KR101355922B1 - Method for Transformation of Rice - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼의 신규한 형질전환 방법에 관한 것으로서, (a) 벼의 성숙 종자를 수득하는 단계; (b) 상기 성숙 종자를 발아시켜 미성숙배세포(Immature embryos, IEs)를 형성시키는 단계; (c) 형질전환하고자 하는 목적 유전자를 포함하는 벡터를 상기 미성숙배세포 내로 도입시키는 단계; 및 (d) 상기 세포로부터 형질전환 벼를 수득하는 단계로 구성된다. 본 발명의 방법에 따르면, 종래 식물체의 성체에서 캘러스를 유도하여 형질전환하는 방법이 아닌, 성숙 종자를 이용하여 세미성숙배세포를 유도하고, 이를 형질전환에 사용함으로써 새로운 품종의 개발 기간이 절반 이상 단축될 수 있다. 또한, 기존의 캘러스 유도 방법은 돌연변이 세포가 발생할 가능성이 높아 인간이 섭취할 수 있는 형질전환 식물체를 제조하는 것이 어려웠으나, 성숙 종자에서 발아된 미성숙배세포의 세포괴를 이용함으로써 인체에 보다 안전한 식물 성체를 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 벼의 품종 개량에 있어 신규한 형질전환방법으로서 이용할 수 있으며, 또한 우수 형질전환체를 단기간에 대량으로 생산할 수 있어 형질전환에 소요되는 기간, 비용 및 노력 등을 획기적으로 절감할 수 있다.The present invention relates to a novel method for transforming rice, comprising: (a) obtaining mature seeds of rice; (b) germinating the seed to form immature embryos (IEs); (c) introducing a vector containing the target gene to be transformed into the immature germ cells; And (d) obtaining a transformed rice from said cells. According to the method of the present invention, rather than the method of transforming by inducing callus in the adult body of the conventional plant, induction of semi-mature germ cells using mature seeds, and using it for transformation, the development period of new varieties is more than half Can be shortened. In addition, the conventional callus induction method is difficult to produce a transgenic plant that humans can ingest due to the high probability of mutant cells, but the plant is safer to human body by using the cell mass of immature germ cells germinated from mature seeds Can be obtained. Therefore, the method of the present invention can be used as a novel transformation method for improving rice varieties, and can also produce excellent transformants in a large amount in a short time, thereby drastically reducing the time, cost, and effort required for transformation. can do.

Description

벼의 형질전환 방법{Method for Transformation of Rice}Transformation method of rice {Method for Transformation of Rice}

본 발명은 벼의 신규한 형질전환 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel transformation method of rice.

벼는 아시아 지역 사람들의 주식으로 이용되는 매우 중요한 농작물로서 생명공학 기술의 발달과 더불어 유전자의 기능 연구나 유전자의 단자엽 식물에서의 작용을 구명하는 모델식물로 이용되는 등 그 중요성이 점차 커지고 있다. 세계적으로 널리 재배되고 있는 벼의 품종은 인디카 형(Indica type)과 자포니카 형(Japonica type)의 두 가지로 대별된다. 인디카 형 벼는 세계 인구 절반 이상의 주식으로서, 지속적으로 증가하는 인구의 수요를 충족시키기 위해서 생산량의 증가가 요구되고 있으며, 더욱이 도시의 높은 쌀 소비량 때문에 영양적 가치가 개선된 새로운 벼의 품종 개발이 요구되고 있다. Rice is a very important crop that is used as a staple food for people in Asia. It is becoming increasingly important as it is used as a model plant to study the function of genes and to investigate the action of monocots. Rice varieties that are widely grown around the world are divided into two types, the Indica type and the Japonica type. Indica-type rice is a staple food for more than half of the world's population, which requires increased production to meet the ever-increasing demand for populations. Moreover, the development of new rice varieties with improved nutritional value due to the high rice consumption of the city. It is becoming.

주곡작물에 있어서 제초제 저항성, 내재해성, 내병충성, 기능성 및 수량성이 향상된 신품종의 개발은 재배 안정성을 높이고 고부가가치의 농산물을 생산할 수 있으며 인류의 가장 큰 문제점으로 부각되고 있는 식량문제를 해결 할 수 있다는 측면에서 매우 중요하다. 신품종의 개발에 있어 형질전환 기술을 이용한 분자육종 방법은, 전통적인 육종 방법인 교배 육종법에 비해 우수한 품종의 유전형질을 그대로 유지하면서 유용 유전자를 직접 도입 가능하다는 점과 다양한 생물 종으로부터 유용 유전자를 확보하여 식물체에 전이할 수 있다는 장점이 있다. 국내에서도 벼, 콩, 배추, 담배, 고추, 토마토, 오이 및 들깨 등을 대상으로 유전자 변형 작물 개발연구가 활발히 이루어지고 있으나 현재까지 상업화된 작물은 없는 실정이다.The development of new varieties with improved herbicide resistance, hazard resistance, disease resistance, functionality and yield in main grain crops can improve cultivation stability, produce high value-added agricultural products, and solve the food problem that is one of the biggest problems of mankind. It is very important in that sense. Molecular breeding method using transformation technology in the development of new varieties, it is possible to directly introduce useful genes while maintaining the genotype of the superior breed compared to the breeding method, which is a traditional breeding method and to secure useful genes from various species It has the advantage of being able to metastasize to plants. In Korea, genetically modified crops are being researched on rice, soybeans, cabbages, tobacco, peppers, tomatoes, cucumbers and perillas, but there are no commercialized crops.

지금까지 개발된 벼 형질전환 방법으로는 원형질체를 이용하는 방법, 유전자총을 이용하는 방법 및 아그로박테리움을 이용하는 방법 등이 있다.The rice transformation methods developed so far include a method using a protoplast, a method using a gene gun, and a method using Agrobacterium.

원형질체에 DNA를 직접 형질전환하는 방법은 80년대 후반에 주로 사용되었으며 외래 DNA를 나출된 원형질체에 도입하기 위해 폴리에틸렌클리콜(PEG)법과 전기충격법(electroporation)을 이용하였다. 그러나 이들 방법은 원형질체에서 재분화 식물체를 분화시키는 과정이 복잡하고 시간이 오래 걸리며 숙련된 기술이 요구된다는 단점이 있다. 1990년대 이후부터는 유전자총을 이용하는 방법과 아그로박테리움을 이용하는 방법이 주로 사용되고 있다. 유전자총을 이용하는 방법은 원하는 유전자 (DNA)를 미세 텅스텐 입자나 금 입자에 코팅하여 헬리움(helium) 가스 압력에 의해 고속으로 목표세포의 핵 속에 전이하는 방법으로, 재분화가 가능한 세포나 조직에 직접 외래 DNA를 도입하는 것이 가능하여 품종 또는 계통에 따른 형질전환 효율의 차이와 관계없이 대부분의 세포에 형질전환이 가능하다는 장점이 있다. 그러나 식물 세포에 삽입되는 DNA 카피수가 많다는 점, 삽입되는 양상의 복잡하고 삽입 DNA가 절단된 형태로 전이되는 등의 문제점이 있다. 이러한 문제점으로 인해 최근에는 실용적인 벼 형질전환 방법으로 아그로박테리움을 이용하는 방법이 가장 널리 사용되고 있다.Directly transforming DNA into protoplasts was mainly used in the late 80's, using polyethylene glycol (PEG) and electroporation to introduce foreign DNA into protoplasts. However, these methods have the disadvantage that the process of differentiating redifferentiated plants from protoplasts is complicated, time consuming, and requires skill. Since the 1990s, methods using a gene gun and methods using Agrobacterium have been mainly used. The method of using a gene gun is to coat a desired gene (DNA) on fine tungsten or gold particles and transfer it to the nucleus of a target cell at high speed by the helium gas pressure. Since it is possible to introduce foreign DNA, there is an advantage in that most cells can be transformed irrespective of the difference in transformation efficiency according to the variety or lineage. However, there is a problem that the number of DNA copies inserted into the plant cell, the complex of the inserted aspect and the inserted DNA is transferred to the truncated form. Due to this problem, the method of using Agrobacterium is most widely used as a practical rice transformation method in recent years.

벼 역시 아그로박테리움을 이용한 유전자 도입을 통해 품종 개량이 연구되어 왔으며, 그 중 자포니카 벼는 형질전환이 비교적 용이하여 품종이 개량되어 왔다. 그러나 인디카 벼는 캘러스 유도가 매우 어려워 형질전환율이 매우 낮은 문제점이 있었다. 따라서 본 발명에서는 캘러스 유도가 매우 어려운 인디카 벼를 이용하여, 새로운 품종개발이 용이 하도록 기존의 방법보다 형질전환기간이 크게 단축된 벼의 신규한 형질전환방법을 제공하고자 한다.
Rice has also been studied to improve varieties through the introduction of genes using Agrobacterium. Among them, japonica rice has been transformed with relatively easy transformation. However, indica rice has a problem that the transformation rate is very low because callus induction is very difficult. Therefore, the present invention is to provide a novel transformation method of rice with a significantly shorter transformation period than the existing method to facilitate the development of new varieties using indica rice is very difficult to callus.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, so that the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.

본 발명자들은 벼의 새로운 형질전환 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 종래 식물체의 성체에서 캘러스를 유도하여 형질전환하는 방법이 아닌, 성숙 종자를 이용하여 미성숙배세포를 유도하고, 이를 형질전환에 사용하는 방법을 발명하였다. 식물 성체로부터의 캘러스 유도가 매우 어려운 경우, 미성숙배세포의 세포괴를 유도하여 형질전환시키는 방법을 사용하면 새로운 품종 개발의 기간이 절반이상 단축된다. 또한 기존의 캘러스 유도 방법은 돌연변이 세포가 발생할 가능성이 높아 인간이 섭취할 수 있는 형질전환 식물체를 제조하는 것이 어려웠으나, 성숙 종자에서 발아된 미성숙배세포의 세포괴를 이용함으로써 인체에 보다 안전한 식물 성체를 얻을 수 있고 이를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
The present inventors made diligent research efforts to develop a new transformation technique of rice. As a result, the present inventors invented a method of inducing immature germ cells using mature seeds, and using the same for transformation, rather than a method of inducing and transforming callus in adult plants. If callus induction from plant adults is very difficult, the method of inducing and transforming immature germ cells to reduce the time period for the development of new varieties is more than half. In addition, the existing callus induction method is difficult to produce a transgenic plant for human consumption due to the high probability of mutant cells, but by using a cell mass of immature germ cells germinated from mature seeds to produce a safer plant adult body The present invention has been completed by obtaining and confirming this.

따라서 본 발명의 목적은 벼의 신규한 형질전환 방법을 제공하는 데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a novel transformation method of rice.

본 발명의 다른 목적은 형질전환 된 벼를 제공하는 데 있다. Another object of the present invention is to provide a transformed rice.

본 발명의 또 다른 목적은 형질전환 된 벼의 종자를 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention to provide a seed of the transformed rice.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 벼의 형질전환 방법을 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method of transforming rice, comprising the following steps:

(a) 벼의 성숙 종자를 수득하는 단계; (a) obtaining mature seeds of rice;

(b) 상기 성숙 종자를 발아시켜 미성숙배세포(Immature embryos, IEs)를 형성시키는 단계; (b) germinating the seed to form immature embryos (IEs);

(c) 형질전환하고자 하는 목적 유전자를 포함하는 벡터를 상기 미성숙배세포 내로 도입시키는 단계; 및 (c) introducing a vector containing the target gene to be transformed into the immature germ cells; And

(d) 상기 세포로부터 형질전환 벼를 수득하는 단계.
(d) obtaining a transformed rice from said cells.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법으로 수득한 형질전환 된 벼를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a transformed rice obtained by the method of the present invention described above.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 방법으로 수득한 형질전환 된 벼의 종자를 제공한다.
According to another aspect of the present invention, the present invention provides a seed of the transformed rice obtained by the method of the present invention described above.

본 발명자들은 벼, 특히 인디카 벼의 새로운 형질전환 기술을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 종래 식물체의 성체에서 캘러스를 유도하여 형질전환하는 방법이 아닌, 성숙 종자를 이용하여 미성숙배세포를 유도하고, 이를 형질전환에 사용하는 방법을 발명하였다. 식물 성체로부터의 캘러스 유도가 매우 어려운 경우, 미성숙배세포의 세포괴를 유도하여 형질전환시키는 방법을 사용하면 새로운 품종 개발의 기간이 절반이상 단축된다. 또한 기존의 캘러스 유도 방법은 돌연변이 세포가 발생할 가능성이 높아 인간이 섭취할 수 있는 형질전환 식물체를 제조하는 것이 어려웠으나, 성숙 종자에서 발아된 분화 전단계의 미성숙배세포의 세포괴를 이용함으로써 인체에 보다 안전한 식물 성체를 얻을 수 있음을 확인하였다.
The present inventors earnestly researched to develop a new transformation technique of rice, especially indica rice. As a result, the present inventors invented a method of inducing immature germ cells using mature seeds, and using the same for transformation, rather than a method of inducing and transforming callus in adult plants. If callus induction from plant adults is very difficult, the method of inducing and transforming immature germ cells to reduce the time period for the development of new varieties is more than half. In addition, the existing callus induction method was difficult to produce a transgenic plant for human consumption due to the high probability of developing mutant cells, but it is safer to human body by using the cell mass of premature germ cells germinated from mature seeds. It was confirmed that plant adults could be obtained.

본 발명의 방법은 공지된 다양한 벼의 품종(cultivar)에 적용될 수 있으며, 예컨대 자포니카 품종, 인디카 품종 및 자바니카 품종에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 인디카 품종이다.The method of the present invention can be applied to various known varieties of rice (cultivar), such as japonica varieties, indica varieties and Javanica varieties, preferably indica varieties.

본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:The method of the present invention will be described in detail in each step as follows:

단계 (a): 벼의 성숙 종자를 수득하는 단계 Step (a): Obtaining Mature Seeds of Rice

본 발명의 형질전환방법은 우선 벼의 성숙 종자를 수득하는 단계를 포함한다.The transformation method of the present invention first comprises the step of obtaining mature seeds of rice.

본 발명의 성숙 종자는 가능하면 별도로 관리된 종자를 사용하는 것이 바람직하다. 예컨대, 벼 재배시의 비배관리가 적절하고 병충해의 피해를 받지 않았으며, 수확 후 탈곡 시에도 과도한 동력을 사용해 종자가 손상을 입지 않은 것을 선별해 사용토록 한다. 가급적 당해 연도에 수확한 것을 사용하고 부득이 오래된 종자를 사용하게 될 때에는 냉장고에 보관하여 종자의 활력을 유지토록 하는 것이 바람직하다. It is preferred that the mature seeds of the present invention, if possible, use separately administered seeds. For example, cultivation of rice during cultivation is appropriate, undamaged by pests, and even when harvested after threshing, excessive power is used to select and use the seed without damage. Whenever possible, it is desirable to use the harvested in the year and to keep the vitality of the seed by storing it in the refrigerator when using inevitable seeds.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 벼의 종자에서 종피를 제거한 후, 에탄올로 소독한다. 에탄올 소독 후, 소듐하이포클로라이트로 세척하는 과정을 추가적으로 더 포함할 수 있다.
According to a preferred embodiment of the present invention, the seed of rice is removed and then sterilized with ethanol. After ethanol sterilization, the method may further include washing with sodium hypochlorite.

단계 (b): 상기 성숙 종자를 발아시켜 미성숙배세포(Immature embryos, IEs)를 형성시키는 단계 Step (b): the step of forming the seed to germinate the mature immature germ cell (Immature embryos, IEs)

이어, 단계 (a)에서 수득한 성숙 종자에서 미성숙배세포를 발아시킨다. 미성숙배세포란 식물 분화 전 단계의 세포를 말한다. Subsequently, immature germ cells are germinated from the mature seeds obtained in step (a). Immature embryonic cells refer to cells prior to plant differentiation.

종자의 발아는 적합한 배지를 이용하여 적합한 암/광조건 하에서 실시될 수 있으며, 상기 종자는, 바람직하게는, 2N6 배지에서 1-3일간 배양하여 미성숙배세포의 발아를 유도한다.
Seed germination can be carried out under suitable cancer / light conditions using a suitable medium, which is preferably incubated for 1-3 days in 2N6 medium to induce germination of immature germ cells.

단계 (c): 형질전환 하고자 하는 목적 유전자를 포함하는 벡터를 상기 미성숙배세포 내로 도입시키는 단계 Step (c): introducing a vector containing the target gene to be transformed into the immature germ cells

상기 미성숙배세포의 형성 후, 형질전환 하고자 하는 목적 유전자를 포함한 벡터를 세포 내로 도입시킨다. After formation of the immature germ cells, the vector containing the target gene to be transformed is introduced into the cell.

상기 목적 유전자는 식물체에 도입될 수 있는 다양한 유전자를 포함하며, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 목적 유전자는 톡소플라빈 분해효소 유전자(tflA)이다. 톡소플라빈은 쌀 생산량 감소를 가져오는 벼 알마름병의 원인으로 알려진 물질로서, 이에 대해 저항성을 가진 작물의 제작을 위해 연구되어 왔고, 최근 톡소플라빈 분해 효소(tflA)를 형질전환 형질전환 선발 마커로 활용 가능하다는 것이 작물기능 유전체연구사업단의 연구 결과물로 보고되었다.The target gene includes various genes that can be introduced into a plant. According to a preferred embodiment of the present invention, the target gene is a toxoflavin degrading enzyme gene ( tflA ). Toxoflavin is a substance known to cause rice blight which causes a decrease in rice production, and has been studied for the production of crops resistant to it, and recently a transgenic selection marker for transducing toxoflavin degrading enzyme ( tflA ) It is reported as a result of research of the crop functional genome research project group.

본 발명에서 이용되는 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있다. 본 발명에 적합한 벡터는 (i) 식물에서 작동하는 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 구조 유전자; 및 (iii) 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다. 또한, 본 발명에서 이용되는 벡터는 선택 표지로서 항생제(예: 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신 및 하이그로마이신), 내성 유전자(예: 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 (npt Ⅱ), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제 (hpt))및 톡소플라빈 분해효소 유전자(tflA)를 포함할 수 있다.
The vector system used in the present invention can be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are described in Sambrook et al. Molecular Cloning , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Suitable vectors for the present invention include (i) a promoter that operates on a plant; (ii) a structural gene operably linked to said promoter; And (iii) polyadenylation signal sequences. The vector may additionally carry genes encoding reporter molecules such as luciferase and β-glucuronidase. In addition, the vectors used in the present invention are antibiotics (e.g. neomycin, carbenicillin, kanamycin, spectinomycin and hygromycin) as selection markers, resistance genes (e.g. neomycin phosphotransferase ( npt II )). and it may include the hygromycin phospho transferase dehydratase (hpt)), and Toxoplasma flavin lyase gene (tflA).

본 발명의 방법에 있어서, 미성숙배세포의 형질전환은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 이는 전기천공 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982) 및 Saul, M. et al., Plant Molecular Biology Manual, Vol. A1, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988)), 입자총 방법 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990) 및 Christou, P., Trends Plant Sci. 1:423-431(1996)) 및 아그로박테리움-매개 형질전환 (미합중국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호)을 포함하며, 바람직하게는, 상기 형질전환 방법은 아그로박테리움-매개 형질전환 방법이다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 형질전환 과정은 아그로박테리움의 배양물을 미성숙배세포에 떨어뜨려 공동배양하는 과정을 포함한다. 이에 의해 아그로박테리움은 식물내로 감염된다.In the method of the present invention, the transformation of immature germ cells can be carried out according to a conventional method known in the art, which is electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J. , 1: 841 (1982) ) And Saul, M. et al., Plant Molecular Biology Manual , Vol. A1, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988), particle gun method (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci . , 87: 9568-9572 (1990) and Christou, P., Trends Plant Sci. 1: 423-431 (1996)) and Agrobacterium-mediated transformation (US Pat. Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011), preferably, the transformation method is an Agrobacterium-mediated transformation method . According to a specific embodiment of the present invention, the transformation process includes dropping the culture of Agrobacterium into immature germ cells and co-culturing. Thereby, Agrobacterium is infected into the plant.

상기 형질전환은 적합한 배지에서 실시될 수 있으며, 바람직하게는 상기 형질전환은 KNO3, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O, FeSO4.7H2O, Na2EDTA, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, KI, CuSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O, CoCl2.6H2O, 비타민, 카사미노산, 아미노산, 당류, 사이토키닌, 옥신, 아가로스 및 아세토시린곤을 포함하는 배지에서 실시된다.The transformation may be carried out in a suitable medium, preferably the transformation is KNO 3 , MgSO 4 .7H 2 O, (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , CaCl 2 .2H 2 O, FeSO 4 .7H 2 O, Na 2 EDTA, MnSO 4 .4H 2 O, ZnSO 4 .7H 2 O, H 3 BO 3, KI, CuSO 4 .5H 2 O, Na 2 MoO 4 .2H 2 O, CoCl 2 .6H 2 O, medium containing vitamins, casamino acids, amino acids, sugars, between the non-talkie, auxin, agarose and acetonitrile ache Gon Is carried out.

본 발명의 배지에 첨가되는 비타민은 당업계에 공지된 다양한 비타민을 포함하며, 바람직하게는, 레티놀, 티아민, 리보플라빈, 니코틴산, 카르니틴, 판토텐산, 피리독신, 비오틴, 이노시톨, 엽산, 코발라민, 아스코르빈산, 칼시페롤, 토코페롤 및 메나디온으로 구성된 군으로부터 선택된 1 또는 2 이상의 비타민을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 비타민은 티아민, 피리독신, 니코틴산 및 이노시톨이다.Vitamins added to the medium of the present invention include various vitamins known in the art, preferably, retinol, thiamine, riboflavin, nicotinic acid, carnitine, pantothenic acid, pyridoxine, biotin, inositol, folic acid, cobalamin, ascorbic acid, At least one vitamin selected from the group consisting of calciferol, tocopherol and menadione. According to a preferred embodiment of the present invention the vitamin is thiamine, pyridoxine, nicotinic acid and inositol.

본 발명의 배지에 첨가되는 아미노산은 당업계에 공지된 다양한 아미노산을 포함하며, 바람직하게는, 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 리신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 셀레노시스테인, 발린, 트립토판 및 티로신으로 구성된 군으로부터 선택된 1 또는 2 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 아미노산은 L-프롤린이다.The amino acids added to the medium of the present invention include various amino acids known in the art, and preferably, alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, One or more amino acids selected from the group consisting of proline, glutamine, arginine, serine, threonine, selenocysteine, valine, tryptophan and tyrosine. According to a preferred embodiment of the invention said amino acid is L-proline.

본 발명의 배지에 첨가되는 당류는 당업계에 공지된 다양한 단당류와 복당류를 포함하며, 바람직하게는, 오탄당(리불로소, 자일룰로스, 리보오스, 아라비노스, 자일로스, 긱소스 및 데옥시리보스), 육탄당(프시코스, 소르보스, 타가토스, 글루코스, 갈락토스, 만니톨, 푸코스, 푸쿨로스, 람노스, 프럭토스, 만노스, 굴로스, 이도스, 탈로스, 알로스, 알트로스 및 탄로스), 이당류(수크로스, 락토오스, 말토오스, 트레할로스, 투라노스 및 셀로비오스), 삼당류(라피노스, 멜레지토스 및 말토트리오스), 사당류(아카보스 및 스타치오스), 올리고당(프럭토올리고사카라이드, 갈락토올리고사카라이드 및 만노올리고사카라이드) 및 다당류(글루칸, 글리코젠, 아밀로스, 아가로스, 아밀로펙틴, 셀룰로스, 덱스트린, 베타글루칸, 말토덱스트린, 프럭탄, 이눌린, 마난 및 갈락탄)로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2이상을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 당류는 글루코스 및 수크로스이다.The sugars added to the medium of the present invention include various monosaccharides and polysaccharides known in the art, and preferably, pentose (ribuloso, xylulose, ribose, arabinose, xylose, gixose and deoxyribose) ), Hexose (Psicose, sorbose, tagatose, glucose, galactose, mannitol, fucose, fuculose, rhamnose, fructose, mannose, gulose, idose, talos, allose, altrose and tanrose) ), Disaccharides (sucrose, lactose, maltose, trehalose, turanose and cellobiose), trisaccharides (rapinose, melezitose and maltotriose), tetrasaccharides (acavoc and starchose), oligosaccharides (fructooligosaka) Lysates, galactooligosaccharides and mannooligosaccharides) and polysaccharides (glucan, glycogen, amylose, agarose, amylopectin, cellulose, dextrin, betaglucan, maltodextrin, fructan, inulin, manan and Galactan) and 1 or 2 or more selected from the group consisting of. According to a preferred embodiment of the present invention the sugars are glucose and sucrose.

본 발명의 배지에 첨가되는 사이토키닌은 식물의 생장 조절 물질 중 하나로서, 세포 분열 촉진, 노화 억제, 휴면 타파, 엽록체 발달 촉진 등에 관여한다. 본 발명에서 배지 조성물로 첨가되는 사이토키닌은 당업계에 공지된 다양한 사이토키닌을 포함하며, 바람직하게는, 키네틴, 6-벤질 아미노 퓨린(6-BA), 지아틴 및 아이소펜테닐 아데닌(2-ip)으로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2이상의 사이토키닌을 포함한다.Cytokine added to the medium of the present invention is one of plant growth regulators, and is involved in promoting cell division, inhibiting aging, dormant breakthrough, and promoting chloroplast development. The cytokinin added to the medium composition in the present invention includes various cytokinins known in the art, and preferably, kinetin, 6-benzyl amino purine (6-BA), giatin and isopentenyl adenine ( 2-ip) one or more cytokinin selected from the group consisting of.

본 발명의 배지에 첨가되는 옥신은 식물의 생장 조절 물질 중 하나로서 성장, 발근을 촉진하고, 낙과를 방지하며, 착과를 조절한다. 본 발명에서 배지 조성물로 첨가되는 옥신은 당업계에 공지된 다양한 옥신을 포함하며, 바람직하게는 2,4-디클로로 페녹시 아세트산(2,4-D), 2,4,5-트리클로로 페녹시 아세트산, 나프탈렌 아세트산(NAA), 인돌아세트산(IAA), 인돌부틸산(IBA) 4-아미노-3,5,6-트리클로로 피콜린산(TCP)으로 구성된 군에서 선택된 1 또는 2이상의 옥신을 포함한다.
Auxin added to the medium of the present invention is one of the plant growth regulators to promote growth, rooting, prevent falling fruit, and control fruiting. Auxins added to the media composition in the present invention include various auxins known in the art, preferably 2,4-dichloro phenoxy acetic acid (2,4-D), 2,4,5-trichloro phenoxy One or more auxins selected from the group consisting of acetic acid, naphthalene acetic acid (NAA), indole acetic acid (IAA), indolebutyl acid (IBA) 4-amino-3,5,6-trichloro picolinic acid (TCP) do.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (c)의 형질전환은 상기 미성숙배세포를 상기 적합한 배지가 포함된 페트리디쉬에 치상한 후, 아그로박테리움을 적하하여 접종을 실시할 수 있다. 형질전환은 바람직하게는 암조건에서 이루어진다. 아그로박테리움의 접종 후, 바람직하게는 종자를 세포탁심으로 세척하여 아그로박테리움을 제거한다.
According to a specific embodiment of the present invention, the transformation of step (c) may be inoculated by dropping Agrobacterium after the immature germ cells are implanted in Petri dishes containing the suitable medium. Transformation is preferably carried out in dark conditions. After inoculation of Agrobacterium, the seed is preferably washed with Cytoxim to remove Agrobacterium.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c) 이후에 목적 유전자가 도입된 미성숙배세포를 배양하여 세포괴(Cell mass)를 형성하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 아그로박테리움으로 접종시킨 미성숙배세포를 페트리디쉬에 치상하여 명조건에서 배양한다. 상기 미성숙 배세포의 세포괴를 형성하는 단계를 거치는 경우, 식물체로 발달하는 확률이 증가할 수 있다. According to a preferred embodiment of the present invention, the method of the present invention may further comprise the step of forming a cell mass by culturing immature germ cells into which the target gene has been introduced after step (c). Preferably, the immature germ cells inoculated with Agrobacterium are cultured in bright condition by being placed in Petri dishes. In the case of forming the cell mass of the immature germ cells, the probability of developing into a plant may increase.

본 명세서의 용어 “세포괴”란, 미성숙배세포의 집합으로서 식물체 분화전 단계의 세포들이 치밀하게 모여 형성된 세포 집단을 말한다.As used herein, the term “cell mass” refers to a cell population in which immature germ cells are formed by densely gathering cells at the stage of plant differentiation.

상기 세포괴 형성은 적합한 배지에서 실시될 수 있으며, 바람직하게는, KNO3, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O, FeSO4.7H2O, Na2EDTA, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, KI, CuSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O, CoCl2.6H2O, 비타민, 카사미노산, 아미노산, 당류, 젤란검, 사이토키닌, 옥신, 세포탁심 및 카르베니실린이 포함된 배지에서 실시한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 아미노산은 L-프롤린 및 L-글루타민이고, 상기 당류는 D-만니톨 및 D-Maltose이며, 상기 비타민은 티아민, 피리독신, 니코틴산 및 이노시톨이고, 상기 옥신 및 사이토키닌은 2,4-D, NAA 및 BA이다.
The cell formation may be carried out in a suitable medium, preferably KNO 3 , MgSO 4 .7H 2 O, (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , CaCl 2 .2H 2 O, FeSO 4 .7H 2 O, Na 2 EDTA, MnSO 4 .4H 2 O, ZnSO 4 .7H 2 O, H 3 BO 3, KI, CuSO 4 .5H the cylinder 2 O, Na 2 MoO 4 .2H 2 O, CoCl 2 .6H 2 O, vitamins, casamino acids, amino acids, sugars, gellan gum, between the non-talkie, auxin, cell Taksim and carboxylic Benny It is carried out in the medium included. According to a preferred embodiment of the invention, the amino acids are L-proline and L-glutamine, the saccharides are D-mannitol and D-Maltose, the vitamins are thiamine, pyridoxine, nicotinic acid and inositol, and the auxins and cytokines Nin is 2,4-D, NAA and BA.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c) 이후에 목적 유전자가 도입된 미성숙배세포를 선별하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 형질전환시킨 미성숙배세포를 톡소플라빈 함유 배지에서 증식시키면 식물 발현 벡터가 도입된 식물 세포는 톡소플라빈 분해 효소(tflA)가 발현되어 배지 중의 톡소플라빈을 분해하므로, 톡소플라빈 함유배지에서 생존할 수 있다. 그러나, 식물 발현 벡터가 형질전환되지 않은 식물 세포는 톡소플라빈 분해 효소가 발현되지 않아 배지 중의 톡소플라빈을 분해하지 못하므로, 톡소플라빈 함유 배지에서 생존할 수 없게 된다.According to another preferred embodiment of the present invention, the method of the present invention may further comprise the step of selecting the immature germ cells into which the gene of interest has been introduced after step (c). When the transformed immature germ cells are propagated in a toxoflavin- containing medium, the plant cells into which the plant expression vector is introduced are expressed by toxoflavin degrading enzyme ( tflA ) to degrade toxoflavin in the medium. Can survive. However, plant cells that are not transformed with plant expression vectors do not express toxoflavin degrading enzymes and thus do not degrade toxoflavin in the medium, and thus cannot survive in the toxoflavin-containing medium.

본 발명의 방법에 따른 형질전환된 식물세포의 선별은 형질전환 배양물을 선택제 (예: 대사 억제제, 항생제, 제초제 또는 톡소플라빈)에 노출시켜 실시될 수 있다. 형질전환되고 선택제 분해효소 유전자를 안정되게 포함하고 있는 식물 세포는 상기한 배양물에서 성장하고 분할한다. 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 선별은 톡소플라빈을 이용하여 실시한다.The selection of transformed plant cells according to the method of the invention can be carried out by exposing the transformed culture to a selection agent (eg metabolic inhibitors, antibiotics, herbicides or toxoflavin). Plant cells that are transformed and stably contain the selective degrading enzyme genes grow and divide in the cultures described above. According to a preferred embodiment of the invention said screening is carried out using toxoflavin.

상기 형질전환된 식물세포의 선별은 바람직하게는, KNO3, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O, FeSO4.7H2O, Na2EDTA, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, KI, CuSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O, CoCl2.6H2O, 비타민, 카사미노산, 아미노산, 당류, 젤란검, 사이토키닌, 옥신, 세포탁심, 카르베니실린, 톡소플라빈이 포함된 배지에서 실시한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 아미노산은 L-프롤린 및 L-글루타민이고, 상기 당류는 D-만니톨 및 D-말토오스이며, 상기 비타민은 티아민, 피리독신, 니코틴산 및 이노시톨이고, 상기 옥신 및 사이토키닌은 2,4-D, NAA 및 BA이다.
Selection of the transformed plant cells is preferably KNO 3 , MgSO 4 .7H 2 O, (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , CaCl 2 .2H 2 O, FeSO 4 .7H 2 O, Na 2 EDTA, MnSO 4 .4H 2 O, ZnSO 4 .7H 2 O, H 3 BO 3, KI, CuSO 4 .5H 2 O, Na 2 MoO 4 .2H 2 O, CoCl 2 .6H 2 O, vitamins, casamino acids, amino acids, sugars, gellan gum, between the non-talkie, auxin, cell Taksim, published carboxylic Benny, It is carried out in a medium containing toxoflavin. According to a preferred embodiment of the invention, the amino acids are L-proline and L-glutamine, the saccharides are D-mannitol and D-maltose, the vitamins are thiamine, pyridoxine, nicotinic acid and inositol, and the auxins and cytokines Nin is 2,4-D, NAA and BA.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c) 이후에 목적 유전자가 도입된 미성숙배세포를 재분화 시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 아그로박테리움에 의해 형질전환된 미성숙배세포는 재분화 배지에서 재분화되며, 이는 신초의 재분화를 성공적으로 야기한다. 최종적으로, 발근 배지에서 재분화된 신초의 발근에 의해 형질전환 식물이 생산된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 형질전환 된 미성숙배세포 중 초록색 부위가 보이도록 증식된 것을 선별하여 재분화 배지에 옮긴다. According to another preferred embodiment of the present invention, the method of the present invention may further comprise the step of re-differentiating immature germ cells into which the gene of interest has been introduced after step (c). Immature germ cells transformed with Agrobacterium re-differentiate in regeneration medium, which successfully causes shoot differentiation. Finally, transgenic plants are produced by roots of regenerated shoots in the rooting medium. According to a preferred embodiment of the present invention, the transformed immature germ cells are selected to proliferate so that the green area is visible and transferred to the regeneration medium.

미성숙배세포의 분화에는 당업계에 알려진 다양한 식물체의 재분화 방법을 사용할 수 있다(Bhojwani, S.S. et al., Plant Tissue Culture : Theory and Practice, Elsevier Science, New York, (1983); 및 Lindsey, K., Ed., Plant Tissue Culture Manual, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, (1991)). 형성된 형질전환 발근 신초는 적합한 식물 성장 배지에 치상된다. 아그로박테리움에 의해 도입된 외래 유전자를 포함하는 식물체의 발달 또는 재분화는 당업계에 공지된 방법에 따라 달성될 수 있다 (미국 특허 제 5,004,863, 5,349,124 및 5,416,011 호). Differentiation of immature germ cells can be carried out using various methods of regeneration of plants known in the art (Bhojwani, SS et al., Plant Tissue Culture : Theory and Practice , Elsevier Science, New York, (1983); And Lindsey, K., Ed., Plant Tissue Culture Manual , Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, (1991)). The transformed root shoots formed are imbedded in a suitable plant growth medium. Development or regeneration of plants comprising foreign genes introduced by Agrobacterium can be accomplished according to methods known in the art (US Pat. Nos. 5,004,863, 5,349,124 and 5,416,011).

상기 미성숙배세포의 분화는, 바람직하게는, KNO3, NH4NO3, MgSO4.7H2O, MnSO4.4H20, ZnSO4.7H2O, CuSo4.5H2O, Cacl2.2H2, KI, CoCl2.6H2O, KH2PO4, H3BO3, Na2MoO4.2H2O, Na2EDTA, FeSO4.7H2O, 비타민, 아미노산, 당류, 젤란검, 사이토키닌, 옥신, 세포탁심 및 톡소플라빈이 포함된 배지에서 실시된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 비타민은 니코틴산, 피리독신, 티아민, 이노시톨이고, 상기 아미노산은 글리신이며, 상기 당류는 소르비톨, 수크로스 및 말토오스이고, 상기 옥신 및 사이토키닌은 키네틴, NAA 및 BA이다.
Differentiation of the immature germ cells, preferably, KNO 3 , NH 4 NO 3 , MgSO 4 .7H 2 O, MnSO 4 .4H 2 0, ZnSO 4 .7H 2 O, CuSo 4 .5H 2 O, Cacl 2 .2H 2, KI, CoCl 2 .6H 2 O, KH 2 PO 4 , H 3 BO 3 , Na 2 is carried MoO 4 .2H 2 O, Na 2 EDTA, FeSO 4 .7H 2 O, vitamins, amino acids, sugars, gellan gum, between the non-talkie, auxin, Taksim cells and in the medium containing Toxoplasma Plastic bin. According to a preferred embodiment of the invention, the vitamin is nicotinic acid, pyridoxine, thiamin, inositol, the amino acid is glycine, the saccharide is sorbitol, sucrose and maltose, the auxin and cytokinin are kinetin, NAA and BA to be.

단계 (d): 상기 세포로부터 형질전환 벼를 수득하는 단계 Step (d): obtaining a transformed rice from the cells

상기 방법에 따라 목적 유전자가 도입된 미성숙배세포를 적절한 배지에서 배양한 경우, 미성숙배세포 또는 그의 세포괴로부터 벼의 소식물체(Plantlet)가 출현한다. 본 발명에 따라 형질전환된 벼는 당업계에 공지된 방법에 의해 형질전환 여부가 확인된다. 예를 들어, 형질전환된 식물의 조직으로부터 얻은 DNA 시료를 이용하여, PCR을 실시하면 형질전환 식물의 지놈에 삽입된 외래 유전자가 규명될 수 있다. 택일적으로, 노던 또는 서던 블럿을 실시하여 형질전환 여부를 확인할 수 있다 (Maniatis et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)).
When immature embryonic cells into which a target gene has been introduced are cultured in a suitable medium according to the above method, rice plantlets appear from immature embryonic cells or cell masses thereof. Rice transformed according to the present invention is confirmed whether or not transformed by a method known in the art. For example, PCR using DNA samples from tissues of transformed plants can identify foreign genes inserted into the genome of the transgenic plant. Alternatively, Northern or Southern blot can be performed to confirm transformation (Maniatis et al., Molecular Cloning , A Laboratory). Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)).

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:

(a) 본 발명은 벼의 신규한 형질전환 기술에 관한 것으로써, 종래 식물체의 성체에서 캘러스를 유도하여 형질전환하는 방법이 아닌, 성숙 종자를 이용하여 세미성숙배세포를 유도하고, 이를 형질전환에 사용하였다. (a) The present invention relates to a novel transformation technology of rice, which is not a method of transforming by inducing callus in adult plants, but inducing semi-mature germ cells using mature seeds and transforming the same. Used for.

(b) 식물 성체로부터의 캘러스 유도는 시간이 많이 소요되는 바, 미성숙배세포의 세포괴를 유도하여 형질전환 시키는 방법을 사용하면 새로운 품종의 개발 기간이 절반 이상 단축될 수 있다. (b) Callus induction from adult plants is time consuming. Using a method of inducing and transforming immature germ cells, the development time of new varieties can be shortened by more than half.

(c) 또한, 기존의 캘러스 유도 방법은 돌연변이 세포가 발생할 가능성이 높아 인간이 섭취할 수 있는 형질전환 식물체를 제조하는 것이 어려웠으나, 성숙 종자에서 발아된 미성숙배세포의 세포괴를 이용함으로써 인체에 보다 안전한 식물 성체를 얻을 수 있다.(c) In addition, the conventional callus induction method is difficult to produce a transgenic plant for human consumption due to the high probability of mutant cells, but by using the cell mass of immature germ cells germinated from mature seeds, Safe plant adulthood can be obtained.

(d) 따라서 본 발명의 방법은 벼의 품종 개량에 있어 신규한 형질전환방법으로서 이용할 수 있으며, 또한 우수 형질전환체를 단기간에 대량으로 생산할 수 있어 형질전환에 소요되는 기간, 비용 및 노력 등을 획기적으로 절감할 수 있다.
(d) Therefore, the method of the present invention can be used as a novel transformation method for improving rice varieties, and can produce a large amount of excellent transformants in a short period of time, thus reducing the time, cost and effort required for transformation. You can save significantly.

도 1은 인디카 벼의 형질전환과정을 나타낸 것이다.
도 2는 형질전환된 인디카 벼 소식물체에서 얻은 DNA로 PCR을 수행하고 전기영동 한 결과이다.
도 3은 톡소플라빈이 함유된 배지에서 선발된 인디카 벼 형질전환체(IR64)의 잎 절편으로부터 게놈 DNA를 분리하여 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 4은 형질전환된 인디카 벼 소식물체에서 얻은 DNA로 서던블럿을 수행한 결과이다. Figure 1 shows the transformation process of indica rice.
Figure 2 shows the results of electrophoresis and PCR with DNA obtained from the transformed indica rice news material.
Figure 3 is a result confirmed by electrophoresis by separating genomic DNA from the leaf section of the indica rice transformant (IR64) selected in the medium containing toxoflavin.
4 is a result of performing Southern blotting with DNA obtained from the transformed indica rice news material.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

실험 방법Experimental Method

tflA 유전자 발현 벡터 및 인디카 벼
tflA 유전자를 발현하는 식물 발현 벡터는 pTflA 벡터(Serry Koh et al., Plant Biotechnology Journal, 9:348-358(2011))를 이용하였다. pTflA 벡터의 제조과정은 다음과 같다. pCAMBIA1304 벡터(CAMBIA GPO Box3200)에 XhoⅠ제한효소 처리하여 하이그로마이신 저항성 유전자를 제거한 후, 인디카 벼의 톡소플라빈 유전자(tflA) 서열을 기반으로 인디카 벼의 cDNA로부터 PCR 합성하여 서열을 확인한 후 이를 CaMV 35S 프로모터에 정방향으로 결합시켜 제조하였다. 인디카 벼의 톡소플라빈 유전자(tflA)의 cDNA 증폭에 사용된 프라이머는 다음과 같다:
정방향 프라이머: 5’-atgacttcgattaaacagctt-3’ tflA gene expression vector and indica rice
As a plant expression vector expressing the tflA gene, a pTflA vector (Serry Koh et al., Plant Biotechnology Journal, 9: 348-358 (2011)) was used. The manufacturing process of the pTflA vector is as follows. The pCAMBIA1304 vector (CAMBIA GPO Box3200) was treated with XhoI restriction enzyme to remove the hygromycin resistance gene, followed by PCR synthesis from cDNA of indica rice based on the toxoflavin gene ( tflA ) sequence of indica rice, followed by CaMV. It was prepared by binding to the 35S promoter in the forward direction. The primers used for cDNA amplification of the toxoflavin gene ( tflA ) of indica rice were as follows:
Forward primer: 5'-atgacttcgattaaacagctt-3 '

역방향 프라이머: 5’-acaggtgaactggtgatctaa-3’

이 때, tflA를 코딩하는 유전자인 tflA는 XhoⅠ 제한효소부위를 이용하여 결합하였는데, 제한효소부위를 도입하는 방법은 다음의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 방법에 의해 수행하였다. 먼저, CaMV35S 프로모터와 CaMV35S 폴리A 사이에 발현되도록 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 말단 부위에 인위적으로 5' 말단과 3' 말단의 XhoⅠ제한효소부위를 첨가하였다. 제조된 프라이머로 PCR을 수행하여 클로닝에 이용될 벡터에 도입될 수 있게 tflA 유전자를 증폭시켰다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 45초의 순서로 30회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 10분간 반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다. 상기와 같이 제조된 pTflA 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA10(Agrobacterium tumefaciens EHA105)로 도입하고 인디카 벼의 형질전환에 사용하였다. Reverse primer: 5'-acaggtgaactggtgatctaa-3 '

At this time, tflA , a gene encoding tflA, was bound using the XhoI restriction enzyme site, and the restriction enzyme site was introduced by the following polymerase chain reaction (PCR) method. First, 5 'and 3' terminal XhoI restriction enzyme sites were artificially added to the terminal sites of the forward and reverse primers so as to be expressed between the CaMV35S promoter and the CaMV35S polyA. PCR was performed with the prepared primers to amplify the tflA gene so that it could be introduced into the vector to be used for cloning. At this time, PCR was denatured at 94 ° C. for 5 minutes as a precycling reaction, and then repeated 30 times in the order of 30 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 60 ° C., and 45 seconds at 72 ° C., and then The PCR reaction was terminated by reacting at 72 ° C for 10 minutes. The pTflA vector prepared as above was introduced into Agrobacterium tumefaciens EHA105 and used for transformation of indica rice.

인디카 벼(Indica rice)는 국제 벼 연구소 (International Rice Research Institute, IRRI)에서 인디카 육종의 모본으로 사용되는 RI64를 이용하였다.
Indica rice used RI64, which is used as a model for indica breeding at the International Rice Research Institute (IRRI).

인디카 벼의 형질전환Transformation of Indica Rice

1. 인디카 벼 종자의 살균 및 발아1. Sterilization and Germination of Indica Rice Seeds

인디카 벼 성숙 종자의 종피를 벗겨 제거한 뒤, 70% 에탄올로 1분간 세척하였다. 이어 상기 종자를 멸균수로 세척하고, Tween-20 을 첨가한 1% 소듐하이포클로라이트로 20분간 세척하였다. 세척 후, 다시 인디카 벼 종자를 멸균수로 5회 이상 세척하였다.The seedlings of the indica rice mature seeds were peeled off and washed with 70% ethanol for 1 minute. The seeds were then washed with sterile water and 20 minutes with 1% sodium hypochlorite added with Tween-20. After washing, the indica rice seeds were washed five more times with sterile water.

이어, 살균된 인디카 벼 성숙 종자를 하기 2N6 배지에 인디카 벼 종자를 치상하여 24시간 배양하여 미성숙배세포(Immature embryos, IEs)를 형성시켰다. 2N6 배지의 조성은 하기 표 1과 같다.Subsequently, the sterilized indica rice mature seeds were incubated for 24 hours by seeding the indica rice seeds in the following 2N6 medium to form immature embryos (IEs). The composition of 2N6 medium is shown in Table 1 below.

2N6 배지의 조성Composition of 2N6 Medium 성분ingredient 최종농도Final concentration 수크로스Sucrose 30 g/L30 g / L 카사미노산Cassamino 300 ㎎/L300 mg / L 프롤린Proline 2.878 ㎎/L2.878 mg / L CHU(sigma c1416)CHU (sigma c1416) 3.981 g/L3.981 g / L N6-비타민 N6-vitamin 1 ㎖/L1 ml / l 2,4-D (2 ㎎/㎖)2,4-D (2 mg / ml) 1 ㎖/L1 ml / l pH : 5.8pH: 5.8 젤란검Gellan gum 2 g/L2 g / L

2. 2. 미성숙배세포의Immature germ cells 아그로박테리움에 의한 접종 Inoculation with Agrobacterium

pTflA 벡터를 포함하는 아그로박테리움을 카나마이신이 첨가된 AB 고상 배지에 스트리킹(Streaking)하여 28℃에서 3일간 배양하였다. Agrobacterium containing the pTflA vector was streaked in AB solid medium to which kanamycin was added and incubated at 28 ° C. for 3 days.

AB 배지의 조성Composition of AB Medium 성분ingredient 최종농도Final concentration 소듐클로라이드Sodium chloride 15 g/L15 g / L 트립톤Tryptone 10 g/L10 g / L 효모추출물Yeast extract 5 g/L5 g / L 아가Baby 15 g/L15 g / L 멸균Sterile 카나마이신Kanamycin 1 ㎖/L1 ml / l

스트리킹은 단일 콜로니를 얻는 방법을 사용하지 않고 세포가 균일하게 자라도록 하는 방법을 사용하였다.      Streaking used a method that allowed cells to grow uniformly without using a single colony.

한편, 형질전환하기 3 시간 전, 층류 후드(Laminar flow hood)에서 페트리디쉬를 열어 표 8 내지 표9의 A201 배지를 3시간동안 건조시켰다.Meanwhile, 3 hours before transformation, Petri dishes were opened in a laminar flow hood to dry the A201 medium of Tables 8 to 9 for 3 hours.

형질전환하기 1 시간 전, 멸균된 루프(Loop)를 이용하여 상기 AB 배지의 아그로박테리움을 채취하였다. 채취한 아그로박테리움을 A200 배지에 현탁시켜, 최종 농도가 3 x 109 cfu/㎖, 흡광도(OD680) 0.3이 되도록 하였다. 현탁시킨 상기 아그로박테리움을 암조건, 25℃에서 1시간동안 배양하였고, 이 때 배양액을 흔들지 않았다. A200 배지의 조성은 하기 표 3 내지 표 7과 같다.One hour before transformation, the Agrobacterium of the AB medium was harvested using a sterile loop. The collected Agrobacterium was suspended in A200 medium, so that the final concentration was 3 × 10 9 cfu / ml and the absorbance (OD 680 ) 0.3. The suspended Agrobacterium was incubated for 1 hour at 25 ° C. under dark conditions, and the culture was not shaken. The composition of the A200 medium is shown in Tables 3 to 7.

상기 건조시킨 A201 배지에, 상기 종자의 미성숙배세포(Immature embryos, IEs)를 배반 부위가 위쪽을 향하도록 올리고, 건조시켰다. 이 때, 한 페트리디쉬 당 약 50개의 미성숙배세포를 치상하였다. 미성숙배세포에 상기 현탁시킨 아그로박테리움 5 μL를 적하하고 건조시킨 후 암조건, 25℃에서 3일 동안 배양하여 형질전환 과정을 실시하였다.In the dried A201 medium, the immature embryos (IEs) of the seed were raised so that the blastocyst sited upwards and dried. At this time, about 50 immature germ cells were healed per petri dish. 5 μL of the suspended Agrobacterium was added dropwise to immature embryonic cells, dried, and cultured at 25 ° C. for 3 days to carry out a transformation process.

A200 배지의 조성Composition of A200 Badge 성분ingredient 최종 농도Final concentration AA salts Macro 10XAA salts Macro 10X 1X1X AA salts Macro 1000XAA salts Macro 1000X 1X1X AA Iron 100XAA Iron 100X 1X1X L- 글루타민L-Glutamine 876 mg/L876 mg / L 아스파트산Aspartic acid 266 mg/L266 mg / L 아르기닌Arginine 174 mg/L174 mg / L 글리신 1000X 용액Glycine 1000X Solution 7.5 mg/L7.5 mg / L B5 비타민B5 vitamin 1X1X 카사미노산Cassamino 500 mg/L500 mg / L 수크로스Sucrose 20 g/L20 g / L D+-글루코스-모노하이드레이트D + -glucose-monohydrate 10 g/L10 g / L PH 5.2　PH 5.2 아세토시린곤(2M)Acetosyringone (2M) 0.1 mM0.1 mM

AA macro salt 10X 스톡의 조성 Composition of AA macro salt 10X stock 성분ingredient 10배 농도10 times concentration CaCl2,2H2OCaCl 2 , 2H 2 O 1499.6 mg/L1499.6 mg / L MgSO4,7H2OMgSO 4 , 7H 2 O 2489 mg/L2489 mg / L NaH2PO4,2H2ONaH 2 PO 4 , 2H 2 O 1700 mg/L1700 mg / L KClKCl 29.5 g/L29.5 g / L

AA macro salt 1000X 스톡의 조성Composition of AA macro salt 1000X stock 성분ingredient 1000배 농도1000 times concentration CoCl2,6H2OCoCl 2 , 6H 2 O 25 mg/L25 mg / L CuSO4,5H2OCuSO 4 , 5H 2 O 25 mg/L25 mg / L H3BO3 H 3 BO 3 3000 mg/L3000 mg / L KIKI 750 mg/L750 mg / L MnSO4,H2OMnSO 4 , H 2 O 10000 mg/L10000 mg / L Na2MoO4,2H2ONa 2 MoO 4 , 2H 2 O 250 mg/L250 mg / L

AA IRON 100X 스톡의 조성Composition of AA IRON 100X Stock 성분ingredient 100배 농도100 times concentration FeNaEDTAFeNaEDTA 3670 mg/L3670 mg / L

글리신 1000X 스톡의 조성Composition of Glycine 1000X Stock 성분ingredient 1000배 농도1000 times concentration 글리신Glycine 7500 mg/L7500 mg / L

A201 배지의 조성Composition of A201 Medium 성분ingredient 최종농도Final concentration 배지 1 L당 첨가량Amount added per 1 L of medium 단위unit N6 major-1N6 major-1 　 2020 ㎖Ml N6 major-2N6 major-2 　 1010 ㎖Ml N6 major-3N6 major-3 　 1010 ㎖Ml N6 major-4N6 major-4 　 1010 ㎖Ml B5 minor-1B5 minor-1 　 1010 ㎖Ml B5 minor-2B5 minor-2 　 1010 ㎖Ml B5 minor-3B5 minor-3 　 1010 ㎖Ml B5 minor-4B5 minor-4 　 1010 ㎖Ml B5 비타민B5 vitamin 　 55 ㎖Ml 카사미노산Cassamino 500 mg/L500 mg / L 0.50.5 gg L-프롤린L-proline 500 mg/L500 mg / L 0.50.5 gg 수크로스Sucrose 20 g/L20 g / L 2020 gg 글루코스Glucose 10 g/L10 g / L 1010 gg PH 5.2PH 5.2 아가로오스 타입 IAgarose Type I 5.5 g/L5.5 g / L 5.55.5 gg 　멸균 15분Sterilization 15 minutes 2,4-D(1mg/㎖)2,4-D (1 mg / ml) 2 mg/L2 mg / L 22 ㎖Ml NAA(1mg/㎖)NAA (1 mg / ml) 1 mg/L1 mg / L 1One ㎖Ml BA(1mg/㎖)BA (1 mg / ml) 1 mg/L1 mg / L 1One ㎖Ml 0.1M 아세토시린곤0.1M acetosyringone 0.1 mM/L0.1 mM / L 1One ㎖Ml

A201 배지, A202 배지 및 A203 배지 내 용액의 조성Composition of the solution in A201 medium, A202 medium and A203 medium 용액명Solution name 성분ingredient 최종농도Final concentration N6 major-1N6 major-1 KNO3 KNO 3 141.5 g/L141.5 g / L N6 major-2N6 major-2 MgSO4.7H2OMgSO 4 .7H 2 O 18.5 g/L18.5 g / L (NH4)2SO4 (NH 4) 2 SO 4 46.5 g/L46.5 g / L N6 major-3N6 major-3 KH2PO4 KH 2 PO 4 40 g/L40 g / L N6 major-4N6 major-4 CaCl2.2H2OCaCl 2 .2H 2 O 16.6 g/L16.6 g / L B5 minor-1B5 minor-1 FeSO4.7H2OFeSO 4 .7H 2 O 2.78 g/L2.78 g / L Na2EDTANa 2 EDTA 3.73 g/L3.73 g / L B5 minor-2B5 minor-2 MnSO4.4H2OMnSO 4 .4H 2 O 1 g/L1 g / L ZnSO4.7H2OZnSO 4 .7H 2 O 0.2 g/L0.2 g / L H3BO3 H 3 BO 3 0.3 g/L0.3 g / L B5 minor-3B5 minor-3 KIKI 0.075 g/L0.075 g / L B5 minor-4B5 minor-4 CuSO4.5H2OCuSO 4 .5H 2 O 0.0025 g/L0.0025 g / L Na2MoO4.2H2ONa 2 MoO 4 .2H 2 O 0.025g/L0.025 g / L CoCl2.6H2OCoCl 2 .6H 2 O 0.0025g/L0.0025 g / L B5 비타민B5 vitamin 티아민Thiamine 200 mg/100 ㎖200 mg / 100 ml 피리독신Pyridoxine 20 mg/100 ㎖20 mg / 100 ml 니코틴산Nicotinic acid 20 mg/100 ㎖20 mg / 100 ml i-이노시톨i-inositol 2000 mg/100 ㎖2000 mg / 100 ml

3. 선별3. Screening

상기 접종과정 후, 인디카 벼의 종자에서 자라난 발아 부위(shoot)를 메스를 이용하여 제거한 뒤, 종자를 세포탁심(LPS solution, Korea)으로 3회 세척하여 아그로박테리움을 제거하였다. A202 배지가 포함된 페트리디쉬에 배반부위가 위쪽을 향하도록 종자를 옮겨, 명조건, 30℃에서 7일 동안 배양하였다. 이 때, 한 페트리디쉬 당 약 16개의 미성숙배세포를 치상하였다. A202 배지의 조성은 하기 표 10와 같다.After the inoculation process, the shoots grown in the seed of Indica rice were removed using a scalpel, and the seeds were washed three times with Celltaxim (LPS solution, Korea) to remove Agrobacterium. Seeds were transferred to a Petri dish containing A202 medium so that the blastocyst was upward and incubated at 30 ° C. for 7 days. At this time, about 16 immature germ cells were healed per petri dish. The composition of the A202 medium is shown in Table 10 below.

A202 배지에서 배양 후, 세포괴(cell mass)와 종자를 분리하여 세포괴 부분만 새로운 A202 배지에 치상하고 7일간 더 배양하였다. 식물체로 발달할 확률을 더 높이기 위해 A202 배지에서 세포괴를 추가배양하는 과정을 거칠 수도 있다. After culturing in A202 medium, the cell mass and seeds were separated, and only the cell mass part was wound on fresh A202 medium and incubated for 7 days. Cell culture may be further cultured in A202 medium to increase the likelihood of plant development.

A202 배지의 조성Composition of A202 Medium 성분ingredient 최종농도Final concentration 배지 1 L당 첨가량Amount added per 1 L of medium 단위unit N6 major-1N6 major-1 　 2020 ㎖Ml N6 major-2N6 major-2 　 1010 ㎖Ml N6 major-3N6 major-3 　 1010 ㎖Ml N6 major-4N6 major-4 　 1010 ㎖Ml B5 minor-1B5 minor-1 　 1010 ㎖Ml B5 minor-2B5 minor-2 　 1010 ㎖Ml B5 minor-3B5 minor-3 　 1010 ㎖Ml B5 minor-4B5 minor-4 　 1010 ㎖Ml B5 비타민B5 vitamin 　 55 ㎖Ml 카사미노산Cassamino 500 mg/L500 mg / L 0.50.5 gg L-프롤린L-proline 500 mg/L500 mg / L 0.50.5 gg L-글루타민L-glutamine 300 mg/L300 mg / L 0.30.3 gg D-만니톨D-mannitol 36 g/L36 g / L 3636 gg D-말토오스 (2%)D-maltose (2%) 20 g/L20 g / L 2020 gg 　PH 5.8PH 5.8 젤란검Gellan gum 5 g/L5 g / L 55 gg 멸균 15분Sterilization 15 minutes 2,4-D(1 mg/㎖)2,4-D (1 mg / ml) 1 mg/L1 mg / L 1One ㎖Ml NAA(1 mg/㎖)NAA (1 mg / ml) 1 mg/L1 mg / L 1One ㎖Ml BA(1 mg/㎖)BA (1 mg / ml) 0.2 mg/L0.2 mg / L 0.20.2 ㎖Ml 세포탁심
(100 mg/㎖)Cell taksim
(100 mg / ml) 250 mg/L250 mg / L 2.5
/12.5
/One ㎖Ml 카르베니실린
(100 mg/㎖)Carbenicillin
(100 mg / ml) 100 mg/L100 mg / L 1One ㎖Ml

상기 A202 배지에서의 배양 후, 5일이 더 경과한 뒤 세포괴를 A203 배지(톡소플라빈 10 mg/L)로 옮겨 10일 동안 배양하여 pTflA 벡터에 의해 형질전환된 세포괴를 선별되도록 하였으며, 이 때 한 페트리디쉬 당 약 8-10개의 세포괴를 치상하였다. A203 배지의 조성은 하기 표 11과 같다.After incubation in the A202 medium, after 5 more days, the cell mass was transferred to A203 medium (10 mg / L toxoflavin) and cultured for 10 days to select the cell mass transformed by the pTflA vector. About 8-10 cell masses were healed per petri dish. The composition of the A203 medium is shown in Table 11 below.

A203 배지의 조성Composition of A203 Badge 성분ingredient 최종농도Final concentration 배지 1 L당 첨가량Amount added per 1 L of medium 단위unit N6 major-1N6 major-1 　 2020 ㎖Ml N6 major-2N6 major-2 　 1010 ㎖Ml N6 major-3N6 major-3 　 1010 ㎖Ml N6 major-4N6 major-4 　 1010 ㎖Ml B5 minor-1B5 minor-1 　 1010 ㎖Ml B5 minor-2B5 minor-2 　 1010 ㎖Ml B5 minor-3B5 minor-3 　 1010 ㎖Ml B5 minor-4B5 minor-4 　 1010 ㎖Ml B5 비타민B5 vitamin 　 55 ㎖Ml 카사미노산Cassamino 500 mg/L500 mg / L 0.50.5 gg L-프롤린L-proline 500 mg/L500 mg / L 0.50.5 gg L-글루타민L-glutamine 300 mg/L300 mg / L 0.30.3 gg D-만니톨D-mannitol 36 g/L36 g / L 3636 gg D-말토오스 (2%)*D-maltose (2%) * 20 g/L20 g / L 2020 gg 　PH 5.8PH 5.8 젤라이트/젤란검Zelite / Gellan Gum 5 g/L5 g / L 55 gg 멸균 15분Sterilization 15 minutes 2,4-D(1 mg/㎖)2,4-D (1 mg / ml) 1 mg/L1 mg / L 1One ㎖Ml NAA(1 mg/㎖)NAA (1 mg / ml) 1 mg/L1 mg / L 1One ㎖Ml BA(1 mg/㎖)BA (1 mg / ml) 0.2 mg/L0.2 mg / L 0.20.2 ㎖Ml 세포탁심
(100 mg/㎖)Cell taksim
(100 mg / ml) 250 mg/L250 mg / L 2.5
/12.5
/One ㎖Ml 카르베니실린
(100 mg/㎖)Carbenicillin
(100 mg / ml) 100 mg/L100 mg / L 1One ㎖Ml 톡소플라빈
(10 mg/㎖)Toxoflavin
(10 mg / ml) 10 mg/L10 mg / L 1One ㎖Ml

5. 형질전환된 인디카 벼의 재분화(5. Regeneration of transformed indica rice RegenerationRegeneration ))

전재분화(Pre-regeneration) 배지인 A204 배지(톡소플라빈 10 mg/L)에 형질전환된 세포괴를 옮겨 10-14일 동안 배양하였으며, 한 페트리디쉬 당 약 6-8개의 미숙배세포 세포괴를 치상하였다. 배양한 세포괴 중 초록색 부위가 보이도록 증식된 것을 선별하여 재분화(Regeneration) 배지인 A205 배지로 옮겨 10-14일 동안 배양하였으며, 이 때 한 페트리디쉬 당 4개의 세포괴를 치상하였다. 상기 배양 후, 각각의 세포괴 라인(Line)을 동정하였다. A204 배지 및 A205 배지의 조성은 하기 표 12 내지 표 14과 같다.The transformed cell mass was transferred to A204 medium (10 mg / L of toxoflavin) for 10-14 days and pre-regeneration medium was cultured for 10-14 days. It was. Among the cultured cell masses, the proliferated green areas were selected and transferred to A205 medium, which is a regeneration medium, and cultured for 10-14 days, at which time 4 cell masses per petri dish were healed. After the incubation, each cell mass line was identified. The composition of A204 medium and A205 medium is shown in Tables 12 to 14 below.

A204 배지의 조성Composition of A204 Medium 성분ingredient 최종농도Final concentration 배지 1 L당 첨가량Amount added per 1 L of medium 단위unit MS1MS1 　 2020 ㎖Ml MS2MS2 　 1010 ㎖Ml MS3MS3 　 1010 ㎖Ml MS4MS4 　 1010 ㎖Ml Fe-EDTAFe-EDTA 　 1010 ㎖Ml MS 비타민MS vitamin 　 55 ㎖Ml 말토오스maltose 30 g/L30 g / L 3030 gg 소르비톨Sorbitol 20 g/L20 g / L 2020 gg 　PH　5.8PH 5.8 아가로스 타입 IAgarose Type I 10 g/L10 g / L 1010 gg 멸균 15분Sterilization 15 minutes 키네틴(1 mg/㎖)Kinetine (1 mg / ml) 2 mg/L2 mg / L 22 ㎖Ml NAA(1 mg/㎖)NAA (1 mg / ml) 0.5 mg/L0.5 mg / L 0.50.5 ㎖Ml BA(1 mg/㎖)BA (1 mg / ml) 0.2 mg/L0.2 mg / L 0.20.2 ㎖Ml 세포탁심
(100 mg/㎖)Cell taksim
(100 mg / ml) 250 mg/L250 mg / L 2.5
/12.5
/One ㎖Ml 톡소플라빈
(10 mg/㎖)Toxoflavin
(10 mg / ml) 10 mg/L10 mg / L 1One ㎖Ml

A204 배지, A205 배지 및 MSO 배지 내 용액의 조성Composition of the solution in A204 medium, A205 medium and MSO medium 용액명Solution name 성분ingredient 최종농도Final concentration MS1MS1 KNO3 KNO 3 95 g/L95 g / L NH4NO3 NH 4 NO 3 82.5 g/L82.5 g / L MS2MS2 MgSO4.7H2OMgSO 4 .7H 2 O 37 g/L37 g / L MnSO4.4H20MnSO 4 .4 H 2 0 2.23 g/L2.23 g / L ZnSO4.7H2OZnSO 4 .7H 2 O 0.86 g/L0.86 g / L CuSo4.5H2OCuSo 4 .5H 2 O 0.0025 g/L0.0025 g / L MS3MS3 Cacl2.2H2 Cacl 2 .2H 2 44 g/L44 g / L KIKI 0.083 g/L0.083 g / L CoCl2.6H2OCoCl 2 .6H 2 O 0.0025 g/L0.0025 g / L MS4MS4 KH2PO4 KH 2 PO 4 17 g/L17 g / L H3BO3 H 3 BO 3 0.62 g/L0.62 g / L Na2MoO4.2H2ONa 2 MoO 4 .2H 2 O 0.025 g/L0.025 g / L Fe-EDTAFe-EDTA Na2EDTANa 2 EDTA 3.725 g/L3.725 g / L FeSO4.7H2OFeSO 4 .7H 2 O 2.785 g/L2.785 g / L MS 비타민MS vitamin Nicotinic acidNicotinic acid 10 mg/100㎖10 mg / 100 ml Pyridoxine HClPyridoxine HCl 10 mg/100㎖10 mg / 100 ml Thiamine HClThiamine HCl 2 mg/100㎖2 mg / 100ml GlycineGlycine 40 mg/100㎖40 mg / 100ml Myo-inositolMyo-inositol 2000 mg/100㎖2000 mg / 100ml

A205 배지의 조성Composition of A205 Medium 성분ingredient 최종농도Final concentration 배지 1 L당 첨가량Amount added per 1 L of medium 단위unit MS1MS1 　 2020 ㎖Ml MS2MS2 　 1010 ㎖Ml MS3MS3 　 1010 ㎖Ml MS4MS4 　 1010 ㎖Ml Fe-EDTAFe-EDTA 　 1010 ㎖Ml MS 비타민MS vitamin 　 55 ㎖Ml 수크로스Sucrose 30 g/L30 g / L 3030 gg 젤란검Gellan gum 3 g/L3 g / L 33 gg 　PH 5.8PH 5.8 멸균 15분　Sterilization 15 minutes 키네틴(1 mg/㎖)Kinetine (1 mg / ml) 2 mg/L2 mg / L 22 ㎖Ml NAA(1 mg/㎖)NAA (1 mg / ml) 1 mg/L1 mg / L 1One ㎖Ml BA(1 mg/㎖)BA (1 mg / ml) 0.2 mg/L0.2 mg / L 0.20.2 ㎖Ml 세포탁심
(100 mg/㎖)Cell taksim
(100 mg / ml) 250 mg/L250 mg / L 2.5
/12.5
/One ㎖Ml 톡소플라빈
(10 mg/㎖)Toxoflavin
(10 mg / ml) 10 mg/L10 mg / L 1One ㎖Ml

6. 6. 발근Rooting ( ( RootingRooting ))

A205 배지에서 배양 후, 재분화되지 않은 세포괴 라인은 새로운 A205 배지로 옮겨 14일간 더 배양하였고, 재분화된 인디카 벼의 소식물체(Plantlet)는 MSO 배지가 포함된 튜브로 옮겨 10-14일간 배양하였다.) 한 튜브 당 하나의 소식물체를 담고, 한 세포괴 라인 당 3개의 소식물체를 채취하여 각각 A, B 및 C로 라벨링 하였다. 추후 시험을 위해 A205 배지의 페트리디쉬를 보관하였다. MSO 배지의 조성은 하기 표 15와 같다.After incubation in A205 medium, undifferentiated cell mass lines were transferred to fresh A205 medium and incubated for another 14 days, and the plantlets of redifferentiated indica rice were transferred to tubes containing MSO medium and incubated for 10-14 days.) One newsletter per tube was taken and three newsletters per cell line were taken and labeled A, B and C, respectively. Petri dishes in A205 medium were stored for later testing. The composition of the MSO medium is shown in Table 15 below.

상기 인디카 벼 소식물체(A, B, C)를 토양이 포함된 화분으로 옮겨 온실에서 배양하였다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR) 및 서던블럿을 위하여, 인디카 벼 소식물체 개체별로 잎을 채취하고 샘플번호를 기재하였다. The indica rice news material (A, B, C) was transferred to a pot containing soil and cultured in a greenhouse. For polymerase chain reaction (PCR) and Southern blotting, leaves were collected for each Indica rice news subject and sample number was given.

MSO 배지의 조성Composition of MSO Medium 성분ingredient 최종농도Final concentration 배지 1 L당 첨가량Amount added per 1 L of medium 단위unit MS1MS1 　 2020 ㎖Ml MS2MS2 　 1010 ㎖Ml MS3MS3 　 1010 ㎖Ml MS4MS4 　 1010 ㎖Ml Fe-EDTAFe-EDTA 　 1010 ㎖Ml MS 비타민MS vitamin 　 55 ㎖Ml 수크로스Sucrose 30 g/L30 g / L 3030 gg 　PH 5.8PH 5.8 젤란검Gellan gum 2 g/L2 g / L 22 gg 멸균 15분Sterilization 15 minutes

6. 6. 중합효소연쇄반응Polymerase chain reaction ( ( PolymerasePolymerase chainchain reactionreaction ))

형질전환 후 tflA 유전자가 식물 내로 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 구체적으로, 톡소플라빈이 함유된 배지에서 선발된 인디카 벼 형질전환체(IR64)의 잎 절편으로부터 게놈 DNA를 분리한 후, 정방향 프라이머 5'-GCGGCTTTGGTGAATTGCTAACGGAA-3'와 역방향 프라이머 5'-AGTTCACCTGTCTCTGTAATCGCC-3'를 PCR 반응에 이용하였다. 이때, PCR은 전반응(precycling reaction)으로 94℃에서 5분간 변성시킨 다음, 94℃에서 30초, 60℃에서 40초 및 72℃에서 30초의 순서로 35회 반응을 반복한 후, 마지막 반응에서 72℃에서 10분간 반응시킴으로서 PCR 반응을 종료시켰다. 도 2는 톡소플라빈 형질전환 인디카 벼 식물체의 PCR 분석 결과를 나타내는 그림이다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환 인디카 벼 식물체에서는 약 500bp의 PCR 산물을 관찰할 수 있었다.
In order to check whether the tflA gene was introduced into the plant after transformation, a polymerase chain reaction was performed. Specifically, genomic DNA was isolated from leaf fragments of indica rice transformant (IR64) selected from medium containing toxoflavin, and then the forward primer 5'-GCGGCTTTGGTGAATTGCTAACGGAA-3 'and the reverse primer 5'-AGTTCACCTGTCTCTGTAATCGCC-3' Was used for the PCR reaction. At this time, PCR was denatured at 94 ° C. for 5 minutes as a precycling reaction, and then repeated 35 times in the order of 30 seconds at 94 ° C., 40 seconds at 60 ° C., and 30 seconds at 72 ° C., and then The PCR reaction was terminated by reacting at 72 ° C for 10 minutes. Figure 2 is a diagram showing the results of PCR analysis of toxoflavin transformed indica rice plant. As can be seen in Figure 2, the transformed indica rice plant was able to observe a PCR product of about 500bp.

6. 형질전환검증 - 서던블럿(6. Transformation verification-Southern blot ( SouthernSouthern blotblot ))

상기 인디카 벼의 형질전환 후 tflA 유전자가 식물 내로 도입되었는지 여부를 확인하기 위하여, 서던 블럿 분석을 수행하였다. 구체적으로는, 톡소플라빈이 함유된 배지에서 선발된 인디카 벼 형질전환체(IR64)의 잎 절편으로부터 게놈 DNA를 분리하여 전기영동으로 확인하였다(도 3). 그 다음 DNA를 EcoRI 으로 절단하여 절단 산물을 아가로스 겔 전기영동을 수행하고, 통상적인 서던 블럿 분석 절차에 따라 서던블럿 분석을 수행하였다.In order to confirm whether the tflA gene was introduced into the plant after transformation of the indica rice, Southern blot analysis was performed. Specifically, genomic DNA was isolated from leaf fragments of indica rice transformant (IR64) selected from a medium containing toxoflavin and confirmed by electrophoresis (FIG. 3). DNA was then cleaved with EcoRI to perform agarose gel electrophoresis on the cleavage product, followed by Southern blot analysis according to conventional Southern blot analysis procedures.

서던 블럿 분석을 위한 tflA 프로브(probe) 서열은 다음과 같으며, 각 프로브는 마크로젠(Macrogen)에 의뢰하여 제작하였다. 정방향 프로브 서열은 5'-GCGGCTTTGGTGAATTGCTAACGGAA-3'이며 역방향 프로브 서열은 5'-AGTTCACCTGTCTCTGTAATCGCC-3'이다. The tflA probe sequence for Southern blot analysis was as follows, and each probe was prepared by Macrogen. The forward probe sequence is 5'-GCGGCTTTGGTGAATTGCTAACGGAA-3 'and the reverse probe sequence is 5'-AGTTCACCTGTCTCTGTAATCGCC-3'.

도 4은 형질전환된 인디카 벼 식물체의 서던 블럿 분석 결과이다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 형질전환 인디카 벼 식물체에서 양성 밴드를 확인할 수 있었다. 상기 결과로써, 외래 유전자(tflA)가 인디카 벼 식물체로 도입되었음을 알 수 있었다.
Figure 4 shows the results of Southern blot analysis of transformed indica rice plants. As can be seen in Figure 4, the positive band was confirmed in the transgenic indica rice plant. As a result, it was found that the foreign gene ( tflA ) was introduced into the indica rice plant.

상기 실시예의 단계를 더 반복하였으며, 그 결과는 표 16에 나타내었다. 표 16는 각 단계별 생존한 인디카 벼 종자의 개수를 나타낸 것이다. The steps of the above example were repeated further, and the results are shown in Table 16. Table 16 shows the number of surviving indica rice seeds in each stage.

각 단계별 생존한 종자의 개수 (배지 내 톡소플라빈 농도 : 10 ㎎/L)Number of surviving seeds at each stage (Toxoflavin concentration in medium: 10 mg / L) 반복시험회수Repeat test count 접종inoculation 휴면dormancy 선별Selection 전 재분화Pre-differentiation 재분화subdivision 발근Rooting PCR -
양성 개수PCR-
Positive count 1th 1 th 200200 200200 2222 4545 1616 88 88 2th 2 th 200200 200200 2323 3th 3 th 200200 200200 8181 145145 9494 3030 3030 4th 4 th 200200 200200 6464 5th 5 th 200200 5353 4949 1414 77 66 22 종자생존율 (%)Seed survival rate (%) 100100 85.385.3 23.923.9 20.420.4 11.711.7 4.44.4 4.04.0

본 발명에 의한 형질전환 방법을 사용하였을 때, 최종 형질전환율은 4.0%를 나타내었다. 이는 캘러스 유도가 어려워 형질전환율이 매우 저조한 인디카 벼에서 괄목할 만한 수치이다.
When the transformation method according to the present invention was used, the final transformation rate was 4.0%. This is remarkable in indica rice, where callus induction is difficult and the transformation rate is very low.

인디카 벼와 자포니카 벼의 형질전환 기간 비교Comparison of Transformation Period between Indica and Japonica Rice

1. 인디카 벼의 형질전환1. Transformation of Indica Rice

종래 캘러스 유도를 이용한 형질전환기간과 본 발명의 형질전환기간을 비교하기 위하여 인디카 벼와 자포니카 벼를 이용한 형질전환시험을 수행하였다. In order to compare the transformation period using conventional callus induction with the transformation period of the present invention, a transformation test using indica rice and japonica rice was performed.

인디카 벼의 형질전환방법은 상기 실시예에 기재된 방법을 사용하였으며, 형질전환기간은 총 8-9주가 소요되었다. 보다 상세하게는, 인디카 벼의 형질전환단계는 세포괴 유도단계(3일), 접종단계(3일), 휴면단계(7일), 선별단계(7일), 전재분화단계(14일), 재분화단계(14일) 및 발근단계(7일)로 이루어진다.
Indica rice was transformed using the method described in Example, and the transformation period was 8-9 weeks in total. More specifically, the transformation step of the indica rice is a cell mass induction step (3 days), inoculation step (3 days), dormant step (7 days), screening step (7 days), pre-differentiation step (14 days), re-differentiation Step (14 days) and rooting step (7 days).

2. 자포니카 벼의 형질전환2. Transformation of Japonica Rice

자포니카 벼의 형질전환방법은 종래 캘러스 유도 방법을 이용하였으며, 형질전환기간은 총 17-18주가 소요되었다. 보다 상세하게는, 자포니카 벼의 형질전환단계는 캘러스 유도단계(4주), 접종단계(3일), 1차 선별단계(1주), 2차 선별단계(3주), 1차 재분화단계(3주), 2차 재분화단계(4주) 및 3차 재분화단계(2주)로 이루어진다.Japonica rice was transformed using a conventional callus induction method, and the transformation period was 17-18 weeks in total. More specifically, the transformation step of japonica rice is callus induction step (4 weeks), inoculation step (3 days), primary screening step (1 week), secondary screening step (3 weeks), primary regeneration step ( 3 weeks), 2nd regeneration stage (4 weeks) and 3rd regeneration stage (2 weeks).

자포니카 벼의 형질전환방법은 다음과 같다. 소독한 벼 종자를 pH 5.8로 조정한 캘러스 유도 배지인 2N6 배지에서 한 달간 배양하였다. 이 후, 형성된 캘러스를 모아 pTflA벡터가 형질 전환된 아그로박테리움을 이용 AAM 배지에 30초간 접종한 후, 3MM 종이를 깐 페트리디쉬 안에 접종된 캘러스를 얹어 호일로 싸 빛을 차단한 후 3일 동안 24℃에서 배양하였다. 처음 1주일간은 5㎎/L 농도로 톡소플라빈이 들어있는 2N6 배지에서 배양하고, 두 번째 3주간은 10㎎/L의 톡소플라빈이 들어있는 2N6배지에 옮겨 배양함으로써 저항성을 갖는 캘러스만을 고르는 작업을 수행하였다. 선별된 캘러스들을 재분화 배지(톡소플라빈 농도 10 ㎎/㎖)로 옮겼다. 3주후 생존한 캘러스들만을 골라 최종적으로 재분화 배지(톡소플라빈 무첨가)에 배양하였으며, 그 결과 4주 후부터 소식물체가 출현하였다. 소식물체들은 기본배지 (MS media)로 옮겨 2주간 배양하였으며 정상 식물과 동일한 과정으로 증식하였다.
The transformation method of japonica rice is as follows. Sterilized rice seeds were incubated for one month in 2N6 medium, a callus induction medium adjusted to pH 5.8. Thereafter, the formed callus was collected and inoculated into AAM medium using Agrobacterium transformed with a pTflA vector for 30 seconds, and then inoculated with a callus inoculated in petri dish coated with 3MM paper to block light for 3 days. Incubated at 24 ° C. The first one week was incubated in 2N6 medium containing toxoflavin at a concentration of 5 mg / L, and the second three weeks were transferred to 2N6 medium containing 10 mg / L of toxoflavin to select only resistant callus. Was performed. Selected callus was transferred to regeneration medium (Toxoflavin concentration 10 mg / ml). After 3 weeks, only the surviving callus was picked and finally cultured in regeneration medium (toxoflavin-free). As a result, news bodies appeared after 4 weeks. The news media were transferred to MS media and incubated for 2 weeks and grown in the same process as normal plants.

상기 결과로서, 본 발명의 형질전환방법은 캘러스 유도를 통한 기존의 방법과 비교하여 형질전환 기간을 절반이하로 단축시키는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, the transformation method of the present invention was confirmed to reduce the transformation period to less than half compared to the conventional method through callus induction.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (12)

다음 단계를 포함하는 인디카(indica) 벼의 형질전환 방법:
(a) 벼의 성숙 종자를 수득하는 단계;
(b) 상기 성숙 종자를 발아시켜 미성숙배세포(Immature embryos, IEs)를 형성시키는 단계;
(c) KNO3, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O, FeSO4.7H2O, Na2EDTA, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, KI, CuSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O, CoCl2.6H2O, 비타민, 카사미노산, 아미노산, 당류, 사이토키닌, 옥신 및 아세토시린곤을 포함하는 배지 하에서, 형질전환하고자 하는 목적 유전자를 포함하는 벡터를 상기 미성숙배세포 내로 도입시키는 단계;
(d) 상기 목적 유전자가 도입된 미성숙배세포로부터 세포괴(Cell mass)를 형성하는 단계; 및
(e) 상기 세포괴로부터 형질전환 벼를 수득하는 단계.
Transformation method of indica rice comprising the following steps:
(a) obtaining mature seeds of rice;
(b) germinating the seed to form immature embryos (IEs);
(c) KNO 3 , MgSO 4 .7H 2 O, (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , CaCl 2 .2H 2 O, FeSO 4 .7H 2 O, Na 2 EDTA, MnSO 4 .4H 2 O, ZnSO 4 .7H 2 O, H 3 BO 3, Under medium containing KI, CuSO 4 .5H 2 O, Na 2 MoO 4 .2H 2 O, CoCl 2 .6H 2 O, vitamins, casamino acids, amino acids, sugars, between the non-talkie, dioxin and acetonitrile ache Gon, transfected Introducing a vector containing the target gene to be converted into the immature germ cells;
(d) forming a cell mass from immature germ cells into which the target gene has been introduced; And
(e) obtaining a transformed rice from said cell mass.
삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 벡터는 톡소플라빈 분해효소 유전자(tflA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
The transformation method according to claim 1, wherein the vector of step (c) comprises a toxoflavin degrading enzyme gene ( tflA ).
삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c) 이후에 목적 유전자가 도입된 미성숙배세포를 선별하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
The method of claim 1, wherein the method further comprises the step of selecting the immature germ cells into which the target gene has been introduced after step (c).
제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c) 또는 단계 (d) 이후에 목적 유전자가 도입된 미성숙배세포를 재분화 시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
The method of claim 1, wherein the method further comprises the step of re-differentiating immature germ cells into which the gene of interest has been introduced after step (c) or step (d).
삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 세포괴의 형성은 KNO3, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O, FeSO4.7H2O, Na2EDTA, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, KI, CuSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O, CoCl2.6H2O, 비타민, 카사미노산, 아미노산, 당류, 젤란검, 사이토키닌, 옥신, 세포탁심 및 카르베니실린을 포함하는 배지에서 실시되는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
The method of claim 1, wherein the cell mass is KNO 3 , MgSO 4 .7H 2 O, (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , CaCl 2 .2H 2 O, FeSO 4 .7H 2 O, Na 2 EDTA, MnSO 4 .4H 2 O, ZnSO 4 .7H 2 O, H 3 BO 3, KI, CuSO 4 .5H 2 O, Na 2 MoO 4 .2H 2 O, CoCl 2 .6H 2 O, vitamins, casamino acids, amino acids, sugars, gellan gum, between the non-talkie, auxin, and a cell Taksim carbenicillin Transformation method characterized in that carried out in a medium containing.
제 5 항에 있어서, 상기 미성숙배세포의 선별은 KNO3, MgSO4.7H2O, (NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O, FeSO4.7H2O, Na2EDTA, MnSO4.4H2O, ZnSO4.7H2O, H3BO3, KI, CuSO4.5H2O, Na2MoO4.2H2O, CoCl2.6H2O, 비타민, 카사미노산, 아미노산, 당류, 젤란검, 사이토키닌, 옥신, 세포탁심, 카르베니실린 및 톡소플라빈을 포함하는 배지에서 실시되는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
The method of claim 5, wherein the immature germ cells are selected from KNO 3 , MgSO 4 .7H 2 O, (NH 4 ) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , CaCl 2 .2H 2 O, FeSO 4 .7H 2 O, Na 2 EDTA, MnSO 4 .4H 2 O, ZnSO 4 .7H 2 O, H 3 BO 3, KI, CuSO 4 .5H 2 O, Na 2 MoO 4 .2H 2 O, CoCl 2 .6H 2 O, and the cylindrical vitamin, casamino acids, amino acids, sugars, gellan gum, between the non-talkie, auxin, cell Taksim, carboxylic Benny Transformation method characterized in that carried out in a medium containing toxoflavin.
제 6 항에 있어서, 상기 미성숙배세포의 재분화는 KNO3, NH4NO3, MgSO4.7H2O, MnSO4.4H20, ZnSO4.7H2O, CuSo4.5H2O, Cacl2.2H2, KI, CoCl2.6H2O, KH2PO4, H3BO3, Na2MoO4.2H2O, Na2EDTA, FeSO4.7H2O, 비타민, 아미노산, 당류, 젤란검, 사이토키닌, 옥신, 세포탁심 및 톡소플라빈을 포함하는 배지에서 실시되는 것을 특징으로 하는 형질전환 방법.
The method of claim 6, wherein the regeneration of the immature germ cells KNO 3 , NH 4 NO 3 , MgSO 4 .7H 2 O, MnSO 4 .4H 2 0, ZnSO 4 .7H 2 O, CuSo 4 .5H 2 O, Cacl 2 .2H 2, KI, CoCl 2 .6H 2 O, KH 2 PO 4 , H 3 BO 3 , Being carried out in a medium containing Na 2 MoO 4 .2H 2 O, Na 2 EDTA, FeSO 4 .7H 2 O, vitamins, amino acids, sugars, gellan gum, between the non-talkie, auxin, cell Taksim and Toxoplasma flavin Transformation method.
제 1 항, 제 3 항, 제 5 항, 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법으로 수득한 형질전환 된 인디카(indica) 벼.
A transformed indica rice obtained by the method of any one of claims 1, 3, 5, 6 and 8 to 10.
제 1 항, 제 3 항, 제 5 항, 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법으로 수득한 형질전환 된 인디카(indica) 벼의 종자. Seeds of transformed indica rice obtained by the method of any one of claims 1, 3, 5, 6 and 8-10.
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