KR101355128B1 - Ｔ７ 파지를 이용한 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법 - Google Patents

Ｔ７ 파지를 이용한 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 T7 파지를 이용하여 바실러스 파지 엔도라이신 유전자를 포함하고 있는 대장균 라이브러리로부터 바실러스 파지 엔도라이신 유전자를 스크리닝할 수 있는 방법을 제공하는데, 대장균을 호스트로 하여 바실러스 파지 엔도라이신 유전자 라이브러리를 구축한 후 T7 파지를 처리하면, 바실러스 파지 엔도라이신 유전자를 신속하고, 경제적인 방법으로, 무독성의 조건 하에서 분리해 낼 수 있다

Description

Ｔ７ 파지를 이용한 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법{Screening method of Bacillus phage endolysin gene with T7 phage}
본 발명은 T7 파지를 이용한 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 T7 파지를 이용하여 바실러스 파지 엔도라이신 유전자를 포함하고 있는 대장균 라이브러리로부터 바실러스 파지 엔도라이신 유전자를 스크리닝할 수 있는 방법에 관한 것이다.
엔도라이신(endolysin)은 박테리아의 세포벽을 가수분해하는 효소로서, 파지가 숙주인 박테리아에 대해 용균 작용을 일으킬 때 사용된다. 파지 감염 과정 중, 엔도라이신은 홀린(holin)을 매개로 하여, 세포막을 통과하여 세포벽의 펩티도글리칸 기질로 이동하여 펩티도글리칸의 가수분해를 일으킨다. 가수분해에 따라 세포벽에 구멍이 형성되고, 삼투압의 작용으로 세포막이 분해하여 용균 작용이 일어난다.
따라서, 파지에 의해 합성되는 엔도라이신은 병원성 세균을 제어하는데 큰 효과가 있을 것이며, 특히 그람 양성균인 바실러스와 같이 엔도라이신에 의해 분해되는 세포벽의 펩티도글리칸이 노출되어 있는 경우에는 직접적인 효과를 볼 수 있다.
한편, 기존의 엔도라이신 분리 방법은 하기와 같았다. 먼저, 엔도뉴클리아제(endonuclease)로 파지의 게놈(genome)을 임의적으로 자른 후, 자른 절편들을 플라스미드에 재조합하여 대장균에 라이브러리를 구축한다. 구축된 라이브러리는 고체 배지에 배양되고, 이것에 클로로포름(chloroform) 증기를 처리하여 대장균을 파괴하는데, 엔도라이신을 합성하는 클론에서는 대장균 밖으로 엔도라이신이 나오게 된다. 이 후, 실험에 사용된 바실러스 파지의 숙주가 되는 바실러스를 클로로포름에 의해 분해된 라이브러리 위에 도말을 한 후, 일정기간 배양을 한다. 그 후, 엔도라이신을 합성하는 클론의 위치에서는 도말한 숙주 바실러스의 생육이 저해되는 것을 확인할 수 있다. 이상과 같은 과정을 통해 세포벽의 펩티도글리칸을 가수분해하는 엔도라이신 유전자를 최종 스크리닝할 수 있는 것이다.
그런데, 상기 방법에서, 대장균 세포의 파괴를 위해 이용되는 클로로포름은 CERCLA 지수가 '보건(3), 화재(0), 반응성(0), 지속성(3), NFPA 지수가 보건(2), 화재(0), 반응성(0)'으로, 위험성과 유해성을 갖고 있다. 흡입, 피부접촉, 눈 접촉, 섭취 등의 경우, 자극을 야기하고, 장기노출의 경우 장기 손상, 구토, 구토 등을 유발할 수 있다. 특히, 상기의 실험 방법에 이용되는 클로로포름은 99.9%의 순도를 갖는 것이며, 사용 시 라이브러리가 배양된 유리 플레이트의 뚜껑에 과량을 넣고, 증기를 통해 세포를 파괴하기 때문에, 피부 접촉, 흡입 등의 위험에 쉽게 노출될 수 있는 문제가 있는 것이다.
또한, 클로로포름을 사용하는 경우, 바실러스 세포에 대한 영향을 없애기 위해, 바실러스의 도말시 클로로포름을 증발시키는 과정이 굉장히 길게 요구되어 시간적 낭비가 될 수 있는 문제가 있고, 다량의 라이브러리를 구축하기 위해서는 다량의 유리 플레이트를 이용해야 하기 때문에 경제적으로도 바람직하지 못한 문제가 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 클로로포름을 이용한 방법에는, 인체에 대한 위해성, 시간의 낭비 및 경제적 문제가 있기 때문에, 이를 최소화하기 위해서는 다른 방법을 이용해 대장균 라이브러리를 파괴할 필요가 있다 할 것이다.
본 발명과 직접적인 관계는 없으나, 참조특허로 대한민국 특허공개번호 제10-2006-0068062호 (공개일자: 2006.06.21)에, "복제원점, MCS, 선택마커, 서열번호2에 기재된 유전자 염기서열을 갖는 프로모터 및, 그 프로모터의 다운 스트림에 대장균의 세포막을 파괴하는 T4 박테리오파지 유래의 홀린을 코딩하는 유전자와 대장균의 세포벽을 파괴하는 T7 박테리오파지 유래의 엔도리신을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 삽입하여 재조합 벡터를 구축하는 단계(a); 상기 단계(a)의 재조합 벡터를 대장균에 삽입하여 대장균을 형질 전환하는 단계(b); 상기 단계(b)의 형질전환된 대장균을 포도당이 첨가된 배지에서 배양하는 단계(c); 및, 배양 후, 상기 단계(c) 배지로부터 외래단백질을 회수하는 단계(d)를 포함하는 것을 특징으로 하는 외래 단백질의 회수 방법"이 기재되어 있다.
본 발명은 기존의 클로로포름 사용으로 말미암은 위험성을 줄이고, 시간적·비용적 효율성을 높일 수 있는 새로운 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 바실러스(Bacillus) 균주를 감염시켜 용균을 일으키는 바실러스 파지(Bacillus phage)의 엔도라이신 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 1차 배양하면서, 엔도라이신 유전자를 발현시켜 엔도라이신 효소를 생산하는 단계 (a); 단계 (a) 후, 상기 재조합 대장균에, T7 파지 및 바실러스 균주를 처리한 후, 2차 배양하여 바실러스 균주의 사멸 여부를 확인하는 단계 (b); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법에 대해 각 단계별로 세분하여 상세히 설명하고자 한다.
[단계 (a): 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 라이브러리 호스트인 대장균을 배양하면서 엔도라이신 유전자를 발현시키는 단계]
본 단계는 바실러스(Bacillus) 균주를 감염시켜 용균을 일으키는 바실러스 파지(Bacillus phage)의 엔도라이신 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 1차 배양하면서, 엔도라이신 유전자를 발현시켜 엔도라이신 효소를 생산하는 단계이다.
본 발명에서는 바실러스 균주를 감염시켜 용균을 일으키는 바실러스 파지로부터, 용균 작용에 직접적으로 작용하는 엔도라이신 유전자를 스크리닝하고자 한다. 이를 위해서는 바실러스 파지의 게놈(genome)을 임의적으로 자른 후, 자른 절편들을 대상으로 라이브러리를 구축하는데, 이때 호스트로 본 발명에서는 대장균을 사용한다. 라이브러리를 구성하는 수많은 대장균에는 바실러스 파지 게놈의 절편이 각각 삽입되어 있는데, 이 수많은 대장균으로부터 엔도라이신 유전자를 포함하는 대장균을 분리해내고, 그로부터 엔도라이신 유전자를 클로닝하는 것이 본 발명의 목적인 것이다.
이를 위해, 본 단계에서는 바실러스(Bacillus) 균주를 감염시켜 용균을 일으키는 바실러스 파지(Bacillus phage)의 엔도라이신 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 1차 배양하면서, 엔도라이신 유전자를 발현시켜 엔도라이신 효소를 생산한다.
한편, 본 단계에 있어서 상기 형질전환은, 엔도라이신 유전자를 대장균 내에 도입시키는 것을 의미하는데, 공지의 유전공학 방법을 이용하여 다양하게 수행할 수 있으나, 바람직하게는 바실러스(Bacillus) 균주를 감염시켜 용균을 일으키는 바실러스 파지(Bacillus phage)의 엔도라이신 유전자를 포함하고 있는 플라스미드를 대장균에 삽입시켜 수행하는 것이 좋다. 가장 간편한 형질전환 방법이기 때문이다. 플라스미드는 벡터로서, 해당 유전자를 호스트에 전달하는 역할을 수행한다.
한편, 본 단계에 있어서, 상기 1차 배양은 다양한 배양 방식으로 수행될 수 있으나, 아가 플레이트 위에서 정치배양하는 것이 좋다. 정치배양을 하는 경우, 눈으로 각각의 샘플이 처리된 구획을 다른 구획으로부터 분리하여 명확히 확인할 수 있어, 스크리닝이 용이하기 때문이다.
[단계 (b): T7 파지 및 바실러스 균주의 처리 단계]
본 단계는 단계 (a) 후, 상기 재조합 대장균에, T7 파지 및 바실러스 균주를 처리한 후, 2차 배양하여 바실러스 균주의 사멸 여부를 확인하는 단계이다. 본 단계는 본 발명의 핵심적인 단계로서, 상기 단계 (a)의 대장균에 T7 파지 및 바실러스 균주를 처리하는 단계이다.
T7 파지를 처리하면 대장균이 용해(lysis)되고, 그 내부에 발현되어 있던 엔도라이신 효소가 배출되어 나오게 된다. 배출된 엔도라이신 효소는 첨가된 바실러스 균주를 사멸시켜 대장균이 용해된 자리에 투명의 환을 만들게 된다. 투명의 환은 처리된 바실러스 균주가 사멸되는 것을 의미하는데, 이와 같이 투명의 환이 형성된 용해지점의 대장균은 엔도라이신 유전자를 가지고 있는 것이고, 해당 대장균으로부터 플라스미드를 분리하여 엔도라이신 유전자를 최종 클로닝할 수 있는 것이다.
한편, 본 단계에 있어서, 상기 T7 파지 및 바실러스 균주의 처리는, 동시에 처리할 수도 있고, 순차적으로 처리할 수도 있다. 동시에 처리하는 방법은 각각 처리하는 방법에 비해 단계를 한 단계 줄일 수 있는데, 이는 시간 및 비용 측면에서 굉장한 장점을 갖는다. 동시 처리의 방법으로는 일 예로, T7 파지 및 바실러스 균주를 소프트 아가에 넣어 상기 대장균에 부어주는 방법이 있다.
한편, 상기 T7 파지 및 바실러스 균주를 순차적으로 처리하는 방법의 예는, T7 파지를 먼저 처리하여 대장균을 용균(lysis)시키고, 용균 후, 바실러스 균주를 처리하는 방법이 있다.
본 발명에서는 T7 파지가 엔도라이신 라이브러리를 구축할 때 호스트로 사용되는 대장균만을 특이적으로 파괴하고, 바실러스를 사멸시키지 않는 것을 확인하였고, 이를 통해 배지로 빠져나온 엔도라이신이 유효한 활성을 가지고 있음을 또한 확인할 수 있었다.
따라서, 대장균을 호스트로 하여 바실러스 파지 엔도라이신의 라이브러리를 구축한 후 T7 파지를 처리하면, 바실러스 파지 엔도라이신을 신속하고, 경제적인 방법으로, 무독성의 조건 하에서 분리해 낼 수 있다.
도 1은 T7 파지의 호스트에 대한 특이성을 보여주는 그래프로서, 대장균에는 감염을 하지만, 바실러스에는 감염하지 않음을 보여준다. 도 1에서 DH 5α는 대장균이며, BC8은 바실러스이다.
도 2는 본 발명에서 사용한 pBAD18 벡터의 개열도이다.
도 3은 T7 파지에 의한 효과적인 균체의 붕괴와 안정적인 균체 내 물질의 분비에 대한 실험 결과를 보여준다. 도 3의 각 플레이트에서, 위는 pBAD18-endo/DH5a, 아래는 pBAD18/DH5a이다. 클로로포름과 T7 파지를 처리한 플레이트의 pBAD18-endo/DH5a 콜로니 주변에는 투명한 환이 생긴 것을 볼 수 있다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: T7 파지의 호스트 특이성 확인]
T7 파지가 라이브러리 제작에서 호스트로 사용되는 대장균을 용해시킬 수 있고, T7 파지의 스크리닝 단계에서 공시 균주로 사용되는 바실러스를 용해시키지 않는지 확인하고자 하였다.
대장균과 바실러스를 각각 LB 브로스(broth)에 오버나이트(overnight)로 배양한 후, 이 배양액을 1/100로 희석하여 다시 새 LB 액체 배지에 계대 배양을 하였다. 1시간 배양 후 T7 파지를 106 PFU의 양으로 두 배양액에 접종하고, 이 시간부터 배양액의 흡광도(600 nm)를 측정하였다. T7 파지가 호스트로 하는 숙주 박테리아는 흡광도가 감소하며 배양액은 점점 투명해지며 사멸된 박테리아의 잔해물이 보이게 된다.
실험 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 T7 파지는 대장균 DH5α에 대해서는 사멸능(용해)을 보이나, 바실러스 BC8에 대해서는 사멸능이 없음을 확인할 수 있었다.
이와 같은 실험을 통해, 대장균을 호스트로 이용하여 구축한 라이브러리로부터 바실러스파지 엔도라이신을 스크리닝할 때, T7 파지를 아주 유의 적절하게 이용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 2: 본 발명의 방법에 의한 엔도라이신 효소의 분리]
본 실시예에서는 바실러스 파지의 엔도라이신을 합성하는 유전자를 포함하는 대장균을 대상으로 클로로포름과 T7 파지를 처리하였을 경우, 균체의 파괴 정도와 균체 내에서 나오는 엔도라이신의 활성 비교에 대한 실험을 수행하였다.
본 발명자들은 T7 파지가 엔도라이신 라이브러리에 사용될 대장균 DH5α를 효과적으로 파괴하고, 세포 내 물질이 밖으로 제대로 분비되는 지를 확인하기 위한 시험군으로 사용하기 위해, 하기와 같이 유전공학적으로 재조합시킨 바실러스 파지 엔도라이신을 이용하였다.
게놈 시퀀싱을 통해 확인된 바실러스 파지의 엔도라이신 유전자(서열번호 1)를 pBAD18(도 2) 플라스미드에 삽입하고, 이 재조합 플라스미드를 상업용 균주로 실험에 많이 사용되고 있는 대장균 DH5α 균주에 형질전환을 하였다. 대조군으로는 pBAD18 자체만 형질전환시킨 대장균 DH5α를 사용하였다. 형질전환을 통해 실험군인 pBAD18-endo/DH5α와 대조군인 pBAD18/DH5α를 제조하였다. 실험군 pBAD18-endo/DH5α에서 'endo'는 엔도라이신을 의미한다.
실험군과 대조군 각각을 LB 액체배지에서 12시간 배양하고, 0.4%의 아라비노오스를 포함하는 LB 고체 배지에 10㎕씩 떨어뜨리고 6시간 동안 배양하였다. 아라비노오스는 pBAD18 플라스미드에 있는 ara 프로모터(promoter)의 유도물질(inducer)로서 재조합된 엔도라이신 유전자의 발현을 유도시킬 수 있는 물질이다.
배양 후, 클로로포름과 T7 파지를 이용해 엔도라이신의 활성을 측정하였다. 이때, 비교예로 사용된 클로로포름의 처리는 기존 알려진 방법과 동일하게 실시하였다. 6시간 동안 배양시킨 플레이트의 뚜껑에 10ml의 클로로포름을 붓고 거꾸로 10분 정도 처리하여 클로로포름의 증기가 세포에 영향을 줄 수 있도록 처리하였다. 그 후 소프트 아가(soft agar, 0.4%)에 바실러스 배양액을 섞고, 이를 클로로포름을 처리한 플레이트에 붓고 굳힌 후 6시간 동안 정치배양하였다.
한편, T7 파지는 클로로포름처럼 독립적으로 처리하지 않고 바실러스 BC8 (Bacillus cereus ATCC 10876)가 포함된 소프트 아가(soft agar)에 함께 넣어 (약 1010 PFU) 이용하였다. 동일하게 6시간을 배양시킨 후 바실러스의 성장 저해를 확인하였다.
실험 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 용균(lysis)된 대장균 DH5a에서 용출된 엔도라이신이 바실러스의 세포 사멸을 일으켜 pBAD18-endo/DH5α의 콜로니 주변에 투명한 환이 생기는 것을 확인할 수 있었다. 이때, 대장균 DH5a의 용균 물질(cell lysis agent)로 클로로포름을 처리한 플레이트와 T7 파지를 처리한 플레이트에서 유의한 차이가 없었다.
따라서, T7 파지를 이용한 본 발명의 엔도라이신 스크리닝 방법이 기존의 방법을 충분히 대체할 수 있을 것으로 판단되었다.
한편, T7파지를 이용한 스크리닝에서 T7 파지의 적정량(titer)이 어느 정도까지 유효한지를 알아보기 위해, 상기와 같은 방법에서 10-배 연속 희석(10-fold serial dilution)을 한 T7 파지(10 PFU/ml ~ 109 PFU/ml)를 샘플에 처리하였다. 103 PFU/ml 까지는 pBAD18-endo/DH5α의 용균이 일어나 투명한 환을 관찰할 수 있었지만, 102 PFU/ml 이하에서는 충분한 용균이 일어나지 못하여 pBAD18/DH5α와 별다른 차이를 보이지 않았다.
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Claims (6)

  1. 바실러스(Bacillus) 균주를 감염시켜 용균을 일으키는 바실러스 파지(Bacillus phage)의 엔도라이신 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 1차 배양하면서, 엔도라이신 유전자를 발현시켜 엔도라이신 효소를 생산하는 단계 (a);
    단계 (a) 후, 상기 재조합 대장균에, T7 파지 및 바실러스 균주를 처리한 후, 2차 배양하여 바실러스 균주의 사멸 여부를 확인하는 단계 (b); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 T7 파지 및 바실러스 균주의 처리는,
    동시에 처리하는 것을 특징으로 하는 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 동시 처리는,
    T7 파지 및 바실러스 균주를 소프트 아가에 넣어 대장균에 부어주는 것을 특징으로 하는 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 T7 파지 및 바실러스 균주의 처리는,
    T7 파지를 먼저 처리하여 대장균을 용균(lysis)시키고, 용균 후, 바실러스 균주를 처리하는 것을 특징으로 하는 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 1차 배양은,
    아가 플레이트 위에서 정치배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 형질전환은,
    바실러스(Bacillus) 균주를 감염시켜 용균을 일으키는 바실러스 파지(Bacillus phage)의 엔도라이신 유전자를 포함하고 있는 플라스미드를 대장균에 삽입시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 바실러스 파지 엔도라이신 유전자의 스크리닝 방법.
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CN111909917A (zh) * 2019-05-10 2020-11-10 中国科学院微生物研究所 一种内溶素Lysmeta1及其编码基因与应用

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KR20060068062A (ko) * 2004-12-15 2006-06-21 재단법인서울대학교산학협력재단 피티에스지프로모터, 세포 파괴를 일으키는 홀린과엔도리신을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 단백질발현용 벡터 및 이를 대장균에 넣어 배양함으로써 재조합단백질을 스크리닝하는 방법
WO2010136754A1 (en) 2009-05-26 2010-12-02 Plant Bioscience Limited Novel polypeptides having endolysin activity and uses thereof

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