KR101353084B1 - 가금분변에서 분리한 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 신규유산균 락토바실러스 살리바리우스 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가금분변에서 분리한 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 신규 유산균 락토바실러스 살리바리우스에 관한 것이다. 본 발명에 따른 균주를 이용하면 항생제 대체물질로서 병원균으로 가축 또는 축산식품을 통해 사람에게 전파되지 않도록 제어할 수 있으며, 생균제(Probiotics) 및 건강기능성식품 소재 등 다양한 분야에 이용할 수 있는 장점이 있다.

Description

가금분변에서 분리한 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 신규유산균 락토바실러스 살리바리우스{LACTOBACILLUS SALIVARIUS ISOLATED FROM POULTRY FECES}

본 발명은 가금분변에서 분리한 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 신규 유산균 락토바실러스 살리바리우스에 관한 것이다.

생균제(Probiotics)는 정상적인 장내 미생물의 균형을 유지시키는 미생물과 그 대사물질이라 정의되며, 유산균은 건강기능성식품 소재로 인정될 뿐만 아니라 사료 첨가용 생균제로 널리 활용되고 있다.

장내 미생물 균총은 여러 가지 미생물이 복합적으로 생존하고 있어 정상적인 장내 미생물 균총을 정의하기 어려우나, 축종에 따라 장내 환경이 다르므로 축종에 맞는 생균제 개발이 필요하다.

유산균은 유해세균에 대한 억제작용을 통해 숙주의 건강을 유지하는 역할을 하는 것으로 알려지고 있으나 균종 및 스트레인에 따라 억제 활성을 나타내는 유해균의 종류가 다양하여 특정 균종에 따른 선택이 필요하다.

황색포도상구균(Saphylococcus aureus)는 생명을 위협할 수 있는 패혈증, 심장내막염, 독성에 의한 쇼크 증상 등을 일으키는 중요한 병원균으로 대부분의 선진국가에서 임상분리주의 50%이상이 항생제 저항성으로 보고되는 병원균으로 가축 또는 축산식품을 통해 사람에게 전파되지 않도록 제어가 필요하다.

살모넬라는 우리나라 식중독 원인세균중 가장 높은 분포를 나타내고 있으며, 오스트리아 식중독 사고의 76%를 차지하며 원인식품으로 난류가 57%, 가금육이 30%로 보고되어(2005) 가금 생산에서 특히 제어가 필요하다.

경제적 측면에서 우리나라 산란계 사육수수는 6,136만수(2008), 육계 8,088만수(2010), 계란생산량은 578천톤(2010)으로 농업생산액은 닭 2조원 계란 1조3천6백억에 달한다.

사료 첨가제용 생균제 시장은 500억원으로 추산되고 있으나 축종별로 세분화되지 않고 영세업체들이 난립되어 있다.

사회적 측면에서 농림수산식품부는 2011년 하반기부터 사료에 항생제 첨가를 전면금지한다고 발표하여, 항생제 대체물질로서 유익한 미생물 개발과 이용 분야에 대한 관심이 높아지고 있다.

이 분야의 선행기술로는 한국공개특허 2011-0009516에 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주 및 이를 함유하는 사료첨가제조성물 및 한국공개특허 2009-0057154에 산란계의 분변에서 분리한 락토바실러스속 미생물이 공개되어 있다.

이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국 본 발명의 목적은 가금분변에서 분리한 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 신규유산균 락토바실러스 살리바리우스 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열목록 1의 16rRNA 염기서열을 갖는 유산균인 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)(기탁번호: KACC 91656)가 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 락토바실러스 살리바리우스는 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 활성을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 락토바실러스 살리바리우스를 함유하는 생균제가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 가금의 분변을 수집하는 단계; 균주를 분리하는 단계; 상기 분리된 균주의 항생제 활성을 확인하는 단계; 및 분리된 균주의 염기서열을 확인하는 단계를 포함하는 가금분변에서 분리한 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 균주의 동정 방법이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 균주를 이용하면 항생제 대체물질로서 병원균으로 가축 또는 축산식품을 통해 사람에게 전파되지 않도록 제어할 수 있으며, 생균제(Probiotics) 및 건강기능성식품 소재 등 다양한 분야에 이용할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 가금의 분변시료에서 유산균을 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 분리된 균주의 항생제 효과를 나타낸다.
도 3은 분리된 균주의 전자현미경 사진이다.
도 4는 락토바실러스 살리바리우스의 리보솜 단백질 분석(BioTyper) 결과이다.
도 5는 선발균주(8-40) 락토바실러스 살리바리우스의 유전체 분석 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열목록 1의 16rRNA 염기서열을 갖는 유산균인 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)(기탁번호: KACC 91656)가 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 락토바실러스 살리바리우스는 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 활성을 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 락토바실러스 살리바리우스를 함유하는 생균제가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 가금의 분변을 수집하는 단계; 균주를 분리하는 단계; 상기 분리된 균주의 항생제 활성을 확인하는 단계; 및 분리된 균주의 염기서열을 확인하는 단계를 포함하는 가금분변에서 분리한 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 균주의 동정 방법이 제공될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 가금의 분변시료에서 유산균을 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 가금의 분변을 수집하는 단계; 균주를 분리하는 단계; 상기 분리된 균주의 항생제 활성을 확인하는 단계; 및 분리된 균주의 염기서열을 확인하는 단계를 포함하는 가금분변에서 분리한 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 균주의 동정 방법이 제공될 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예

실시예 1. 포도상구균과 살모넬라 억제 유산균의 분리 및 동정

국립축산과학원에서 사육중인 가금의 분변시료를 수집하였다. 분변에서 채취한 균은 유산균선택배지(BCP agar)에 배양하여 유산균을 분리하였다.

가금 장내 주요 유산균 선발을 위해 10⁸ CFU/g 이상 함유된 유산균을 선발하였다.

선발 방법은 다음과 같다. 우선 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar)에 항생제 저항성 포도상구균 스테필로코커스 아우리우스를 도말한 후, 유산균 배양액 5μl를 점적하고 37℃에서 철야배양한 다음 항균활성을 관찰하였다.

상기에서 선발된 유산균 38균주 중에서 살모넬라 엔테리티디스와 살모넬라 타이피뮤리움 억제 유산균을 선발하였다.

그 결과 살모넬라 엔테리티디스 억제 유산균주 5종, 살모넬라 타이피뮤리움 억제 유산균주 4종, 살모넬라 엔테리티디스와 타이피뮤리움 억제 균주 1종을 동정할 수 있었다.

초미세여과(Ultrafiltration), C18 컬럼 분획후 항균효과를 확인하였다.

16S rRNA 염기서열 분석 및 유전체 분석을 통해 균주를 동정하였다.

하기 표 1은 가금 분변의 유산균수를 나타낸다.

가금분변 유산균수

시료	1	2	5	7	8	9	10
유산균수 CFU/g	3.5×108	4.9×109	1.2×109	1.2×108	4.4×108	1.7×109	1.0×109

상기 표 1에 나타난 시료에서 가금 분변에 10⁸ CFU/g 이상 함유된 287 균주에 대해 항균성 테스트를 실시하여 이 중에서 항생제 포도상구균(MRSA) 억제 균주를 1차로 선발하였으며, 시료번호를 표 2에 나타내었다.

시료 번호		항균성-지름(cm)
1	5	0.7
	7	0.5
2	5	0.6
	10	0.5
	20	0.7
	45	0.45
	49	0.6
5	2	0.5
	5	0.45
	8	0.5
	14	0.5
7	2	0.5
	9	0.5
8	1	0.7
	2	0.75
	3	0.8
	4	0.6
	6	0.6
	9	0.7
	11	0.6
	16	0.8
	19	0.9
	21	0.5
	22	0.6
	29	0.4
	31	0.7
	32	0.5
	35	0.4
	36	0.6
	39	0.8
	40	0.8
	41	0.5
	42	0.6
	43	0.4
9	13	0.6
10	6	0.6
	7	0.6
	8	0.4

상기 선발된 균주를 대상으로 항균성 테스트를 실시하여 MRSA 억제균주 37종 중에서 하기와 같은 살모넬라 억제균주에 저항성을 나타내는 샘플을 선발하였다.

샘플번호	S. enteritidis KCCM12021	S. typhimurium KCCM40253
2-5		0.9
5-5		0.9
7-2	0.6
8-16	0.47
8-19	0.61
8-40	0.4	0.5

상기 샘플번호 8-40 균주의 16S rRNA의 염기서열을 분석하고, 외형관찰을 통한 확인 결과, 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)로 판명되었다. 상기 균주의 염기서열은 서열목록 1에 첨부되어 있다. 이를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였으며, 기탁번호는 KACC 91656이다.

실시예 2. 락토바실러스 살리바리우스의 포도상구균 및 살모넬라 억제활성 테스트

상기 분리된 락토바실러스 살리바리우스가 포도상구균 및 살모넬라에 저항성을 나타내는지 재차 검증하였다.

항균성 테스트를 위해 트립틱 소이 아가(Tryptic soy agar)에 항생제 저항성 포도상구균 스테필로코커스 아우리우스 또는 살모넬라 타이피뮤리움을 도말한 후, 상기 선발된 락토바실러스 살리바리우스 배양액 5μl를 점적하고 37℃에서 철야배양한 다음 항균활성을 관찰하였다.

실시예 3. 락토바실러스 살리바리우스(KACC 91656)를 포함하는 생균제의 효능 및 테스트

상기 선발된 락토바실러스 살리바리우스를 생균제로 활용하기 위해 세포의 셀을 제거하거나, 파쇄한 경우 및 그렇지 않은 경우 등으로 나누어 생균제의 활성이 나타나는 경우를 관찰하였다.

실시예 4. 락토바실러스 살리바리우스(KACC 91656)의 특성 분석

락토바실러스 살리바리우스가 생산하는 10 kDa 이하 신규(NCBI검색) 단백질을 검색한 결과 아래와 같은 폴리펩티드가 검색되었다.

1) MTIVRLPPLLIFYGLPASFLHARDLTLMSKITQANTA

2) MVSNKKVEYYYNNKIPGIYLNIRGIYTLYKKTLNKFV

3) MAKGSYQAMLMVQPCYMMMCNMLFGMYNSSQRLTSSR

4) MYYKAMFDMLSNNAWYIWRINDEDKDALNKYIEDSLKRINKFRI

5) MGKKAKKHKRSYVKKKQRRIKKKLEEKQTEQAKTTAK

6) MAAGAMRAFGVARSLYKALIGAWIKLRIRQDIALTFILSK

7) MTTFKKINSKWFAEWLNPMGLELEINDLVNDNISDKIIELLQE

8) MYHSSKLADFCSKRCYKRIAVRLEWTLRLILIVANILANYPIRA

9) MQDQNPRKEFIQGLESLEEAAVELNQSIKELNKRLDELNKILESR

10) MVETKNKKEPSDVYDRFTQELDEKQRREFEKLTQKQKLAVIKDYLRKY

11) MCILRDFFYIFLEIGNLNNNGKIATTKITMKGSVAKF

12) MVSIYESIVVINDDYLFYYYLNEMKNTFNKKIKNYKVQKATNIDC

13) MSYTEYNDLTLFFSSTYSVMQELTKYKPINEHYNDMKKLIKELQQNK

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

1. 서열목록 1의 16S rRNA 염기서열을 가지며, 항생제저항성 포도상구균과 살모넬라를 억제하는 활성을 나타내는 유산균인 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius)(기탁번호: KACC 91656P)
   
2. 삭제
3. 제1항의 락토바실러스 살리바리우스를 함유하는 생균제.
   
4. 삭제

Images