KR101356106B1 - Marker and primer set for diagnosis of soft tunic syndrome - Google Patents

Marker and primer set for diagnosis of soft tunic syndrome Download PDF

Info

Publication number
KR101356106B1
KR101356106B1 KR1020120005701A KR20120005701A KR101356106B1 KR 101356106 B1 KR101356106 B1 KR 101356106B1 KR 1020120005701 A KR1020120005701 A KR 1020120005701A KR 20120005701 A KR20120005701 A KR 20120005701A KR 101356106 B1 KR101356106 B1 KR 101356106B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
nos
primer
primer set
diagnosing
Prior art date
Application number
KR1020120005701A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR20130084823A (en
Inventor
정태성
차인석
노성원
장호빈
박성빈
김영림
하미애
Original Assignee
경상대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경상대학교산학협력단 filed Critical 경상대학교산학협력단
Priority to KR1020120005701A priority Critical patent/KR101356106B1/en
Publication of KR20130084823A publication Critical patent/KR20130084823A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR101356106B1 publication Critical patent/KR101356106B1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/113—PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 멍게 물렁병 진단용 마커 조성물 및 상기 마커를 포함하는 멍게 물렁병 진단 키트 및 멍게 물렁병 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 마커를 이용하면 빠르고 정확하게 멍게 물렁병의 진단이 가능하므로, 멍게 물렁병의 확산을 막을 수 있으며, 효과적인 방제가 가능하다.The present invention relates to a testosterone diagnosing marker composition, and a testosterone diagnosing kit and a method for diagnosing the disease. By using the marker provided in the present invention, it is possible to quickly and accurately diagnose the bruises, so that the spread of the bruises can be prevented and effective control is possible.

Description

멍게 물렁병 진단용 마커 및 프라이머 세트 {Marker and primer set for diagnosis of soft tunic syndrome}Marker and primer set for diagnosis of soft tunic syndrome}

본 발명은 멍게 물렁병 진단용 마커 조성물 및 상기 마커를 포함하는 멍게 물렁병 진단 키트 및 멍게 물렁병 진단 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a testosterone diagnosing marker composition, and a testosterone diagnosing kit and a method for diagnosing the disease.

멍게는 우리나라, 일본의 북해도 지방 및 일부 아시아 국가의 기호식품으로서, 최근 멍게류에서 콜라겐, 바나듐, 식이섬유 및 콘드로이친 같은 생리활성 물질 외에 천연 항암 및 항생 물질이 다량 함유되어 있는 것으로 밝혀짐에 따라 그 수요가 증가하고 있다.Sea urchin is a favorite food of Korea, Japan's Hokkaido region and some Asian countries. Recently, sea urchin has been found to contain large amounts of natural anticancer and antibiotic substances in addition to bioactive substances such as collagen, vanadium, dietary fiber and chondroitin. Demand is increasing.

그러나 1970년대 후반부터 양식산 멍게가 일명 물렁병 또는 조그랑증 등의 질병으로 인해 대량 폐사가 발생하고 있으며, 이로 인해 폐사율이 연간 양식량의 최고 80%에 달하고, 연간 피해 금액이 약 200 ~400억 원이 이르는 것으로 추정되고 있다 (멍게수하식수협, 2007). 이러한 양식 멍게의 대량 폐사는 국내 멍게 양식업계에 막대한 직접적 경제적 손실을 가져올 뿐만 아니라 국내 생산 멍게의 해외수출에도 큰 장애가 되고 있다. However, since the late 1970s, farmed sea urchin has become a major cause of mortality due to diseases such as runny diseases or granulosis, resulting in mortality of up to 80% of annual farming and annual damage of about 20 to 40 billion won. It is estimated that the circle reaches early (Sea of Dignity, 2007). The mass mortality of these farmed sea urchins is not only a huge direct economic loss to the domestic sea urchin farming industry, but also a major obstacle to the export of domestically produced sea urchins.

명게 물렁병으로 인해 대량 폐사되는 멍게는 멍게의 표면을 감싸고 있는 피낭이 연화되고, 비이상적으로 점액성 물질이 증가하며, 피낭이 괴사 또는 천공되어 내부조직이 유출되는 외형적 특징을 가지고 있다. 또 다른 폐사 원인으로 조그랑증으로 인해 대량 폐사되는 멍게는 피낭은 수하연(垂下延)에 붙어 있으나 육질부가 흘러내리고, 피낭이 쪼그라드는 증상을 나타낸다. 이와 같은 멍게 질병의 원인을 밝혀내기 위한 환경적 요인 조사(수온, 염분, 용존 산소, pH, 클로로필 α 함량 등), 생리적 요인 조사(산지별 멍게의 성장 상태), 세균학적 조사(소화선내 총 세균수), 및 분자유전학적 접근 등 다학제적인 연구가 진행되고 있지만, 현재까지 대량 폐사의 원인이 명확히 밝혀지지 않아 이에 대한 예방 및 대책이 미비한 실정이다.Massive deaths of the sea urchins caused by Myeonggu crab disease are characterized by softening of the cysts surrounding the surface of the sea urchins, non-ideal increase of mucous substances, and leakage of internal tissues due to necrosis or perforation of the cysts. Another cause of mortality is that sea urchins, which are largely killed by granulomatosis, have pinangs attached to the lower abdomen (연 下 延), but the flesh flows down, and the capsules break down. Investigate environmental factors (water temperature, salinity, dissolved oxygen, pH, chlorophyll α content, etc.), physiological factors (growth of sea urchins by region), bacteriological investigations (total bacteria in digestive glands) Although multidisciplinary studies such as a) and molecular genetic approaches have been conducted, the cause of mass mortality is not clearly understood until now, and thus prevention and countermeasures are insufficient.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 멍게 물렁병의 원인체를 밝히기 위하여 예의 노력한 결과 특정 편모충이 관련하고 있다는 사실을 알아냈으며, 이를 바탕으로 하여 멍게 물렁병 진단용 마커 조성물을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
In order to solve the above problems, the present inventors have found out that a particular flagellar worm is involved as a result of intensive efforts to identify the causative agent of bruise ulcer disease, and based on this, the present invention is completed by identifying a marker composition for diagnosis of bruise ulcer disease. It was.

국내특허출원번호 : 10-2009-0006515Domestic patent application number: 10-2009-0006515

본 발명의 목적은 멍게 물렁병 진단용 마커 조성물을 제공함에 있다.It is an object of the present invention to provide a marker composition for diagnosing bruises.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 멍게 물렁병 진단용 키트 및 멍게 물렁병 진단 방법을 제공함에 있다.
Still another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing bruises and a bruises diagnosis comprising the composition.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 멍게 물렁증의 원인체 (AsSTF)인 편모충의 알파-튜불린, 베타-튜불린, 액틴, 엔도 또는 60S 리보좀 단백질 (Ribosomal protein) L7으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 단백질의 일부 서열을 갖는 전방 프라이머 및 역방 프라이머 세트를 포함하는 멍게 물렁병 진단용 마커 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention is selected from the group consisting of alpha-tubulin, beta-tubulin, actin, endo or 60S Ribosomal protein L7 of flagella larvae (AsSTF) Provided is a marker composition for diagnosing bruising disease comprising a front primer and a reverse primer set having a partial sequence of any one protein.

상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6 으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8 로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 구성되는 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택되는 것을 특징으로 한다. The primer set comprises a primer set consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8; And a primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10. It is characterized in that at least one selected from the group consisting of.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 멍게 물렁병 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for diagnosing bruises disease comprising the composition.

또한, 본 발명은 (a) 멍게 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6 으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8 로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 구성되는 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택되는 프라이머 세트를 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 산물을 분석하여 멍게 물렁병을 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 멍게 물렁병의 진단 방법을 제공한다.
In addition, the present invention comprises the steps of (a) separating the DNA from the sea urchin sample; (b) a primer set composed of SEQ ID NOs: 1 and 2 as a template of the DNA isolated in step (a); Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8; And a primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10; amplifying DNA using a primer set selected from one or more selected from the group consisting of; And (c) analyzing the product amplified in the step (b) to diagnose the bruising rash.

본 발명에서 제공하는 마커를 이용하면 빠르고 정확하게 멍게 물렁병의 진단이 가능하므로, 멍게 물렁병의 확산을 막을 수 있으며, 효과적인 방제가 가능하다.
By using the marker provided in the present invention, it is possible to quickly and accurately diagnose the bruises, so that the spread of the bruises can be prevented and effective control is possible.

도 1은 멍게 물렁병의 진단을 위한 본 발명의 실험 방법을 간략하게 도시한 것이다.
도 2는 total RNA로부터 cDNA를 만들기 위하여, total RNA 샘플의 성분비를 나타낸 것이다.
도 3은 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit를 이용하여 total RNA로부터 cDNA를 만들기 위한 조성물의 성분비를 나타낸 것이다.
도 4는 cDNA 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 멍게 물렁병의 원인체인 편모충을 동정한 결과이다.
도 6은 멍게 물렁병을 진단하기 위한 프라이머를 나타낸 것이다.
도 7은 멍게 물렁병을 진단하기 위한 PCR 조건을 나타낸 것이다.
도 8은 멍게 물렁증의 원인체 (AsSTF)인 편모충의 알파-튜불린 단백질을 확인하기 위한 프라이머를 설계한 것이다.
도 9는 멍게 물렁증의 원인체 (AsSTF)인 편모충의 베타-튜불린 단백질을 확인하기 위한 프라이머를 설계한 것이다.
도 10은 멍게 물렁증의 원인체 (AsSTF)인 편모충의 액틴 단백질을 확인하기 위한 프라이머를 설계한 것이다.
도 11은 멍게 물렁증의 원인체 (AsSTF)인 편모충의 엔도 단백질을 확인하기 위한 프라이머를 설계한 것이다.
도 12는 멍게 물렁증의 원인체 (AsSTF)인 편모충의 60S 리보좀 단백질 (Ribosomal protein) L7을 확인하기 위한 프라이머를 설계한 것이다.
도 13은 서열번호 1 및 2로 구성된 프라이머 세트 (alpha-tubulin) 를 이용하여 828bps에서 밴드를 확인한 결과이다.
도 14은 서열번호 3 및 4로 구성된 프라이머 세트 (beta-tubulin)를 이용하여 815bps에서 밴드를 확인한 결과이다.
도 15는 서열번호 5 및 6으로 구성된 프라이머 세트 (Actin)를 이용하여 897bps에서 밴드를 확인한 결과이다.
도 16은 서열번호 7 및 8로 구성된 프라이머 세트 (Endo-)를 이용하여 658bps에서 밴드를 확인한 결과이다.
도 17은 서열번호 9 및 10으로 구성된 프라이머 세트 (60S RP L7)를 이용하여 663bps에서 밴드를 확인한 결과이다.Figure 1 shows briefly the experimental method of the present invention for the diagnosis of bruises.
Figure 2 shows the component ratio of the total RNA sample, in order to make cDNA from total RNA.
Figure 3 shows the composition ratio of the composition for making cDNA from total RNA using the RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit.
Figure 4 shows the cDNA synthesis process.
5 is a result of identifying flagella, the causative agent of bruising rash.
Figure 6 shows the primers for diagnosing bruises.
Figure 7 shows the PCR conditions for diagnosing bruising rash.
Figure 8 is designed a primer for identifying the alpha-tubulin protein of the flagella larvae (AsSTF) cause of bruising rash.
Figure 9 is designed a primer for identifying beta-tubulin protein of flagella larvae (AsSTF) cause of bruising rash.
Figure 10 is designed a primer for identifying the actin protein of the flagella larvae (AsSTF) cause of bruising rash.
Figure 11 is designed a primer for identifying the endo protein of the flagella larvae (AsSTF) cause of bruising rash.
Figure 12 is designed a primer for identifying 60S Ribosomal protein (L7) of flagella larvae, the causative agent of bruise rash (AsSTF).
Figure 13 shows the results of confirming the band at 828bps using a primer set (alpha-tubulin) consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2.
Figure 14 shows the results of confirming the band at 815bps using a primer set (beta-tubulin) consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4.
Figure 15 shows the results of confirming the band at 897bps using a primer set (Actin) consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6.
Figure 16 shows the results of confirming the band at 658bps using a primer set (Endo-) consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8.
Figure 17 shows the results of confirming the band at 663bps using a primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10 (60S RP L7).

이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명은 멍게 물렁증의 원인체 (AsSTF)인 편모충의 알파-튜불린, 베타-튜불린, 액틴, 엔도 또는 60S 리보좀 단백질 (Ribosomal protein) L7으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 단백질의 일부 서열을 갖는 전방 프라이머 및 역방 프라이머 세트를 포함하는 멍게 물렁병 진단용 마커 조성물을 제공한다. The present invention relates to a sequence of any one of the proteins selected from the group consisting of alpha-tubulin, beta-tubulin, actin, endo or 60S ribosomal protein L7 of flagella larvae (AsSTF) Provided is a marker composition for diagnosing bruises disease comprising a front primer and a reverse primer set having.

상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6 으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8 로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 구성되는 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택되는 것을 특징으로 한다. The primer set comprises a primer set consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8; And a primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10. It is characterized in that at least one selected from the group consisting of.

본 발명에서 사용하는 용어인 “마커”란 멍게 물렁병을 나타내는 멍게를 정상 멍게와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 멍게와 비교하여 멍게 물렁병을 나타내는 멍게에서 특이적으로 존재하는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. The term "marker" used in the present invention is a substance which can be diagnosed by distinguishing the sea urchin from the sea urchin disease from the normal sea urchin. Organic biomolecules such as nucleic acids (eg mRNA), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) and the like.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 멍게 물렁병 발병 여부를 확인하는 것이다. As used herein, the term "diagnostic" means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. For the purposes of the present invention, the diagnosis is to determine whether the bruising rash occurs.

본 발명에 있어서 “프라이머”란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. In the present invention, a "primer" refers to a nucleic acid sequence having a short free hydroxyl group, which forms a base pair with a complementary template, and serves as a starting point for template strand copying. Primers of the invention can be chemically synthesized using methods known in the art, such as, for example, phosphoramidite solid support methods.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 멍게 물렁병 진단용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for diagnosing bruises disease comprising the composition.

상기 멍게 물렁병 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다. 본 발명의 키트는 본 발명의 프라이머 세트 중 하나 이상, DNA 중합 효소 및 PCR 완충용액(buffer)을 포함하는 멍게 물렁병 진단용 키트를 제공한다. PCR 완충용액에 포함되는 성분들은 하기에 개시하고 있는 것과 같이 공지된 성분을 이용할 수 있으며, 이외에 PCR산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.The kite diagnosis kit may further comprise one or more other component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods. The kit of the present invention provides a kit for diagnosing bruise disease comprising at least one of the primer sets of the present invention, a DNA polymerase and a PCR buffer. Components included in the PCR buffer solution may use known components as described below, and in addition to the components necessary for the electrophoresis to confirm the amplification of the PCR product may be additionally included in the kit of the present invention. have.

또한, 본 발명은 (a) 멍게 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6 으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8 로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 구성되는 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택되는 프라이머 세트를 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 산물을 분석하여 멍게 물렁병을 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 멍게 물렁병의 진단 방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (a) separating the DNA from the sea urchin sample; (b) a primer set composed of SEQ ID NOs: 1 and 2 as a template of the DNA isolated in step (a); Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8; And a primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10; amplifying DNA using a primer set selected from one or more selected from the group consisting of; And (c) analyzing the product amplified in the step (b) to diagnose the bruising rash.

상기 DNA는 멍게의 게놈 DNA 또는 cDNA일 수 있다. The DNA may be a genomic DNA or cDNA of the sea urchin.

상기 DNA의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction) 을 사용하는 것이 바람직하다. 일반적인 PCR 수행 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 구체적으로, PCR 반응은 당업계에서 PCR반응에 필요하다고 알려진 여러 성분을 포함하는 PCR 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR 반응액은 분석하고자 하는 멍게로부터 유래된 DNA, 본 발명의 마커, 적당량의 DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액(buffer) 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다.It is preferable to use a polymerase chain reaction (PCR) for amplification of the DNA. General PCR methods are well known in the art. Specifically, the PCR reaction may be performed using a PCR reaction solution containing various components known in the art for the PCR reaction. For example, the PCR reaction solution may include DNA derived from the sea urchin to be analyzed, a marker of the present invention, an appropriate amount of DNA polymerase (eg, Taq polymerase), a dNTP mixture, a PCR buffer, and water. do. The PCR buffer may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2.

본 발명에서 상기 증폭된 산물은 전기영동에 의해 확인하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 전기영동 시 사용하는 겔은 통상적으로 전기영동에서 사용할 수 있는 겔을 사용할 수 있고, 대표적인 예로 아가로스 겔 또는 폴리아크릴아미드 겔을 사용할 수 있다. 전기영동 후 실버 염색(silver staining)으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 전기영동 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
In the present invention, the amplified product is preferably confirmed by electrophoresis, but is not limited thereto. In the present invention, the gel used for electrophoresis can be a gel which can be used in electrophoresis. Agarose gel or polyacrylamide gel can be used as a representative example. Electrophoresis results can be analyzed by silver staining after electrophoresis. General electrophoretic analysis methods are well known in the art.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically based on examples. It will be apparent to those skilled in the art that the embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention.

실시예Example 1. 멍게  1. Sea urchin 물렁병의Runny 원인체인 편모충의 분리 Isolation of the cause chain flagella

멍게 물렁병의 원인체 (AsSTF, AsSTS(soft tunic syndrome in ascidian, Halocynthia roretzi )-associated flagellate)를 분리하기 위하여 정상 멍게 및 멍게 물렁병 감염 개체 또는 감염 의심개체를 준비한 후, 상기 멍게의 외피 (tunic)을 제거하였다 (도 1). 이를 멸균한 후 0.22um에 여과된 해수에 3-4회 세척하였다. 상기 과정을 통해 하나의 개체로부터 분리하고 세척한 멍게의 외피 (tunic)를 2x3cm의 크기를 자르고, 6 웰 배양 플레이트에 넣은 후, 멸균 후 0.22um에 여과된 해수를 500 μl /well로 넣었다. 15-30분 후, 웰 내의 suspension 용액을 피펫으로 모으고, 이를 300g에서 3 분간 원심분리하여 상층액만을 수득하였다. 상기에서 수득한 상등액으로부터 TRIzol®Reagent를 이용하여 total RNA 분리하였다 (도 2). 이 후 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit를 이용하여 분리된 total RNA로부터 cDNA 합성하였다 (도 3 내지 도 4).
After preparing the normal sea squirts, and sea squirt bottle softens infected object or suspicious object in order to remove the sea squirt woninche softens the bottle (AsSTF, AsSTS (soft tunic syndrome in ascidian, Halocynthia roretzi) -associated flagellate), the outer covering of the sea squirt (tunic) Was removed (FIG. 1). It was sterilized and washed 3-4 times in seawater filtered at 0.22um. The tunic of the sea urchin isolated and washed from one individual through the above procedure was cut to a size of 2 × 3 cm, placed in a 6-well culture plate, and sterilized and then filtered into 0.22 μm of 500 μl / well of seawater. After 15-30 minutes, the suspension solution in the wells was pipetted and centrifuged at 300 g for 3 minutes to obtain only supernatant. Total RNA was separated from the supernatant obtained above using TRIzol ® Reagent (FIG. 2). Thereafter, cDNA was synthesized from total RNA isolated using RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (FIGS. 3 to 4).

실시예Example 2. 멍게  2. Sea urchin 물렁병의Runny 원인체인 편모충의 동정 Identification of the cause chain flagella

실시예 1에서 분리한 멍게 물렁병의 원인체 (AsSTF)를 동정하기 위하여, pyrosequencing을 통해 유전자 서열을 확보한 후, metatranscriptome 으로부터, 한 개의 transcript을 이용한 동정이 아닌 여러 개의 transcript을 이용한 multimarker-based phylogenetic analysis를 수행하였다. 그 결과, 멍게 물렁증의 원인체 (Ascidian soft tunic syndrome-associated flagellate, AsSTF)는 Class level에서 kinetoplastida, Order level에서 Bodonidae, family level에서 Neobodo sp.에 가까운 종임을 확인하였다 (도 5).
In order to identify AsSTF, which is isolated from Example 1, after obtaining the gene sequence through pyrosequencing, from the metatranscriptome, multimarker-based phylogenetic analysis using several transcripts rather than one transcript Was performed. As a result, it was confirmed that Ascadian soft tunic syndrome-associated flagellate (AsSTF) is a species close to kinetoplastida at the class level, Bodonidae at the order level, and Neobodo sp. At the family level (FIG. 5).

실시예Example 3. 멍게  3. Sea urchin 물렁병의Runny 진단 Diagnosis

실시예 1에서 수득한 각 멍게의 cDNA를 주형 (template)으로 하여, 본 발명의 서열번호 1 내지 10의 프라이머를 이용하여, PCR을 수행하였다 (도 6 내지 도 7). 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6 으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8 로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 구성되는 프라이머 세트;는 각각 멍게 물렁병의 원인체인 편모충의 알파-튜불린, 베타-튜불린, 액틴, 엔도 또는 60S 리보좀 단백질 (Ribosomal protein) L7의 일부 서열을 가진다 (도 8 내지 도 12). PCR was performed using the primers of SEQ ID NOS: 1 to 10 of the present invention, using cDNA of each sea urchin obtained in Example 1 as a template (FIGS. 6 to 7). Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8; And a primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10; each has a partial sequence of alpha-tubulin, beta-tubulin, actin, endo or 60S Ribosomal protein L7 of flagella, the causative agent of bruises 8 to 12).

실험 결과, 도 13 내지 17에 나타낸 바와 같이, 정상 멍게 (증상으로 판단)의 조직/기관에서 분리한 cDNA에서는 어떠한 밴드도 나타나지 않았으나 (1. siphon muscle, 2. Tunic, 3. Muscle, 4. Intestine, 5. Gonad, 6. Pharyngeal basket), 멍게 물렁병 감염 개체 또는 감염 의심 개체에서 분리한 멍게 물렁병의 원인체인 편모충 (밴드 7)에서는 뚜렷한 밴드가 나타나, 본 발명의 프라이머가 멍게 물렁병의 진단 마커로 이용될 수 있음을 확인하였다. 음성대조군으로 증류수를 이용하였다 (con). 상기 실험 결과를 통하여, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 멍게 물렁병을 진단할 수 있음을 확인하였다.
As a result of the experiment, as shown in FIGS. 13 to 17, no band was found in the cDNA isolated from the tissue / organ of normal sea urchin (judged as symptom) (1. siphon muscle, 2. Tunic, 3. Muscle, 4. Intestine) , 5. Gonad, 6. Pharyngeal basket), flagellar larvae (Band 7), the causative agent of bruising ulcers isolated from infected or suspicious infections, and the primers of the present invention have been diagnosed. It was confirmed that it can be used as a marker. Distilled water was used as a negative control (con). Through the above experimental results, it was confirmed that the bruises can be diagnosed using the primer set of the present invention.

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims (5)

서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6 으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8 로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 구성되는 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트를 포함하는 멍게 물렁병 진단용 마커 조성물.
Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8; And a primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10;
삭제delete 제 1항의 조성물을 포함하는 멍게 물렁병 진단용 키트.
A kite for diagnosing bruises disease comprising the composition of claim 1.
(a) 멍게 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4 로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6 으로 구성되는 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8 로 구성되는 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 10으로 구성되는 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 1 이상 선택되는 프라이머 세트를 이용하여 DNA를 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 산물을 분석하여 멍게 물렁병을 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 멍게 물렁병의 진단 방법.
(a) isolating DNA from the sea urchin sample;
(b) a primer set composed of SEQ ID NOs: 1 and 2 as a template of the DNA isolated in step (a); Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 3 and 4; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6; Primer sets consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8; And a primer set consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10; amplifying DNA using a primer set selected from one or more selected from the group consisting of; And
(c) a method of diagnosing bruises, characterized in that the step of diagnosing the bruises by analyzing the product amplified in the step (b).
제 4항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 증폭 산물의 확인은 전기영동을 통해 확인하는 것을 특징으로 하는 멍게 물렁병의 진단 방법. 5. The method of claim 4,
Identification of the amplification product in the step (c) is a method of diagnosing bruises, characterized in that confirmed by electrophoresis.
KR1020120005701A 2012-01-18 2012-01-18 Marker and primer set for diagnosis of soft tunic syndrome KR101356106B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120005701A KR101356106B1 (en) 2012-01-18 2012-01-18 Marker and primer set for diagnosis of soft tunic syndrome

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120005701A KR101356106B1 (en) 2012-01-18 2012-01-18 Marker and primer set for diagnosis of soft tunic syndrome

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130084823A KR20130084823A (en) 2013-07-26
KR101356106B1 true KR101356106B1 (en) 2014-01-29

Family

ID=48995278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120005701A KR101356106B1 (en) 2012-01-18 2012-01-18 Marker and primer set for diagnosis of soft tunic syndrome

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101356106B1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017043406A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 Dic株式会社 Curing accelerator for oxidatively polymerizable unsaturated resin, printing ink and coating material

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100087496A (en) * 2009-01-28 2010-08-05 한국과학기술연구원 A novel bacterium kme-002 and use thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100087496A (en) * 2009-01-28 2010-08-05 한국과학기술연구원 A novel bacterium kme-002 and use thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Fish Diseases, Vol. 33, pp. 153-160 (2010) *
한국어병학회지, 제24권, 제3호, 제197-204면 (2011) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130084823A (en) 2013-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nissen et al. Genetic analysis of Trichuris suis and Trichuris trichiura recovered from humans and pigs in a sympatric setting in Uganda
Zhang et al. A greedy algorithm for aligning DNA sequences
Løvoll et al. Quantification of piscine reovirus (PRV) at different stages of Atlantic salmon Salmo salar production
KR101361730B1 (en) DNA Polymorphism Marker for Identification of Cucumis sativus L.
van Bleijswijk et al. Detection of grey seal Halichoerus grypus DNA in attack wounds on stranded harbour porpoises Phocoena phocoena
CN102719531B (en) Macrobrachium rosenbergii sex specific molecular marker, screening method and application
CN105861642A (en) Sturgeon sexuality difference molecular marker and application thereof
Duceppe et al. Analysis of survival and hatching transcriptomes from potato cyst nematodes, Globodera rostochiensis and G. pallida
Luis-Villaseñor et al. Probiotic modulation of the gut bacterial community of juvenile Litopenaeus vannamei challenged with Vibrio parahaemolyticus CAIM 170
Quinn et al. Lesion bacterial communities in American lobsters with diet-induced shell disease
Patarwut et al. Infections of digenetic trematode metacercariae in Wrestling Halfbeak, Dermogenys pusilla from Bangkok Metropolitan Region in Thailand
Prado-Alvarez et al. First detection of OsHV-1 in the cephalopod Octopus vulgaris. Is the octopus a dead-end for OsHV-1?
Velasco et al. Kudoa amazonica n. sp.(Myxozoa; Multivalvulida), a parasite of the esophageal musculature of the freshwater catfish, Hypophthalmus marginatus (Siluriformes: Pimelodidae), from a river of the Amazon region
Shen et al. Diversity, population structure, and evolution of local peach cultivars in China identified by simple sequence repeats
KR101356106B1 (en) Marker and primer set for diagnosis of soft tunic syndrome
Moore et al. Impact of poxvirus lesions on saltwater crocodile (Crocodylus porosus) skins
CN110551826B (en) Microsatellite primer, kit and identification method for identifying crocus tridacna, tridacna and first filial generation thereof
Carrasco et al. Perkinsus chesapeaki observed in a new host, the European common edible cockle Cerastoderma edule, in the Spanish Mediterranean coast
Rengifo-Herrera et al. Helminth parasites found in faecal samples of phocids from the Antarctic Peninsula
Jørgensen et al. Characterisation of a low pathogenic form of Gyrodactylus salaris from rainbow trout
Yokoyama et al. First record of Unicapsula seriolae (Myxozoa: Multivalvulida) from the muscle of Malabar grouper Epinephelus malabaricus in Japan
David et al. Molecular approaches to bivalve population studies: a review
Řehulka et al. Disseminated infection due to Exophiala pisciphila in Cardinal tetra, Paracheirodon axelrodi
Mattiucci et al. Anisakiasis
Cooper et al. A flatworm from the genus Waminoa (Acoela: Convolutidae) associated with bleached corals in Western Australia

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170111

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180112

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee