KR101361531B1 - Composition for preventing and treating cancer - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 코릴라진(Corilagin)의 소화기 종양 특히 대장암에 대한 항암성을 이용한 항암 보조요법 및 대장암 예방을 위한 기능성 천연물 추출물 항암 제재의 개발에 관한 것이다.The present invention relates to an anticancer composition, and more particularly, to the development of a functional natural product extract anticancer agent for anticancer adjuvant therapy and colon cancer prevention using anti-cancer properties of corilaginous gastrointestinal tumors, particularly colon cancer.

Description

항암 및 항암 보조제 조성물{Composition for preventing and treating cancer}Anticancer and anticancer adjuvant composition

본 발명은 항암 조성물에 관한 것으로 더욱 상세하게는 코릴라진(Corilagin)의 소화기 종양 특히 대장암에 대한 항암성을 이용한 항암 보조요법 및 대장암 예방을 위한 기능성 천연물 추출물 항암 제재의 개발에 관한 것이다.
The present invention relates to an anticancer composition, and more particularly, to the development of a functional natural product extract anticancer agent for anticancer adjuvant therapy and colon cancer prevention using anti-cancer properties of corilaginous gastrointestinal tumors, particularly colon cancer.

현대 의학의 대표적 암 치료법에는 외과적 수술요법, 생물요법, 방사선요법, 항암물질 투여에 의한 화학요법 등이 있다. 화학요법은 항암제를 경구나 주사로 투여하여 암세포의 증식을 억제하는 방법으로서, 화학요법이 가지는 장점은 몸의 어떤 부위에 생긴 암이라도 약물이 도달할 수 있고, 전이된 암을 치료할 수 있다는 것으로, 현재 화학요법은 전이성 암 치료에 표준요법으로 사용되고 있다. 물론 화학요법으로 전이된 암을 완치시킬 수 있는 것은 아니지만 증상을 완화시켜 수명을 연장시켜주는 중요한 역할을 한다.Representative cancer treatments of modern medicine include surgical surgery, biotherapy, radiation therapy, and chemotherapy with chemotherapy. Chemotherapy is a method of inhibiting the proliferation of cancer cells by administering oral or injecting an anticancer agent, the advantage of chemotherapy is that the drug can reach any cancer in any part of the body, and can treat metastatic cancer, Chemotherapy is currently used as a standard therapy for treating metastatic cancer. Of course, chemotherapy can not cure cancer, but it plays an important role in relieving symptoms and extending lifespan.

현재까지 천연물 유래의 항암제 중 가장 널리 사용되고 있는 항암제는 택솔(taxol)로서 유방암, 난소암의 치료에 사용되고 있다. 그러나 이러한 화학요법제는 부작용, 항암제 내성 등의 문제점을 가지고 있으며, 지금까지 암에 대한 많은 연구가 계속되고 있음에도 불구하고 암 자체의 다양성 및 발병기전의 다양화로 인해 부작용이 적고 내성을 극복할 수 있는 항암제는 개발되지 않았다.To date, the most widely used anticancer agent among natural anticancer agents is taxol, which is used to treat breast and ovarian cancers. However, these chemotherapeutic agents have problems such as side effects, anticancer drug resistance, and despite many studies on cancer until now, due to the diversity of cancer itself and diversification of pathogenesis mechanism, the side effects are small and can overcome the resistance. No cancer drugs have been developed.

한편, 코릴라진(Corilagin)은 일종의 갈로타닌(gallotannin)으로써 천연식물성(예: 꿀식물, Alchornea glandulosa) 추출물이며, 갈로타닌은 일종의 폴리페놀 모노머(polyphenol monomer)인 갈릭산(gallic acid)이 에스화(esterify)하여 포도당(glucose)같은 폴로올 탄수화물(polyol hydrocarbohyrate)의 hydroxyl group 과 결합할 때 형성되는 폴리머이다.(도 1) 국내 자생식물인 진주초(여우구슬, Phyllanthus urinaria)의 수용성 추출물로써 추출되기도 한다.Corilagin is a kind of gallotannin, which is an extract of natural vegetation (e.g., honey plant, Alchornea glandulosa), and gallotan is a type of gallic acid (gallic acid), a polyphenol monomer. It is a polymer formed by esterification and binding to the hydroxyl group of a polyol hydrocarbohyrate such as glucose. (Fig. 1) As a water-soluble extract of Korean native plant pearl pearl (fox bead, Phyllanthus urinaria). Sometimes it is extracted.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 천연물 유래 항암 조성물을 제공하는 것이다.The present invention solves the above problems and the object of the present invention is to provide a natural-derived anticancer composition.

본 발명의 다른 목적은 기존의 화학적 항암제재에 의한 항암 치료법과 상승효과를 나타내는 보조적인 항암제를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide an adjuvant anticancer agent having a synergistic effect with an anticancer therapy using a conventional chemical anticancer agent.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코릴라진(corilagin)을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer, comprising corilagin as an active ingredient.

또한 본 발명은 진주초 추출물을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer comprising the pearl extract as an active ingredient.

또한 본 발명은 코릴라진(corilagin)을 유효성분으로 함유하는 항암보조용 약제학적 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for anticancer supplement containing corilagin as an active ingredient.

또한 본 발명은 진주초 추출물을 유효성분으로 함유하는 항암보조용 약제학적 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a pharmaceutical composition for anticancer auxiliary containing pearl vinegar extract as an active ingredient.

이하 본 발명을 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described.

본 발명자들은 만성 HBV 감염에 의한 만성 B형 간염 환자에 대해서 치료목적으로 건강기능성 제재로 개발되어 사용되었던 진주초 (Phyllanthus urinaria)의 추출물 가루(powder) 제재로 실험하던 중, 우연히 수용성 천연추출물이 대장암, 위암 및 간세포암 세포주에 대해서 세포사멸(apoptosis)을 유도한다는 사실을 발견하였다. 이러한 관찰소견을 기반으로 진주초의 수용성 추출물을 HPLC 법으로 분석한 결과, 코릴라진(Corilagin), 브레비폴린(Brvevifolin carboxylic acid) 안토시아닌(Anthocyanin)이 주요 성분분석인 것으로 확인하였고, 이 중에서 코릴라진에 주목하여 소화기 종양(대장암, 위암 및 간세포암)에 대한 항암능력 및 기존의 항암 화학제재인 5-Fluorouracil (5-FU) 사이에 상호작용과 항암능력을 비교분석하고, 그것의 항암기전을 연구하였다. The inventors of the present invention, while experimenting with the extract powder of phyllanthus urinaria, which was developed and used as a health functional agent for the treatment of chronic hepatitis B patients due to chronic HBV infection, accidentally water-soluble natural extract It has been found to induce apoptosis in cancer, gastric and hepatocellular carcinoma cell lines. Based on these observations, water-soluble extracts of pearl vinegar were analyzed by HPLC, and corilagin and brevifolin carboxylic acid anthocyanin were found to be the main component analysis. Focusing on gin, we compared and analyzed the interaction and anticancer capacity between 5-Fluorouracil (5-FU), an anticancer ability against gastrointestinal tumors (colon cancer, gastric cancer, and hepatocellular carcinoma) and its anticancer mechanism. Was studied.

본 발명은 천연식물의 수용성 추출물로써 수용성 타닌(tannin)계열에 속하는 gallotannin 의 일종인 Corilagin의 소화기 종양(대장암, 위암, 간세포암)에 대한 항암효능(anti-cancer effect) 및 화학적 암예방(chemoprevention)효과를 입증하고, 발암 위험도가 높은 환자들을 대상으로 질병의 주치료제와 더불어 병용요법 혹은 단독 예방요법이 가능하도록 천연식물의 기능성 (의약품) 제재로 개발하는 것에 관한 것이다.The present invention is a water-soluble extract of natural plants, anti-cancer effect and chemical cancer prevention (chemoprevention) against the gastrointestinal tumors (colon cancer, gastric cancer, hepatocellular carcinoma) of Corilagin, a kind of gallotannin belonging to the water-soluble tannin family It is about the development of functional (medicinal) products of natural plants to prove the effectiveness and to be able to use the combination of the main treatment of the disease, or combination therapy or prophylaxis, in patients with high risk of carcinogenesis.

본 발명은 천연식물에서 추출되는 일종의 수용성 갈로타닌(gallotanin)인 코릴라진(corilagin)을 기반으로 하는 천연물 항암제 개발에 관한 것으로서, 특히 대장암(colorectal cancer), 위암(stomach cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma)의 치료 및 예방에 대해서 코릴라진의 항암성이 기존의 화학적 항암제재에 의한 항암 치료법과 상승효과를 나타내는 보조적인 항암제(anti-cancer agent) 뿐만 아니라, 발암 고위험군에 대한 암예방 화학요법제 (chemopreventive agent) 개발에 관한 것이다. The present invention relates to the development of natural anticancer drugs based on corilagin, a kind of water-soluble gallotanin (gallotanin) extracted from natural plants, and particularly, colorectal cancer, gastric cancer, stomach cancer, and hepatocellular carcinoma ( In the treatment and prevention of hepatocellular carcinoma, the anti-cancer agent of coryazine is an anti-cancer agent with synergistic effects with conventional chemical anti-cancer agents, as well as an anti-cancer agent that shows synergistic effects. (chemopreventive agent) development.

본 발명의 조성물에 포함되는 코릴라진 화합물은 또한 이의 염의 형태로도 사용될 수 있으며, 이러한 염은 약제학적으로나 생리학적으로 허용되는 다양한 유기산 또는 무기산과의 산 부가 염을 포함한다. 적합한 무기산으로는, 예를 들면 염산, 황산 등의 할로겐산 또는 인산이 있다. 적합한 유기산으로는, 예를 들면 카르복실산,포스폰산, 술폰산, 아세트산, 프로피온산, 옥탄산, 데칸산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산,말산, 타르타르산, 시트르산, 글루탐산, 아스파르트산, 말레산, 벤조산, 살리실산, 프탈산, 페닐아세트산, 벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 메틸황산, 에틸황산, 도데실황산 등이 있다.Coryazine compounds included in the compositions of the present invention may also be used in the form of their salts, which include acid addition salts with various organic or inorganic acids that are pharmaceutically or physiologically acceptable. Suitable inorganic acids include, for example, hydrochloric acid, halogen acids such as sulfuric acid, and phosphoric acid. Suitable organic acids include, for example, carboxylic acid, phosphonic acid, sulfonic acid, acetic acid, propionic acid, octanoic acid, decanoic acid, glycolic acid, lactic acid, fumaric acid, succinic acid, adipic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, glutamic acid, aspartic acid. , Maleic acid, benzoic acid, salicylic acid, phthalic acid, phenylacetic acid, benzenesulfonic acid, 2-naphthalenesulfonic acid, methyl sulfuric acid, ethyl sulfuric acid, dodecyl sulfate.

본 발명의 조성물은 코릴라진 화합물, 또는 이 화합물 이외에 약리학적으로나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다.The composition of the present invention may further comprise a coryazine compound, or a pharmacologically or physiologically acceptable carrier, excipient, diluent, in addition to the compound.

본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 형태 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며,경구투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체,부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수있다. 상기 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.The composition of the present invention may be formulated in various forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral formulations, sterile injectable solutions, etc. It may be used and may be administered via a variety of routes including oral administration, intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal, topical administration and the like. Examples of suitable carriers, excipients and diluents that may be included in such a composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Methylcellulose, amorphous cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil. The composition may further include a filler, an anti-coagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, an antiseptic, and the like.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다.Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like in the composition. Mix and formulate. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.

경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Base materials for injections may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifying agents, stabilizers, and preservatives.

본 발명에 있어서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.In the present invention, "administration" means providing a predetermined substance to a patient in any suitable manner, and the administration route of the composition of the present invention may be oral or parenteral ≪ / RTI > In addition, the composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.

본 발명에서 "환자"는 본 발명의 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간과 원숭이, 개,염소, 돼지, 또는 쥐 등의 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 조성물은 인간(치료, 억제 또는 예방)용일 뿐만 아니라 상업적으로 유용한 다른 동물들에게도 적용될 수 있다.In the present invention, "patient" means a human and an animal such as a monkey, a dog, a goat, a pig, or a rat having a disease whose symptoms can be improved by administering the composition of the present invention. The compositions according to the present invention are applicable not only to humans (treatment, inhibition or prevention) but also to other commercially useful animals.

다른 양태로서, 본 발명은 코릴라진 화합물 또는 약제학적으로 허용가능한 이들의 염을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써 암과 암 전이를 억제하고,예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 종래의 상기 질환 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.In another aspect, the present invention provides a method for inhibiting, preventing and treating cancer and cancer metastasis by administering to a patient a composition comprising a corylazine compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof. The composition of the present invention can be administered in parallel with the above-mentioned conventional therapeutic agents for diseases.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.The composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.

본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.In the present invention, "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level will depend on the type of disease, severity, , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including co-administered drugs, and other factors well known in the medical arts. The composition of the present invention can be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and can be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and can be administered singly or in multiple doses. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.

구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏당 1 내지 50 mg, 바람직하게는 1 내지 10 mg을 매일 또는 격일로 투여하거나 1일 1 내지 3 회로 나누어 투여할 수 있다.Specifically, the effective amount of the compound according to the present invention may vary depending on the age, sex, and body weight of the patient. In general, 1 to 50 mg, preferably 1 to 10 mg, It may be administered one to three times a day.

그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.However, the dosage may not be limited in any way because it may be increased or decreased depending on route of administration, severity of disease, sex, weight, age, and the like.

본 발명의 코릴라진 화합물은 천연 물질로부터 분리하거나 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 합성할 수 있다.Corylazine compounds of the present invention can be isolated from natural materials or synthesized using methods well known in the art.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 일 구현예에서 코릴리진(corilagin)이 소화기 종양(대장암, 위암, 간세포암)에 대해서 항암능력을 나타내는지를 확인하였고,In one embodiment of the present invention, it was confirmed whether coriligin exhibits anticancer ability against gastrointestinal tumors (colon cancer, gastric cancer, hepatocellular carcinoma),

다른 구현예에서, 소화기 종양(대장암, 위암, 간세포암)에 대한 항암능력이 현재 사용되고 있는 항암제인 5-Fluorouracil (5-FU) 의 항암 능력에 비해서 어느 정도 수준인가를 확인하였으며,In another embodiment, the degree of anticancer activity against gastrointestinal tumors (colon cancer, gastric cancer, hepatocellular carcinoma) was compared with that of 5-Fluorouracil (5-FU), an anticancer agent currently used.

또 다른 구현예에서 코릴라진(corilagin)의 항암성과 5-FU 항암제 사이에 상승작용, 상호억제작용, 혹은 상호작용이 없는가를 확인하고,In another embodiment to confirm that there is no synergy, interaction inhibition or interaction between the anticancer and 5-FU anticancer agents of corilagin,

다른 구현예에서, 코릴라진(corilagin)의 소화기 종양(대장암, 위암, 간세포암) 세포주에 대한 증식억제 능력의 기전이 세포독성(poisoning) 때문인가 혹은 선택적인 세포사멸(apopotosis) 유도능력 때문인가를 확인하였다.In another embodiment, whether the mechanism of anti-proliferative ability of corilagin against gastrointestinal tumor (colon cancer, gastric cancer, hepatocellular carcinoma) cell line is due to cytotoxicity or ability to induce selective apoptosis. Confirmed.

본 발명은 소화기 종양(대장암, 위암, 간세포암)세포주 6 종류를 대상으로 코릴라진(corilagin)을 처리한 결과 세포사멸(apoptosis)을 유도한다는 사실을 처음으로 발견하였다. 이러한 항암효과를 약제에 의한 세포증식 억제능을 스크리닝하는 검사법인 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) 방법으로 측정한 결과 (만성 B형 간염 한자에 사용되었던 기능성 천연추출물 약물제재의) 인체에 대한 치료용량 한계범위에서 용량의존적으로 세포생장 억제능력이 유의하게 관찰되었으며, 특히 대장암의 경우에 그 억제능력이 더욱 현저하게 관찰되었다.(도 2 내지 4 참조)The present invention was the first to discover that the treatment of corilagin in six types of gastrointestinal tumor (colon cancer, gastric cancer, hepatocellular carcinoma) cell line induces apoptosis. This anticancer effect was measured by MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) method, which is a screening method for inhibiting cell proliferation by drugs (chronic B The dose-dependent inhibition of cell growth of the functional natural extract drug product used in the hepatitis kanji in the range of therapeutic dose to the human body was observed, especially in the case of colorectal cancer. (See Figures 2-4)

또한 본 발명은 양성 대조군으로써 소화기 종양(대장암, 위암, 간세포암)치료에 사용하는 대표적인 항암제인 5-Fluorouricil (5-FU)의 치료효과와 동시에 비교한 결과, 그 치료효능은 인체 치료용량 수준의 5-FU 와 비슷하거나 효과적인 결과를 보였다(도 5 내지 7 참조).In addition, the present invention compared with the therapeutic effect of 5-Fluorouricil (5-FU), a representative anticancer agent used in the treatment of gastrointestinal tumors (colon cancer, gastric cancer, hepatocellular carcinoma) as a positive control, the therapeutic efficacy of the human therapeutic dose level A similar or effective result of 5-FU was obtained (see FIGS. 5 to 7).

5-FU처리 후 MTT assay 결과 농도 비례적으로 세포 억제능을 나타내기는 하나, 0.5ug/ml 이상의 농도에서는 세포 억제능의 변화가 거의 없었다.After 5-FU treatment, MTT assay showed cell inhibition in proportion to concentration, but there was little change in cell inhibition at concentrations above 0.5ug / ml.

또한 소화기 종양(대장암, 위암, 간세포암)에 대한 항암능력이 음성 대조군에 비해서 유효한가를 조사하기 위하여, 음성 대조군으로 사용된 수용성 홍삼(gingsen, 시중에서 판매되는 제품)추출물 및 명일엽 수용성 추출물을 처리한 결과, 홍삼과 명일엽을 처리하였으나 세포 억제능을 보이지 않았다.(도 8 내지 10 참조).In addition, in order to investigate whether the anticancer capacity of gastrointestinal tumors (colon cancer, gastric cancer, hepatocellular carcinoma) is more effective than the negative control group, water-soluble red ginseng extract (commercially available product) used as a negative control group, and the water-soluble extract of Myeongil-yeop are treated. As a result, red ginseng and Myeongil-Yeop were treated, but did not show cell inhibition (see FIGS. 8 to 10).

또한 본 발명의 제재는 천연물 추출제재로서, 원천 천연물은 민간요법 제재로써 수 백 년 동안 사용되어 왔으며, 최근에는 건강기능성 약제로 인정받아 수년 동안 별 문제 없이 일반인들에게 사용되었기 때문에, 그 주성분의 하나인 코릴라진은 전임상 연구 및 임상연구가 즉시 가능한 안전한 제재이다.In addition, the preparation of the present invention is a natural extract, a source natural product has been used for hundreds of years as a folk remedy, and recently it was recognized as a health functional drug and used for many years without problems, one of the main ingredients Incorylazine is a safe product that can be immediately used for preclinical and clinical studies.

또한 본 발명의 물질이 산 및 열에 대한 영향을 받는지를 조사하기 위하여 간세포암 세포주인 Hep3B에 corilagin을 끓이거나 산 처리한 것 처리 후 생장률로 보아 산 및 열에 대해서 어느 정도 내성을 나타내었다.(도 11 내지 16 참조)In addition, in order to investigate whether the substance of the present invention is affected by acid and heat, hepat3B, a hepatocellular carcinoma cell line, was boiled or treated with corilagin, and showed growth resistance after treatment with acid and to some extent. To 16)

또한 본 발명의 코릴라진(corilagin)의 항암보조 활성을 살펴 본 결과, 5-FU만 처리했을 때 보다 코릴라진을 동시에 처리했을 때 추가적으로 약 10∼30%의 생장률 감소를 더 보였다.(도 21 내지 28 참조)In addition, as a result of examining the anticancer adjuvant activity of the corilagin of the present invention, when treated with the corylazine at the same time than the 5-FU treatment alone, the growth rate of about 10 to 30% was further reduced. 21 to 28)

본 발명에서 소화기 종양이란 대장암, 위암, 간세포암에 생긴 악성 종양을 의미하고, Gastrointestinal tumor in the present invention means colon cancer, stomach cancer, hepatocellular carcinoma malignant tumor,

Corilagin은 진주초의 주요구성 유효성분의 하나로써 수용성 tannin 계열에 속하는 gallotannin을 의미하며,Corilagin means gallotannin belonging to the water-soluble tannin family as one of the major constituent active ingredients of Jinjucho,

MTT 실험은 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (a yellow tetrazole)의 발색반응을 이용한 세포증식 억제(cell proliferation inhibition)에 관한 실험을 의미한다.The MTT experiment refers to an experiment on cell proliferation inhibition using color reaction of 3- (4,5-dimethylmethylzol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (a yellow tetrazole).

본 발명은 수용성 천연 추출물질인 코릴라진(corilagin)을 기반으로 하는 천연물 항암제 개발에 관한 것으로서, 소화기 종양, 특히 대장암의 치료 및 예방에 있어서 코릴라진(corilagin)을 기존 치료법과 상승효과를 나타내는 보조적인 항암제(anti-cancer agent) 뿐만 아니라, 소화기 종양(대장암, 위암, 간세포암) 고위험군에 대한 암예방 화학요법제 (chemopreventive agent)로 사용될 수 있는 효과가 있다. 본 발명은 독성이 거의 없는 것으로 검증된 기능성 천연물 항암제재로 대장암 등에 대한 기존 치료법과 상승효과를 나타내는 보조적인 항암요법제로 사용될 수 있고, 대장암과 같은 종양 고위험군에 대한 암예방 화학요법제(chemopreventive agent)로 사용될 수 있다.
The present invention relates to the development of a natural anticancer drug based on corilagin, a water-soluble natural extract, which has a synergistic effect with corilagin in the treatment and prevention of gastrointestinal tumors, particularly colon cancer. In addition to the adjuvant anti-cancer agents indicated, there is an effect that can be used as a chemopreventive agent for cancer of the gastrointestinal tumor (colon cancer, stomach cancer, hepatocellular carcinoma) high risk group. The present invention can be used as an adjuvant anti-cancer agent that shows synergistic effects with existing treatments for colorectal cancer, etc. as a functional natural product anticancer agent that has been proved to be almost non-toxic, and a chemopreventive agent for cancer high risk groups such as colorectal cancer (chemopreventive) agent).

도 1은 Corilagin 화합물 구조로, 갈로타닌은 일종의 폴리페놀 모노머(polyphenol monomer)인 갈릭산(gallic acid)이 에스화(esterify)하여 포도당(glucose)같은 폴로올 탄수화물(polyol hydrocarbohyrate)의 hydroxyl group 과 결합할 때 형성되는 폴리머이다.
도 2는 간세포암 세포주에 코릴라진(corilagin)을 처리했을 때 생장률을 나타내고,
도 3은 위암 세포주에 코릴라진(corilagin)을 처리했을 때 생장률을 나타내며,
도 4는 대장암 세포주에 코릴라진(corilagin)을 처리했을 때 생장률을 나타내고,
도 5는 간세포암 세포주에 5-FU를 처리했을 때 생장률을 나타내며,
도 6은 위암 세포주에 5-FU를 처리했을 때 생장률을 나타내고,
도 7은 대장암 세포주에 5-FU를 처리했을 때 생장률을 나타내고,
도 8은 간세포암 세포주에 천연물 처리후 생장률을 나타내고,
도 9는 간세포암 세포주에 천연물 처리후 생장률을 나타내고,
도 10은 대장암 세포주에 천연물 처리후 생장률을 나타내며,
도 11은 간세포암 세포주인 HepG2에 corilagin을 끓이거나 산 처리한 것 처리 후 생장률을 나타내고,
도 12는 간세포암 세포주인 HepG.2.152에 corilagin을 끓이거나 산 처리한 것 처리 후 생장률을 나타내고,
도 13은 간세포암 세포주인 Huh7에 corilagin을 끓이거나 산 처리한 것 처리 후 생장률을 나타내고,
도 14는 간세포암 세포주인 Hep3B에 corilagin을 끓이거나 산 처리한 것 처리 후 생장률을 나타내고,
도 15는 대장암 세포주인 HT29에 corilagin을 끓이거나 산 처리한 것 처리 후 생장률을 나타내고,
도 16은 대장암 세포주인 HTC116에 corilagin을 끓이거나 산 처리한 것 처리 후 생장률을 나타내고,
도 17은 간세포암 세포주 Huh7에서 Fas/FasLG(ligand) 발현에 대한 Western blot 비교한 사진으로, 사진에서 M은 Marker, 1 레인은 Huh7 Control, 2 레인은 5-FU 20ug/ml 24H, 3 레인은 Corilagin 100ug/ml 24H, 4레인은 Huh7 Control, 5 레인은 5-FU 20ug/ml 48H, 및 6번 레인은 Corilagin 100ug/ml 48H를 나타낸다. 사진에서 알 수 있는 바와 같이, Huh7의 경우, Fas 발현 증가상태가 대조군과 차이 없으며, Fas ligand(FasLG) 발현이 없었다. 따라서, Huh7 세포사멸기전은 Fas/FasLG 이외의 다른 기전에 의한 것으로 추정된다.
도 18은 간세포암 세포주 Hep3B에서 Fas/FasLG(ligand) 발현에 대한 Western blot 비교한 사진으로, 사진에서 M은 Marker, 1레인은 Hep3B Control, 2 레인은 5-FU 20ug/ml 24H, 3 레인은 Corilagin 100ug/ml 24H, 4 레인은 Hep3B Control, 5 레인은 5-FU 20ug/ml 48H, 6 레인은 Corilagin 100ug/ml 48H를 나타내고, 사진에서 알 수 있는 바와 같이, Hep3B의 경우, Fas 발현 증가상태가 Corilagin 투여군이 대조군과 5FU 에 비해서 유의하게 증가되며, Fas ligand(FasLG) 발현도 역시 동일한 현상을 나타내었다. 따라서, Hep3B 세포사멸기전은 Fas/FasLG 기전이 가장 중요한 것으로 추정된다.
도 19는 대장암 세포주 HT29에서 Fas/FasLG(ligand) 발현에 대한 Western blot 비교한 사진으로, 사진에서 M은 Marker, 1 레인은 HT29 Control, 2레인은 5-FU 20ug/ml 24H, 3레인은 Corilagin 100ug/ml 24H, 4레인은 HT29 Control, 5 레인은 5-FU 20ug/ml 48H, 6 레인은 Corilagin 100ug/ml 48H를 나타내고, 사진에서 알 수 있는 바와 같이,HT29의 경우, Fas 발현 증가상태가 Corilagin 투여군이 대조군과 5FU 에 비해서 유의하게 감소되며, Fas ligand(FasLG) 발현도 역시 동일한 현상을 나타낸다. 따라서, HT29 세포사멸기전은 Fas/FasLG 기전이외의 기전이 중요한 것으로 추정된다.
도 20은 대장암 세포주 HCT116에서 Fas/FasLG(ligand) 발현에 대한 Western blot 비교한 사진으로, 사진에서 M은 Marker, 1레인은 HCT116 Control, 2레인은 5-FU 20ug/ml 24H, 3레인은 Corilagin 100ug/ml 24H, 4레인은 HCT116 Control, 5레인은 5-FU 20ug/ml 48H, 6레인은 Corilagin 100ug/ml 48H를 나타내고, 사진에서 알 수 있는 바와 같이,HCT116의 경우, Fas 발현 증가상태가 Corilagin 투여군이 대조군과 5FU 에 비해서 증가경향을 보이나, Fas ligand(FasLG) 발현은 관찰되지 않는다.따라서, HCT116 세포사멸기전은 Fas/FasLG 기전이외의 기전이 관여하는 것으로 추정된다.
도 21은 간세포암 세포주인 HepG2에 5-Fu와 corilagin 동시 처리 했을 때의 생장률에 대한 표와 그래프이다. 도 21로부터 알 수 있는 바와 같이, 5-FU만 처리했을 때 보다 코릴라진을 동시에 처리했을 때 추가적으로 약 5~10%의 생장률 감소를 더 보였다.
도 22는 간세포암 세포주인 HepG2.2.15에 5-Fu와 corilagin 동시 처리했을 때의 생장률에 대한 표와 그래프이다. 도 22로부터 알 수 있는 바와 같이,5-FU만 처리했을 때 보다 코릴라진을 동시에 처리했을 때 추가적으로 약 7%의 생장률 감소를 더 보였다.
도 23은 간세포암 세포주인 Huh7에 5-Fu와 corilagin 동시 처리 했을 때의 생장률에 대한 표와 그래프이다. 도 23으로부터 알 수 있는 바와 같이,5-FU만 처리했을 때 보다 코릴라진을 동시에 처리했을 때 추가적으로 약 20~30%의 생장률 감소를 더 보였다.
도 24는 간세포암 세포주인 Hep3B7에 5-Fu와 corilagin 동시 처리 했을때의 생장률에 대한 표와 그래프이다. 도 24로부터 알 수 있는 바와 같이,5-FU만 처리했을 때 보다 코릴라진을 동시에 처리했을 때 추가적으로 약 15%의 생장률 감소를 더 보였다.
도 25는 위암 세포주인 MKN45에 5-Fu와 corilagin 동시 처리 했을 때의 생장률에 대한 표와 그래프이다. 도 25로부터 알 수 있는 바와 같이,5-FU만 처리했을 때 보다 코릴라진을 동시에 처리했을 때 추가적으로 약 15%의 생장률 감소를 더 보였다.
도 26은 위암 세포주인 AGS에 5-Fu와 corilagin 동시 처리 했을 때의 생장률에 대한 표와 그래프이다. 도 26으로부터 알 수 있는 바와 같이, AGS는 코리라진에 대한 생장률 저해의 민감도가 다른 세포주보다 민감하였으며, 5-Fu만 처리했을 때 보다 코리라진을 동시에 처리했을 때 추가적으로 약 15%의 생장률 감소를 더 보였다.
도 27은 대장암 세포주인 HCT116에 5-Fu와 corilagin 동시 처리 했을 때의 생장률에 대한 표와 그래프이다. 도 27로부터 알 수 있는 바와 같이,5-FU만 처리했을 때 보다 코릴라진을 동시에 처리했을 때 추가적으로 약 15%의 생장률 감소를 더 보였다.
도 28은 대장암 세포주인 HT29에 5-Fu와 corilagin 동시 처리 했을 때의 생장률에 대한 표와 그래프이다. 도 28로부터 알 수 있는 바와 같이,5-FU만 처리했을 때 보다 코릴라진을 동시에 처리했을 때 추가적으로 약 5~10%의 생장률 감소를 더 보였다.
도 29는 대장암 세포주 2종(HCT116, HT29) 및 대조군으로서 비종양 세포 (UCMCS, 제대세포유래 미성숙 줄기세포, 암세포 아님)에 대해서, 코릴라진을 처리했을 때의 생장률에 대한 표와 그래프이다.
도 30은 간암세포 4종(HepG2, HepG2.2.15, Huh7, Hep3B) 및 대조군으로서 비종양 세포 (UCMCS, 제대세포 유래 미성숙 줄기세포, 암세포 아님)에 대해서, 코릴라진을 처리했을 때의 생장률에 대한 표와 그래프이다.
1 is a structure of a corilagin compound, gallotanine is a kind of polyphenol monomer (gallic acid) is esterified by the esterification (gallic acid) is combined with the hydroxyl group of the polyol hydrocarbohyrate (polyol hydrocarbohyrate) such as glucose (glucose) When the polymer is formed.
Figure 2 shows the growth rate when treated with corilagin in hepatocellular carcinoma cell line,
Figure 3 shows the growth rate when treated with corilagin (corilagin) in gastric cancer cell line,
Figure 4 shows the growth rate when treated with corilagin (corilagin) to colon cancer cell line,
Figure 5 shows the growth rate when treated with 5-FU in hepatocellular carcinoma cell line,
Figure 6 shows the growth rate when treated with 5-FU gastric cancer cell line,
Figure 7 shows the growth rate when treated with 5-FU colorectal cancer cell line,
8 shows the growth rate after treatment with natural products in hepatocellular carcinoma cell line,
Figure 9 shows the growth rate after natural product treatment in hepatocellular carcinoma cell line,
10 shows the growth rate after treatment with natural products in colorectal cancer cell lines,
Figure 11 shows the growth rate after treatment with boiled or acid-treated corilagin in HepG2, a hepatocellular carcinoma cell line,
Figure 12 shows the growth rate after treatment with boiled or acid-treated corilagin in HepG.2.152, a hepatocellular carcinoma cell line,
Figure 13 shows the growth rate after treatment with boiled or acid-treated corilagin in Huh7, a hepatocellular carcinoma cell line,
Figure 14 shows the growth rate after the treatment of boiled or acidic treatment of hepatocellular carcinoma cell line Hep3B,
Figure 15 shows the growth rate after treatment with boiled or acidic treatment of the corilagin in HT29 colon cancer cell line,
Figure 16 shows the growth rate after treatment with boiled or acid-treated corilagin in colon cancer cell line HTC116,
17 is a photograph comparing Western blot for Fas / FasLG (ligand) expression in hepatocellular carcinoma cell line Huh7, in which M is Marker, lane 1 is Huh7 Control, lane 2 is 5-FU 20ug / ml 24H, and lane 3 is Corilagin 100ug / ml 24H, lane 4 shows Huh7 Control, lane 5 shows 5-FU 20ug / ml 48H, and lane 6 shows Corilagin 100ug / ml 48H. As can be seen from the photograph, in the case of Huh7, Fas expression increase was not different from the control group, there was no Fas ligand (FasLG) expression. Thus, the Huh7 apoptosis mechanism is presumed to be due to a mechanism other than Fas / FasLG.
FIG. 18 is a photograph comparing Western blot for Fas / FasLG (ligand) expression in hepatocellular carcinoma cell line Hep3B, in which M is Marker, lane 1 Hep3B Control, lane 2 5-FU 20ug / ml 24H, lane 3 Corilagin 100ug / ml 24H, lane 4 shows Hep3B Control, lane 5 shows 5-FU 20ug / ml 48H, lane 6 shows Corilagin 100ug / ml 48H, and as shown in the photograph, in the case of Hep3B, Fas expression was increased. Was significantly increased in Corilagin-treated group compared to control and 5FU, and Fas ligand (FasLG) expression was also the same. Therefore, it is assumed that the Fas / FasLG mechanism is the most important for the Hep3B apoptosis mechanism.
19 is a photograph comparing Western blot for Fas / FasLG (ligand) expression in colorectal cancer cell line HT29, in which M is Marker, lane 1 is HT29 Control, lane 2 is 5-FU 20ug / ml 24H, and lane 3 is Corilagin 100ug / ml 24H, lane 4 shows HT29 Control, lane 5 shows 5-FU 20ug / ml 48H, lane 6 shows Corilagin 100ug / ml 48H, and as shown in the photograph, in the case of HT29, Fas expression was increased. The Corilagin group was significantly decreased compared to the control group and 5FU, and Fas ligand (FasLG) expression was also the same. Therefore, the mechanism of HT29 apoptosis other than Fas / FasLG mechanism is considered to be important.
20 is a photograph comparing Western blot for Fas / FasLG (ligand) expression in colorectal cancer cell line HCT116, in which M is Marker, 1 lane is HCT116 Control, 2 lane is 5-FU 20ug / ml 24H, and 3 lane is Corilagin 100ug / ml 24H, 4 lanes are HCT116 Control, 5 lanes are 5-FU 20ug / ml 48H, 6 lanes are Corilagin 100ug / ml 48H, As can be seen from the photo, in the case of HCT116, Fas expression increased state Corilagin-treated group showed increased tendency compared to control and 5FU, but Fas ligand (FasLG) expression was not observed. Therefore, HCT116 apoptosis mechanism is presumed to be involved in the mechanism other than Fas / FasLG.
FIG. 21 is a table and a graph showing the growth rate when 5-Fu and corilagin were simultaneously treated with HepG2, a hepatocellular carcinoma cell line. As can be seen from FIG. 21, the growth rate of about 5 to 10% was further increased when coryazine was simultaneously treated than when 5-FU was treated.
22 is a table and a graph showing the growth rate when 5-Fu and corilagin were co-treated with HepG2.2.15, a hepatocellular carcinoma cell line. As can be seen from Figure 22, when treated with the corylazine at the same time than the treatment with 5-FU further showed a further decrease of about 7% growth rate.
FIG. 23 is a table and a graph showing growth rates when 5-Fu and corilagin are simultaneously treated in Huh7, a hepatocellular carcinoma cell line. As can be seen from Figure 23, when treated with the same simultaneous treatment with coryazine than 5-FU only showed a further decrease in growth rate of about 20-30%.
FIG. 24 is a table and a graph showing the growth rate when hep3B7, a hepatocellular carcinoma cell line, simultaneously treated with 5-Fu and corilagin. As can be seen from FIG. 24, a further reduction in growth rate of about 15% was observed when corridazine was simultaneously treated than when 5-FU alone was treated.
FIG. 25 is a table and a graph showing growth rates when 5-Fu and corilagin were simultaneously treated in gastric cancer cell line MKN45. As can be seen from FIG. 25, the growth rate was further increased by about 15% when corylazine was simultaneously treated than when 5-FU was treated.
FIG. 26 is a table and a graph showing growth rates when 5-Fu and corilagin were simultaneously treated in AGS, a gastric cancer cell line. As can be seen from FIG. 26, AGS was more sensitive to growth rate inhibition to coryazine than other cell lines, and further reduced growth rate by about 15% when treatment with coryazine simultaneously than with 5-Fu alone. Seemed.
FIG. 27 is a table and a graph showing the growth rate when 5-Fu and corilagin were simultaneously treated with HCT116, a colorectal cancer cell line. As can be seen from FIG. 27, the growth rate was further increased by about 15% when corridazine was simultaneously treated than when 5-FU was treated alone.
FIG. 28 is a table and a graph showing the growth rate when 5-Fu and corilagin are simultaneously treated in HT29, a colorectal cancer cell line. As can be seen from Figure 28, when treated with the corylazine at the same time than the treatment with 5-FU further showed a further decrease in growth rate of about 5-10%.
FIG. 29 is a table and a graph showing the growth rate of corylazine treatment for two types of colorectal cancer cell lines (HCT116 and HT29) and non-tumor cells (UCMCS, umbilical cord-derived immature stem cells, not cancer cells) as a control group. .
Fig. 30 shows the growth rate when corylazine was treated for four types of hepatocellular carcinoma cells (HepG2, HepG2.2.15, Huh7, Hep3B) and non-tumor cells (UCMCS, immature stem cells, not cancer cells) as a control group. Tables and graphs for

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.The present invention will now be described in more detail by way of non-limiting examples. The following examples are intended to illustrate the invention and the scope of the invention is not to be construed as being limited by the following examples.

본 발명에서 사용된 세포주는 한국 세포주 은행으로부터 AGS- 21739, MKN- 80103, Ht29- 30038, Hct116-10247, Hepg2-88065, Huh7-60104, Hep3B-88064을 입수하였다.The cell lines used in the present invention obtained AGS- 21739, MKN-80103, Ht29-30038, Hct116-10247, Hepg2-88065, Huh7-60104, Hep3B-88064 from the Korea Cell Line Bank.

또한 각 암세포에 대해서 성격이 다른 2가지 암세포주들을 (대장암, HT29- 30038 / HCT116-10247, ; 간세포암, Huh7-60104 / Hep3B-88064; 위암, AGS- 21739, / MKN- 80103 ; 간아세포암, HepG2-88065 / HepG2.2.15) 각각 쌍으로 비교연구 실험을 수행하였다.In addition, two cancer cell lines with different personalities were identified for each cancer cell (colon cancer, HT29-30038 / HCT116-10247, hepatocellular carcinoma, Huh7-60104 / Hep3B-88064; gastric cancer, AGS- 21739, / MKN- 80103; hepatoblasts). Cancer, HepG2-88065 / HepG2.2.15) each of the comparative study experiments were performed.

본 발명에서 사용된 시약 및 그 구입처는 FBS(Gibco), antibiotic-antimycotic(Sigma), MTT(Sigma), corilagin(Santa cruz biotechnology)이다.
Reagents used in the present invention and where to buy is FBS (Gibco), antibiotic-antimycotic (Sigma), MTT (Sigma), corilagin (Santa cruz biotechnology).

실시예Example 1:천연물 처리 1: natural treatment

시중에 판매되고 있는 명일엽 엑기스와 정관장 6년근 홍삼 엑기스를 수용액으로 만든 뒤 0.25um sylinge filter로 필터 한 후 각 세포주에 처리하였다. 농도의 결정은 사람이 1회 섭취하는 양이 5000ml serum에 희석되는 것으로 환산하여 결정하였다.Myeongilyeop extract and 6 years old red ginseng extract of Jeonggwanjang were made into aqueous solution, filtered with 0.25um sylinge filter, and then treated to each cell line. The concentration was determined by converting the amount of human intake into 5000 ml serum once.

또한 진주초 추출물은 구입한 진주초를 추출하고, 시중에서 발매되고 있던 진주초 추출물의 상품명인 헤파가드(일양약품)를 구입하여, 파쇄를 한 다음, HPLC 분석을 통해서 3개의 주요 peaks (brevifolin, anthocyanin, corilagin)가 동일한 농도로 존재함을 확인함으로써 두 종류의 실험에 사용된 제재, 즉 진주초 원료추출물과 헤파가드의 분쇄가루의 (H2O에 녹인) 수용성 추출물 사이에 조성의 차이가 없다는 것을 확인하고, 실험에 사용하였다. 코릴라진(Corilagin) 분말제재는 상품화된 것을 구입하여(Santa cruz biotechnology) DMSO 에 녹여서 필요한 만큼 실험에 사용하였다.In addition, pearl leaf extract extracts the purchased pearl leaf, hepagard (Ilyang Pharmaceutical), which is a commercially available pearl leaf extract, is crushed, and then broken down, and then analyzed through three major peaks (brevifolin, Confirming that anthocyanin and corilagin were present in the same concentration, there was no difference in composition between the materials used in the two experiments, namely, the pearlescent raw extract and the water-soluble extract (dissolved in H2O) of the ground powder of Hepagard. It was used for the experiment. Corilagin powder was purchased commercially (Santa cruz biotechnology) and dissolved in DMSO and used in experiments as needed.

실시예Example 2: 2: MTTMTT assayassay

소화기 종양(대장암, 위암, 간세포암) 세포주를 96well에 5X103cell/well로 seeding 한 후, 2일간 배양하였다. 진주초 추출물을 농도별로 처리하고, 대조군으로 5-Fu를 농도별로 처리한 후 48 시간 동안 배양하였다. 5mg/ml MTT를 10ul 처리하여 4 시간 반응시킨 후, 배양액을 제거하고 isopropanol 과 DMSO를 10:1의 비율로 섞은 용액을 100ul 처리하여 15분간 반응한 후, 570nm/640nm에서 흡광도를 측정하였다.Gastrointestinal tumor (colon cancer, gastric cancer, hepatocellular carcinoma) cell lines were seeded at 5 × 10 3 cells / well in 96 wells and then cultured for 2 days. Pearl persimmon extract was treated by concentration, and treated as a control group by 5-Fu concentration and incubated for 48 hours. After treatment with 10ul of 5mg / ml MTT for 4 hours, the culture medium was removed, and 100ul of the solution mixed with isopropanol and DMSO at a ratio of 10: 1 was reacted for 15 minutes, and then absorbance was measured at 570nm / 640nm.

실시예Example 3:세포 배양 3: cell culture

본 발명에 사용된 세포에 대한 배양 배지 및 성분은 표 1과 같다.Culture medium and components for the cells used in the present invention are shown in Table 1.

HepG2HepG2 MEMMEM 1% 항생물질1% antibiotic 10% FBS10% FBS 2.2.152.2.15 DMEMDMEM 1% 항생물질1% antibiotic 10% FBS10% FBS Hep3BHep3B DMEMDMEM 1% 항생물질1% antibiotic 10% FBS10% FBS Huh7Huh7 DMEMDMEM 1% 항생물질1% antibiotic 10% FBS10% FBS HT29HT29 RPMI1640RPMI1640 1% 항생물질1% antibiotic 10% FBS10% FBS HCT116HCT116 RPMI1640RPMI1640 1% 항생물질1% antibiotic 10% FBS10% FBS AGSAGS RPMI1640RPMI1640 1% 항생물질1% antibiotic 10% FBS10% FBS MKN45MKN45 RPMI1640RPMI1640 1% 항생물질1% antibiotic 10% FBS10% FBS

표 1은 본 발명에 사용된 세포에 대한 배양 정보이다.Table 1 shows the culture information for the cells used in the present invention.

본 발명의 DMEM는 4500 mg/L D-glucose, L-glutamine, 110 mg/L sodium pyruvateDMEM of the present invention is 4500 mg / L D-glucose, L-glutamine, 110 mg / L sodium pyruvate

및 Sodium Bicarbonate를 포함하며, RPMI1640는 25mM Hepes를 포함하였다.And Sodium Bicarbonate, and RPMI1640 contained 25 mM Hepes.

실시예Example 4: 4: 웨스턴Western 블럿Blot

6 well plate에 각 cell line을 1X106/well로 접종하였. 48 시간 동안 37℃ 5% CO2조건으로 배양 후 반응을 보고자 하는 시약을 농도별로 처리하고, 24, 48시간 배양하였다. plate의 media를 제거하고, PBS로 세척 후, trypsin-EDTA를 이용하여 세포를 떼어, 1200rpm에서 3분간 원심분리하고, PBS로 세척 후 1.5.ml tube에 pellet을 모았다. 각 튜브에 protease inhibitor cocktail이 첨가된 RIPA buffer를 100ul 첨가하고, 10분간 반응하였다. 15000rpm에서 15분간 원심분리하고, 상청액을 따로 모았다. Bio-Rad protein assay를 이용하여 단백질 농도를 측정하고, 30ug/well로 10% SDS-PAGE Gel에 load하였다. 분리된 단백질을 nitrocellulose filter에 transfer하고, skim milk를 이용하여 blocking 하였고, Primary Ab를 4℃에서 16시간 동안 반응하였다. 세척 후 secondary Ab를 2시간 동안 실온에서 반응하였으며, ECL solution에 1분간 노출한 후 X-ray film을 이용하여 현상하였다.Each cell line was inoculated with 1 × 10 6 / well in a 6 well plate. After 48 hours incubation at 37 5% CO 2 conditions to treat the reagents to see the reaction by concentration, incubated for 24, 48 hours. After removing the media of the plate, washed with PBS, cells were removed using trypsin-EDTA, centrifuged for 3 minutes at 1200rpm, pellets were collected in 1.5.ml tube after washing with PBS. 100 μl of RIPA buffer containing protease inhibitor cocktail was added to each tube and reacted for 10 minutes. Centrifuge for 15 minutes at 15000 rpm, and the supernatants were collected separately. Protein concentration was measured using a Bio-Rad protein assay and loaded on 10% SDS-PAGE Gel at 30ug / well. The separated protein was transferred to a nitrocellulose filter, blocked using skim milk, and the Primary Ab was reacted at 4 ° C. for 16 hours. After washing, the secondary Ab was reacted at room temperature for 2 hours, and then developed by using an X-ray film after exposure to ECL solution for 1 minute.

실시예Example 5: 정상세포 및 암세포에서  5: in normal cells and cancer cells 코릴라진(Corilagin)의Of corilagin 효과 비교 Compare effects

본 발명에 사용된 UCMCS 세포주는 정상적인 제대세포로부터 분화시킨 제대세포유래 미성숙 줄기세포로서 암세포가 아니며, 본 실시예에서는 대장암 세포주(2종)와 간암세포주(2종)에 대해서 코릴리진(Corilagin, Santa cruz biotechnology)의 항암성 MTT 실험의 대조군으로 사용하였다. The UCMCS cell line used in the present invention is immature stem cells derived from umbilical cord cells, which are differentiated from normal umbilical cord cells, and are not cancer cells. In this embodiment, corylgin (Corilagin) is applied to colon cancer cell lines (2 types) and liver cancer cell lines (2 types). , Santa cruz biotechnology) was used as a control for the anticancer MTT experiment.

요약하면, 각 세포주를 96well에 5X103cell/well로 seeding 한 후, 2일간 배양한다. 코릴라진을 농도별로 처리하고, 대조군으로 5-FU를 농도별로 처리한 후 48Hr동안 배양하였다. 5mg/ml MTT를 10ul 처리하여 4hr 반응시킨 후, 배양액을 제거하고 isopropanol 과 DMSO를 10:1의 비율로 섞은 용액을 100ul 처리하여 15분간 반응한 후, 570nm/640nm에서 흡광도를 측정하였다.In summary, each cell line is seeded at 5 × 10 3 cell / well in 96 wells and incubated for 2 days. Corylazine was treated by concentration, and 5-FU was treated by concentration as a control, followed by incubation for 48 Hr. After 10ul of 5mg / ml MTT was treated for 4hr, the culture medium was removed, and 100ul of the solution mixed with isopropanol and DMSO at a ratio of 10: 1 was reacted for 15 minutes, and then absorbance was measured at 570nm / 640nm.

도 29 및 도 30에서 알 수 있는 바와 같이, 코릴라진은 대장암 세포주 2종과 간암세포주 4종에 대해서는 모두 농도증가에 따라서 생장억제 효과 (proliferation inhibition) 나타내었으나, UCMCS 세포주에 대해서는 전혀 억제효과가 없었다.As can be seen in FIGS. 29 and 30, corylazine showed proliferation inhibition for two colon cancer cell lines and four hepatocellular carcinoma cell lines with increasing concentration, but no inhibitory effect for UCMCS cell lines. There was no.

Claims (8)

코릴라진(corilagin)을 유효성분으로 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학 조성물.A pharmaceutical composition for preventing or treating colorectal cancer, comprising corilagin as an active ingredient. 삭제delete 코릴라진(corilagin)을 유효성분으로 함유하는 대장암 또는 위암에 대한 항암보조용 약제학적 조성물.An anticancer pharmaceutical composition for colorectal cancer or stomach cancer containing corilagin as an active ingredient. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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