KR101376311B1 - 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법 - Google Patents

박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 박층크로마토그래피를 이용하여 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물로부터 사포닌을 효과적으로 분리하는 방법에 관한 것으로서, 상기 액상 조성물이 도포된 박층크로마토그래피 플레이트를 비극성 유기용매, 극성 유기용매 및 물로 이루어진 혼합용매로 1차 전개하고, 이후 강산 수용액으로 2차 전개하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법은 종래의 박층크로마토그래피 방법에 비해 강산 수용액으로 박층크로마토그래피 플레이트를 다시 한번 더 전개하기 때문에 박층크로마토그래피 플레이트 상에 사포닌이 분배된 영역으로부터 당류를 효과적으로 제거할 수 있고, 사포닌의 분리능을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법은 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물로부터 사포닌 분자들을 검출하거나 고순도로 정제하는데에 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법은 야생콩, 재배콩 또는 다년생콩을 포함하는 Glycine 속 식물 종자들의 다양한 사포닌 표현형 및 그 함량을 시각화할 수 있고, 이를 통해 Glycine 속 식물 종자들 간의 유연관계(Phylogenetic Relationship)를 분석하는 경우 야생콩 종을 구분하기 위한 마커로 활용될 수 있다.

Description

박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법{Method for separating saponin by thin layer chromatography}
본 발명은 사포닌의 분리방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 박층크로마토그래피를 이용하여 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물로부터 사포닌을 효과적으로 분리하는 방법에 관한 것이다.
사포닌(saponin)은 식물의 2차 대사산물로서 스테로이드(C27) 또는 트리테르페노이드(C30) 아글리콘 및 상기 아글리콘의 적어도 하나 이상의 위치에서 글리코시드 결합을 통해 연결된 많은 탄수화물 성분을 포함한다(비특허문헌 1). 많은 트리테르페노이드 배당체가 야생 Glycine 속의 종자에서 보고되고 있다(비특허문헌 2). 게다가, 야생콩에서 단리된 소야사포닌은 그들의 아글리콘 구조에 기초하여 복잡하고 다양한 분자 구조들을 보이고 있으며, 크게 A군 사포닌과 DDMP(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one) 사포닌들로 분류되어 왔다(비특허문헌 3, 4). A군 사포닌은 주로 종자의 배축에서 검출되며 사포게놀 A의 C-3 위치 및 C-22 위치에 2개의 당 체인이 결합된 비스데스모사이드(bisdesmoside) 사포닌인 것으로 나타났다. 특히, 모든 A군 사포닌에서 사포게놀 A의 C-22 위치에 결합된 올리고당 체인의 말단은 모두 아세틸화되어 있다(비특허문헌 5). 한편, DDMP 사포닌은 종자의 배축 및 자엽 모두에 존재한다. DDMP 사포닌은 사포게놀 B의 C-3 위치에 결합된 하나의 당 체인 및 사포게놀 B의 C-22 위치에 결합된 하나의 DDM기를 가진 모노데스모사이드(monodesmoside) 사포닌이다. DDMP 사포닌은 상대적으로 불안정하고 대부분의 상업적 추출 과정 내지 B군 사포닌 및 E군 사포닌을 형성하기 위한 처리 과정 동안 쉽게 분해된다(비특허문헌 4). 이러한 트리테르페노이드 사포닌은 잠재적인 영양 촉진 기능, 기호적 특성 및 불분명한 생합성 경로 때문에 크게 주목을 받고 있다(비특허문헌 6, 7, 8). 따라서, 야생콩, 재배콩 또는 다년생콩을 포함하는 Glycine 속 식물의 종자에 함유된 신규 사포닌이나 그 변이체를 발견하는 것은 매우 중요하다.
한편, 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)는 주로 혼합물 내에 존재하는 많은 성분들을 분리하거나, 용질 분자들을 동정하거나, 특정 화합물의 순도를 확인하는데에 주로 사용되는 값싸고 간단한 분석방법이다(비특허문헌 9). TLC는 콩 종자로부터 추출된 추출물에 함유된 사포닌 성분들을 분리하고 검출하는데에 중요한 역할을 담당하고 있다. 보통 야생콩 종자로부터 사포닌을 추출하기 위해 추출용매로 수용성 유기용매인 70% 에탄올 수용액 또는 80% 메탄올 수용액이 이용된다(비특허문헌 2, 10). 이렇게 추출된 야생콩 종자 조추출물에는 다양한 사포닌 분자들뿐만 아니라, 이소플라본류 및 당류들을 포함한다. 조추출물에 포함된 용질들은 실리카겔이 코팅된 TLC 플레이트 상에서 바로 분리되고 확인된다. 이때 용질 분자들의 분리는 26개의 파라미터에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 가장 중요한 파라미터들로 고정상인 흡착제, 이동상인 전개용매, 전개용 챔버의 형태, 전개용 챔버의 증기압 등이 있다(비특허문헌 11). 야생콩 종자 조추출의 성분을 분리하고 검출하기 위한 전통적인 TLC 방법에서 TLC 플레이트는 보통 전개용 챔버의 하부에 담겨 있고 클로로포름, 메탄올 및 물로 이루어진 혼합용매로 전개되는데, 이때, 조출물의 이소플라본류는 사포닌 영역 위에서 흡착되지만 당류는 사포닌 영역의 바로 아래에서 흡착된다. TLC 플레이트의 전개 후 분리된 성분들은 10% 황산 수용액의 분무 및 탄화(charring)에 의해 시각화되는데 이때 당류는 검은색 밴드로 나타나며 종종 사포닌 분자들의 분리 및 검출을 방해한다. 이를 해결하기 위해 조추출물을 물과 부탄올로 분배하고 부탄올층만을 분리하여 물층으로 용해된 당류를 제거하는 방법이 제시되어 있으나(특허문헌 1, 비특허문헌 12), 이러한 방법은 분리공정을 복잡하게 하여 시간과 비용을 상승시키고 더 큰 부피의 분리 시료를 요구하는 문제가 있다.
1. 대한민국공개특허공보 제10-2011-0077739호
1. K.R. Price, I.T. Johnson, G.R. Genwick, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 26 (1987) 27-135. 2. M. Shiraiwa, F. Yamauchi, K. Harada, K. Okubo, Agri. Biol. Chem. 54 (1990) 1347-1352. 3. C. Tsukamoto, A. Kikuchi, K. Harada, K. Kitamura, K. Okubo, Phytochem. 34 (1993) 1351-1356. 4. S. Kuduo, M. Tonomura, C. Tsukamato, T. Uchida, T. Sakabe, N. Tamura, K. Okubo, Biosci. Biotechnol. Biochem. 57 (1993) 546-550. 5. Shiraiwa M, Kudo S, Shimoyamada M, Harada K, Okubo K (1991) Composition and structure of group A saponin in soybean seed. Agric Biol Chem 55: 315-322. 6. Y. Yoshiki, S. Kudou, K. Okubo, Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 (1998) 2291-2299. 7. K. Okubo, M. Iijima, Y. Kobayashi, M. Yoshikoshi, T. Uchida, S. Kudou, Biosci. Biotech. Biochem. 56 (1992) 99-103. 8. M. Shibuya, K. Nishimura, N. Yasuyama, Y. Ebizuka, FEBS Lett. 584 (2010) 2258-2264. 9. C.F. Poole, J. Chromatogr. A, 856 (1999), 399-427 10. N. Honda, C. Tsukamoto, Y. Maehara, I. Tayama, K. Kitamura, R.J. Singh, G.H. Chung Proceedings of World Soybean Research Conference VIII. (2009) Electronic Press on CD, No Pages, Beijing, China. 11. F. GEISS, Dr. Alfred Huthig Verlag, Heidelberg, Germany, (1987). 12. M. Shimoyamada, K. Okubo, M. Yoshikoshi, Y. Yoshiki, K. Watanabe, Food Sci. Technol. Int. 1 (1995) 112-114.
본 발명은 종래의 문제점을 해결하기 위해 도출된 것으로서, 본 발명의 목적은 박층크로마토그래피를 이용하여 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물로부터 사포닌을 분리할 때 박층크로마토그래피 플레이트 상의 사포닌 영역으로부터 당류를 최대한 멀리 이동시켜 사포닌을 효과적으로 분리할 수 있는 방법을 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 박층크로마토그래피를 이용하여 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물로부터 사포닌을 분리할 때, 박층크로마토그래피 플레이트 상에 분배된 성분(특히 당류)의 발색을 위해 사용되는 강산 수용액(특히 황산 수용액)을 박층크로마토그래피 플레이트 상에 분무하는 대신 박층크로마토그래피 플레이트를 전개하기 위한 이동상으로 사용하는 경우 박층크로마토그래피 플레이트 상의 사포닌 영역으로부터 당류를 효과적으로 제거할 수 있는 점을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 (a) 평판 및 상기 평판의 적어도 일면에 흡착제가 코팅되어 박층으로 형성된 고정상을 포함하는 박층크로마토그래피 플레이트를 준비하는 단계; (b) 상기 박층크로마토그래피 플레이트의 고정상에 위치한 베이스라인에 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물을 도포하고 건조하는 단계; (c) 비극성 유기용매, 극성 유기용매 및 물로 이루어진 혼합용매가 하부에 담긴 전개용 챔버를 상기 혼합용매로 포화시키는 단계; (d) 상기 액상 조성물이 도포된 박층크로마토그래피 플레이트를 상기 혼합용매를 이동상으로 하여 혼합용매로 포화된 전개용 챔버 안에서 1차 전개하는 단계; (e) 상기 1차 전개된 박층크로마토그래피 플레이트를 건조하여 박층크로마토그래피 플레이트에 존재하는 혼합용매를 제거하는 단계; 및 (f) 상기 혼합용매가 제거된 박층크로마토그래피 플레이트를 강산 수용액을 이동상으로 하여 다른 전개용 챔버 안에서 2차 전개하는 단계를 포함하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법을 제공한다. 이때, 전개용 챔버는 1차 전개 및 2차 전개하는 동안 밀폐된 상태로 유지된다.
본 발명의 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법은 종래의 박층크로마토그래피 방법에 비해 강산 수용액으로 박층크로마토그래피 플레이트를 다시 한번 더 전개하기 때문에 박층크로마토그래피 플레이트 상에 사포닌이 분배된 영역으로부터 당류를 효과적으로 제거할 수 있고, 사포닌의 분리능을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법은 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물로부터 사포닌 분자들을 검출하거나 고순도로 정제하는데에 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법은 야생콩, 재배콩 또는 다년생콩을 포함하는 Glycine 속 식물 종자들의 다양한 사포닌 표현형 및 그 함량을 시각화할 수 있고, 이를 통해 Glycine 속 식물 종자들 간의 유연관계(Phylogenetic Relationship)를 분석하는 경우 야생콩 종을 구분하기 위한 마커로 활용될 수 있다.
도 1은 종래의 TLC 방법에 의해 콩 추출물을 분리한 제1 결과를 나타낸 사진이다.
도 2는 종래의 TLC 방법에 의해 콩 추출물을 분리한 제2 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 종래의 TLC 방법에 의해 콩 추출물을 분리한 제3 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 종래의 TLC 방법에 의해 콩 추출물을 분리한 제4 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 종래의 TLC 방법에 의해 콩 추출물을 분리한 제5 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 개량된 TLC 방법 1에 의해 콩 추출물을 분리한 제1 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 개량된 TLC 방법 1에 의해 콩 추출물을 분리한 제2 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 개량된 TLC 방법 1에 의해 콩 추출물을 분리한 제3 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 개량된 TLC 방법 1에 의해 콩 추출물을 분리한 제4 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 개량된 TLC 방법 1에 의해 콩 추출물을 분리한 제5 결과를 나타낸 사진이다.
도 11은 개량된 TLC 방법 2에 의해 콩 추출물을 분리한 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 개량된 TLC 방법 2에 의한 콩 추출물의 분리시 1차 전개 후 전개용매의 기화 정도에 따른 분리 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 개량된 TLC 방법 3에 의해 콩 추출물을 분리한 제1 결과를 나타낸 사진이다.
도 14는 개량된 TLC 방법 3에 의해 콩 추출물을 분리한 제2 결과를 나타낸 사진이다.
도 15는 개량된 TLC 방법 3에 의한 콩 추출물의 분리시 2차 전개용매인 황산 수용액의 황산 농도에 따른 분리 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 대한민국의 야생콩들(G. soja collections) 종자의 배축 추출물에서 나타나는 사포닌 표현형을 개량된 TLC 방법 3으로 분리하여 비교한 것이다.
본 발명의 일 측면은 박층크로마토그래피를 이용하여 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물로부터 사포닌을 효과적으로 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법은 (a) 평판 및 상기 평판의 적어도 일면에 흡착제가 코팅되어 박층으로 형성된 고정상을 포함하는 박층크로마토그래피 플레이트를 준비하는 단계; (b) 상기 박층크로마토그래피 플레이트의 고정상에 위치한 베이스라인에 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물을 도포하고 건조하는 단계; (c) 비극성 유기용매, 극성 유기용매 및 물로 이루어진 혼합용매가 하부에 담긴 전개용 챔버를 상기 혼합용매로 포화시키는 단계; (d) 상기 액상 조성물이 도포된 박층크로마토그래피 플레이트를 상기 혼합용매를 이동상으로 하여 혼합용매로 포화된 전개용 챔버 안에서 1차 전개하는 단계; (e) 상기 1차 전개된 박층크로마토그래피 플레이트를 건조하여 박층크로마토그래피 플레이트에 존재하는 혼합용매를 제거하는 단계; 및 (f) 상기 혼합용매가 제거된 박층크로마토그래피 플레이트를 강산 수용액을 이동상으로 하여 다른 전개용 챔버 안에서 2차 전개하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 (a)~(b) 단계 및 (c) 단계는 순서에 구애받지 않으며, 동시에 수행될 수도 있고, 임의적인 시계열적 순서에 따라 행해질 수도 있다. 또한, 본 발명의 바람직한 일 예에 따른 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법은 (g) 상기 2차 전개된 박층크로마토그래피 플레이트를 가열하는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 바람직한 일 예를 각 단계별로 나누어 설명한다.
박층크로마토그래피 플레이트를 준비하는 단계
본 발명의 바람직한 일예에 사용되는 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, 이하 "TLC"로 표기함) 플레이트는 평판 및 상기 평판의 적어도 일면에 흡착제가 코팅되어 박층으로 형성된 고정상을 포함한다. TLC 플레이트를 구성하는 평판은 고정상 내지 분리하고자 하는 시료와 비반응성인 재료로 이루어진 판상 형태의 쉬트(sheet)로서, 평판의 재료는 일반적으로 유리, 플라스틱, 또는 알루미늄 호일 등에서 선택된다. 상기 평판의 적어도 일면에는 박층 형태의 고정상이 구비되는데, 이때, 고정상은 흡착제를 평판의 일면에 코팅하여 형성한다. 고정상을 형성하기 위해 사용되는 흡착제로는 분석하고자 하는 시료의 성분, 특히 사포닌류, 이소플라본류 및 당류에 대한 친화도의 차이가 서로 다른 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 실리카겔, 산화알루미늄 등이 있으며, 이 중 실리카겔인 것이 바람직하다. 또한, TLC 플레이트의 고정상으로 사용되는 실리카겔은 일반적으로 정상(normal phase) 실리카겔이나, 역상(reverse phase) 실리카겔일 수도 있다. 정상 실리카겔과 역상 실리카겔은 분리하고자 하는 시료의 성분들에 대한 분배 순서가 서로 반대이다. 역상 실리카겔은 비극성 또는 소수성 관능기가 결합된 실리카로 이루어지며, 상기 비극성 또는 소수성 관능기로는 예를 들어 탄소수가 18인 옥타데실기(octadecyl functional group) 등이 있다.
한편, TLC 플레이트의 고정상인 박층의 두께는 그 구체적인 용도에 따라 약 0.1~2㎜의 범위를 갖는데, 예를 들어 사포닌의 검출과 같은 분석용 목적으로는 약 0.1~0.5㎜, 바람직하게는 0.1~0.25㎜이며, 사포닌 성분의 단리 및 정제와 같은 분취용(preparative TLC) 목적으로는 0.5~2.0㎜, 바람직하게는 0.5~1㎜이다.
TLC 플레이트의 고정상에 분리 시료를 도포하고 건조하는 단계
TLC 플레이트가 준비되면, TLC 플레이트의 고정상에 분리하고자 하는 시료, 즉 분리 시료를 도포하고 건조한다. 구체적으로 TLC 플레이트의 고정상에 위치한 베이스라인(Base line)에 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물을 도포하고 건조한다. 이때, 베이스라인은 일반적으로 TLC 플레이트 하단의 내측으로 약 1~3㎝ 떨어진 곳에 위치하며, 액상 조성물은 스팟 형태 또는 밴드 형태로 도포한다. 또한, 액상 조성물은 유리 모세관(glass capillary), 주사기(Syringe), TLC applicator 등을 사용하여 도포한다.
한편, 분리 시료는 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물이고, 이러한 액상 조성물로는 Glycine 속 식물의 잎, 줄기, 또는 종자로부터 추출된 추출물이 있다. Glycine 속 식물의 잎, 줄기, 또는 종자(본 발명에서 종자는 종실을 포함하는 개념이다.)는 일반적으로 사포닌 및 당류를 포함하며, Glycine 속 식물로는 예를 들어 Glycine albicans Tindale & Craven; Glycine aphyonota B.E.Pfeil; Glycine arenaria Tindale; Glycine argyrea Tindale; Glycine canescens F.J.Herm.; Glycine clandestina J.C.Wendl.; Glycine curvata Tindale; Glycine cyrtoloba Tindale; Glycine falcata Benth.; Glycine gracei B.E.Pfeil & Craven; Glycine hirticaulis Tindale & Craven; Glycine hirticaulis subsp . leptosa B.E.Pfeil; Glycine lactovirens Tindale & Craven; Glycine latifolia (Benth.) C.Newell & Hymowitz; Glycine latrobeana (Meissner) Benth.; Glycine microphylla (Benth.) Tindale; Glycine montis -douglas B.E.Pfeil & Craven; Glycine peratosa B.E.Pfeil & Tindale; Glycine pescadrensis Hayata; Glycine pindanica Tindale & Craven; Glycine pullenii B.E.Pfeil, Tindale & Craven; Glycine rubiginosa Tindale & B.E.Pfeil; Glycine stenophita B.E.Pfeil & Tindale; Glycine syndetika B.E.Pfeil & Craven; Glycine tabacina (Labill.) Benth.; Glycine tomentella Hayata; ; Glycine soja Sieb. & Zucc.; Glycine max (L.) Merr. 등이 있다. 또한, 본 발명에서 상기 분리 시료는 바람직하게는 콩 추출물이고, 더 바람직하게는 콩의 종자(배축, 자엽, 및 종피로 구성되어 있음) 추출물이고, 가장 바람직하게는 콩의 종자에서 분리된 배축의 추출물이다. 콩 추출물을 추출하기 위한 추출 용매는 바람직하게는 물, 극성 유기용매 또는 수용성 유기용매에서 선택되는 적어도 1종으로 구성된다. 극성 유기용매로는 탄소수가 1~5인 저급 알코올, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등이 있다. 또한, 수용성 유기용매는 탄소수가 1~5인 저급알코올 및 물로 이루어지는데, 콩으로부터 사포닌류 등을 추출하기 위한 바람직한 수용성 유기용매로는 메탄올 수용액 또는 에탄올 수용액 등이 있고, 이중 메탄올 수용액인 것이 더 바람직하다. 콩 추출물의 추출 용매가 메탄올 수용액을 사용하는 경우 메탄올 수용액 내에서 메탄올 함량은 적어도 50wt%인 것이 바람직하고, 70wt% 이상인 것이 더 바람직하며, 80wt% 이상인 것이 가장 바람직하다. 추출 방법은 상온에서 추출용매 안에 콩의 배축 또는 자엽 분말을 장시간 방출하거나, 40~60℃로 가열 및 환류하면서 추출하는 방법이 있다. 수용성 유기용매를 이용하여 콩 종자로부터 추출한 추출물은 사포닌, 이소플라본, 당류 등을 포함하는데, 본 발명의 TLC를 이용한 사포닌의 분리방법은 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물에서 사포닌을 분자 수준으로 분리하고, 동시에 당류를 TLC 플레이트상의 사포닌 영역에서 최대한 멀리 이동시켜 제거하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 TLC를 이용한 사포닌의 분리방법에서 분리가능한 사포닌의 종류는 스테로이드 사포닌, 트리테르페노이드 사포닌 등 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 이중 트리테르페노이드 사포닌인 것이 바람직하고, 소야사포닌인 것이 더 바람직하다. 소야사포닌은 당 부분인 글리콘과 비당 부분인 아글리콘이 결합된 형태를 가지는데, 이중 아글리콘인 소야사포게놀 A, 소야사포게놀 B, 및 소야사포게놀 E에 따라 크게, A군, B군, E군으로 구분되며, 소야사포닌 B군은 C-22 위치에 2,3-다이히드로-2,5-다이히드록시-6-메틸-4H-피란-4-온(2,3-dihydro-2,5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one; 이하, "DDMP"로 표기함)의 결합 여부에 따라 DDMP 군으로 더 세분된다(대한민국 공개특허공보 제10-2011-0077739호, 미국등록특허공보 제4,524,067호, 중국공개특허공보 제101891796호 참조). 하기 표 1은 본 발명의 TLC를 이용한 사포닌의 분리방법에서 분리가능한 사포닌 분자를 나타낸 것이다. 하기 표 1의 항목 중 소야사포닌 분자 구조 항목에 표시된 A, B, E는 각각 소야사포게놀 A, 소야사포게놀 B 및 소야사포게놀 E를 나타낸다. 또한, 본 발명의 TLC를 이용한 사포닌의 분리방법은 표 1에 나타난 사포닌 분자뿐만 아니라 아직까지 그 구조가 명확히 밝혀지지 않은 소수의 소야사포닌(본 발명에서는 이를 α 사포닌으로 표기함)도 분리할 수 있다. 또한, 본 발명의 액상 조성물에 포함된 당류는 소야사포닌 분자구조 내에 존재하는 당 부분과 별개로 존재하는 자유 당류(Free sugar)를 의미하며, 예를 들어 단당류, 이당류, 올리고당류 등이 있다. 이러한 자유 당류는 일반적으로 콩 추출물에 포함된다.
소야사포닌 군 소야사포닌
분자명		 소야사포닌 분자 구조 분자량
(M.W)
A 그룹 소야사포닌 Aa Glc (1 2) gal (1 2) glcUA (1 3) A (22 1) ara (3 1) xyl (2,3,4-tri-O-acetyl) 1364
소야사포닌 Ab Glc (1 2) gal (1 2) glcUA (1 3) A (22 1) ara (3 1) glc (2,3,4,6-tetra-O-acetyl) 1436
소야사포닌 Ac Rha (1 2) gal (1 2) glcUA (1 3) A (22 1) ara (3 1) glc (2,3,4,6-tetra-O-acetyl) 1420
소야사포닌 Ad Glc (1 2) ara (1 2) glcUA (1 3) A (22 1) ara (3 1) glc (2,3,4,6-tetra-O-acetyl) 1390
소야사포닌 Ae Gal (1 2) glcUA (1 3) A (22 1) ara (3 1) xyl (2,3,4-tri-O-acetyl) 1202
소야사포닌 Af Gal (1 2) glcUA (1 3) A (22 1) ara (3 1) glc (2,3,4,6-tetra-O-acetyl) 1274
소야사포닌 Ag Ara (1 2) glcUA (1 3) A (22 1) ara (3 1) xyl (2,3,4-tri-O-acetyl) 1172
소야사포닌 Ah Ara (1 2) glcUA (1 3) A (22 1) ara (3 1) glc (2,3,4,6-tetra-O-acetyl) 1244
B 그룹 소야사포닌 Ba(Ⅴ) Glc (1 2) gal (1 2) glcUA (1 3) B 958
소야사포닌 Bb(Ⅰ) Rha (1 2) gal (1 2) glcUA (1 3) B 942
소야사포닌 Bc(Ⅱ) Rha (1 2) ara (1 2) glcUA (1 3) B 912
소야사포닌 Bb'(Ⅲ) Gal (1 2) glcUA (1 3) B 796
소야사포닌 Bc'(Ⅳ) Ara ( 1 2 ) glcUA ( 1 3 ) B 766
DDMP 그룹 소야사포닌 αg Glc (1 2) gal (1 2) glcUA (1 3) B (22 2) DDMP 1084
소야사포닌 βg Rha (1 2) gal (1 2) glcUA (1 3) B (22 2) DDMP 1068
소야사포닌 βa Rha (1 2) ara (1 2) glcUA (1 3) B (22 2) DDMP 1038
소야사포닌 γg Gal (1 2) glcUA (1 3) B (22 2) DDMP 922
소야사포닌 γa Ara (1 2) glcUA (1 3) B (22 2) DDMP 892
E 그룹 소야사포닌 Bd Glc (1 2) gal (1 2) glcUA (1 3) E 956
소야사포닌 Be Rha ( 1 2 ) gal ( 1 2 ) glcUA ( 1 3 ) E 940
전개용 챔버를 1차 전개용매로 포화시키는 단계
상기 액상 조성물이 도포된 TLC 플레이트를 1차 전개하기 전에 전개용 챔버를 1차 전개용매로 포화시킨다. 전개용 챔버의 하부에는 1차 전개용매로 비극성 유기용매, 극성 유기용매 및 물로 이루어진 혼합용매가 약 1㎝ 이하의 깊이로 담겨져 있는데, 전개용 챔버의 뚜껑을 닫고 밀폐된 상태에서 전개용 챔버를 일정 시간 방치하여 전개용 챔버를 1차 전개용매의 증기로 포화시키면, 1차 전개시 분리능을 향상시킬 수 있다. 이때, 전개용 챔버의 포화 시간은 전개용 챔버의 크기, 1차 전개용매의 종류 등에 의해 결정되며, 통상적으로 2시간 이상인 것이 바람직하고, 2시간 내지 5시간인 것이 더 바람직하다. 1차 전개용매는 비극성 유기용매, 극성 유기용매 및 물로 이루어진 혼합용매인데, 이때, 비극성 유기용매로는 클로로포름, 헥산 벤젠, 톨루엔 등이 사용될 수 있으며, 극성 유기용매로는 알코올, 아세테이트(예를 들어 에틸아세테이트)등이 사용될 수 있으며, 분리하고자 하는 시료에 사포닌과 당류가 포함된 점을 고려할 때, 비극성 유기용매로 클로로포름을 사용하고, 극성 유기용매로 탄소수가 1~5인 저급알코올을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 1차 전개용매인 혼합용매는 클로로포름, 메탄올 및 물로 이루어지는 것이 가장 바람직하고, 이때, 상기 혼합용매에서 클로로포름 : 메탄올 : 물의 비가 부피를 기준으로 (12~14) : (6~8) : (1~3)인 것이 더 바람직하다.
TLC 플레이트를 1차 전개하는 단계
전개용 챔버를 1차 전개용매로 포화시킨 후, 액상 조성물이 도포된 TLC 플레이트를 1차 전개용매를 이동상으로 1차 전개용매로 포화된 전개용 챔버 안에서 1차 전개한다. 구체적으로 1차 전개용매로 포화된 전개용 챔버안에 액상 조성물이 도포된 TLC 플레이트를 넣어 TLC 플레이트의 하단이 전개용 챔버의 하부에 담긴 1차 전개용매에 닿게 한 후 고정한다. 이때, TLC 플레이트의 고정상에 위치한 베이스라인(Base line)은 1차 전개용매에 닿지 않도록 한다. 이후 전개용 챔버의 뚜껑을 닫아 전개용 챔버를 밀폐시키고 TLC 플레이트를 1차 전개한다. TLC 플레이트의 1차 전개 시간은 전개용 챔버의 크기, 1차 전개용매의 종류 및 분리 시료인 액상 조성물의 성분 구성 등에 의해 결정되며, 통상적으로 50분 이상인 것이 바람직하고, 50분 내지 90분인 것이 더 바람직하다.
1차 전개된 TLC 플레이트에 존재하는 1차 전개용매 등을 제거하는 단계
1차 전개가 완료되면, 1차 전개된 TLC 플레이트를 건조하여 TLC 플레이트에 존재하는 1차 전개용매 및 분리 시료인 액상 조성물에 포함된 용매(예를 들어 추출용매)를 제거한다. 이때, 1차 전개용매 등의 제거가 충분하지 않은 경우 후술하는 TLC 플레이트 상에 나타나는 사포닌 밴드가 파괴되는 등의 부정적인 효과가 발생할 수 있다. TLC 플레이트 상에 존재하는 1차 전개용매 등을 제거하기 위한 건조는 1차 전개용매의 충분한 제거를 담보하는 측면에서 100℃ 이상, 바람직하게는 100~150℃에서 적어도 5분 이상, 바람직하게는 10~20분 수행되거나, 상온에서 2시간 이상 수행된다.
1차 전개용매가 제거된 TLC 플레이트를 2차 전개하는 단계
TLC 플레이트에 존재하는 1차 전개용매 등을 충분히, 바람직하게는 완전히 제거한 후 TLC 플레이트를 하부에 2차 전개용매가 담긴 별도의 2차 전개용 챔버 안에 넣어 TLC 플레이트의 하단이 전개용 챔버의 하부에 담긴 2차 전개용매에 닿게 한 후 고정한다. 이후 전개용 챔버의 뚜껑을 닫아 전개용 챔버를 밀폐시키고 TLC 플레이트를 2차 전개한다. 이때, 2차 전개용매는 강산 수용액이고, 분리된 사포닌의 시각화 등을 고려할 때 황산 수용액인 것이 바람직하다. 또한, 황산 수용액의 황산 함량은 사포닌 등을 분해하지 않는 수준이라면 그 크기가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 황산 수용액의 황산 함량은 5~20w%일 수 있고, 분리 속도 등을 고려할 때 5~10w%인 것이 바람직하다.
2차 전개된 TLC 플레이트를 가열하는 단계
본 발명의 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법은 2차 전개된 TLC 플레이트를 가열하는 단계를 선택적으로 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 TLC 플레이트의 2차 전개가 완료되면 사포닌 분자들의 분배 및 사포닌 영역으로부터의 당류가 제거되며, 이후 TLC 플레이트를 가열하여 2차 전개용매 등을 제거하면 분배된 사포닌 분자들을 확정적으로 TLC 플레이트 상에 고정시킬 수 있다.
2차 전개가 완료된 TLC 플레이트의 가열은 통상적으로 110℃ 이상, 예를 들어 110~120℃에서 10분 이상, 예를 10분 내지 20분 동안 수행된다.
본 발명의 다른 측면은 전술한 사포닌의 분리방법을 응용한 사포닌 분자들의 검출 등과 같은 분석방법 내지 사포닌 분자들의 단리 및 정제 등과 같은 분취방법을 제공하는데에 있다. 박층크로마토그래피를 이용하여 특정 성분들을 분리한 후 분리된 특정 성분들을 검출하거나 회수하는 방법은 널리 알려져 있다. 예를 들어 TLC 플레이트 상에 발색된 특정 성분들의 이미지를 분석하여 특정 성분들을 검출할 수 있고, 목적하는 특성 성분들의 밴드만을 긁어 모은 후 적당한 용매로 추출하거나 침전 등의 결정화 등을 통해 회수할 수 있다. 본 발명의 박층크로마토그래피를 이용하여 사포닌을 검출하는 방법은 2차 전개 후 상기 가열된 박층크로마토그래피 플레이트 상에 표시된 사포닌 밴드의 이미지를 화상 분석기로 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 박층크로마토그래피를 이용하여 사포닌 분자들을 고순도로 회수하는 방법은 TLC 플레이트 상에 존재하는 사포닌 분자들의 밴드만을 각각 긁어 모은 후 에테르 침전을 통해 결정화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예들을 통하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 명확하게 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 종래의 박층크로마토그래피 방법에 의한 사포닌의 분리 및 검출
(1) 사용된 콩 종자의 종류
재배콩인 Glycine max (L.) Merr.(이하 "G. max"로 표기함)의 종자로 Taekwang - Aa와 Wooram - Ab를 농촌진흥정(the Rural Development Administration, Suwon, South Korea)으로부터 입수하였다. 또한, 야생콩인 Glycine soja Siebold & Zucc.(이하 "G. soja"로 표기함)의 종자로 CW10101- Ab, CW10188 - Aa, CW10195 - AaBc, CW10199 - AaBc, CW10200 - AaBc, CW10204 - AaBc, CW10207 - AaBc+α, CW10210 - AaBc, CW10219 - AaBc, CW10293 - AaBc, CW10300 - Aa, CW10301 - Aa, CW10307 - Aa, CW10311 - Aa, CW10315 - Aa, CW10318 - Aa, CW10319 - AaBc, CW12425 - AaBc, CW12428 - Aa, CW12429 - AaBc, CW12431 - AaBc, CW12434 - AaBc, CW12442 - AaBc, CW12445 - AaBc, CW12446 - AaBc+α, CW12794 - Ab, CW13586 - Ab, CW13644 - AaBc, CW14151 - AaBc, CW14162 - Aa, CW14206 - AaBc, CW14216 - AaBc, CW14225 - AaBc, CW14228 - AaBc, CW14231 - AaBc, CW14263 - AaBc, 및 CW14345 - AbBc를 국립 전남대학교의 생식질 수집 센터(the Germplasm Collection Centre, Chonnam National University, Yeosu campus, South Korea)로부터 입수하였다. 상기 콩 종자의 표현형에서 Aa, Ab, Bc, 및 α는 콩 종자에 함유된 주요 사포닌의 형태를 표시한 것으로서, Aa는 소야사포닌 Aa를, Ab는 소야사포닌 Ab를, Bc는 소야사포닌 Bc를 각각 의미하고, α는 아직까지 그 구조가 명확히 밝혀지지 않은 소수 소야사포닌을 의미한다.
(2) 콩 추출물의 제조
건조된 완숙 종자를 배축과 자엽으로 분리하였다. 분리한 배축에 10배 부피에 해당하는 80w% 메탄올 수용액을 첨가하고 상온에서 약 24시간 동안 추출하여 콩 배축 추출물을 제조하였다. 또한, 종자 분쇄물 및 자엽 분말에 대해서도 6배 부피의 80w% 메탄올 수용액을 첨가하고 동일한 방법을 사용하여 콩 종자 추출물 및 콩 자엽 추출물을 제조하였다. 이후, 제조한 콩 추출물을 4℃에서 보관하였고, 후술하는 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, 이하 "TLC"로 표기함)의 분석 시료로 사용하였다.
(3) 박층크로마토그래피 방법에 의한 사포닌의 분리
콩 추출물로 이루어진 분석 시료 10㎕를 실리카겔(SiO2)이 코팅된 TLC 플레이트((catalogue no: 105626, Merck Millipore, Germany) 상의 베이스라인에 도포하고 건조기로 건조하였다. 이후, 사각형 전개용 챔버(catalogue no: Z126195, Sigma-Aldrich, USA)를 전개용 챔부의 하부에 담겨진 전개용매(클로로포름:메탄올:물이 부피비로 65:35:10인 혼합용매)로 2시간 동안 포화시켰다. 이후, TLC 플레이트의 하단을 도포된 분석 시료가 전개용매에 닿지 않은 상태로 전개용매에 담그고 덮개로 전개용 챔버를 밀폐한 후 TLC 플레이트를 전개용매로 50분 동안 전개하였다. 전개가 완료된 TLC 플레이트를 상온에서 60분 동안 건조하여 이동상인 전개용매를 기화시키고, TLC 플레이트 상에 10w% 황산 수용액을 분무하였다. 이후, TLC 플레이트를 115℃로 13분 동안 가열하고, 스캐너(scanjet 5370c scanner, Hewlett-Packard Company, USA)로 TLC 플레이트의 이미지를 촬영하였다.
(4) 종래의 TLC 방법에 의한 사포닌의 분리 결과 및 논의
도 1은 종래의 TLC 방법에 의해 콩 추출물을 분리한 제1 결과를 나타낸 사진이다. 도 1에서 레인(lane) 1 내지 6은 순서대로 G. max (Wooram - Ab), G. soja (CW14162 - Aa), G. soja (CW14151 - AaBc), G. soja (CW10101 - Ab), G. soja (CW14345 - AbBc) 및 G. max (Taekwang - Aa)의 배축 추출물에 대한 결과이고, 레인 7 내지 12는 순서대로 G. max (Wooram - Ab), G. soja (CW14162 - Aa), G. soja (CW14151 - AaBc), G. soja (CW10101 - Ab), G. soja (CW14345 - AbBc) 및 G. max (Taekwang - Aa)의 자엽 추출물에 대한 결과이다. 도 1에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류가 부 사포닌(minor saponin)의 영역에 위치하고 있음을 알 수 있다.
도 2는 종래의 TLC 방법에 의해 콩 추출물을 분리한 제2 결과를 나타낸 사진이다. 도 2에서 레인 1 내지 12는 순서대로 G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW10188 - Aa), G. soja (CW10195 - AaBc), G. soja (CW10199 - AaBc), G. soja (CW10200 - AaBc), G. max (Wooram - Ab), G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW10204 - AaBc), G. soja (CW10207 - AaBc+α), G. soja (CW10210 - AaBc), G. soja (CW10219 - AaBc), 및 G. max (Wooram - Ab)의 배축 추출물에 대한 결과이다. 도 2에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류가 사포닌 영역 속으로 들어가서 사포닌의 표현형을 확인하는데에 영향을 미치고 있음을 알 수 있다.
도 3은 종래의 TLC 방법에 의해 콩 추출물을 분리한 제3 결과를 나타낸 사진이다. 도 3에서 레인 1 내지 12는 순서대로 G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW10293 - AaBc), G. soja (CW10300 - Aa), G. soja (CW10301 - Aa), G. soja (CW10307 - Aa), G. max (Wooram - Ab), G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW10311 - Aa), G. soja (CW10315 - Aa), G. soja (CW10318 - Aa), G. soja (CW10319 - AaBc), 및 G. max (Wooram - Ab)의 배축 추출물에 대한 결과이다. 도 3에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류가 사포닌 영역 속으로 들어가서 사포닌의 표현형을 확인하는데에 영향을 미치고 있음을 알 수 있다.
도 4는 종래의 TLC 방법에 의해 콩 추출물을 분리한 제4 결과를 나타낸 사진이다. 도 4에서 레인 1 내지 12는 순서대로 G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW12425 - AaBc), G. soja (CW12428 - Aa), G. soja (CW12429 - AaBc), G. soja (CW12431 - AaBc), G. max (Wooram - Ab), G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW12434 - AaBc), G. soja (CW12442 - AaBc), G. soja (CW12445 - AaBc), G. soja (CW12446 - AaBc+α), 및 G. max (Wooram - Ab)의 배축 추출물에 대한 결과이다. 도 4에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류가 사포닌 영역 속으로 들어가서 사포닌의 표현형을 확인하는데에 영향을 미치고 있고, 그로 인해 레인 11에서 사포닌 α에 해당하는 성분을 발견할 수 없음을 알 수 있다.
도 5는 종래의 TLC 방법에 의해 콩 추출물을 분리한 제5 결과를 나타낸 사진이다. 도 4에서 레인 1 내지 12는 순서대로 G. soja (CW13644 - AaBc), G. soja (CW14206 - AaBc), G. soja (CW12794 - Ab), G. soja (CW14216 - AaBc), G. soja (CW14225 - AaBc), G. max (Wooram - Ab), G. soja (13644 - AaBc), G. soja (CW13586 - Ab), G. soja (CW14228 - AaBc), G. soja (CW14231 - AaBc), G. soja (CW14263 - AaBc), 및 G. max (Wooram - Ab)의 배축 추출물에 대한 결과이다. 도 5에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류가 사포닌 영역 속으로 들어가서 사포닌의 표현형을 확인하는데에 영향을 미침을 알 수 있다.
수용성 유기용매인 80w% 메탄올 수용액을 이용하여 콩 종자로부터 추출한 콩 추출물은 사포닌 외에 이소플라본류과 당류와 같은 다른 분자들을 포함하고 있다. 이중 당류는 TLC 방법에 의한 콩 추출물의 처리 과정에서 사포닌 분리 및 검출을 방해한다. TLC 방법에 의한 콩 추출물의 처리 과정에서 분석 시료에 포함된 성분들은 그들의 친수성 정도에 기초하여 실리카 겔 상에 분배된 상태로 흡착된다. 종래의 TLC 방법에서는 분배된 분자들을 시각화시키기 위해 황산 수용액을 분무하면 당류는 아래와 같은 반응식에 의해 탈수된다.
CnHnOn + n(H2SO4) → nC + n(H2O) + mixture of water and acid
이때, 연소는 탈수 과정을 향상시키고, TLC 상의 부 사포닌 성분의 영역에는 검은 밴드 형태로 탄소가 위치하게 된다. 특히, 종종 당류는 발열 반응에 의해 생성되는 물 분자와 함께 모세관 현상에 의해 사포닌 영역 안으로 스며들게 되고 사포닌의 분리와 검출에 부정적인 영향을 끼친다.
2. 개량된 박층크로마토그래피 방법 1에 의한 사포닌의 분리 및 검출
(1) 사용된 콩 종자의 종류
재배콩인 Glycine max (L.) Merr.(이하 "G. max"로 표기함)의 종자로 Taekwang - Aa와 Wooram - Ab를 농촌진흥정(the Rural Development Administration, Suwon, South Korea)으로부터 입수하였다. 또한, 야생콩인 Glycine soja Siebold & Zucc.(이하 "G. soja"로 표기함)의 종자로 CW10121 - AaBc, CW10129 - AaBc, CW10137 - AaBc, CW10140 - AaBc, CW10152 - Aa), CW10165 - Aa, CW10184 - Aa, CW10185 - AaBc, CW13626 - AaBc, CW13627 - AaBc, CW13628 - AaBc, CW13641 - AaBc, CW13643 - AaBc, CW13707 - AaBc, CW13715 - Aa, CW13724 - Aa, CW14482 - AaBc, CW14483 - AaBc, CW14484 - AaBc, CW14485 - Aa, CW14486 - Aa, CW14487 - AaBc, CW14489 - AaBc, CW14676 - AaBc, CW14677 - Aa, CW14678 - Aa, CW14679 - Aa, CW14680 - Aa, CW14681 - Aa, CW14682 - Aa, CW14683 - Aa, CW14684 - Aa, CW14685 - Aa, CW14686 - AaBc, CW14687 - Aa, CW14688 - Aa, CW14689 - AaBc, CW14690 - AaBc, CW14691 - Aa, 및 CW14788 - AaBc를 국립 전남대학교의 생식질 수집 센터(the Germplasm Collection Centre, Chonnam National University, Yeosu campus, South Korea)로부터 입수하였다.
(2) 콩 추출물의 제조
건조된 완숙 종자를 배축과 자엽으로 분리하였다. 분리한 배축에 10배 부피에 해당하는 80w% 메탄올 수용액을 첨가하고 상온에서 약 24시간 동안 추출하여 콩 배축 추출물을 제조하였다. 또한, 종자 분쇄물 및 자엽 분말에 대해서도 6배 부피의 80w% 메탄올 수용액을 첨가하고 동일한 방법을 사용하여 콩 종자 추출물 및 콩 자엽 추출물을 제조하였다. 이후, 제조한 콩 추출물을 4℃에서 보관하였고, 후술하는 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, 이하 "TLC"로 표기함)의 분석 시료로 사용하였다.
(3) 박층크로마토그래피 방법에 의한 사포닌의 분리
콩 추출물로 이루어진 분석 시료 10㎕를 실리카겔(SiO2)이 코팅된 TLC 플레이트((catalogue no: 105626, Merck Millipore, Germany) 상의 베이스라인에 도포하고 건조기로 건조하였다. 이후, 사각형 전개용 챔버(catalogue no: Z126195, Sigma-Aldrich, USA)를 전개용 챔부의 하부에 담겨진 전개용매(클로로포름:메탄올:물이 부피비로 65:35:10인 혼합용매)로 5 시간을 초과하여 포화시켰다. 이후, TLC 플레이트의 하단을 도포된 분석 시료가 전개용매에 닿지 않은 상태로 전개용매에 담그고 덮개로 전개용 챔버를 밀폐한 후 TLC 플레이트를 전개용매로 90분 동안 전개하였다. 전개가 완료된 TLC 플레이트를 상온에서 60분 동안 건조하여 이동상인 전개용매를 기화시키고, TLC 플레이트 상에 10w% 황산 수용액을 분무하였다. 이후, TLC 플레이트를 115℃로 13분 동안 가열하고, 스캐너(scanjet 5370c scanner, Hewlett-Packard Company, USA).로 TLC 플레이트의 이미지를 촬영하였다.
(4) 개량된 TLC 방법 1에 의한 사포닌의 분리 결과 및 논의
도 6은 개량된 TLC 방법 1에 의해 콩 추출물을 분리한 제1 결과를 나타낸 사진이다. 도 6에서 레인(lane) 1 내지 12는 순서대로 G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW10121 - AaBc), G. soja (CW10129 - AaBc), G. soja (CW10137 - AaBc), G. soja (CW10140 - AaBc), G. max (Wooram - Ab), G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW10152 - Aa), G. soja (CW10165 - Aa), G. soja (CW10184 - Aa), G. soja (CW10185 - AaBc), 및 G. max (Wooram - Ab)의 배축 추출물에 대한 결과이다. 도 6에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류와 사포닌 간의 간격이 종래의 TLC 방법에 의할 때보다 상당히 증가하였고, 사포닌의 표현형을 더 명확하게 확인할 수 있다. 그러나, 개량된 TLC 방법 1에 의할 때 탈수된 사포닌과 같은 약간의 인공산물 밴드(도 6에서 화살표로 표시됨)가 발견되었다.
도 7은 개량된 TLC 방법 1에 의해 콩 추출물을 분리한 제2 결과를 나타낸 사진이다. 도 7에서 레인(lane) 1 내지 12는 순서대로 G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW13626 - AaBc), G. soja (CW13627 - AaBc), G. soja (CW13628 - AaBc), G. soja (CW13641 - AaBc), G. max (Wooram - Ab), G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW13643 - AaBc), G. soja (CW13707 - AaBc), G. soja (CW13715 - Aa), G. soja (CW13724 - Aa), 및 G. max (Wooram - Ab)의 배축 추출물에 대한 결과이다. 도 7에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류와 사포닌 간의 간격이 종래의 TLC 방법에 의할 때보다 상당히 증가하였고, 사포닌의 표현형을 더 명확하게 확인할 수 있다. 그러나, 개량된 TLC 방법 1에 의할 때 탈수된 사포닌과 같은 약간의 인공산물 밴드(도 6에서 화살표로 표시됨)가 발견되었다.
도 8은 개량된 TLC 방법 1에 의해 콩 추출물을 분리한 제3 결과를 나타낸 사진이다. 도 8에서 레인(lane) 1 내지 12는 순서대로 G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW14482 - AaBc), G. soja (CW14483 - AaBc), G. soja (CW14484 - AaBc), G. soja (CW14485 - Aa), G. max (Wooram - Ab), G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW14486 - Aa), G. soja (CW14487 - AaBc), G. soja (CW14788 - AaBc), G. soja (CW14489 - AaBc), 및 G. max (Wooram - Ab)의 배축 추출물에 대한 결과이다. 도 8에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류와 사포닌 간의 간격이 종래의 TLC 방법에 의할 때보다 상당히 증가하였고, 사포닌의 표현형을 더 명확하게 확인할 수 있다. 그러나, 개량된 TLC 방법 1에 의할 때 탈수된 사포닌과 같은 약간의 인공산물 밴드가 발견되었다.
도 9는 개량된 TLC 방법 1에 의해 콩 추출물을 분리한 제4 결과를 나타낸 사진이다. 도 9에서 레인(lane) 1 내지 12는 순서대로 G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW14676 - AaBc), G. soja (CW14677 - Aa), G. soja (CW14678 - Aa), G. soja (CW14679 - Aa), G. max (Wooram - Ab), G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW14680 - Aa), G. soja (CW14681 - Aa), G. soja (CW14682 - Aa), G. soja (CW14683 - Aa) and G. max (Wooram - Ab)의 배축 추출물에 대한 결과이다. 도 9에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류와 사포닌 간의 간격이 종래의 TLC 방법에 의할 때보다 상당히 증가하였고, 사포닌의 표현형을 더 명확하게 확인할 수 있다. 그러나, 밴드들이 선명하지 않았다.
도 10은 개량된 TLC 방법 1에 의해 콩 추출물을 분리한 제5 결과를 나타낸 사진이다. 도 10에서 레인(lane) 1 내지 12는 순서대로 G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW14684 - Aa), G. soja (CW14685 - Aa), G. soja (CW14686 - AaBc), G. soja (CW14687 - Aa), G. max (Wooram - Ab), G. max (Taekwang - Aa), G. soja (CW14688 - Aa), G. soja (CW14689 - AaBc), G. soja (CW14690 - AaBc), G. soja (CW14691 - Aa), 및 G. max (Wooram - Ab)의 배축 추출물에 대한 결과이다. 도 10에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류와 사포닌 간의 간격이 종래의 TLC 방법에 의할 때보다 상당히 증가하였고, 사포닌의 표현형을 더 명확하게 확인할 수 있다. 그러나, 밴드들이 선명하지 않았다.
종래의 TLC 방법에 의한 콩 추출물의 처리 과정에서 당류가 사포닌 분리 및 검출을 방해하는 것을 해결하기 위해 개량된 TLC 방법 1에서는 전개시간과 전개용 챔버 안의 전개용매 증기밀도를 변화시켰다. 높은 전개용매 증기 밀도를 달성하기 위해 전개용 챔버의 하부에 담겨진 전개용매로 전개용 챔버를 5시간 초과하여 포화시켰고, 높은 증기 밀도 상태의 전개용 챔버 안에서 TLC 플레이트를 90분 동안 전개하였다. 이러한 조건에서 사포닌 성분들은 당과 상당한 거리 차이로 이동하였고, 사포닌의 표현형을 더 명확히 확인할 수 있었다. 그러나, 콩 추출물의 분리 결과사포닌 밴드가 선명하지 않았으며, 분해된 사포닌과 같은 인공산물의 밴드가 발견되었다. 이러한 인공산물들은 종종 잘못된 분석 결과를 야기하고, 시간과 비용의 소모를 증가시킨다.
3. 개량된 박층크로마토그래피 방법 2에 의한 사포닌의 분리 및 검출
(1) 사용된 콩 종자의 종류
재배콩인 Glycine max (L.) Merr.(이하 "G. max"로 표기함)의 종자로 Taekwang - Aa와 Wooram - Ab를 농촌진흥정(the Rural Development Administration, Suwon, South Korea)으로부터 입수하였다. 또한, 야생콩인 Glycine soja Siebold & Zucc.(이하 "G. soja"로 표기함)의 종자로 CW10101 - Ab, CW14151 - AaBc, CW14162 - Aa, 및 CW14345 - AbBc를 국립 전남대학교의 생식질 수집 센터(the Germplasm Collection Centre, Chonnam National University, Yeosu campus, South Korea)로부터 입수하였다.
(2) 콩 추출물의 제조
건조된 완숙 종자를 배축과 자엽으로 분리하였다. 분리한 배축에 10배 부피에 해당하는 80w% 메탄올 수용액을 첨가하고 상온에서 약 24시간 동안 추출하여 콩 배축 추출물을 제조하였다. 또한, 종자 분쇄물 및 자엽 분말에 대해서도 6배 부피의 80w% 메탄올 수용액을 첨가하고 동일한 방법을 사용하여 콩 종자 추출물 및 콩 자엽 추출물을 제조하였다. 이후, 제조한 콩 추출물을 4℃에서 보관하였고, 후술하는 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, 이하 "TLC"로 표기함)의 분석 시료로 사용하였다.
(3) 박층크로마토그래피 방법에 의한 사포닌의 분리
콩 추출물로 이루어진 분석 시료 10㎕를 실리카겔(SiO2)이 코팅된 TLC 플레이트((catalogue no: 105626, Merck Millipore, Germany) 상의 베이스라인에 도포하고 건조기로 건조하였다. 이후, 사각형 전개용 챔버(catalogue no: Z126195, Sigma-Aldrich, USA)를 전개용 챔부의 하부에 담겨진 전개용매(클로로포름:메탄올:물이 부피비로 65:35:10인 혼합용매)로 2시간 동안 포화시켰다. 이후, TLC 플레이트의 하단을 도포된 분석 시료가 전개용매에 닿지 않은 상태로 전개용매에 담그고 덮개로 전개용 챔버를 밀폐한 후 TLC 플레이트를 전개용매로 50분 동안 1차 전개하였다. 1차 전개가 완료된 TLC 플레이트를 상온에서 30분 동안 건조하여 이동상인 전개용매를 기화시켰다. 이후, TLC 플레이트를 다른 전개용 챔버에 넣고 덮개를 덮어 전개용 챔버를 밀폐한 후, TLC 플레이트를 전개용 챔버의 하부에 담긴 10w% 황산 수용액으로 2차 전개하였다. 2차 전개가 완료된 TLC 플레이트를 115℃로 13분 동안 가열하고, 스캐너(scanjet 5370c scanner, Hewlett-Packard Company, USA)로 TLC 플레이트의 이미지를 촬영하였다.
또한, 1차 전개 후 전개용매의 기화 정도에 의한 사포닌의 분리 효과를 알아보기 위해 다른 조건들은 동일하게 하고 1차 전개가 완료된 TLC 플레이트를 상온에서 10분 및 20분 동안 건조하여 전개용매를 기화시켰다.
(4) 개량된 TLC 방법 2에 의한 사포닌의 분리 결과 및 논의
도 11은 개량된 TLC 방법 2에 의해 콩 추출물을 분리한 결과를 나타낸 사진이다. 도 11에서 레인(lane) 1 내지 6은 순서대로 G. max (Wooram - Ab), G. soja (CW14162 - Aa), G. soja (CW14151 - AaBc), G. soja (CW10101 - Ab), G. soja (CW14345 - AbBc), 및 G. max (Taekwang - Aa)의 배축 추출물에 대한 결과이고, 레인 7 내지 12는 순서대로 G. max (Wooram - Ab), G. soja (CW14162 - Aa), G. soja (CW14151 - AaBc), G. soja (CW10101 - Ab), G. soja (CW14345 - AbBc), 및 G. max (Taekwang - Aa)의 자엽 추출물에 대한 결과이다. 도 11에서 보이는 바와 같이 탈수된 당류는 TLC 플레이트 상에서 사포닌 영역의 위에 위치하고, 그로 인해 사포닌의 표현형을 더 명확하게 확인할 수 있다. 그러나, 개량된 TLC 방법 2에 의할 때 사포닌 밴드에 약간의 부정적인 효과가 발생하였다.
도 12는 개량된 TLC 방법 2에 의한 콩 추출물의 분리시 1차 전개 후 전개용매의 기화 정도에 따른 분리 결과를 나타낸 것이다. 도 12에서 (a) 및 (b)는 1차 전개가 완료된 후 TLC 플레이트를 상온에서 30분 동안 건조하여 이동상인 전개용매를 기화시킨 것이고, (c)는 20분 동안 건조한 것이고, (d)는 10분 동안 건조한 것이다. 도 12에서 보이는 바와 같이 개량된 TLC 방법 2에서 황산 수용액으로 TLC 플레이트를 2차 전개하기 전에 TLC 플레이트 상에 이동상인 전개용매가 존재하는 경우 사포닌 밴드가 파괴되는 것을 알 수 있다.
개량된 TLC 방법 2에서는 황산 수용액을 TLC 플레이트에 분무한 종래의 TLC 방법과 달리 황산 수용액으로 TLC 플레이트를 밀폐된 전개용 챔버 안에서 2차 전개하였다. 이러한 변화에 의해 TLC 플레이트 상의 사포닌 영역에서 당류가 제거되는 양호한 효과를 얻었지만 사포닌의 밴드가 파괴되는 부정적인 효과도 동시에 발생하였다. 개량된 TLC 방법 2에서 사포닌 밴드에 대한 부정적인 효과는 TLC 플레이트 상에 존재하는 이동상인 전개용매의 존재에 의해 발생하는 것으로 보이며, 이동상인 전개용매의 존재에 의한 사포닌 밴드의 파괴는 다양한 형태로 나타났다.
4. 개량된 박층크로마토그래피 방법 3에 의한 사포닌의 분리 및 검출
(1) 사용된 콩 종자의 종류
재배콩인 Glycine max (L.) Merr.(이하 "G. max"로 표기함)의 종자로 Taekwang - Aa와 Wooram - Ab와 야생콩인 Glycine tabacina(이하, "G. tabacina"로 표기함)의 종자로 IT199076을 농촌진흥정(the Rural Development Administration, Suwon, South Korea)으로부터 입수하였다. 또한, 야생콩인 Glycine soja Siebold & Zucc.(이하 "G. soja"로 표기함)의 종자로 CW14161 - Aa, CW10101 - Ab, CW14151 - AaBc 및 CW14345 - AbBc를 국립 전남대학교의 생식질 수집 센터(the Germplasm Collection Centre, Chonnam National University, Yeosu campus, South Korea)로부터 입수하였다. 또한, 야생콩인 Glycine tomentella(이하, "G. tomentella"로 표기함)의 종자 302682와 Glycine latifolia(이하, "G. latifolia")의 종자 321851을 the Australian Tropical Grains Germplasm Centre(Australia)로부터 입수하였다.
(2) 콩 추출물의 제조
건조된 완숙 종자를 배축과 자엽으로 분리하였다. 분리한 배축에 10배 부피에 해당하는 80w% 메탄올 수용액을 첨가하고 상온에서 약 24시간 동안 추출하여 콩 배축 추출물을 제조하였다. 또한, 종자 분쇄물 및 자엽 분말에 대해서도 6배 부피의 80w% 메탄올 수용액을 첨가하고 동일한 방법을 사용하여 콩 종자 추출물 및 콩 자엽 추출물을 제조하였다. 이후, 제조한 콩 추출물을 4℃에서 보관하였고, 후술하는 박층크로마토그래피(thin layer chromatography, 이하 "TLC"로 표기함)의 분석 시료로 사용하였다.
(3) 박층크로마토그래피 방법에 의한 사포닌의 분리
콩 추출물로 이루어진 분석 시료 10㎕를 실리카겔(SiO2)이 코팅된 TLC 플레이트((catalogue no: 105626, Merck Millipore, Germany) 상의 베이스라인에 도포하고 건조기로 건조하였다. 이후, 사각형 전개용 챔버(catalogue no: Z126195, Sigma-Aldrich, USA)를 전개용 챔부의 하부에 담겨진 전개용매(클로로포름:메탄올:물이 부피비로 65:35:10인 혼합용매)로 2시간 동안 포화시켰다. 이후, TLC 플레이트의 하단을 도포된 분석 시료가 전개용매에 닿지 않은 상태로 전개용매에 담그고 덮개로 전개용 챔버를 밀폐한 후 TLC 플레이트를 전개용매로 50분 동안 1차 전개하였다. 1차 전개가 완료된 TLC 플레이트를 상온에서 2시간 동안 건조하거나 110℃에서 10분 동안 건조하여 이동상인 전개용매를 완전하게 기화시켰다. 이후, TLC 플레이트를 다른 전개용 챔버에 넣고 덮개를 덮어 전개용 챔버를 밀폐한 후, TLC 플레이트를 전개용 챔버의 하부에 담긴 10w% 황산 수용액으로 2차 전개하였다. 2차 전개가 완료된 TLC 플레이트를 115℃로 13분 동안 가열하고, 스캐너(scanjet 5370c scanner, Hewlett-Packard Company, USA)로 TLC 플레이트의 이미지를 촬영하였다.
또한, 2차 전개용매인 황산 수용액의 황산 농도에 따른 사포닌의 분리 효과를 알아보기 위해 다른 조건들은 동일하게 하고 황산 수용액의 황산 농도를 5w%, 및 20w%로 하고 TLC 플레이트를 2차 전개하였다.
(4) 개량된 TLC 방법 3에 의한 사포닌의 분리 결과 및 논의
도 13은 개량된 TLC 방법 3에 의해 콩 추출물을 분리한 제1 결과를 나타낸 사진이다. 도 13에서 레인(lane) 1 내지 6은 순서대로 G. max (Wooram - Ab), G. soja (CW14162 - Aa), G. soja (CW14151 - AaBc), G. soja (CW10101 - Ab), G. soja (CW14345 - AbBc), 및 G. max (Taekwang - Aa)의 배축 추출물에 대한 결과이고, 레인 7 내지 12는 순서대로 G. max (Wooram - Ab), G. soja (CW14162 - Aa), G. soja (CW14151 - AaBc), G. soja (CW10101 - Ab), G. soja (CW14345 - AbBc), 및 G. max (Taekwang - Aa)의 자엽 추출물에 대한 결과이다. 도 13에서 보이는 바와 같이 개량된 TLC 방법 3에 의할 때 사포닌의 표현형을 더 명확하게 확인할 수 있었고, 동시에 사포닌 밴드에 대한 부정적인 효과가 발생하지 않았다.
도 14는 개량된 TLC 방법 3에 의해 콩 추출물을 분리한 제2 결과를 나타낸 사진이다. 도 14에서 레인(lane) 1 내지 4는 순서대로 G. max, G. soja, G. tomentella, 및 G. latifolia의 배축 추출물에 대한 결과이고, 레인 5 내지 8은 순서대로 G. max, G. soja, G. tomentella, 및 G. latifolia의 자엽 추출물에 대한 결과이며, 레인 9 내지 12는 순서대로 G. max, G. soja, G. tomentella, 및 G. latifolia의 종자 추출물에 대한 결과이다.
도 15는 개량된 TLC 방법 3에 의한 콩 추출물의 분리시 2차 전개용매인 황산 수용액의 황산 농도에 따른 분리 결과를 나타낸 것이다. 도 15에서 TLC 플레이트 상의 왼쪽을 기준으로 첫 번째 내지 여섯 번째 레인은 순서대로 G. max (Wooram - Ab), G. soja (CW14162 - Aa), G. soja (CW14151 - AaBc), G. soja (CW10101 - Ab), G. soja (CW14345 - AbBc), 및 G. max (Taekwang - Aa)의 배축 추출물에 대한 결과이고, 일곱 번째 내지 열두 번째 레인은 순서대로 G. max (Wooram - Ab), G. soja (CW14162 - Aa), G. soja (CW14151 - AaBc), G. soja (CW10101 - Ab), G. soja (CW14345 - AbBc), 및 G. max (Taekwang - Aa)의 자엽 추출물에 대한 결과이다. 또한, 도 15에서 (a)는 2차 전개용매로 5w% 황산 수용액을 사용한 것이고, (b)는 2차 전개용매로 10w% 황산 수용액을 사용한 것이며, (c)는 2차 전개용매로 20w% 황산 수용액을 사용한 것이다. 도 15에서 보이는 바와 같이 TLC 플레이트들 간에 당류 제거에 대한 차이는 거의 발생하지 않았다. 다만, 2차 전개용매로 20w% 황산 수용액을 사용하는 경우 전개속도가 느려짐을 알 수 있다.
도 16은 대한민국의 야생콩들(G. soja collections) 종자의 배축 추출물에서 나타나는 사포닌 표현형을 개량된 TLC 방법 3으로 분리하여 비교한 것이다. 도 16에서 레인 1 내지 7은 순서대로 표현형 Aa, Ab, AaBc, AbBc, Aa+α AaBc+α, 및 AbBc+α에 대한 결과이다. 콩 종자의 배축에서 사포닌의 TLC 패턴은 주로 위쪽 영역의 아세틸기를 가진 A 그룹 사포닌, 중간 영역의 DDMP 및 B 그룹 사포닌, 및 아래쪽 영역의 α 사포닌 성분들로 이루어진 기타 사포닌들로 나누어진다.
개량된 TLC 방법 3에서는 황산 수용액을 TLC 플레이트에 분무한 종래의 TLC 방법과 달리 황산 수용액으로 TLC 플레이트를 밀폐된 전개용 챔버 안에서 2차 전개하였다. 또한, 1차 전개 후 TLC 플레이트 상에 존재하는 이동상인 전개용매를 완전히 제거하기 위하여 TLC 플레이트를 상온에서 2시간 동안 또는 100℃에서 10분 동안 건조하였다. 이러한 조건에서 황산에 의해 당류는 사포닌 영역으로부터 완벽하게 제거되었고, 사포닌 성분에 대한 부정적인 효과가 발생하지 않았으며, 그 결과는 신뢰성 및 재현성이 양호하였다. 또한, 2차 전개용매로 5~10w% 황산 수용액이 20w% 황산 수용액보다 더 적당하였다. 개량된 TLC 방법 3에서 황산 수용액으로 TLC 플레이트를 2차 전개할 때 당류와 실리카겔(SiO2) 사이의 친수성 상호작용은 당류의탈수에 의해 감소하고, 당류는 실리카겔(SiO2)에서 탈착하여 황산과 함께 이동하게 된다. 황산의 당류에 대한 효과는 사포닌에 포함된 당 성분에 효과보다 더 빨라 TLC 플레이트 상에서 사포닌의 이동은 거의 변화하지 않는 것으로 보인다. 개량된 TLC 방법 3에 의해 대한민국의 야생콩들(G. soja collections) 종자의 배축에서 Aa, Ab, AaBc, AbBc, Aa+α AaBc+α, 및 AbBc+α로 명명된 7가지의 사포닌 표현형을 발견하였다. 사포닌 표현형 Aa, Ab, AaBc, 및 AbBc는 재배콩과 야생콩에 공통으로 존재하지만 사포닌 표현형 Aa+α AaBc+α, 및 AbBc+α는 야생형에서만 존재하였다. TLC 플레이트 상에서 알파 사포닌은 DDMP 사포닌 바로 아래에 위치한 푸르스름한 밴드로 나타났다. 종래의 TLC 방법에서 탈수된 당류가 사포닌 영역으로 종종 이동하여 알파 사포닌의 존재와 부 사포닌들의 변화를 확인할 수 없었지만 개량된 TLC 방법 3에서는 이러한 문제를 극복할 수 있었다.
하기 표 2는 본 발명의 TLC를 이용한 사포닌 분리 또는 검출 방법에서 최상의 프로토콜을 나타낸 것이다.
단계 시간
전개용 챔버의 포화 : 전개용 챔버의 하부에 클로로포름, 메탄올 및 물로 이루어진 전개용매를 붓고 잘 섞은 후 방치함 120분
1차 전개 : 클로로포름, 메탄올 및 물로 이루어진 전개용매로 TLC 플레이트를 전개함 50분
건조 : 1차 전개 후 TLC 플레이트를 약 100℃에서 건조함 10분
2차 전개 : 10w% 황산 수용액을 TLC 플레이트를 전개함 15분
가열 : 2차 전개 후 TLC 플레이트를 약 115℃로 가열함 13분
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (17)

  1. (a) 평판 및 상기 평판의 적어도 일면에 흡착제가 코팅되어 박층으로 형성된 고정상을 포함하는 박층크로마토그래피 플레이트를 준비하는 단계;
    (b) 상기 박층크로마토그래피 플레이트의 고정상에 위치한 베이스라인에 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물을 도포하고 건조하는 단계;
    (c) 비극성 유기용매, 극성 유기용매 및 물로 이루어진 혼합용매가 하부에 담긴 전개용 챔버를 상기 혼합용매로 포화시키는 단계;
    (d) 상기 액상 조성물이 도포된 박층크로마토그래피 플레이트를 상기 혼합용매를 이동상으로 하여 혼합용매로 포화된 전개용 챔버 안에서 1차 전개하는 단계;
    (e) 상기 1차 전개된 박층크로마토그래피 플레이트를 건조하여 박층크로마토그래피 플레이트에 존재하는 혼합용매를 제거하는 단계; 및
    (f) 상기 혼합용매가 제거된 박층크로마토그래피 플레이트를 강산 수용액을 이동상으로 하여 다른 전개용 챔버 안에서 2차 전개하는 단계를 포함하고,
    상기 1차 전개 및 2차 전개시 전개용 챔버는 밀폐된 상태인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  2. 제 1항에 있어서, (g) 상기 2차 전개된 박층크로마토그래피 플레이트를 가열하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 흡착제는 실리카겔인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물은 Glycine 속 식물로부터 추출된 것을 특징으로 하는 사포닌의 분리방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물은 콩 추출물인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 콩 추출물은 콩 종자의 배축 추출물인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 콩 추출물은 물, 극성 유기용매 또는 수용성 유기용매에서 선택되는 적어도 1종의 추출용매로 추출된 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 추출용매는 탄소수가 1~5인 저급알코올 및 물로 이루어진 수용성 유기용매인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 수용성 유기용매는 메탄올 수용액이고, 상기 메탄올 수용액의 메탄올의 함량이 적어도 50wt%인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 혼합용매의 비극성 유기용매는 클로로포름이고, 극성 유기용매는 탄소수가 1~5인 저급알코올인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 혼합용매는 클로로포름, 메탄올 및 물로 이루어지고, 상기 혼합용매에서 클로로포름 : 메탄올 : 물의 비가 부피를 기준으로 (12~14) : (6~8) : (1~3)인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 전개용 챔버의 포화 시간은 2시간 내지 5시간인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  13. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 1차 전개 시간은 50분 내지 90분인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  14. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 혼합용매를 제거하는 단계는 100~150℃에서 적어도 5분 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  15. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 강산 수용액은 황산 수용액인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 황산 수용액의 황산 함량은 5~10w%인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 분리방법.
  17. (a) 평판 및 상기 평판의 적어도 일면에 흡착제가 코팅되어 박층으로 형성된 고정상을 포함하는 박층크로마토그래피 플레이트를 준비하는 단계;
    (b) 상기 박층크로마토그래피 플레이트의 고정상에 위치한 베이스라인에 사포닌 및 당류를 포함하는 액상 조성물을 도포하고 건조하는 단계;
    (c) 비극성 유기용매, 극성 유기용매 및 물로 이루어진 혼합용매가 하부에 담긴 전개용 챔버를 상기 혼합용매로 포화시키는 단계;
    (d) 상기 액상 조성물이 도포된 박층크로마토그래피 플레이트를 상기 혼합용매를 이동상으로 하여 혼합용매로 포화된 전개용 챔버 안에서 1차 전개하는 단계;
    (e) 상기 1차 전개된 박층크로마토그래피 플레이트를 건조하여 박층크로마토그래피 플레이트에 존재하는 혼합용매를 제거하는 단계;
    (f) 상기 혼합용매가 제거된 박층크로마토그래피 플레이트를 강산 수용액을 이동상으로 하여 다른 전개용 챔버 안에서 2차 전개하는 단계;
    (g) 상기 2차 전개된 박층크로마토그래피 플레이트를 가열하는 단계; 및
    (h) 상기 가열된 박층크로마토그래피 플레이트 상에 표시된 사포닌 밴드의 이미지를 화상 분석기로 분석하는 단계를 포함하고,
    상기 1차 전개 및 2차 전개시 전개용 챔버는 밀폐된 상태인 것을 특징으로 하는 박층크로마토그래피를 이용한 사포닌의 검출방법.
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