KR101383058B1 - Complex composition of Disulfide crosslinked Polyethylenimine/Target gene Complex and target gene for effective transfection into the cells - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재내피화를 촉진하거나 평활근 세포의 증식을 억제하는 혈관 재협착 방지용 유전자 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전자 전달체는 목적 유전자가 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화(complexed)됨으로써 유전자 전달체의 안정적인 생체로의 전달이 가능하며, 기존의 사용하는 고분자물질로 야기되는 혈전이나 염증 유발 등의 문제를 해결 뿐 아니라 많은 양의 목적 유전자 특히 siRNA와의 결합이 가능하여 특정 질병 유전자의 발현을 효율적으로 억제할 수 있는 장점이 있다.
뿐만 아니라 본 발명에 따른 유전자 전달체는 히알루론산(hyaluronic acid)이 코팅된 스텐트상에 목적 유전자를 고정화시킴으로써 유전자를 세포내로 전달 효율이 매우 높은 장점이 있으며, 정상세포에 대한 독성을 현저히 줄일 수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a gene carrier for delivering a target gene to a cell, and more particularly, to a gene carrier for preventing vascular restenosis and a method for preparing the same, which promote re-endothelialization or inhibit the proliferation of smooth muscle cells.
The gene carrier according to the present invention is capable of delivering a gene carrier to a stable living body by complexing the target gene with branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds (ssPEI) through disulfide bonds. As well as solving problems such as blood clots or inflammation caused by the existing polymer material, it is possible to combine with a large amount of target genes, in particular siRNA, which can effectively suppress the expression of a specific disease gene.
In addition, the gene carrier according to the present invention has the advantage that the efficiency of delivering the gene into the cell is very high by immobilizing the target gene on the hyaluronic acid-coated stent, and can significantly reduce the toxicity to normal cells. There is this.

Description

목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체{Complex composition of Disulfide crosslinked Polyethylenimine/Target gene Complex and target gene for effective transfection into the cells}Complex composition of Disulfide crosslinked Polyethylenimine / Target gene Complex and target gene for effective transfection into the cells

본 발명은 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재내피화를 촉진하거나 평활근 세포의 증식을 억제하는 혈관 재협착 방지용 유전자 전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a gene carrier for delivering a target gene to a cell, and more particularly, to a gene carrier for preventing vascular restenosis and a method for preparing the same, which promote re-endothelialization or inhibit the proliferation of smooth muscle cells.

관상동맥질환이 진전되면 관상동맥이 완전히 막히면서 심장 근육의 일부가 괴사하게 되어 심장의 박동력이 떨어지게 되고, 이로 인해 심장이 피를 제대로 신체로 공급하지 못해 여유의 피가 심실 및 허파에 고이게 되어 심한 호흡장애가 나타난다. 관상동맥 질환 치료의 시작은 가능한 한 빨리 좁아진 혈관을 확장시키거나 노폐물을 제거해 심장에 충분한 영양분과 산소를 공급하는 것이다.As coronary artery disease progresses, the coronary artery is completely blocked and part of the heart muscle is necrotic, which causes the heart's pulsating force to drop. This causes the heart to fail to supply blood to the body, causing excess blood to accumulate in the ventricles and lungs. Respiratory disorders appear. The start of treating coronary heart disease is to expand the narrowed blood vessels or remove wastes as soon as possible to provide enough nutrients and oxygen to the heart.

그러나, 심각한 상태라면 관상동맥 우회술과 관상동맥 확장술로 불리는 중재적 시술이 효과적이다. 관상동맥 우회술은 심장 부근의 동맥이나 다리 정맥을 잘라 관상동맥의 막힌 부위에 이식하는 방법으로 우회로를 만들어 주는 외과적 수술법인데, 약물에 대한 의존도를 낮춘다는 장점은 있지만 5 내지 10년 후 다시 혈관이 막힐 수 있다는 단점이 있다. 중재적 시술에는 막힌 관상동맥에 풍선이 달린 카데터를 넣어 좁아진 부위를 확장시키는 풍선 확장술과 풍선으로 혈관을 부풀린 후 스텐트(stent)를 삽입해 혈관벽을 고정하는 스텐트 삽입술이 있다. 이 경우 역시 여러 가지 이유로 혈관이 다시 좁아지는 재협착률이 높은 것이 문제다.However, in severe cases, interventional procedures called coronary artery bypass surgery and coronary artery dilation are effective. Coronary artery bypass surgery is a surgical procedure that cuts arteries or leg veins near the heart and implants them in a blocked area of the coronary arteries. This technique has the advantage of lowering the dependence on drugs, but again after 5 to 10 years. The disadvantage is that it can be blocked. Interventional interventions include balloon dilation, which involves placing a catheter with a balloon in a blocked coronary artery to expand the narrowed area, and inflating the vessel with a balloon, and then inserting a stent to fix the vessel wall. In this case, too, there is a high rate of restenosis in which the blood vessels narrow again for various reasons.

상기 스텐트란 혈관, 위장관 및 담도 등 혈액이나 체액의 흐름이 순조로워야 되는 부위에 악성 혹은 양성질환이 발생하여 그 흐름에 장애가 발생하였을 때, 외과적 수술을 통하지 않고 x-선 투시하에서 좁아지거나 막힌 부위에 삽입하여 흐름을 정상화시키는데 사용되는 원통형의 의료용 재료이며, 스텐트의 재질은 스텐레스와 형상기억 합금인 나이티놀 등이 많이 사용되고 있다.The stent is a narrow or clogged area under X-ray fluoroscopy without surgical surgery when a malignant or benign disease occurs due to a malignant or benign disease in the area where blood or body fluid should flow smoothly, such as blood vessels, gastrointestinal tract and biliary tract. It is a cylindrical medical material used to normalize the flow by inserting it into the material, and the material of the stent is stainless steel and nitinol, which is a shape memory alloy.

혈관질환에서 스텐트는 동맥경화증에 의해 동맥 내에 혈전이나 지질의 침착으로 동맥 내경이 좁아져 혈류의 흐름이 원활하지 못한 경우에 설치하는데, 주로 다리에 혈류를 공급하는 골반부의 장골동맥, 뇌에 혈류를 공급하는 경동맥 및 신장에 혈류를 공급하는 신동맥 등에 많이 이용되고 있다. 스텐트를 이용한 수술의 장점은 개복수술 방법보다 간편하며, 전신마취를 하지 않고 부분마취를 하여 시술에 부담을 줄일 수 있으며, 수술 성공률도 높아 세계적으로 널리 이용되고 있다. 스텐트를 이용한 혈관시술의 경우에는 상대적으로 고령, 심장질환 및 호흡기 질환 등의 원인으로 개복 수술이나 전신마취를 하는데 위험부담이 큰 경우에 더 많이 시술되고 있다.In vascular diseases, stents are installed when the internal diameter of the artery is narrowed due to blood clots or lipid deposits in the arteries due to atherosclerosis, and the flow of blood flows to the iliac arteries and brains of the pelvis. It is widely used for carotid arteries to supply and renal arteries for supplying blood flow to the kidneys. The advantages of surgery using stents are simpler than laparotomy, partial anesthesia without general anesthesia to reduce the burden on the procedure, and the success rate of surgery is widely used worldwide. In the case of vascular surgery using stents, more surgeries are performed in cases where the risk of laparotomy or general anesthesia is relatively high due to age, heart disease and respiratory diseases.

스텐트의 개발로 풍선 확장술의 급성합병증 같은 위험요인은 감소하였으나 스텐트 시술 빈도가 급격히 증가함에 따라 재협착의 절대 빈도도 같이 증가하여 재협착 병변 자체가 중재 시술의 중요한 한 분야가 되었다.The development of stents reduced risk factors such as acute complications of balloon dilation, but as the frequency of stents increased rapidly, the absolute frequency of restenosis increased as well, and the restenosis lesion itself became an important area of intervention.

혈관 재협착은 스텐트 수술 후 주로 6개월 내에 발생하며 평활근 세포가 과도하게 증식하여 혈관을 재협착 시키는 과정이다. 즉, 혈관 재협착은 한마디로 관동맥 내막이 풍선 확장술로 손상을 받게 되어 일어나는 치유과정이 원하지 않게 과도하게 일어난 결과로 요약할 수 있다. 풍선 확장술로 혈관 내막이 손상을 받고 중막이 확장하게 되면 정상적인 상처 치유 과정(wound-healing process)으로 염증반응이 야기되게 되며(inflammatory phase), 과립화된 조직(granulation tissue)이 증식되고(granulation phase), 혈관이 재형성(remodeling phase)된다.Vascular restenosis occurs mainly within 6 months after stent surgery and is a process in which smooth muscle cells proliferate excessively and restrain the blood vessels. In other words, vascular restenosis can be summarized as a result of undesirably excessive healing process caused by the balloon endothelium being damaged by balloon dilation. Balloon dilation damages the vascular lining and expands the media, causing an inflammatory reaction in the normal wound-healing process (inflammatory phase), granulation tissue proliferation (granulation phase) ), The blood vessel is remodeling phase.

시술 후 재협착률은 풍선 확장술 시술 후 40 내지 50% 및 스텐트 삽입술 시술 후 25 내지 30% 정도가 재협착에 의하여 재수술을 받아야한다. 따라서 재협착률을 줄이는 것이 중재적 시술의 관건이라 할 수 있다.After the procedure, restenosis rate should be 40-50% after balloon dilatation and 25-30% after stent implantation. Therefore, reducing the restenosis rate is the key to interventional procedures.

최근 방사선 조사로 재협착을 감소시키기 위한 관상동맥 근접방사선치료(brachytherapy)가 시도되면서 재협착 병변의 치료에 많은 진전이 있다는 보고도 있으나 이러한 방법에는 기술적 및 경제적 문제점 등이 있으며 혈관 재협착 자체를 예방하는 데는 한계가 있다.Recently, there have been reports of progress in the treatment of restenosis lesions due to the recent attempt at coronary brachytherapy to reduce restenosis by irradiation. However, these methods have technical and economic problems and prevent vascular restenosis itself. There is a limit to doing so.

따라서, 최근에는 상기에서 언급한 스텐트 시술 후의 재협착의 빈도를 낮추는 문제에 관심이 모아지고 있는데 이런 문제를 개선하려는 일환으로 약물 방출형 스텐트에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 많은 연구자들이 스텐트에 혈관 재협착을 억제하는 활성물질을 고분자물질과 혼합하여 물질이 천천히 방출될 수 있도록 제작한 서방형 약물 방출형 스텐트 및 이러한 스텐트에 사용될 수 있는 혈관 재협착을 억제하는 활성물질을 연구하고 있다.Therefore, in recent years, attention has been drawn to the problem of lowering the frequency of restenosis after the above-described stent procedure. As a part of improving the problem, researches on drug-release stents have been conducted. We have been studying sustained-release drug-release stents made by mixing an active substance that inhibits stenosis with a polymeric substance to release the substance slowly, and an active substance that inhibits vascular restenosis that can be used for such a stent.

약물방출형 스텐트란 혈관재협착을 방지하는 약물을 코팅한 것으로 최근의 혈관 스텐트 시술의 90% 이상이 약물방출형 스텐트로 시술되고 있다. 그런데 이러한 약물방출형 스텐트는 약물과 함께 사용하는 고분자물질이 오히려 혈전이나 염증을 유발하는 문제를 가지고 있다.Drug-release stents are coated with a drug that prevents vascular restenosis, and more than 90% of recent vascular stents are treated with drug-release stents. By the way, the drug-release stent has a problem that causes a blood clot or inflammation of the polymer material used with the drug.

한편, 세린 트레오닌 키니아제 Akt(단백질 키니아제 B)는 세포 생존, 및 세포 증식의 중요한 조절제이다(Vivano and Sawyers, 2002). On the other hand, serine threonine kinase Akt (protein kinase B) is an important regulator of cell survival and cell proliferation (Vivano and Sawyers, 2002).

상기 Akt의 지배적인 음성 대립 유전자는 세포 생존을 차단하고, 세포자살반응을 유도하는 것으로 보고되었다(Li et al., 1998). 왜냐하면 Akt가 세포의 생존과 증식 모두를 촉진시키기 때문에, 예를 들면 Akt 활성을 바꾸는 것에 의한 그 하류 신호전달 경로의 특정 억제는 Akt 유전자의 증폭과 함께 종양을 위한 합리적인 치료 전략일 수 있다.The dominant negative allele of Akt has been reported to block cell survival and induce apoptosis (Li et al., 1998). Because Akt promotes both cell survival and proliferation, certain inhibition of its downstream signaling pathways, for example by altering Akt activity, may be a rational therapeutic strategy for tumors with amplification of the Akt gene.

한편, siRNA는 표적 유전자의 서열에 상응하는 이중가닥 RNA에 의해 유도된 전사 후 유전자 침묵 메커니즘(gene-silencing mechanism)을 갖는다(Hu et al., 2002; Cogoni and Macino, 2000).SiRNA, on the other hand, has a post-transcriptional gene-silencing mechanism induced by double-stranded RNA corresponding to the sequence of the target gene (Hu et al., 2002; Cogoni and Macino, 2000).

화학적으로 합성된 siRNAs의 도입은 포유류 세포에서 유전자 침묵을 유도할 수 있으며, 보통 내인성으로 표현된 표적 mRNA의 단지 일시적인 감소를 유도한다. 상술한 siRNA 기술의 출현은 생체 외 및 생체 내 모두에서 효과적인 유전 조작의 가능성을 열었다.The introduction of chemically synthesized siRNAs can induce gene silencing in mammalian cells, leading to only a temporary decrease in target mRNA, usually expressed endogenously. The emergence of the siRNA technology described above has opened up the possibility of effective genetic manipulation both in vitro and in vivo.

그러나 siRNA의 성공적인 생체내 적용 여부는 적합한 운반체 및 siRNA의 표적이 되는 전달체에 달려있다.However, the successful in vivo application of siRNA depends on the suitable carrier and the target carrier of the siRNA.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 혈관 재협착을 방지하기 위하여 재내피화를 촉진하거나 평활근 세포의 증식을 억제하는 유전자 전달체를 제조하고, 이를 스텐트에 도포하여 사용함으로써 체내로 효율적으로 전달하여 생체부작용이 없고 세포접착을 효율적으로 저해하여 혈관 재협착률을 낮추는 것을 확인하고, 본 발명의 완성하였다.Under these backgrounds, the present inventors have prepared a gene carrier which promotes re-endothelialization or inhibits the proliferation of smooth muscle cells in order to prevent vascular restenosis, and by applying it to a stent, it is efficiently delivered into the body and there is no biological side effect. It was confirmed that lowering the vascular restenosis rate by efficiently inhibiting cell adhesion, and completed the present invention.

KR 제10-2009-0058233호, 2009년 06월 09일KR 10-2009-0058233, June 09, 2009

본 발명의 목적은 질병세포 또는 조직에 지속적인 유전자를 안정적으로 전달하고, 전달된 유전자의 고효율 발현을 가능케 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체를 제공하는 것으로, 보다 상세하게는 재내피화를 촉진하거나 평활근 세포의 증식을 억제하는 목적 유전자가 고정화된 유전자 전달체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a gene carrier for stably delivering a continuous gene to diseased cells or tissues, and for delivering a gene of interest to a cell, which enables high efficiency expression of the delivered gene. The present invention provides a gene carrier in which a target gene is immobilized to promote or inhibit the proliferation of smooth muscle cells, and a method of manufacturing the same.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 목적 유전자가 고정화된 유전자 전달체를 스텐트에 도포한 혈관 재협착 방지용 유전자 전달체를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a gene carrier for preventing vascular restenosis by applying a gene carrier to which a target gene is immobilized to a stent.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 생분해성 폴리에틸렌이민(polyethylenimine;, PEI)을 목적 유전자와 혼합하여 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 복합체화된(complexed) 것을 특징으로 하는, 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is characterized in that the biodegradable polyethylenimine (PEI) is mixed with the gene of interest, complexed by ionic interaction (ionic interaction), characterized in that the target gene into a cell Provide a gene carrier for delivery.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 상기 폴리에틸렌이민이 분자량이 1 내지 102 KDa인 것을 특징으로 한다. The gene carrier according to the present invention is characterized in that the polyethyleneimine has a molecular weight of 1 to 10 2 KDa.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 목적 유전자가 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화된(complexed) 것을 특징으로 한다.The gene carrier according to the present invention is characterized in that the target gene is complexed with branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds (ssPEI).

본 발명에 따른 유전자 전달체는 목적 유전자가 siRNA(small interfering RNA)인 것으로, 보다 상세하게는 Akt 유전자에 특이적인 siRNA인 것을 특징으로 한다.Gene carrier according to the present invention is that the target gene is siRNA (small interfering RNA), more specifically characterized in that the siRNA specific to the Akt gene.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 히알루론산(hyaluronic acid)이 표면에 코팅된 스텐트에 도포하여 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다.Gene carrier according to the invention is characterized in that the hyaluronic acid (hyaluronic acid) can be used to apply to the stent coated on the surface.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 혈관 재협착 방지용 스텐트인 것을 특징으로 한다.Gene carrier according to the invention is characterized in that the stent for preventing vascular restenosis.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 (1) 분지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine, bPEI), 선형 폴리에틸렌이민(Linear polyethylenimine, LPEI), 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)으로부터 선택되는 1종 이상의 폴리에틸렌이민을 목적 유전자와 혼합하여 이온 상호작용(ionic interaction)으로 결합에 의해 복합체를 형성시켜 유전자 전달체를 제조하는 단계;Gene carriers according to the present invention are (1) branched polyethylenimine (bPEI), linear polyethylenimine (LPEI), linear polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds (Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; preparing a gene carrier by mixing at least one polyethyleneimine selected from ssPEI) with a gene of interest to form a complex by binding in ionic interaction;

(2) 히알루론산(hyaluronic acid) 코팅액으로 스텐트를 코팅하는 단계; 및(2) coating the stent with a hyaluronic acid coating solution; And

(3) 상기 (2)의 히알루론산(hyaluronic acid)이 코팅된 스텐트에 상기 (1)의 유전자 전달체를 고정화하는 단계;를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.(3) immobilizing the gene carrier of (1) on the stent coated with hyaluronic acid (hyaluronic acid) of (2).

이하 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 분지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine, bPEI), 선형 폴리에틸렌이민(Linear polyethylenimine, LPEI), 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)으로부터 선택되는 1종 이상의 폴리에틸렌이민을 목적 유전자와 혼합하여 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 복합체화된(complexed), 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체를 제공한다.The present invention is a branched polyethylenimine (bPEI), linear polyethylenimine (Linear polyethylenimine, LPEI), disulfide-linked polyethyleneimine (Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI) The above polyethylenimine is mixed with a target gene to provide a gene carrier for delivering the target gene to cells, which is complexed by ionic interaction.

본 발명에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민은 분지형 또는 선형, 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)을 사용할 수 있으며, 1 내지 102 kDa의 분자량, 바람직하게는 1 내지 50 kDa의 분자량을 사용할 수 있다. 예를 들면 도 1의 구조를 가질 수 있다.In the present invention, the polyethyleneimine may use a branched or linear, cross-linked polyethyleneimine (ssPEI) crosslinked through disulfide bonds, molecular weight of 1 to 10 2 kDa, preferably Can use a molecular weight of 1 to 50 kDa. For example, it may have the structure of FIG.

본 발명에 있어서, 상기 목적 유전자는 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화된(complexed) 것으로, 상기 고분자는 고분자 사슬내에 양전자를 많이 함유하고 있어 음전하를 띠는 목적 유전자와 결합하기에 아주 유용한 구조를 가지고 있어, 구조적으로도 본원발명의 목적을 달성하기 위해 중요한 의미를 가진다. 뿐만 아니라 유전자 전달체의 안정적인 생체로의 전달을 가능하게 하여, 기존의 사용하는 고분자물질로 야기되는 혈전이나 염증 유발 등의 문제를 해결하여 정상세포에 대한 독성을 현저히 줄일 수 있는 장점이 있다.In the present invention, the target gene is complexed with branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds (ssPEI) through disulfide bonds, and the polymer contains a lot of positrons in the polymer chain. It has a very useful structure for binding to the negatively charged target gene, structurally important to achieve the object of the present invention. In addition, by enabling the delivery of the gene carrier to the stable living body, there is an advantage that can significantly reduce the toxicity to the normal cells by solving problems such as causing blood clots or inflammation caused by the existing polymer material.

본 발명의 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(ssPEI)은 동결건조하여 파우더로 제조된 분지형 폴리에틸렌이민을 질소 환경하에서 메탄올에 용해시킨 후, 프로필렌 설파이드(propylene sulfide)를 첨가한 반응물을 감압하에 증발시킨 후 다이에틸 에테르(Diethyl ether)에 2회 침전하고, 정제하여 ssPEI(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)를 제조한다.Polyethyleneimine (ssPEI) cross-linked through the disulfide bond of the present invention is lyophilized to dissolve the branched polyethyleneimine prepared as a powder in methanol under a nitrogen environment, and then react the reactant to which propylene sulfide is added under reduced pressure. After evaporation, the precipitate was precipitated twice in diethyl ether and purified to prepare ssPEI (Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI).

보다 상세하게는 25 kDa의 분지형 폴리에틸렌이민(bPEI 25 kDa), 선형 폴리에틸렌이민(LPEI 25kDa) 및 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(ssPEI)과 목적 유전자가 축합된 유전자 복합체의 제조에 있어, 혼합되는 목적 유전자의 농도에 따른 세포에서의 최적 발현율을 조사하였다. 그 결과 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민과 목적 유전자가 축합된 유전자 전달체가 목적 유전자의 농도가 증가함에 따라 유전자 전달 효율 뿐 아니라 가장 높은 목적 유전자의 발현을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 도 6을 참조한다.More specifically, in the preparation of a 25 kDa branched polyethyleneimine (bPEI 25 kDa), linear polyethyleneimine (LPEI 25 kDa) and crosslinked polyethyleneimine (ssPEI) and a gene of interest through the disulfide bond, The optimal expression rate in the cells according to the concentration of the target gene to be mixed was investigated. As a result, it was confirmed that the gene carrier condensed with polyethyleneimine and the target gene cross-linked through disulfide bond showed the highest expression of the gene as well as the gene transfer efficiency as the concentration of the target gene increased. Please refer to Fig.

본 발명에 있어서, 상기 목적 유전자는 siRNA(small interfering RNA), 안티센스 분자, 길항제, 리보자임, 억제제, 펩티드 및 소형 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 siRNA인 것을 특징으로 한다. 상기 siRNA는 모든 종류의 siRNA가 사용될 수 있으나 바람직하게는 Akt 유전자에 특이적인 siRNA인 것을 사용할 수 있다.In the present invention, the target gene may be one or more selected from the group consisting of siRNA (small interfering RNA), antisense molecules, antagonists, ribozymes, inhibitors, peptides and small molecules, more preferably siRNA It is characterized by. The siRNA may be used for all kinds of siRNA but preferably may be siRNA specific to the Akt gene.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 폴리에틸렌이민/siRNA 타입인 것을 특징으로 한다.The gene carrier according to the present invention is characterized in that the polyethyleneimine / siRNA type.

본 발명에 있어서, 상기 유전자 전달체는 폴리에틸이민과 목적 유전자가 물리적 결합 및 화학적 결합으로 복합체화 될 수 있으며, 보다 상세하게는 음전하를 띄는 siRNA와 양전하를 띄는 폴리에틸렌이민의 전하결합에 의한 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 복합체화되어(complexed) 제조된다.In the present invention, the gene carrier is a polyethylimine and the target gene can be complexed by physical bonds and chemical bonds, more specifically ionic interactions by the charge binding of the negatively charged siRNA and the positively charged polyethyleneimine It is prepared complexed by ionic interaction.

본 발명에 있어서, 폴리에틸아민과 목적 유전자는 1 : 0.01 내지 1.0 중량 비율로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1: 0.01 내지 0.5 중량비율로 혼합된다.In the present invention, the polyethylamine and the target gene may be mixed in a weight ratio of 1: 0.01 to 1.0, preferably 1: 0.01 to 0.5 weight ratio.

상기의 중량 비율은 목적 유전자의 발현율 및 세포 내 전달되는 유전자 전달체로 인한 세포 독성에 따른 세포성장에 대한 부작용이 없는 범위이다. The weight ratio is in the range of no side effects on cell growth due to the expression rate of the target gene and cytotoxicity due to the gene carrier delivered in the cell.

본 발명은 상기 목적 유전자가 지지체 상에 고정화된 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체를 제공하는 것으로, 보다 상세하게는 상기 목적 유전자가 고정화된 유전자 전달체를 스텐트에 도포한 혈관 재협착 방지용 유전자 전달체를 제공한다.The present invention provides a gene carrier for delivering a target gene immobilized on a support to a cell, and more specifically, a gene carrier for preventing vascular restenosis by applying a gene carrier immobilized on the target gene to a stent. To provide.

보다 상세하게는 본 발명은 (1) 분지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine, bPEI), 선형 폴리에틸렌이민(Linear polyethylenimine, LPEI), 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)으로부터 선택되는 1종 이상의 폴리에틸렌이민을 목적 유전자와 혼합하여 이온 상호작용(ionic interaction)으로 결합에 의해 복합체를 형성시켜 유전자 전달체를 제조하는 단계;More specifically, the present invention provides a method for preparing a polyvinylene (BPEI), a branched polyethylenimine (BPEI), a linear polyethylenimine (LPEI), a disulfide bond, a crosslinked polyethylenimine (Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; preparing a gene carrier by mixing at least one polyethyleneimine selected from ssPEI) with a gene of interest to form a complex by binding in ionic interaction;

(2) 히알루론산(hyaluronic acid) 코팅액으로 스텐트를 코팅하는 단계; 및(2) coating the stent with a hyaluronic acid coating solution; And

(3) 상기 (2)의 히알루론산(hyaluronic acid)이 코팅된 스텐트에 상기 (1)의 유전자 전달체를 고정화하는 단계;를 포함하여 제조되는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체를 제공한다.(3) immobilizing the gene carrier of (1) on the stent coated with hyaluronic acid of (2) to provide a gene carrier for delivering the desired gene to the cell.

본 발명에 있어서, 상기 지지체는 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 콜라겐이 표면에 코팅된 스텐트인 것으로, 바람직하게는 히알루론산을 이용한다.In the present invention, the support is a hyaluronic acid (hyaluronic acid) or collagen is a stent coated on the surface, preferably hyaluronic acid is used.

상기 히알루론산은 높은 분자량을 가지는 글리코사아미노글리칸으로 1×105 내지 107 Da 정도의 분자량을 가지며, 대부분의 인체 조직의 세포외 바탕질(extracellular matrix)과 세포 표면에서 발견된다. 히알루론산은 (β,1-4)-D-글루크론산(GlcUA)과 (β,1-3)-N-acetyl-D-글루코사민(GlcNAc)의 반복서열로 구성되어져 있다. 본 발명에 따른 히알루론산은 스텐트에 코팅됨으로써 혈액 구성성분에 대하여 보호막으로서의 역할과 표적 세포에 타겟팅 하기 위한 리간드로서의 역할을 함께 할 수 있는 장점이 있다.The hyaluronic acid is a glycosaaminoglycan having a high molecular weight and has a molecular weight of about 1 × 10 5 to 10 7 Da and is found in the extracellular matrix and cell surface of most human tissues. Hyaluronic acid consists of a repeating sequence of (β, 1-4) -D-glucuronic acid (GlcUA) and (β, 1-3) -N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc). The hyaluronic acid according to the present invention has the advantage that it can act as a protective film and a ligand for targeting the target cell to blood components by coating on the stent.

보다 상세하게는 본 발명에 의한 ssPEI/Akt1 siRNA complex가 고정화된 스텐트를 이용하여 세포 내 독성을 확인한 결과, 양성 대조군인 경우 70%의 세포 생존력에 비해 90% 이상 세포 생존력을 가짐을 확인할 수 있었다. 또한, 세포 내 전달된 목적 유전자의 발현율을 통해 세포 내 Akt1 siRNA가 효율적으로 전달되어 Akt1의 발현을 효과적으로 억제시킴을 확인할 수 있었다. 도 10 및 도 11을 참조한다.More specifically, as a result of confirming intracellular toxicity by using the ssPEI / Akt1 siRNA complex immobilized stent according to the present invention, it was confirmed that the positive control group had a cell viability of 90% or more as compared to 70% cell viability. In addition, it was confirmed that the intracellular Akt1 siRNA was efficiently delivered through the expression rate of the target gene delivered in the cell, thereby effectively inhibiting the expression of Akt1. See FIGS. 10 and 11.

상기의 결과로부터 본 발명에 따른 유전자 전달체는 인체 기관내에 삽입되어 협착 부위를 팽창시키는 본연의 기능을 가지며 동시에 체내로 효율적으로 Akt1 siRNA를 전달하고, 생체부작용이 없으며, 세포접착을 효율적으로 저해하여 혈관 재협착률내 효율적임을 확인할 수 있었다.From the above results, the gene carrier according to the present invention has an inherent function of expanding the constriction site by being inserted into human organs, and at the same time, efficiently delivering Akt1 siRNA into the body, having no biological side effects, and effectively inhibiting cell adhesion to blood vessels. Efficient within the restenosis rate was confirmed.

본 발명에 따른 유전자 전달체는 목적 유전자가 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화(complexed)됨으로써 유전자 전달체의 안정적인 생체로의 전달이 가능하며, 기존의 사용하는 고분자물질로 야기되는 혈전이나 염증 유발 등의 문제를 해결 뿐 아니라 많은 양의 목적 유전자 특히 siRNA와의 결합이 가능하여 특정 질병 유전자의 발현을 효율적으로 억제할 수 있는 장점이 있다.The gene carrier according to the present invention is capable of delivering a gene carrier to a stable living body by complexing the target gene with branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds (ssPEI) through disulfide bonds. As well as solving problems such as blood clots or inflammation caused by the existing polymer material, it is possible to combine with a large amount of target genes, in particular siRNA, which can effectively suppress the expression of a specific disease gene.

뿐만 아니라 본 발명에 따른 유전자 전달체는 히알루론산(hyaluronic acid)이 코팅된 스텐트상에 목적 유전자를 고정화시킴으로써 유전자를 세포내로 전달 효율이 매우 높은 장점이 있으며, 정상세포에 대한 독성을 현저히 줄일 수 있는 장점이 있다.In addition, the gene carrier according to the present invention has the advantage that the efficiency of delivering the gene into the cell is very high by immobilizing the target gene on the hyaluronic acid-coated stent, and can significantly reduce the toxicity to normal cells. There is this.

도 1은 본 발명의 실시예에 사용한 폴리에틸렌이민의 화학구조를 보여주는 것이고,
(A: bPEI, B: LPEI, C: ssPEI)
도 2는 본 발명의 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’에 있어서, 사용된 폴리에틸렌이민 종류에 따른 목적 유전자의 발현 정도를 확인한 그림이며,
(A: bPEI, B: LPEI)
도 3은 본 발명의 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’에 있어서, 사용된 폴리에틸렌이민의 종류, 목적 유전자의 농도, 혼합시간에 따른 목적 유전자의 발현 정도를 확인한 그림이고,
(A: bPEI, B: LPEI)
도 4는 본 발명의 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’에 있어서, 세포로의 전달 방법에 따른 유전자 전달효율을 목적 유전자의 농도별로 확인한 그림이며,
(A: bPEI, B: LPEI)
도 5는 본 발명의 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’에 있어서, 세포로의 전달 후 세포에 대한 독성 여부를 확인한 그림이고,
(A: bPEI, B: LPEI)
도 6은 본 발명의 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’에 있어서, 사용된 폴리에틸렌이민의 종류(25 kDa bPEI, 25 kDa LPEI, ssPEI)에 따른 목적 유전자의 농도별 발현 정도를 확인한 그림이며,
도 7은 본 발명에 따른 목적 유전자가 고정화된 스텐트의 세포 내 부착능을 SEM으로 확인한 사진이고,
(A:×100배, B: ×200배)
도 8은 본 발명의‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’에 있어서, 목적 유전자와 폴리에틸렌이민 사이의 결합력 확인한 그림이며,
(A: bPEI/Akt1 siRNA complex, B: ssPEI/Akt1 siRNA complex)
도 9는 본 발명에 따른 ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’에 있어서, 스텐트 상에 목적 유전자가 고정화된 것을 확인한 사진이고,
도 10은 본 발명에 따른 ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’에 있어서, 스텐트와 목적 유전자의 결합력을 조사한 결과이며,
(A: 혼합 비율이 10, B: 혼합 비율이 20)
도 11은 본 발명에 따른 ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’에 있어서, 세포로의 전달 후 세포에 대한 독성 여부를 확인한 결과이고,
도 12는 본 발명에 따른 ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’로부터 세포 내로 전달된 목적 유전자의 발현을 확인한 결과이며,
도 13은 본 발명에 따른 ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’를 토끼의 관상동맥에 식립 4주 후, 토끼의 관상동맥으로부터 식립 스텐트를 분리하여 찍은 micro CT 사진이고,
도 14는 본 발명에 따른 ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’를 토끼 관상동맥에 식립 4주 후 토끼 관상동맥에서의 스텐트 내 재협착병변(In- stent-Restenosis, ISR)의 비율을 조사한 결과이며,
도 15는 본 발명에 따른 ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’를 토끼의 관상동맥에 식립 4주 후, 토끼의 관상동맥으로부터 식립 스텐트를 분리하여 찍은 SEM 사진이고,
(A: 무처리 금속 스텐트, B: HA-코팅 스텐트, C: Akt1-siRNA)
도 16은 본 발명에 따른 ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’를 토끼의 관상동맥 식립 2주(A) 및 식립 4주(B) 후, 스텐트가 식립된 관상동맥을 잘라 H&E 염색한 결과를 보여주는 것이다.Figure 1 shows the chemical structure of the polyethyleneimine used in the embodiment of the present invention,
(A: bPEI, B: LPEI, C: ssPEI)
2 is a view confirming the expression level of the target gene according to the type of polyethyleneimine used in the 'conjugated gene complex of the target gene' of the present invention,
(A: bPEI, B: LPEI)
3 is a view confirming the expression level of the target gene according to the type of polyethylenimine used, the concentration of the target gene, the mixing time in the 'conjugated gene complex of the target gene' of the present invention,
(A: bPEI, B: LPEI)
4 is a view showing the gene transfer efficiency according to the concentration of the target gene according to the delivery method to the cells in the 'gene complex condensed genes of the present invention',
(A: bPEI, B: LPEI)
Figure 5 is a 'confirm the target gene is condensed gene complex' of the present invention, it is a figure confirming the toxicity to cells after delivery to cells,
(A: bPEI, B: LPEI)
6 is a view confirming the expression level of the target gene concentration according to the type of polyethylenimine (25 kDa bPEI, 25 kDa LPEI, ssPEI) in the 'gene complex condensed genes of the present invention',
7 is a SEM photograph showing the intracellular adhesion of the stent to which the target gene is immobilized according to the present invention.
(A: × 100 times, B: × 200 times)
8 is a view confirming the binding force between the target gene and polyethyleneimine in the 'gene complex condensed gene of the present invention',
(A: bPEI / Akt1 siRNA complex, B: ssPEI / Akt1 siRNA complex)
9 is a photograph confirming that the target gene is immobilized on the stent in the 'gene carrier immobilized on the stent' according to the present invention,
10 is a result of investigating the binding force between the stent and the target gene in the 'gene carrier of the target gene immobilized on the stent' according to the present invention,
(A: the mixing ratio is 10, B: the mixing ratio is 20)
11 is a result of confirming the toxicity to the cells after delivery to the cells in the 'gene genes immobilized on the stent' according to the present invention,
12 is a result of confirming the expression of the target gene delivered into the cell from the 'gene gene carrier immobilized on the stent' according to the present invention,
FIG. 13 is a micro CT photograph of the target gene immobilized on the stent according to the present invention after 4 weeks of implantation in a rabbit coronary artery, after separating the implantation stent from the rabbit coronary artery.
Figure 14 shows the ratio of the in-stent-Restenosis (ISR) in the stent in the rabbit coronary artery after 4 weeks of implantation of the 'target gene immobilized on the stent' in the rabbit coronary artery according to the present invention Is the result of our investigation,
FIG. 15 is a SEM photograph taken after 4 weeks of implantation of the 'target gene immobilized on the stent' in the rabbit coronary artery, after separating the implantation stent from the rabbit coronary artery according to the present invention.
(A: untreated metal stent, B: HA-coated stent, C: Akt1-siRNA)
FIG. 16 shows H & E staining of a coronary artery in which a stent is implanted after 2 weeks (A) and 4 weeks (B) of coronary artery implantation of a rabbit using a 'gene carrier immobilized on a stent' according to the present invention. To show the results.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 아이디어와 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에 종사하는 업자에게는 명백한 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to specific examples. However, the present invention is not limited by the following examples, and it is apparent to those skilled in the art that various changes or modifications can be made within the idea and scope of the present invention.

이 때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 지닌다.Here, unless otherwise defined in the technical terms and scientific terms used, those having ordinary skill in the art to which the present invention belongs have a generally understood meaning.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.Repeated descriptions of the same technical constitution and operation as those of the conventional art will be omitted.

[제조예][Manufacturing Example]

(1) 목적 유전자가 축합된 유전자 복합체의 제조(1) Preparation of Gene Complex Condensed with Target Gene

목적 유전자가 축합된 유전자 복합체를 제조하기 위하여, 분자량(25 kDa, 10 kDa, 1.8 kDa)에 따른 분지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine, bPEI), 분자량(25 kDa, 2.5 kDa)에 따른 선형 폴리에틸렌이민(Linear polyethylenimine, LPEI) 및 25 kDa의 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI) 용액을 제조하였다.To prepare a gene complex in which a target gene is condensed, branched polyethylenimine (bPEI) according to molecular weight (25 kDa, 10 kDa, 1.8 kDa), linear polyethyleneimine according to molecular weight (25 kDa, 2.5 kDa) A linear polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds (ssPEI) solution was prepared through disulfide bonds of linear polyethylenimine (LPEI) and 25 kDa.

상기 25 kDa의 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민은 하기의 방법으로 제조하였다.Polyethyleneimine crosslinked through the disulfide bond of 25 kDa was prepared by the following method.

분지형 폴리에틸렌이민(평균분자량 대략 1,200 내외) 용액의 pH를 7.2 정도로 맞춘 후 동결건조하여 파우더를 얻었으며 이 파우더를 질소 환경하에서 메탄올에 용해시킨 후, 프로필렌 설파이드(propylene sulfide)를 첨가하여 반응을 시켰다. 반응물은 감압하에 증발시킨 후 다이에틸 에테르(Diethyl ether)에 2회 침전하고 정제하여 ssPEI(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)를 제조하였다.The pH of the branched polyethyleneimine (average molecular weight approximately 1,200 or so) solution was adjusted to 7.2 and lyophilized to obtain a powder. The powder was dissolved in methanol in a nitrogen environment, and then reacted by adding propylene sulfide. . The reaction was evaporated under reduced pressure, precipitated and purified twice in diethyl ether to prepare ssPEI (Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI).

상기 분자량에 따라 제조된 폴리에틸렌이민 용액(bPEI, LPEI, ssPEI)에 phosphate buffer saline(PBS, pH7.4) 용액에 녹인 목적 유전자(DNA)를 한 방울씩 떨어뜨린 후 상온에서 혼합(PEI/DNA complex)하여 15분 동안 항온처리하여, ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’를 제조하였다.After dropping the target gene (DNA) dissolved in phosphate buffer saline (PBS, pH7.4) solution in polyethyleneimine solution (bPEI, LPEI, ssPEI) prepared according to the molecular weight, mixed at room temperature (PEI / DNA complex) Incubation for 15 minutes to prepare a 'conjugated gene complex'.

상기 폴리에틸렌이민과 목적유전자의 중량비율은 9:0.5, 9:1.0, 9:1.5, 9:2.0, 9:2.5 및 9:3.0로 혼합하였다.The weight ratio of the polyethyleneimine and the target gene was mixed at 9: 0.5, 9: 1.0, 9: 1.5, 9: 2.0, 9: 2.5, and 9: 3.0.

상기 목적 유전자는 Akt 유전자에 특이적인 siRNA(Akt1-siRNA)를 사용하였다.
The target gene was siRNA (Akt1-siRNA) specific to the Akt gene.

(2) ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’의 제조(2) Preparation of 'gene carriers whose target genes are immobilized on stents'

상기 (1)에서 제조한 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’가 고정화된 스텐트 즉, ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’를 제조하기 위하여 우선, 히알루론산(hyaluronic acid) 코팅액으로 스텐트를 코팅하였다.In order to manufacture a stent in which the 'gene gene condensed with the target gene' prepared in (1) is immobilized, that is, 'the gene carrier in which the target gene is immobilized on the stent', the stent is first coated with a hyaluronic acid coating solution. Coated.

히알루론산(MW: 130,000) 200 mg과 도파민(MW: 189.64) 36 mg을 혼합시킨 혼합용액(MES, pH 5.5) 에 코발트-크롬 합금의 스텐트를 37℃의 온도에서 11시간 합성하였다. 합성 과정은 히알루론산의 -COOH 그룹의 활성화를 위하여 EDC(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, FW: 191.7) 405 mg과 NHS(N-hydroxysulfosuccinimide, FW: 115.09) 121 mg을 첨가하여 이루어졌다. 불순물(EDC, NHS)의 제거를 위한 투석(3일)과 동결건조(3일) 과정을 거친 후, 이를 pH 8.5의 TBS(Tris-Buffered Saline) 완충액에 녹인 다음, 그 용액에 스텐트를 12시간 침지시켜 스텐트의 표면에 히알루론산을 코팅하였다.A stent of cobalt-chromium alloy was synthesized at a temperature of 37 ° C. for 11 hours in a mixed solution (MES, pH 5.5) in which 200 mg of hyaluronic acid (MW: 130,000) and 36 mg of dopamine (MW: 189.64) were mixed. The synthesis process adds 405 mg of EDC (1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (FW: 191.7) and 121 mg of NHS (N-hydroxysulfosuccinimide, FW: 115.09) to activate the -COOH group of hyaluronic acid. Was done. After dialysis (3 days) and lyophilization (3 days) to remove impurities (EDC, NHS), the solution was dissolved in Tris-Buffered Saline (TBS) buffer at pH 8.5, and the stent was added to the solution for 12 hours. Immersion coated hyaluronic acid on the surface of the stent.

상기 히알루론산이 코팅된 스텐트에 상기 (1)에서 제조한 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’를 함침시킨 후 건조하여, 최종적으로 ‘목적 유전자가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체’를 제조하였다.
The hyaluronic acid-coated stent was impregnated with 'gene gene condensed with object gene' prepared in (1), followed by drying, thereby finally preparing 'gene carriers having object gene immobilized on stent'.

[실시예 1] ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’의 목적 유전자의 발현Example 1 Expression of a Target Gene of a Gene Complex Condensed with a Target Gene

(1) 폴리에틸렌이민의 종류에 따른 목적 유전자의 발현조사(1) Investigation of the expression of the target gene according to the type of polyethyleneimine

상기 제조예의 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’에 있어 제조된 폴리에틸렌이민의 종류에 따른 목적 유전자의 발현정도 및 세포독성을 조사하였다.The expression level and cytotoxicity of the target gene according to the type of polyethylenimine prepared in the "gene complex condensed with the target gene" of the preparation example was investigated.

분지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine, bPEI)과 복합체화된 목적유전자(bPEI/DNA complex)의 전달체와 선형 폴리에틸렌이민(Linear polyethylenimine, LPEI)과 복합체화된 목적유전자(LPEI/DNA complex)의 전달체를 이용하여 리포터 유전자인 루시퍼레이즈(luciferase)의 활성을 조사하였다. Using a carrier of a bPEI / DNA complex complexed with a branched polyethylenimine (bPEI) and a carrier of a LPEI / DNA complex complexed with a linear polyethylenimine (LPEI) The activity of luciferase, a reporter gene, was examined.

상기 NIH3T3 섬유아 세포의 배양은 각각의 세포를 37℃, 5% 이산화탄소 환경에서 FBS(소 혈청)이 10% 포함된 DMEM 배양액에서 배양한 세포 5×104개를 상기 제조된 유전자 전달체에 처리하였다. 형질전환을 위해 세포를 상기 실시예의 유전자 전달체에 14시간 부착한 후, 72시간 동안 루시퍼레이즈의 발현량을 조사하였다. 그 후 24시간 후 세포용혈과정을 통해 단백질의 발현양을 정량하고, 형광현미경을 통해 발현량을 모니터하였다.In the culture of the NIH3T3 fibroblasts, 5 × 10 4 cells cultured in DMEM medium containing 10% of FBS (bovine serum) at 37 ° C. and 5% carbon dioxide were treated with the gene carrier prepared above. . After transformation of the cells to the gene carrier of the above example for transformation for 14 hours, the expression level of luciferase was examined for 72 hours. After 24 hours, the expression level of the protein was quantified through the cell hemolysis process, and the expression level was monitored through a fluorescence microscope.

그 결과 도 2 및 도 3에서도 확인할 수 있듯이, ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’에서 폴리에틸렌이민의 종류 뿐 아니라 목적 유전자의 농도에 따라 목적 유전자의 발현이 다소 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 분지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine, bPEI)과 축합된 목적유전자(bPEI/DNA complex) 복합체의 경우는 목적 유전자의 농도가 2 내지 3 ㎍의 농도에서 24 시간 내지 48시간 이후 유전자의 발현이 가장 우수하였지만 선형 폴리에틸렌이민(Linear polyethylenimine, LPEI)과 축합된 목적유전자(LPEI/DNA complex) 복합체는 목적 유전자의 농도가 1.5 내지 3 ㎍의 농도에서 24 시간에서 유전자의 발현이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as can be seen in Figures 2 and 3, it was confirmed that the expression of the target gene is slightly different depending on the concentration of the target gene as well as the type of polyethylenimine in the 'target gene condensed gene complex'. That is, in the case of a branched polyethylenimine (bPEI) and a condensed target gene (bPEI / DNA complex) complex, the expression of the gene is best after 24 to 48 hours at the concentration of 2 to 3 μg. Although excellent, linear polyethylenimine (LPEI) and the condensed target gene (LPEI / DNA complex) complex was found to be the best gene expression at 24 hours at the concentration of the target gene 1.5 ~ 3 ㎍.

(2) 유전자의 전달 방법에 따른 세포로의 유전자 전달 효율(2) Gene Delivery Efficiency to Cell by Gene Delivery Method

또한, 상기 제조예의 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’에 대하여, 유전자의 전달 방법에 따른 세포로의 유전자 전달 효율을 조사하였다.In addition, the gene transfer efficiency to the cells according to the gene delivery method for the 'gene complex condensed with the target gene' of the preparation example was investigated.

유전자 전달방법은(transfection)은 섬유세포인 NIH/3T3(ATCC, USA)와 흰쥐 혈관 평활근 세포인 A10 세포를 사용하였다.Transfection was performed using NIH / 3T3 (ATCC, USA), a fibroblast, and A10 cells, a rat vascular smooth muscle cell.

세포 배양방법은 상기 (1)의 방법과 동일하며, 유전자의 전달 방법은 리버스 트랜스펙션(reverse transfection) 기법으로 배양 플레이트에 목적 유전자와 복합체화된 유전자 전달체를 미리 고정한 후, 그 위에 5×104개의 세포를 처리하여 상기 목적유전자를 세포로 전달을 유도하였다. The cell culture method is the same as the method of (1) above, and the gene transfer method is previously fixed with a gene carrier complexed with a target gene in a culture plate by reverse transfection, and then 5 × 10 on it. Four cells were treated to induce delivery of the gene of interest.

반면 대조구는 일반적인 유전자 전달기법(bolus)으로 상기 리버스 트랜스펙션(reverse transfection)과 반대로 세포를 14시간 동안 배양한 후 그 위에 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’를 처리하는 방법으로 수행하였다. On the other hand, the control was performed by incubating the cells for 14 hours as opposed to the reverse transfection by a general gene transfer technique (bolus) and then treating the 'gene gene condensed with the target gene' thereon.

그 결과 도 4에서 확인할 수 있듯이, 상기 제조예의 목적 유전자가 축합된 유전자 복합체는 리버스 트랜스펙션(reverse transfection) 기법이 일반적인 유전자 전달기법(bolus) 보다 유전자 전달 효율이 우수한 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 4, the gene complex condensed with the target gene of the preparation example was confirmed that the reverse transfection technique is superior to the gene transfer efficiency (bolus) gene transfer efficiency (bolus).

특히, 분지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine, bPEI)과 축합된 목적유전자(bPEI/DNA complex) 복합체의 경우, 분지형 폴리에틸렌이민의 분자량이 25 kDa/g에 목적 유전자의 농도가 2.5 ㎍/㎠인 경우에 가장 높은 유전자 전달 효율을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
In particular, in the case of a branched polyethylenimine (bPEI) and a condensed target gene (bPEI / DNA complex) complex, when the molecular weight of the branched polyethyleneimine is 25 kDa / g and the concentration of the target gene is 2.5 ㎍ / ㎠ Was found to show the highest gene transfer efficiency.

(3) 폴리에틸렌이민의 종류에 따른 세포독성 조사(3) Cytotoxicity Survey by Polyethyleneimine

상기 제조예의 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’에 있어, 혼합된 폴리에틸렌이민의 종류(bPEI 25kDa, bPEI 10kDa, bPEI 1.8kDa/ LPEI 2.5kDa, LPEI 25kDa, ssPEI)에 따른 세포에 대한 독성 여부를 조사하였다.In the 'complex of the target gene condensed gene' of the preparation example, the toxicity of the cells according to the type of mixed polyethyleneimine (bPEI 25kDa, bPEI 10kDa, bPEI 1.8kDa / LPEI 2.5kDa, LPEI 25kDa, ssPEI) It was.

세포독성은 상기 NIH/3T3(ATCC, USA) 세포에 상기 제조예의 ‘목적 유전자가 축합된 유전자 복합체’를 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 MTS assay(promega, USA)을 처리한 후 분광계를 이용하여 490 nm 영역의 파장에서 그 수치를 통해 세포 생존력(cell viability)을 조사하였다. Cytotoxicity is treated with the 'gene gene condensed with the target gene' of the preparation example in the NIH / 3T3 (ATCC, USA) cells, incubated for 24 hours and then treated with MTS assay (promega, USA) using a spectrometer The cell viability was examined through the numerical values at the wavelength of 490 nm region.

그 결과, 세포 내로 전달된 유전자로 인한 세포독성은 도 5의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 세포독성이 없어 세포성장에 대한 부작용을 낮음을 확인할 수 있었다.
As a result, the cytotoxicity due to the gene delivered into the cell was confirmed that the side effects on the cell growth is low because there is no cytotoxicity, as can be confirmed in the results of FIG.

(4) 25 (4) 25 kDakDa bPEIbPEI , 25 , 25 kDakDa LPEILPEI , , ssPEIssPEI 에서 목적 유전자의 농도에 따른 세포에서의 최적 발현율을 조사Optimal Expression Rate in Cells According to Concentration of Target Gene

상기 실시예에서 제조한 25 kDa의 분지형 폴리에틸렌이민(bPEI 25kDa), 선형 폴리에틸렌이민(LPEI 25kDa) 및 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(ssPEI)과 목적 유전자가 축합된 유전자 복합체에 있어, 혼합되는 목적 유전자의 농도에 따른 세포에서의 최적 발현율을 조사하였다.In the 25 kDa branched polyethyleneimine (bPEI 25kDa), linear polyethyleneimine (LPEI 25kDa) and disulfide-linked polyethylenimine (ssPEI) and the target genes condensed in the gene complex prepared in the above embodiment, Optimal expression rate in cells was investigated according to the concentration of the target gene.

그 결과 도 6에서 확인할 수 있듯이, 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민과 목적 유전자가 축합된 유전자 복합체가 목적 유전자의 농도가 증가함에 따라 유전자 전달 효율 뿐 아니라 가장 높은 목적 유전자의 발현을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as can be seen in Figure 6, it is confirmed that the gene complex condensed polyethylenimine and the target gene cross-linked through disulfide bond shows the expression of the highest target gene as well as gene transfer efficiency as the concentration of the target gene increases. Could.

(5) 겔 이동분석 ((5) gel transfer assay ( GelCome retardationretardation assayassay ))

폴리아크릴아미드 겔 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)을 이용하여 목적 유전자와 ssPEI 사이의 결합력에 조사하였다.Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) was used to investigate the binding force between the target gene and ssPEI.

폴리에틸렌이민 용액(bPEI, ssPEI)에 Akt1의 siRNA 용액을 각각 다른 비율(10, 20, 30, 40)로 혼합한 후 15분간 배양하여 유전자 복합체(bPEI 25kDa/Akt1 siRNA complex와 ssPEI/Akt1 siRNA complex)를 제조하고, 상기 제조된 유전자 복합체를 폴리아크릴아미드겔에 전기영동하여 자외선 조사기(UV illuminator)를 이용하여 확인하였다. The siRNA solution of Akt1 was mixed in polyethyleneimine solution (bPEI, ssPEI) in different ratios (10, 20, 30, 40) and incubated for 15 minutes, followed by incubation for 15 minutes. Was prepared, and the prepared gene complex was electrophoresed on polyacrylamide gel and confirmed by using an ultraviolet illuminator.

그 결과 도 8에서 확인할 수 있듯이, ssPEI/Akt1 siRNA complex가 bPEI 25kDa/Akt1 siRNA complex에 비하여 모든 농도의 비율에서 강하게 결합되어 축합된 유전자 복합체를 이루는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as can be seen in Figure 8, the ssPEI / Akt1 siRNA complex was confirmed to form a condensed gene complex by binding strongly at all concentrations compared to the bPEI 25kDa / Akt1 siRNA complex.

[[ 실시예Example 2] ‘목적 유전자가  2] 'The target gene 스텐트Stent 상에 고정화된 유전자 전달체’의 세포증식 억제효과 Cell Proliferation Inhibitory Effect of Gene Carriers Immobilized on the Rat

(1) (One) inin vitrovitro 실험 Experiment

① ‘목적 유전자가 ① 'The target gene 스텐트Stent 상에 고정화된 유전자 전달체’의  Of gene carriers immobilized on the 스텐트Stent 표면상에 고정화된 목적 유전자 발현조사 Target gene expression study immobilized on the surface

상기 실시예의 히알루론산이 코팅된 스텐트 표면상에 고정화된 목적 유전자의 발현을 확인하기 위해, 폴리에틸렌이민 용액(bPEI, ssPEI)에 yoyo1-1 유전자(초록색의 형광 표지인자)가 붙어있는 Akt1 siRNA 용액을 각각 다른 비율(10, 20)로 혼합한 후 유전자 전달체를 제조하고, 상기 제조된 유전자 전달체에 히알루론산이 코팅된 스텐트를 함침시켜 고정화한 후, 형광현미경을 통하여 도 9의 부착영상을 확인할 수 있었다. In order to confirm the expression of the target gene immobilized on the surface of the hyaluronic acid-coated stent of the above embodiment, an Akt1 siRNA solution having a yoyo1-1 gene (green fluorescent marker) attached to a polyethyleneimine solution (bPEI, ssPEI) was used. After mixing at different ratios (10, 20), the gene carrier was prepared, and the immobilized by imposing a stent coated with hyaluronic acid on the prepared gene carrier, the attachment image of FIG. 9 was confirmed through a fluorescence microscope. .

또한, 히알루론산이 코팅된 스텐트와 유전자 전달체의 결합력을 조사한 결과 도 10에서 확인할 수 있듯이 78% 이상 고효율로 부착되어 있음을 확인할 수 있었다.
In addition, as a result of examining the binding force between the hyaluronic acid-coated stent and the gene carrier, as shown in FIG.

② ‘목적 유전자가 ② 'The target gene 스텐트Stent 상에 고정화된 유전자 전달체’의 세포독성 조사 Cytotoxicity of the gene carrier immobilized on the

세포독성은 A10 세포에 ssPEI/Akt1 siRNA complex가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체를 농도별로(25 pmol, 50 pmol, 75 pmol, 100 pmol)처리하고 24시간 동안 배양한 후 MTS assay(promega, USA)을 처리한 후 분광계를 이용하여 490 nm 영역의 파장에서 그 수치를 통해 세포 생존력(cell viability)을 조사하였다. 양성 대조군을 PEI 25kDa/Akt1 siRNA complex를 사용하였다.Cytotoxicity was measured by MTS assay (promega, USA) after treatment with concentrations of gene carriers immobilized on ssPEI / Akt1 siRNA complex on stents (25 pmol, 50 pmol, 75 pmol, 100 pmol) in A10 cells for 24 hours. After treatment with the spectrometer, the cell viability was investigated through the values at a wavelength of 490 nm region. Positive controls used PEI 25kDa / Akt1 siRNA complex.

그 결과 도 11에서 확인할 수 있듯이 ssPEI/Akt1 siRNA complex가 고정화된 스텐트의 경우 90% 이상 세포 생존력을 가짐을 확인할 수 있었고, 양성 대조군인 경우 70%의 세포 생존력을 가짐을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 11, the ssPEI / Akt1 siRNA complex was confirmed to have a cell viability of 90% or more in the immobilized stent, and the positive control group had a cell viability of 70%.

③ ‘목적 유전자가 ③ 'The target gene 스텐트Stent 상에 고정화된 유전자 전달체’로부터 세포 내로 전달된 목적 유전자의 발현 Of the gene of interest transferred into the cell from the gene carrier immobilized on the

목적 유전자인 Akt1 siRNA의 발현을 확인하기 위하여, 역전사 유전자증폭분석(RT-PCR)을 수행하였다.In order to confirm the expression of the target gene Akt1 siRNA, reverse transcription gene amplification analysis (RT-PCR) was performed.

리버스 트랜스펙션(reverse transfection) 기법으로 배양 플레이트에 ssPEI/Akt1 siRNA complex를 미리 고정한 후, 3T3세포 섬유아세포를 배양하였다. 상기 Akt1 siRNA 용액을 각각 다른 비율(10, 20)로 혼합한 후 ssPEI/Akt1 siRNA complex를 제조하였다. Negative control로 scramble siRNA(scr siRNA)을 사용하였다.After ssPEI / Akt1 siRNA complexes were pre-fixed to the culture plate by reverse transfection, 3T3 cell fibroblasts were cultured. The Akt1 siRNA solutions were mixed at different ratios (10, 20), respectively, to prepare ssPEI / Akt1 siRNA complexes. As a negative control, scramble siRNA (scr siRNA) was used.

배양 24시간 동안 Akt1의 발현을 유도하고, 세포로부터 mRNA를 추출하였다. 그 후 mRNA의 각 염기에 상보적 염기를 합성하여 cDNA를 제작하였다. cDNA에 합성을 위해 하기 프라이머 세트를 사용하였다.Expression of Akt1 was induced for 24 hours of culture and mRNA was extracted from the cells. Then, cDNA was prepared by synthesizing base complementary to each base of mRNA. The following primer sets were used for the synthesis on cDNA.

PCR은 95℃, 5분, 주형 DNA를 변성 -> (94℃, 1분간 -> 55℃에서 1분간 -> 72℃, 1분간), 34회 반복 -> 72℃, 10분의 반응 조건으로 수행하였다, PCR denatured template DNA at 95 ℃ for 5 minutes-> (94 ℃, 1 minute-> 55 ℃ for 1 minute-> 72 ℃ for 1 minute), 34 repetitions-> 72 ℃ for 10 minutes Performed,

Akt1 정방향(서열번호 1): 5’-ATGAGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3; Akt1 forward (SEQ ID NO: 1): 5'-ATGAGCGACGTGGCTATTGTGAAG-3;

Akt1 역방향(서열번호 2): 5’-GAGGCCGTCAGCCACAGTCTGGATG-3’Akt1 reverse (SEQ ID NO: 2): 5'-GAGGCCGTCAGCCACAGTCTGGATG-3 '

그 결과, 도 12에서 확인할 수 있듯이, 세포 내 Akt1 siRNA가 효율적으로 전달되어 Akt1의 발현을 효과적으로 억제시킴을 확인할 수 있었다.
As a result, as can be seen in Figure 12, it was confirmed that the intracellular Akt1 siRNA is efficiently delivered to inhibit the expression of Akt1.

(1) (One) inin vivovivo 실험 Experiment

토끼(3개월령, 약 3.5 kg)의 관상동맥에 상기 ‘목적 유전자가 스텐트상에 고정화된 유전자 전달체’, 무처리 금속 스텐트(BMS), 및 히알루론산(HA)이 코팅된 스텐트를 각각 식립한 후, 2주 또는 4주 후에 관상동맥으로 분리한 스텐트 내 재협착병변(In- stent-Restenosis, ISR) 비율, 스텐트의 scanning electron microscope(SEM)사진 및 혈관의 양상을 조사하였다. In the coronary artery of a rabbit (3 months old, about 3.5 kg), the 'gene genes immobilized on the stent', the untreated metal stent (BMS), and the hyaluronic acid (HA) coated stent were respectively implanted. After 2 or 4 weeks, the rate of in-stent-restenosis (ISR) in the stent, coronary artery, scanning electron microscope (SEM) image of the stent, and vessel pattern were examined.

① ① 식립Placement 후,  after, 스텐트Stent 내  of mine 재협착병변Restenosis (( InIn - - stentstent -- RestenosisRestenosis , , ISRISR ) 조사) Research

상기 제조된 ssPEI/Akt1 siRNA complex가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체, 무처리 금속 스텐트(BMS), 및 히알루론산(HA)이 코팅된 스텐트를 각각 식립한 4주 후, 관상동맥으로 분리한 스텐트로부터 스텐트 내 재협착병변(In- stent-Restenosis, ISR) 비율을 하기 식 1을 이용하여 조사하였다. Four weeks after the ssPEI / Akt1 siRNA complex prepared above were implanted with the gene carrier immobilized on the stent, the untreated metal stent (BMS), and the hyaluronic acid (HA) coated stent, respectively, from the stent separated by coronary artery. The rate of restenosis in the stent (In-stent-Restenosis, ISR) was investigated using Equation 1 below.

Figure 112012021395715-pat00001
Figure 112012021395715-pat00001

그 결과, 도 13 및 도 14에서 확인할 수 있듯이 히알루론산(HA)이 코팅된 스텐트의 경우 무처리 금속 스텐트(BMS) 보다 재협착이 억제되는 것을 확인할 수 있었고, ssPEI/Akt1 siRNA complex가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체의 경우 1.5 내지 2배 이상 재협착 억제효과가 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as can be seen in FIGS. 13 and 14, in the case of the hyaluronic acid (HA) coated stent, restenosis was more suppressed than the untreated metal stent (BMS), and the ssPEI / Akt1 siRNA complex was confirmed on the stent. In the case of an immobilized gene carrier, it was confirmed that the inhibitory effect of restenosis over 1.5 to 2 times was excellent.

② ② 식립Placement 후,  after, SEMSEM (( scanningscanning electronelectron microscopemicroscope )을 이용한 표면 관찰Surface observation with

상기 제조된 ssPEI/Akt1 siRNA complex가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체, 무처리 금속 스텐트(BMS), 및 히알루론산(HA)이 코팅된 스텐트를 각각 식립한 4주 후, 관상동맥으로부터 분리한 스텐트의 표면을 SEM(scanning electron microscope)을 이용하여 확인하였다.After 4 weeks of ssPEI / Akt1 siRNA complex prepared above, the stent coated with the gene carrier immobilized on the stent, the untreated metal stent (BMS), and the hyaluronic acid (HA) coated stent, respectively, of the stent separated from the coronary artery. The surface was confirmed using a scanning electron microscope (SEM).

그 결과, 도 15에서도 확인할 수 있듯이, 무처리 금속 스텐트(BMS)의 경우는 식립 후 재협착이 많이 생겨 스텐트의 위치가 잘 보이지 않는 반면, HA-코팅된 스텐트는 다소 재협착이 억제되나 이 역시 무처리 금속 스텐트와 마찬가지로 스텐트의 위치의 확인이 어려운 것을 확인할 수 있엇다.As a result, as can be seen in Figure 15, in the case of untreated metal stents (BMS) a lot of restenosis occurs after implantation, the position of the stent is not seen well, while HA-coated stent is somewhat restrained restrained but also As with the untreated metal stent, it was confirmed that the stent's position was difficult.

그러나 ssPEI/Akt1 siRNA complex가 스텐트 상에 고정화된 유전자 전달체의 경우, 상기 HA-코팅된 스텐트 보다 스텐트의 위치를 명확하게 확인할 수 있었고, 이는 식립 후 재협착 억제효과가 우수함을 확인한 결과이기도 하다.
However, in the case of the gene carrier in which the ssPEI / Akt1 siRNA complex is immobilized on the stent, the position of the stent can be clearly identified than the HA-coated stent, which is also a result of confirming that the restenosis suppression effect is excellent after implantation.

③ ③ 식립Placement 후, 혈관 양상 조사 After, vascular pattern investigation

토끼(3개월령, 약 3.5 kg)의 관상동맥에 상기 ‘목적 유전자가 스텐트상에 고정화된 유전자 전달체’, 무처리 금속 스텐트(BMS), 및 히알루론산(HA)이 코팅된 스텐트를 각각 식립한 후, 2주 또는 4주 후에 혈관의 양상을 조사하여 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.In the coronary artery of a rabbit (3 months old, about 3.5 kg), the 'gene genes immobilized on the stent', the untreated metal stent (BMS), and the hyaluronic acid (HA) coated stent were respectively implanted. After 2 or 4 weeks, the pattern of blood vessels was examined and shown in Table 1 and Table 2 below.

Figure 112012021395715-pat00002
Figure 112012021395715-pat00002

혈관의 양상은 상기 도면을 참고하여 하기 식 2 및 식 3를 이용하였다.The vessels were used in Equations 2 and 3 below with reference to the drawings.

Figure 112012021395715-pat00003
Figure 112012021395715-pat00003

Figure 112012021395715-pat00004
Figure 112012021395715-pat00004

Figure 112012021395715-pat00005
Figure 112012021395715-pat00005

Figure 112012021395715-pat00006
Figure 112012021395715-pat00006

그 결과 상기 표 1 및 표 2의 결과에서도 확인할 수 있듯이, 혈관의 두께 및 실험 방법의 신뢰도를 입증할 수 있는 internal elastic lamina(IEL area), lumen area에는 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다.As a result, as can be seen in the results of Table 1 and Table 2, it was confirmed that there is no significant difference in the internal elastic lamina (IEL area), lumen area that can prove the reliability of the blood vessel thickness and the experimental method.

재협착 정도를 확인할 수 있는 병리학적 흡착(pathologic stenosis)은 도 16에서도 확인할 수 있듯이, ‘목적 유전자가 스텐트상에 고정화된 유전자 전달체’가 무처리 금속 스텐트(BMS), 및 히알루론산(HA)이 코팅된 스텐트에 비해 낮게 나타냄을 확인할 수 있었다.Pathologic stenosis, which can confirm the degree of restenosis, can also be confirmed in FIG. 16, in which the gene transfer target immobilized on the stent is an untreated metal stent (BMS) and hyaluronic acid (HA). It can be seen that it is lower than the coated stent.

즉, 상기의 결과들로부터 본 발명의 ‘목적 유전자가 스텐트상에 고정화된 유전자 전달체’가 목적 유전자가 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화(complexed)됨으로써 유전자 전달체의 안정적인 생체로의 전달이 가능하며, 기존의 사용하는 고분자물질로 야기되는 혈전이나 염증 유발 등의 문제를 해결 뿐 아니라 많은 양의 목적 유전자 특히, siRNA와의 결합이 가능하여 특정 질병 유전자의 발현을 효율적으로 억제하여, 혈관의 재협착을 효율적으로 방지할 수 있음을 확인할 수 있었다.That is, from the above results, the 'gene carrier in which the target gene is immobilized on the stent' of the present invention is complexed with the branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds (ssPEI) through the disulfide bond. (complexed) enables the delivery of gene carriers to stable living organisms, and solves problems such as blood clots and inflammation caused by existing polymer materials, as well as binding to a large amount of target genes, in particular, siRNA. It was confirmed that the expression of the disease genes can be efficiently suppressed, thereby effectively preventing blood vessel restenosis.

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Claims (11)

분지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine, bPEI), 선형 폴리에틸렌이민(Linear polyethylenimine, LPEI), 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)으로부터 선택되는 1종 이상의 폴리에틸렌이민을 목적 유전자와 혼합하여 이온 상호작용(ionic interaction)에 의해 복합체화된(complexed), 목적 유전자로 Akt 유전자에 특이적인 siRNA를 세포로 전달하여 재내피화를 촉진하거나 평활근 세포의 증식을 억제하는 혈관 재협착 방지용 유전자 전달체.One or more polyethyleneimines selected from branched polyethylenimine (bPEI), linear polyethylenimine (LPEI), and branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds (ssPEI). Is a blood vessel that is mixed with the target gene and complexed by ionic interaction to deliver siRNA specific to the Akt gene to the cell, thereby promoting re-endothelialization or inhibiting the proliferation of smooth muscle cells. Gene carrier for preventing restenosis. 제 1항에 있어서,
상기 목적 유전자는 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)과 복합체화된(complexed) 것을 특징으로 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.The method of claim 1,
The gene of interest is a gene carrier for delivering a gene of interest to the cell, characterized in that complexed with (branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI) cross-linked through disulfide bonds. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 폴리에틸렌이민은 분자량이 1 내지 102 KDa인 것을 특징으로 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.3. The method according to claim 1 or 2,
The polyethyleneimine has a molecular weight of 1 to 10 2 KDa characterized in that the gene carrier for delivering the target gene to the cell. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 유전자 전달체는 폴리에틸이민과 목적 유전자가 1 : 0.01 내지 1.0 중량 비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.3. The method according to claim 1 or 2,
The gene carrier is a gene carrier for delivering a target gene to the cell, characterized in that the mixture of polyethylenimine and the target gene in a weight ratio of 1: 0.01 to 1.0. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 목적 유전자가 지지체 상에 고정화된 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.3. The method according to claim 1 or 2,
A gene carrier for delivering a target gene immobilized on a support to the cell. 제 8항에 있어서,
상기 지지체는 히알루론산(hyaluronic acid) 또는 콜라겐이 표면에 코팅된 스텐트인 것을 특징으로 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.The method of claim 8,
The support is a gene carrier for delivering a target gene to a cell, characterized in that the hyaluronic acid (hyaluronic acid) or collagen coated on the surface of the stent. 제 8항에 있어서,
상기 유전자 전달체는 혈관 재협착 방지용 스텐트(stent)인 것을 특징으로 하는 목적 유전자를 세포로 전달하기 위한 유전자 전달체.The method of claim 8,
The gene carrier is a gene carrier for delivering a target gene to the cell, characterized in that the stent (sten) for preventing vascular restenosis. (1) 분지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine, bPEI), 선형 폴리에틸렌이민(Linear polyethylenimine, LPEI), 이황화 결합을 통해 가교 결합된 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds; ssPEI)으로부터 선택되는 1종 이상의 폴리에틸렌이민을 목적 유전자와 혼합하여 이온 상호작용(ionic interaction)으로 결합에 의해 복합체를 형성시켜 제 1항 또는 제 2항에 따른 유전자 전달체를 제조하는 단계;
(2) 히알루론산(hyaluronic acid) 코팅액으로 스텐트를 코팅하는 단계; 및
(3) 상기 (2)의 히알루론산(hyaluronic acid)이 코팅된 스텐트에 상기 (1)의 유전자 전달체를 고정화하는 단계;
를 포함하는, 목적 유전자로 Akt 유전자에 특이적인 siRNA를 세포로 전달하여 재내피화를 촉진하거나 평활근 세포의 증식을 억제하는 혈관 재협착 방지용 유전자 전달체의 제조방법.(1) Branched Polyethylenimine (bPEI), Linear Polyethylenimine (LPEI), Disulfide Bonded Polyethyleneimine (Branched Polyethylenimine cross-linked via disulfide bonds (ssPEI) Preparing a gene carrier according to claim 1 or 2 by mixing the polyethyleneimine with a target gene to form a complex by binding in ionic interaction;
(2) coating the stent with a hyaluronic acid coating solution; And
(3) immobilizing the gene carrier of (1) on the stent coated with hyaluronic acid of (2);
A method of producing a gene transporter for preventing vascular restenosis, comprising: transducing siRNA specific to an Akt gene to a cell as a target gene and promoting re-endothelialization or inhibiting the proliferation of smooth muscle cells.
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