).The analysis was performed using a PLACE (A database of Plant cis-acting Regulatory DNA elements) program for analyzing expression regulators in the promoter according to the present invention. As a result, the putative cis sequence was obtained, and based on this, the factors influencing the expression of genes related to saponin synthesis were identified. As a regulator, light, hormones, drought, low temperature, salts, wounds, pathogens, heat shock were present (see Fig. 12, Table 3).
또한, 본 발명은 상기 DDS 프로모터를 포함하는 식물체의 형질전환용 바이너리 벡터 (pBI101)를 제공함에 특징이 있다. 상기 바이너리 벡터의 식물체로의 도입은 당 분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 아그로박테리움-매개에 의한 방법을 사용하여 본 발명의 재조합 벡터로 애기장대를 형질전환하였다. In addition, the present invention is characterized by providing a binary vector (pBI101) for transformation of a plant comprising the DDS promoter. Introduction of the binary vector into the plant can be used a method known in the art. For example, but not limited to, the Agrobacterium sp.-mediated method, particle gun bombardment, silicon carbide whiskers, sonication, electroporation Precipitation by electroporation and polyethylene glycol (PEG) can be used. In one embodiment of the present invention, Arabidopsis was transformed with the recombinant vector of the present invention using the Agrobacterium-mediated method.
또한, 본 발명은 본 발명의 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입한 후 이를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 식물체의 환경 스트레스 저항성을 증가시키는 방법은 식물체 내로 DDS 프로모터 유전자를 도입함으로써 식물체가 환경 스트레스를 받게 되는 경우 상기 유전자의 발현이 유도되어 환경 스트레스 방어 기작과 관련된 유전자군의 발현이 유도되도록 함으로써 식물체의 환경 스트레스 저항성 형질을 증가시키거나 또는 환경 스트레스 저항성 형질이 새롭게 부여되도록 하는 방법이다.The present invention also provides a method of increasing the environmental stress resistance of a plant comprising the step of inserting the gene of the present invention into a plant expression vector and then introducing it into the plant. The method of increasing the environmental stress resistance of the plant according to the present invention is to introduce the DDS promoter gene into the plant when the plant is subjected to environmental stress so that the expression of the gene is induced to induce the expression of the gene group related to the environmental stress defense mechanism By increasing the environmental stress-resistant trait of the plant or to give a new environmental stress-resistant trait.
본 발명에서 "환경 스트레스"란 식물체의 성장 또는 생산성을 저하시키는 외부적인 요인을 말하며 크게 생물학적 스트레스(biotic stress)와 비생물학적 스트레스(abiotic stress)로 대별된다. 생물학적 스트레스로는 대표적으로 병원균을 들 수 있으며 비생물학적 스트레스로는 고농도의 염, 저온, 빛, 호르몬, 가뭄, 상처 및 열 쇼크 등이 포함된다.In the present invention, "environmental stress" refers to an external factor that lowers the growth or productivity of a plant and is largely classified into a biological stress and an abiotic stress. Biological stresses typically include pathogens, and abiotic stresses include high concentrations of salt, low temperature, light, hormones, droughts, wounds and heat shock.
"환경 스트레스 저항성"이란 상기와 같은 환경 스트레스에 의한 식물체의 성장 저하 또는 생산성의 저하가 억제되거나 지연되는 형질을 말한다.The term " environmental stress resistance "refers to a trait that inhibits or delays plant growth or productivity deterioration due to such environmental stresses.
"환경 스트레스 저항성 전사인자"란 상술한 바와 같은 환경 스트레스에 의해 그 발현이 유도되어 환경 스트레스에 대한 방어기작과 관련된 유전자의 발현을 유도하는 활성을 가진 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 말한다. The "environmental stress resistant transcription factor" refers to a protein having an activity or a gene encoding the same, the expression of which is induced by environmental stress as described above and induces the expression of a gene associated with a defense mechanism against environmental stress.
상기 본 발명에서는 GUS 리포터 유전자가 함유된 벡터(pBI101)를 제조하였고, 상기 GUS 리포터 유전자는 외래 유전자의 한 예로서 다른 유용한 목적의 외래 유전자로 치환할 수 있음은 당업자에게 자명하다.In the present invention, a vector containing a GUS reporter gene (pBI101) was prepared, and it is apparent to those skilled in the art that the GUS reporter gene may be replaced with a foreign gene of another useful purpose as an example of a foreign gene.
본 발명에서 DDS 프로모터에 의해 GUS 리포터 유전자를 표현하는 애기장대 형질전환체와 인삼 형질전환체를 완성한 후, 식물 생장 발달에 따른 GUS 발현을 분석하였다. 또한 애기장대 형질전환체에 대한 빛과 호르몬의 영향을 분석하였다. TMV 감염에 대한 DDS 프로모터의 전사 활성을 측정하였다. 그 결과 애기장대 및 인삼 형질전환체의 식물 생장 발달에 따른 DDS 프로모터의 발현은 도 16 및 도 17과 같은 결과를 확인하였고, 자스몬산(jasmonic acid) 호르몬과 빛에의 해 반응이 유도됨을 확인 하였다 (도 18, 18 참조).형질전환 인삼 잎에 TMV를 접종했을 때, GUS 활성이 증가해, 프로모터가 TMV를 방어하고, DDS 유전자 발현을 활성화하는 배열을 포함한다는 것을 알 수 있었다. DDS 유전자를 발현하는 형질전환 담배 식물은 의학적으로 유용한 담마란다이올(dammarenediol-II)을 생산했고, TMV에 대한 증가된 저항성을 보여주었다.
In the present invention, after completing the Arabidopsis transformant and the ginseng transformant expressing the GUS reporter gene by the DDS promoter, GUS expression according to plant growth development was analyzed. We also analyzed the effects of light and hormones on Arabidopsis transformants. The transcriptional activity of the DDS promoter against TMV infection was measured. As a result, the expression of the DDS promoter according to the plant growth development of Arabidopsis and ginseng transformant was confirmed as shown in Figures 16 and 17, it was confirmed that the response to the hormone and the jasmonic acid (jasmonic acid) hormone is induced. When the transgenic ginseng leaves were inoculated with TMV, the GUS activity was increased, indicating that the promoter contained an array for defending TMV and activating DDS gene expression. Transgenic tobacco plants expressing the DDS gene produced the medically useful dammarenediol-II and showed increased resistance to TMV.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples.
<< 실시예Example 1> 1>
인삼 Ginseng 모상근으로부터From hair roots GenomeWalkerGenomeWalker LibraryLibrary 제작 making
인삼 모상근에서 genomic DNA의 분리는 DNeasy Plant Maxi prep kit (Qiagen)의 manual에 따라 수행하였다. 배양한 인삼 모상근 (도 1 참조) 1 g 을 액체 질소 하에서 잘 부순 다음, AP1 버퍼 5 ml을 넣고 vortex하여 잘 섞어 주었다. 65℃에서 10 분 간 반응시켜 세포를 용해시키고, AP2 버퍼 1.8 ml을 첨가하여 단백질과 폴리사카라이드(polysaccharide) 등을 침전시켰다. 4,000 g에서 5분간 원심분리한 다음, 상층액을 QIAshredder Maxi spin column에 넣고 5분간 원심분리하였다. 빠져나온 용액의 1.5 V의 AP3/E 버퍼를 넣고 바로 vortex하여 섞어준 다음, DNeasy Maxi spin column에 넣은 후 5 분 간 원심분리하였다. AW 버퍼 12 ml로 column을 세척한 후 AE 버퍼를 column에 넣어 DNA를 용출하였다. 인삼의 담마란다이올 생합성(dammarenediol synthase) 유전자의 프로모터 부위를 얻기 위해서, GenomeWalking PCR (Clontech) 방법을 이용하였다 (도 2 참조).
Isolation of genomic DNA from ginseng hairy root was performed according to the manual of DNeasy Plant Maxi prep kit (Qiagen). 1 g of cultured ginseng hairy root (see FIG. 1) was crushed well under liquid nitrogen, and 5 ml of AP1 buffer was added and vortexed and mixed well. Cells were lysed by reaction at 65 ° C. for 10 minutes, and 1.8 ml of AP2 buffer was added to precipitate proteins, polysaccharides, and the like. After centrifugation at 4,000 g for 5 minutes, the supernatant was placed in a QIAshredder Maxi spin column and centrifuged for 5 minutes. 1.5 V AP3 / E buffer solution was added, vortex and mixed immediately, and then placed in a DNeasy Maxi spin column and centrifuged for 5 minutes. After washing the column with 12 ml of AW buffer, DNA was eluted by adding the AE buffer to the column. In order to obtain the promoter region of the dammarenediol synthase gene of ginseng, GenomeWalking PCR (Clontech) method was used (see FIG. 2).
① Genomic DNA의 제한효소 절단① Restriction Enzyme Cleavage of Genomic DNA
Genome library를 제작하기 위해, genomic DNA를 4 종류의 제한효소 즉, Dra I, EcoR V, Pvu II, Stu I을 사용하여 blunt-end로 각각 자르고, positive control로써 인간 genomic DNA를 Pvu II로 절단하였다. Genomic DNA 2.5 μg에 10 제한효소 버퍼를 넣고 4℃에서 2시간 가량 둔 다음, 각각의 제한효소 40 U을 넣고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 다시 제한효소 40 U을 더 넣고 37℃에서 밤새 반응시켰다. To construct the genome library, genomic DNA was purified using four types of restriction enzymes: Dra I , EcoR V , and Pvu. II and Stu I were cut into blunt-ends, respectively, and Pvu of human genomic DNA was used as a positive control. Cut to II . 10 restriction enzyme buffer was added to 2.5 μg of genomic DNA for 2 hours at 4 ° C, and 40 U of each restriction enzyme was added and reacted at 37 ° C for 2 hours. Again 40 U of restriction enzyme was added and reacted overnight at 37 ° C.
② DNA의 정제② Purification of DNA
제한효소로 절단된 DNA가 들어있는 각 튜브에 동량의 페놀을 첨가하고 잘 섞어준 후, 수용액층과 유기용매층이 분리되도록 원심분리를 잠깐 하였다. 상층액을 새 tube에 옮겨 담고, 동량의 클로로포름(chloroform)을 넣어준 다음, 잘 섞고 원심분리하였다. 상층액을 다시 새 tube에 옮기고, 2 V의 95% 에탄올과, 1/10 V의 3 M NaOAc(pH 4.5)를 첨가하였다. 잘 섞이도록 한 후, 4℃, 14,000 rpm에서 15 분 간 원심분리하였다. 상층을 버리고 70% 에탄올로 pellet을 세척하였다. DNA pellet은 공기 중에서 잘 말린 후, TE 버퍼에 녹였다.The same amount of phenol was added to each tube containing the DNA cut by restriction enzyme and mixed well, followed by briefly centrifugation to separate the aqueous layer and the organic solvent layer. Transfer the supernatant to a new tube, add the same amount of chloroform (chloroform), mix well and centrifuged. The supernatant was transferred back to a new tube and 2 V 95% ethanol and 1/10 V 3 M NaOAc (pH 4.5) were added. After mixing well, the mixture was centrifuged at 4 ° C. and 14,000 rpm for 15 minutes. Discard the top layer and wash the pellet with 70% ethanol. The DNA pellet was dried well in air and then dissolved in TE buffer.
③ GenomeWalker adaptor ligation③ GenomeWalker adapter ligation
정제한 각각의 genomic library에 GenomeWalker adaptor, T4 DNA ligase를 넣고 16℃에서 밤새 반응시킨 후, 70℃에서 5 분 간 두어 반응을 종료시켰다. GenomeWalker adapter and T4 DNA ligase were added to each of the purified genomic libraries and reacted overnight at 16 ° C., followed by 5 minutes at 70 ° C. to terminate the reaction.
④ GenomeWalker PCR④ GenomeWalker PCR
상기 제작한 genome library로부터, adaptor primer (AP1)와 증폭하고자 하는 유전자에 특이적인 프라이머 (GSP2)로 첫 번째 PCR을 수행하였다. 첫 번째 PCR 산물을 두 번째 nested PCR하기 위한 주형으로 쓰기 위해 적당히 희석한 다음, adaptor primer (AP2)와 nested gene-specific primer (GSP1)로 두 번째 PCR을 하였다. GSP1과 GSP2 프라이머는 각 유전자의 인트론이 없는 부분에서 결정하였으며 cDNA의 염기서열에 근거하여 특이적으로 design하였다 (표 1 참조). GenomeWalking PCR 조건은 표 2와 같다.
From the genome library, the first PCR was performed with an adapter primer (AP1) and a primer specific for the gene to be amplified (GSP2). The first PCR product was diluted appropriately to serve as a template for the second nested PCR, followed by a second PCR with an adapter primer (AP2) and a nested gene-specific primer (GSP1). GSP1 and GSP2 primers were determined in the intron-free region of each gene and were specifically designed based on the cDNA base sequence (see Table 1). GenomeWalking PCR conditions are shown in Table 2.
72℃ 3' 94 ℃ 25 "
72 ℃ 3 '
72℃ 3' 94 ℃ 25 "
72 ℃ 3 '
67℃ 3'94 ℃ 25 "
67 ℃ 3 '
67℃ 3'94 ℃ 25 "
67 ℃ 3 '
인삼 모상근으로부터 genomic DNA를 분리한 후, DNA의 크기와 상태를 확인하기 위해 키트 안에 있는 control genomic DNA와 같이 전기영동하였다 (도 3 참조). After separating genomic DNA from ginseng hairy root, it was electrophoresed with control genomic DNA in the kit to check the size and state of DNA (see FIG. 3).
Genome library를 제작하기 위해, genomic DNA를 blunt-end로 자르는 제한 효소, Dra I, EcoR V, Pvu II, Stu I을 각각 처리한 후, 전기영동하여 확인하였다 (도 4 참조).
To construct the genome library, restriction enzymes that cut genomic DNA into blunt- ends , Dra I , EcoR V , and Pvu After treating II and Stu I , respectively, it was confirmed by electrophoresis (see FIG. 4).
<< 실시예Example 2> 2>
인삼 Ginseng 모상근의Hairline 담마란다이올Dhammaranddiol 생합성 유전자의 프로모터 부위 확보 및 Promote promoter region of biosynthetic gene and 클로닝Cloning
GenomeWalking PCR에 의해 얻은 산물을 염기서열 분석을 위하여 pGEM T easy vector에 클로닝하였다. 재조합벡터에서 insert확인은 도5 에서 보는 바와 같이 어댑터서열에 있는 프라이머와 DDS에 특이적인 프라이머 세트를 이용하였다. 또한 클로닝사이트를 절단하는 제한효소를 이용하여 insert삽입여부와 크기도 재차 확인하였다.The product obtained by GenomeWalking PCR was cloned into pGEM T easy vector for sequencing. Insertion confirmation in the recombinant vector was used as primers in the adapter sequence and primer set specific to the DDS as shown in FIG. In addition, the insertion and size of the insert were again confirmed using restriction enzymes that cleave the cloning site.
현재까지 DDS 유전자가 클로닝된 보고가 없기 때문에 인삼에서 DDS 유전자의 intron 유무를 알 수 없었다. 따라서, DDS 유전자 프로모터를 영역을 클로닝하기 위해 ATG 개시 코돈 down stream 쪽으로부터 적당한 간격을 두고 프라이머를 여러 개 제작하여 실험을 수행하였다 (도 6 참조). 각각의 GenomeWalking library를 주형으로 하여, 1차 PCR은 DDS-GSP2/AP1 프라이머로, 2차 PCR은 DDS-GSP1/AP2 프라이머를 이용하였다 (표 1 참조). 2차 PCR을 거친 후 얻은 산물은 도 7과 같다. Stu I library에서 얻은 약 1 kb의 산물을 pGEM T easy vector에 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과, 본 연구팀이 기 확보한 DDS cDNA (ABI22080)와 일치하는 부분이 없었을 뿐 아니라 DDS 유전자의 ORF도 갖고 있지 않았다. To date, there is no report of cloning of the DDS gene, so it is not known whether DDS gene is intron in ginseng. Therefore, experiments were performed by constructing several primers at appropriate intervals from the ATG start codon down stream to clone the region of the DDS gene promoter (see FIG. 6). Using each GenomeWalking library as a template, the primary PCR used DDS-GSP2 / AP1 primers and the secondary PCR used DDS-GSP1 / AP2 primers (see Table 1). The product obtained after the second PCR is shown in FIG. 7. About 1 kb of the product obtained from the Stu I library was cloned into pGEM T easy vector to analyze the sequencing. As a result, there was no match with the DDS cDNA (ABI22080) secured by the research team, and also the ORF of the DDS gene. There was not.
다시 다른 위치에 프라이머 (DDS-GSP6와 DDS-GSP7)를 디자인하였다 (도 6 참조). DDS-GSP7/AP1 프라이머 (서열번호 3)로 1차 PCR, DDS-GSP6/AP2 (서열번호 2) 프라이머로 2차 PCR하여 증폭시킨 결과, 도 8에서 보는 것과 같이 EcoR V library로부터 약 1 kb의 산물을 얻었다. Again primers (DDS-GSP6 and DDS-GSP7) were designed at different locations (see FIG. 6). DDS-GSP7 / AP1 primer (SEQ ID NO: 3) as the primary PCR, DDS-GSP6 / AP2 (SEQ ID NO: 2) The result of the second PCR amplified with primers of approximately 1 kb from the EcoR V library as shown in Figure 8 The product was obtained.
염기 서열 분석 결과, 도 10 에서 보는 것과 같이 DDS-GSP6 프라이머로 얻은 1kb의 PCR 산물은 DDS cDNA (ABI22080)의 염기서열과 100% 일치함을 알 수 있었다. 도 10 에서 (A)는 DDS cDNA 염기서열이고, (B)는 본 실험에서 얻은 1kb의 담마란다이올 생합성 유전자의 프로모터 염기서열이다. 빨간색 염기는 서로 일치하는 부분이며, 아미노산 서열도 100% 일치함을 확인하였다. DDS유전자는 5' 비번역 부위에 인트론이 존재하지 않았다.As shown in FIG. 10, the PCR product of 1 kb obtained with the DDS-GSP6 primer was 100% identical to the nucleotide sequence of the DDS cDNA (ABI22080). In Figure 10 (A) is a DDS cDNA nucleotide sequence, (B) is a promoter nucleotide sequence of 1 kb of dammarandol oligo synthesis gene obtained in this experiment. The red bases were identical to each other, and the amino acid sequence was confirmed to be 100% identical. The DDS gene did not have an intron at the 5 'untranslated site.
이상의 결과, 본 발명에서 기 확보한 사포닌 합성에 중요한 유전자로 밝혀진 DDS cDNA (ABI22080)에 해당하는 유전자의 5’비번역 부위를 포함한 프로모터부위를 확보하였다 (서열번호 1)(도 11 참조). 도 11에서 단백질 합성 개시 코돈‘ATG'는 밑줄 친 굵은 글씨체로 표시하였다. 도 11에서 나타난 바와 같이, DDS 유전자의 프로모터는 번역 개시점의 상류로부터 933bp 까지의 영역에 해당하는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성된다.
As a result, a promoter region including a 5 'untranslated region of a gene corresponding to DDS cDNA (ABI22080), which was found to be an important gene for saponin synthesis secured in the present invention, was secured (SEQ ID NO: 1) (see FIG. 11). In Figure 11 protein synthesis start codon 'ATG' is shown in bold underlined font. As shown in Figure 11, the promoter of the DDS gene consists of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1 corresponding to the region up to 933bp upstream of the translation start point.
<< 실시예Example 3> 3>
사포닌 생합성관련유전자의 프로모터 염기서열 결정 및 분석Determination and Analysis of Promoter Sequences of Saponin Biosynthesis Related Genes
Genomic Walker library를 이용하여 확보한 DDS 유전자의 프로모터 염기서열을 결정하였다. 인삼의 약효를 대표하는 진세노이드 (dammarene-type triterpene)의 생성에 가장 중요한 역할을 하는 담마란다이올 생합성 유전자의 프로모터 서열은 현재까지 보고된 바가 없으므로, 유전자의 발현에 영향을 미칠 것으로 예상되는 putative cis-elements를 PLACE program (A database of Plant cis-acting Regulatory DNA elements) 을 이용하여 찾아 비교, 분석하였다.Promoter sequence of the DDS gene obtained using the Genomic Walker library was determined. The promoter sequence of the dammaranediol biosynthesis gene, which plays the most important role in the production of ginseng (dammarene-type triterpene), which represents the efficacy of ginseng, has not been reported to date, so putative cis is expected to affect the expression of the gene. -elements were found, compared and analyzed using the PLACE program (A database of Plant cis-acting Regulatory DNA elements).
그 결과 도 12와 표 3에서 보는 것과 같이, TATA box는 -142/-135에 존재하고, 전사 개시점으로부터 상류에 14 개의 CAAT box가 존재하였다. 빛, 호르몬, 그리고 가뭄, 저온, 염, 상처, 병원균, 열 쇼크 등과 같은 스트레스와 연관있는 조절인자들이 존재하였다.
As a result, as shown in FIG. 12 and Table 3, the TATA box was present at -142 / -135, and there were 14 CAAT boxes upstream from the transcription start point. There were light, hormonal and stress-related regulators such as drought, low temperature, salts, wounds, pathogens and heat shock.
<< 실시예Example 4> 4>
바이너리벡터Binary vector 제작 making
식물체 내에서의 DDS 프로모터의 기능을 검증하기 위해 바이너리 벡터인 pBI101 벡터를 이용하여 제작하였다. pGEM T easy 벡터에 들어있는 DDS 프로모터를 5‘ 쪽은 AP2 프라이머, 3‘ 쪽은 BamH I 제한효소 인식부위를 첨가시킨 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하여 프로모터 부위만 얻게 하였다. 도 5 에서 보는 것처럼 GenomeWalker adaptor에는 Sal I 제한 효소 인식 부위가 존재한다. In order to verify the function of the DDS promoter in the plant was constructed using the binary vector pBI101 vector. The DDS promoter in the pGEM T easy vector was amplified by PCR using primers added with AP2 primer on the 5 'side and BamH I restriction enzyme recognition site on the 3' side to obtain only the promoter region. As shown in Figure 5 GenomeWalker adapter There is a Sal I restriction enzyme recognition site.
여기에 사용한 프라이머는 DDS (forward : AP2 primer, reverse : 5’-CGggatccCTTCAGCTTCCACATTCT-3’)이며, 첨가시킨 제한 효소 인식 부위는 밑줄로 표시하였다 (도 5 참조). The primer used here was DDS (forward: AP2 primer, reverse: 5'-CG ggatcc CTTCAGCTTCCACATTCT-3 '), and the restriction enzyme recognition site added was underlined (see FIG. 5).
pBI101 벡터와 제한효소 인식부위를 넣어 PCR한 각각의 프로모터를 Sal I과 BamH I으로 자른 후, ligation하여 E. coli (XL-1 blue)에 형질 전환하였다. 형질전환된 E. coli 로부터 재조합 벡터를 miniprep하여 Sal I과 BamH I으로 자른 후, 프로모터의 삽입 여부를 확인하였다 (도 13 참조).
Each promoter was PCR-cut into Sal I and BamH I with pBI101 vector and restriction enzyme recognition site, and then ligation was transformed into E. coli (XL-1 blue). Miniprep recombinant vector from transformed E. coli After cutting with Sal I and BamH I , the insertion of the promoter was confirmed (see FIG. 13).
<< 실시예Example 5> 5>
DDSDDS 프로모터 삽입 운반체의 Of promoter insertion carrier AgrobacteriumAgrobacterium 형질전환 Transformation 및 이를 이용한 애기장대 형질전환And Arabidopsis transformation using the same
확인된 벡터를 애기장대에 형질전환하기 위해, 우선 Agrobacterium에 형질전환하였고 형질전환된 Agrobacterium으로부터 플라스미드 DNA를 miniprep하여 제한 효소로 잘라서 프로모터가 제대로 들어가 있는지 최종적으로 확인하였다. DDS 프로모터가 삽입된 Agrobacterium 형질전환체는 애기장대 형질전환에 사용하였다. In order to transform the identified vector into Arabidopsis, Agrobacterium was first transformed, and plasmid DNA was minipreped from the transformed Agrobacterium and cut with restriction enzymes to finally check whether the promoter was properly inserted. Agrobacterium with DDS promoter Transformants were used for Arabidopsis transformation.
식물 형질전환용 바이너리 벡터인 pBI101에 삽입된 DDS 프로모터 플라스미드 DNA를 Agrobacterium (GV3101) competent cell에 넣은 다음, 바로 액체 질소에 2 분 간 담가두었다. 37℃에 5 분 동안 두어 다시 녹인 다음, LB 액체 배지를 넣고 30℃에서 2 시간 동안 전배양하고 항생제가 포함된 LB 배지에서 형질전환된 콜로니가 생성될 때까지 약 2 일 간 배양하였다. 형질전환된 Agrobacterium으로부터 플라스미드를 분리한 후, 서열번호 4 및 서열번호 5의 각 프로모터 특이적인 프라이머(표 4 참조)로 플라스미드를 PCR하여 프로모터의 삽입 여부를 확인하였다 (도 14 참조). DDS promoter plasmid DNA inserted in pBI101, a plant transformation binary vector, was placed in an Agrobacterium (GV3101) competent cell and immediately immersed in liquid nitrogen for 2 minutes. After dissolving for 5 minutes at 37 ° C, LB liquid medium was added, pre-cultured at 30 ° C for 2 hours, and incubated for about 2 days until transformed colonies were generated in LB medium containing antibiotics. After separating the plasmid from the transformed Agrobacterium , the plasmid was PCR with each promoter specific primer (see Table 4) of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 to confirm the insertion of the promoter (see Figure 14).
파종한 후 20℃ 배양기 (16시간 낮/8시간 밤)에서 약 4 주간 생육된 애기장대 (Arabidopsis thaliana ecotype Columbia) 식물체의 일차 추대를 제거하여 최소한 3-4개의 이차 추대를 유도하였다. 식물 형질전환용 프로모터 삽입 운반체가 보유된 형질전환 Agrobacterium 배양 세포에 0.25% tween20이 함유된 5% sucrose용액으로 희석하여 현탁한 후, 애기장대 꽃봉우리에 분사하여 Agrobacterium을 감염시켰다. 충분한 습도를 유지한 상태로 하룻밤 동안 배양한 후 20℃ 배양기 (16 시간 낮/8 시간 밤)에서 4~5 일간 배양한 후 상기와 동일한 방법으로 배양 희석한 Agrobacterium을 재차 꽃봉우리에 분사하였다. 20℃ 배양기에서 silique이 갈색으로 완전히 성숙할 때 까지 약 5 주간 생육시킨 후 채종하였다. After seeding, primary harvesting of Arabidopsis thaliana ecotype Columbia plants grown for about 4 weeks in a 20 ° C. incubator (16 hours day / 8 hours night) was removed to induce at least 3-4 secondary harvests. Transgenic Agrobacterium culture cells containing a promoter for plant transformation were diluted with 5% sucrose solution containing 0.25% tween20 and suspended, and then sprayed on Arabidopsis buds to infect Agrobacterium . After incubation overnight with sufficient humidity, the incubator was incubated for 4 to 5 days in a 20 ° C. incubator (16 hours day / 8 hours night), and then sprayed on the buds of the diluted Agrobacterium . In a 20 ℃ incubator, the silique was grown for about 5 weeks until full maturation and browning.
<< 실시예Example 6> 6>
애기장대 형질전환체 선별Arabidopsis transformant screening
형질전환 애기장대로부터 얻은 종자 (F0)는 멸균하여 항생제 (kanamycin)가 포함된 1/2× MS 배지에 파종하여 선별한 후 항생제 내성을 지닌 식물체는 토양으로 옮겨 F1 세대의 형질전환체를 선발하였다. 각 식물체로부터 genomic DNA를 추출하여 프로모터의 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 분석으로 형질전환체를 확인하였다. Genomic DNA를 이용한 PCR 분석은 식물체의 어린 잎을 약 0.5cm2 으로 잘라 마이크로튜브에 넣고 50 μl의 extraction buffer (500 mM NaCl, 100 mM Tris-Cl, pH 7.5, 50 mM EDTA, pH 7.5)로 hand homogenize한 후, 150μl의 extraction buffer를 더 첨가하여 완전히 균질화하였다. 20% SDS를 20μl 넣고 65℃에서 10분 간 반응시켜 cell lysis하였다. 동량의 P:C:I (25:24:1)를 넣고 잘 흔들어 섞은 후, 4℃, 10,000 g에서 3분 간 원심분리 하였으며, 상등액을 덜어내어 2 volume의 에탄올을 첨가하고 -20℃에서 30분 간 정치시킨 후, 4℃, 10,000 g에서 10분 간 원심 분리하였다. 생성된 DNA pellet은 70% 에탄올로 씻어 준 다음, 10μl의 TE에 녹였다. 20μl의 PCR 반응에 5μg의 genomic DNA를 사용하였다.Seeds (F0) from transgenic Arabidopsis were sterilized and sown in 1/2 × MS medium containing antibiotics (kanamycin), and antibiotic-resistant plants were transferred to soil to select F1 generation transformants. . Genomic DNA was extracted from each plant and transformants were identified by PCR analysis using specific primers of the promoter. PCR analysis using genomic DNA measures approximately 0.5 cm 2 of young leaves of plants. Cut into the microtubes and hand homogenized with 50 μl of extraction buffer (500 mM NaCl, 100 mM Tris-Cl, pH 7.5, 50 mM EDTA, pH 7.5), and further homogenized by adding 150 μl of extraction buffer. 20 μl of 20% SDS was added and reacted at 65 ° C. for 10 minutes for cell lysis. After adding the same amount of P: C: I (25: 24: 1) and shaking well, the mixture was centrifuged at 10,000 g for 3 minutes at 4 ° C. The supernatant was removed and 2 volumes of ethanol were added and 30 ° C at -20 ° C. After standing still for 10 minutes, centrifugation was performed at 10,000 g for 10 minutes at 4 ° C. The resulting DNA pellet was washed with 70% ethanol and dissolved in 10 μl of TE. 5 μg of genomic DNA was used for 20 μl of PCR reaction.
그 결과 DDS 프로모터를 가진 바이너리벡터로 형질전환 시켜서 얻은 F0종자를 카나마이신 배지에서 발아시켰고, 이중 카나마이신 내성을 보이는 22식물체를 토양으로 옮겼다. 이들 형질전환체의 프로모터 삽입여부를 PCR방법과 GUS 염색으로 확인한 후, 18개의 독립적인 형질전환개체에서 F1 종자를 수확하였다 (도 15 참조).
As a result, F0 seeds obtained by transforming with a binary vector having a DDS promoter were germinated in kanamycin medium, and 22 plants showing kanamycin resistance were transferred to the soil. After confirming the promoter insertion of these transformants by PCR and GUS staining, F1 seeds were harvested from 18 independent transformants (see FIG. 15).
<< 실시예Example 7> 7>
DDSDDS 프로모터:: Promoter :: GUSGUS 형질전환체 Transformant 라인선별을Line selection 위한 for GUSGUS 발현 분석 Expression analysis
DDS 프로모터의 형질전환체로부터 얻은 F1 종자를 rax가 포함된 종자 멸균액으로 소독한 다음, MS 배지에 파종하여 발아 후 1, 5, 15, 20 일 간 배양하였다. 각 시기별 식물체를 GUS 추출 버퍼 (50 mM NaPO4, pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% triton X-100, 0.1% sarcosyl, 10 mM β-mercaptoethanol)를 넣고 hand-homogenizer로 조직을 파쇄한 다음, 10 분 간 4℃에서 10,000 g로 원심분리하여 세포 추출액만 얻었다. 획득된 세포 추출액은 1 mM MUG (4-methylumbelliferyl glucuronide)와 섞어 37℃에서 1 시간 동안 반응시킨 다음, 0.2 M Na2CO3를 넣어 반응을 종료시켰다. 반응이 종료된 반응액은 형광계(fluorometer)를 이용하여 형광 (excitation 365nm, emission 455nm)을 측정하였다. 또한, 1mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide)를 기질로 하는 조직염색액 (100mM sodium phosphate (pH 7.0), 10mM EDTA, 0.5mM potassium ferricyanide, 0.5mM potassium ferrocyanide, 0.1% Triton X-100)에 담가 약 6 ~ 24 시간 동안 반응시켰다.
F1 seeds obtained from transformants of the DDS promoter were disinfected with seed sterile solution containing rax, and then seeded in MS medium and cultured for 1, 5, 15 and 20 days after germination. Plants at each time were put in GUS extraction buffer (50 mM NaPO 4 , pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% triton X-100, 0.1% sarcosyl, 10 mM β-mercaptoethanol) and crushed by hand-homogenizer. Only cell extracts were obtained by centrifugation at 10,000 g at 4 ° C. for 10 min. The obtained cell extract was mixed with 1 mM MUG (4-methylumbelliferyl glucuronide) and reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then 0.2 M Na 2 CO 3 was added to terminate the reaction. The reaction solution after the reaction was measured for fluorescence (excitation 365nm, emission 455nm) by using a fluorometer (fluorometer). In addition, a tissue stain based on 1 mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide) (100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, 0.1% Triton X-100) was reacted for about 6 to 24 hours.
<< 실시예Example 8> 8>
DDSDDS 프로모터:: Promoter :: GUSGUS 형질전환체의 식물 생장 발달에 따른 According to the plant growth of transformants GUSGUS 발현 분석 Expression analysis
① 형질전환 애기장대 식물① Transgenic Arabidopsis Plant
DDS 프로모터의 형질전환체로부터 얻은 F1 종자를 rax가 포함된 종자 멸균액으로 소독한 다음, MS 배지에 파종하여 발아 후 1, 5, 15, 20 일 간 배양하였다. 또한, 토양으로 옮겨 각 시기별로 샘플링한 식물체를 GUS 추출 버퍼 (50mM NaPO4, pH 7.0, 10mM EDTA, 0.1% triton X-100, 0.1% sarcosyl, 10mM β-mercaptoethanol)를 넣고 hand-homogenizer로 조직을 파쇄한 다음, 10분 간 4℃에서 10,000g로 원심분리하여 세포 추출액만 얻었다. 획득된 세포 추출액은 1mM MUG (4-methylumbelliferyl glucuronide)와 섞어 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 0.2M Na2CO3를 넣어 반응을 종료시켰다. 반응이 종료된 반응액은 형광계(fluorometer)를 이용하여 형광(excitation 365nm, emission 455nm)을 측정하였다. 또한, 1 mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide)를 기질로 하는 조직염색액 (100mM sodium phosphate (pH 7.0), 10mM EDTA, 0.5mM potassium ferricyanide, 0.5mM potassium ferrocyanide, 0.1% Triton X-100)에 담가 약 6 ~ 24시간 동안 반응시켰다. F1 seeds obtained from transformants of the DDS promoter were disinfected with seed sterile solution containing rax, and then seeded in MS medium and cultured for 1, 5, 15 and 20 days after germination. In addition, the plants were transferred to the soil and sampled at each time period, and GUS extraction buffer (50 mM NaPO 4 , pH 7.0, 10 mM EDTA, 0.1% triton X-100, 0.1% sarcosyl, 10 mM β-mercaptoethanol) was added to the tissues. After crushing, centrifugation at 10,000 g at 4 ° C. for 10 minutes yielded only cell extracts. The obtained cell extract was mixed with 1 mM MUG (4-methylumbelliferyl glucuronide) and reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then 0.2 M Na 2 CO 3 was added to terminate the reaction. The reaction solution after the reaction was measured for fluorescence (excitation 365nm, emission 455nm) using a fluorometer (fluorometer). In addition, tissue staining solution based on 1 mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide) (100 mM sodium phosphate (pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM) potassium ferrocyanide, 0.1% Triton X-100) and reacted for about 6 to 24 hours.
그 결과 DDS 프로모터의 활성도 매우 낮았으며, 어린 식물체에는 부분적으로 잎에 염색이 되고 뿌리에서는 전혀 GUS 염색이 되지 않았다. 성숙된 잎에서는 잎의 가장자리와 엽육에 부분적으로 염색되었고 뿌리에서도 일부 염색이 되었음을 확인하였다. 꽃 조직에서는 주두, 암술대, 꽃받침, 꽃자루 등이 강하게 발현되었다 (도 16a 참조). Seedling을 잎과 뿌리로 나누어 GUS 활성을 측정한 결과, 잎 보다 뿌리에서 활성이 다소 증가함을 보였다 (도 16b 참조).
As a result, the activity of the DDS promoter was very low. In young plants, the leaves were partially stained and the roots were not GUS stained at all. In mature leaves, it was partially stained at the edges and leaf flesh of the leaves, and at the roots. In flower tissues, ovule, pistil, calyx, peduncle, etc. were strongly expressed (see FIG. 16A). As a result of measuring the GUS activity by dividing the Seedling into the leaves and the roots, the activity was slightly increased in the roots than the leaves (see FIG. 16B).
② 형질전환 인삼의 DDS 프로모터의 발현 분석② Expression analysis of DDS promoter of transformed ginseng
DDS 프로모터를 가지는 형질전환 식물 (T0)에서 약한 GUS 발현이 발견되었다. DDS 프로모터는 잎과 꽃 조직(암술머리, 꽃받침)에서 GUS가 발현되었다 (도 17 참조). 어린식물체 발달 (T1) 에서 프로모터 활성은 연구 중이다. DDS 프로모터는 발달 단계에서 형질전환 인삼에서 강하게 발현했다.
Weak GUS expression was found in transgenic plants (T 0 ) with a DDS promoter. The DDS promoter expressed GUS in leaf and flower tissues (pistil, calyx) (see Figure 17). Promoter activity in young plant development (T 1 ) is under study. The DDS promoter was strongly expressed in transgenic ginseng at the developmental stage.
<< 실시예Example 9> 9>
DDSDDS 프로모터:: Promoter :: GUSGUS 형질전환체에 대한 빛과 호르몬의 영향 Effect of light and hormones on transformants
DDS 프로모터 내에 존재하는 cis-element 중, 호르몬과 빛에 반응하는 조절인자가 다수 존재하여 각 프로모터 형질전환 애기장대에 호르몬과 빛에 대한 영향을 살펴보았다.
Among the cis- elements present in the DDS promoter, there are a number of regulators that respond to hormones and light, and we examined the effects of hormones and light on the transgenic Arabidopsis.
<실시예 9-1> 호르몬의 영향Example 9-1 Influence of Hormones
발아 4 일 째 식물체를 20 μM, 50 μM α-naphthylphthalamic acid (NAA), 6-benzylaminopurine (BA), jasmonic acid (JA)의 호르몬이 포함된 MS 액체배지에 담가 24 시간 동안 반응시켰다. 20℃ 배양기에서 빛과 호르몬 처리를 하였으며, 반응이 끝난 후 GUS 추출 버퍼를 넣고 hand-homogenizer로 조직을 파쇄한 다음, 조직 추출액만 얻어 GUS 활성을 측정하였다.On the fourth day of germination, the plants were soaked in MS liquid medium containing hormones of 20 μM, 50 μM α-naphthylphthalamic acid (NAA), 6-benzylaminopurine (BA), and jasmonic acid (JA) for 24 hours. Light and hormone treatment in the incubator at 20 ℃, after the reaction was put into the GUS extraction buffer and the tissue was disrupted by a hand-homogenizer, GUS activity was measured by obtaining only the tissue extract.
발아 후 4일 째 되는 애기장대 seedlings을 20μM의 α-naphthylphthalamic acid (NAA), 6-benzylaminopurine (BA), jasmonic acid (JA)가 포함된 MS 액체 배지에 담가 24 시간 동안 처리하였다. 대조군은 호르몬이 첨가되지 않은 MS 배지에 처리하였다. 그 결과 DDS 프로모터는 JA에만 반응이 유도되었는데, 10 μM JA에서는 1.8~7.5배, 20 μM JA에서는 3.8~21.0 배 증가하였다 (도 18 참조).
<실시예 9-2> 빛의 영향Example 9-2 Influence of Light
DDS 프로모터의 형질전환체로부터 얻은 F1 종자를 rax가 포함된 종자 멸균액으로 소독한 다음, MS 배지에 파종하여 발아 후 4일 째 되는 식물체를 명조건과 암조건으로 나누어 48 시간 동안 처리한 다음 빛의 영향을 알아보고자 하였다. 발아 후 4일 째 되는 애기장대 seedling을 암조건과 명조건으로 각각 48 시간 동안 처리한 후 GUS 염색하고 활성을 측정하였다. 그 결과 DDS 프로모터의 경우 명조건에 대해 1.4~4.9 배 증가함을 확인하였다 (도 19 참조).
F1 seeds obtained from the transformants of the DDS promoter were disinfected with seed sterile solution containing rax, and then seeded in MS medium, and the
<< 실시예Example 10> 10>
TMVTMV 에 의해 유도된 Induced by DDSDDS 와 Wow DDSDDS 프로모터의 전사 활성 Transcriptional activity of the promoter
인삼(Panax ginseng)의 바이러스 감염에 대한 PgDDS(P. ginseng dammarenediol-Ⅱ synthase)의 전사 활성을 RT-PCR로 분석하였다. DDS 유전자의 전사 활성은 DDS 프로모터 분석으로 설명 할 수 있다. TMV 감염된 잎에서 얻은 RNA 샘플은 DDS와 TMV-CP특이적인 프라이머로 증폭하였다. Actin은 대조군으로 사용하였다. 인삼 잎을 TMV(Tobacco mosaic virus)로 감염시키자 전사물이 상당히 축적되었다 (도 20a 참조). TMV-CP mRNA는 TMV로 감염된 잎에서 발견되었으나 대조군에서는 신호가 발견되지 않았다 (도 20a 참조). 이 결과에서 볼 때 DDS 유전자는 바이러스 감염에 반응하는 것을 알 수 있다.Transcriptional activity of Pg ginseng dammarenediol-II synthase (PgDDS) against viral infection of Panax ginseng was analyzed by RT-PCR. Transcriptional activity of the DDS gene can be explained by DDS promoter analysis. RNA samples from TMV infected leaves were amplified with primers specific for DDS and TMV-CP. Actin was used as a control. Infection of ginseng leaves with Tobacco mosaic virus (TMV) resulted in significant accumulation of transcripts (see FIG. 20A). TMV-CP mRNA was found in the leaves infected with TMV but no signal was found in the control group (see FIG. 20A). The results show that the DDS gene responds to viral infection.
TMV 감염에 대한 DDS 프로모터의 반응을 결정하기 위해서, DDS의 프로모터 부위를 분리하였다. DDS의 프로모터 부위에서 50-flanking sequence의 933 염기를 얻었다(AB638615). Putative cis-elements는 W box (TTGAC[C/T]) 병원균과 관련되었다. GT-1 (GTTTTT) 와 SEBF (TGTCNC)는 PLACE database를 사용하여 상류 배열에서 발견되었다 (도 20 b 참조). 프로모터 부위에서 putative cis-element의 존재로부터, DDS 는 병원균이나 스트레스에 반응할 것이라는 것을 알 수 있다. DDS 프로모터에 의해 GUS 리포터 유전자를 표현하는 형질전환 식물이 완성한 후, TMV 감염에 대한 DDS 프로모터의 전사 활성을 측정하였다. 활성 실험은 독립적으로 세 번 실시했다. 형질전환 인삼 잎에 TMV를 접종했을 때, GUS 활성은 대조군에 비해 4배 이상 증가했으며 (도 20 c 참조), 프로모터가 TMV를 방어하고, DDS 유전자 발현을 활성화하는 배열을 포함한다는 것을 알 수 있다. To determine the response of the DDS promoter to TMV infection, the promoter site of DDS was isolated. The 933 base of the 50-flanking sequence was obtained at the promoter site of DDS (AB638615). Putative cis-elements were associated with W box (TTGAC [C / T]) pathogens. GT-1 (GTTTTT) and SEBF (TGTCNC) were found in the upstream array using the PLACE database (see Figure 20b). From the presence of the putative cis-element at the promoter site, it can be seen that DDS will respond to pathogens or stress. After the transgenic plants expressing the GUS reporter gene by the DDS promoter were completed, the transcriptional activity of the DDS promoter against TMV infection was measured. Activity experiments were performed three times independently. When the transgenic ginseng leaves were inoculated with TMV, the GUS activity increased more than four times compared to the control group (see FIG. 20C), and it can be seen that the promoter includes an array that protects TMV and activates DDS gene expression. .
인삼을 바이러스 감염 시켰을 때 DDS mRNA와 DDS 프로모터의 전사 활성이 증가하는 것은 바이러스 감염에 의해 진세노사이드 생합성이 상향 조절되고, 바이러스 방어 기전을 나타냄을 보여준다.
Increasing the transcriptional activity of DDS mRNA and DDS promoter upon viral infection of ginseng suggests that ginsenoside biosynthesis is upregulated by viral infection, indicating a viral defense mechanism.
<< 실시예Example 11> 11>
DDSDDS 유전자 발현 식물의 Gene expression of plant TMVTMV 저항성 확인 Resistance check
Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S 프로모터의 조절 하에 있는 DDS(AB122080)를 발현하는 형질전환 담배를 제조했다 (도 21a 참조). 처음 생산한 15개 형질전환 라인 중에 3개를 선별했다. 인삼 DDS와 hygromycin phosphotransferase(HPT)유전자를 인삼 유전자에 통합한 것은 PCR로 확인하였으나, 야생형 식물에서는 신호가 발견되지 않았다 (도 21b 참조). 인삼 DDS mRNA의 전사는 역전사-PCR (RT-PCR)로 확인했다 (도 21c 참조). Transgenic tobacco expressing DDS (AB122080) under the control of the Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter was prepared (see FIG. 21A). Three of the first 15 transformation lines produced were selected. Incorporation of ginseng DDS and hygromycin phosphotransferase (HPT) gene into the ginseng gene was confirmed by PCR, but no signal was found in wild-type plants (see FIG. 21B). Transcription of ginseng DDS mRNA was confirmed by reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) (see FIG. 21C).
결론적으로, DDS 유전자를 발현하는 형질전환 담배 식물은 의학적으로 유용한 담마란다이올(dammarenediol-II)을 생산했고, TMV에 대한 증가된 저항성을 보여주었다. 또한, 담마란다이올(Dammarenediol-II)은 담배에서 병원균 저항성을 촉진시키는 2차 대사물질로서 작용하고, 식물의 바이러스 저항성을 향상시키는 유용한 화합물이 될 수 있다는 것을 확인하였다.
In conclusion, transgenic tobacco plants expressing the DDS gene produced medically useful dammarenediol-II and showed increased resistance to TMV. In addition, it was confirmed that dammarenediol-II acts as a secondary metabolite to promote pathogen resistance in tobacco, and could be a useful compound for improving the viral resistance of plants.
따라서 이러한 실험 결과를 통해, 본 발명에 따른 DDS 프로모터의 염기서열을 알 수 있었으며, 상기 DDS 프로모터를 포함한 형질전환용 바이너리벡터를 제작하고, 이를 이용해 형질전환 식물체를 얻을 수 있었다. 형질전환된 식물체를 통해 DDS 프로모터는 식물 발달 단계별 발현패턴이 다르고, 호르몬, 빛, 담배 모자이크 바이러스(TMV)에 의해 활성이 유도됨을 알 수 있어 DDS 프로모터를 진세노사이드 함량이 증가된 형질전환 식물, 환경 스트레스 저항성 형질전환식물, TMV 저항성 형질전환 식물 제조에 이용할 수 있음을 알 수 있었다.
Therefore, through these experimental results, it was possible to know the nucleotide sequence of the DDS promoter according to the present invention, to produce a transformed binary vector including the DDS promoter, it was possible to obtain a transgenic plant using this. The transformed plant shows that the DDS promoter has different expression patterns according to the plant development stages, and that activity is induced by hormones, light, and tobacco mosaic virus (TMV). It can be seen that it can be used for the production of environmental stress resistant transgenic plants and TMV resistant transgenic plants.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.So far I looked at the center of the preferred embodiment for the present invention. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.
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